第十章生物制品的生物測定法第一節(jié)概念

第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法第三節(jié)外源性DNA殘留量的檢查法第四節(jié)鼠IgG殘留量的檢查法目錄第十章生物制品的生物測定法第五節(jié)殘余抗生素的檢查法學(xué)習(xí)目標(biāo)第十章生物制品的生物測定法掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法熟悉生物制品的概念；宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白

殘留量、外源性DNA殘留量等檢查法的概念了解生物制品所含雜質(zhì)的分類概述第一節(jié)第十章生物制品的生物測定法第一節(jié)概述一.

生物制品的概念

生物制品（biologicalproducts）是指以微生物、細(xì)胞、動物或人員組織和體液等為起始原材料，用生物學(xué)技術(shù)制成，用于預(yù)防、治療和診斷人類疾病的制劑，如疫苗、血液制品、生物技術(shù)藥物、微生態(tài)制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、診斷制品等。二.

生物制品雜質(zhì)的分類

第一節(jié)概述

（1）生物污染物包括微生物污染，細(xì)胞成分（如宿主細(xì)胞蛋白等）、培養(yǎng)基成分（如牛血清蛋白等）。

（2）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)包括二聚體及多聚體、脫氨或氧化產(chǎn)物、突變物、錯誤裂解產(chǎn)物、二硫化物異構(gòu)體等。

（3）工藝添加劑包括殘余的抗生素，蛋白分離劑（如乙醇等）、產(chǎn)品穩(wěn)定劑（如肝素等）、防腐劑（如苯酚等）、佐劑（如氫氧化鋁等）、細(xì)菌及病毒滅活劑（如甲醛等）。宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法第二節(jié)第十章生物制品的生物測定法一.

概念

第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法

宿主細(xì)胞（或菌體）的殘留蛋白是指與生物制品生產(chǎn)用的細(xì)胞、工程菌相關(guān)的特殊蛋白雜質(zhì)。對該類生物制品的檢定應(yīng)按照《中國藥典》現(xiàn)行版三部的規(guī)定來嚴(yán)格測定和控制異源蛋白的含量，以防其超量而導(dǎo)致機體出現(xiàn)的各種不良免疫反應(yīng)，確保該類產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。二.

原理及方法1.方法

根據(jù)《中國藥典》（2015年版）的規(guī)定，目前對宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的測定主要采用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法二.

原理及方法第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法2.原理

根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)的特點，先將抗體（抗原）包被在固相載體表面后，按不同的步驟加入待測抗原（抗體）和酶標(biāo)記的抗體（抗原），待其充分反應(yīng)后，用洗滌的方法將固相載體上形成的特異性抗原-抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，洗去未結(jié)合的游離酶標(biāo)抗體（抗原），最后加入酶的底物，根據(jù)酶對底物催化的顯色反應(yīng)的程度，對標(biāo)本中的抗原（抗體）進行定性或定量檢測。3.ELISA（雙抗體夾心法）方法舉例大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組生物制品中殘留菌體蛋白含量測定方法的基本步驟為:

（1）包被抗體：將特異性抗體與固相載體連接，形成固相載體，洗滌除去未吸附的抗體和雜質(zhì)。

（2）加待測標(biāo)本并孵育：使標(biāo)本中的待測抗原與上述固相抗體充分反應(yīng)，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，洗滌除去其他未結(jié)合的游離抗原和雜質(zhì).第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法二.

原理及方法

（3）加酶標(biāo)抗體孵育：使固相抗原抗體復(fù)合物中的抗原再與相應(yīng)的酶標(biāo)抗體相結(jié)合，形成固相抗體-待測抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物（即雙抗體夾心法），洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體和其他雜質(zhì)。（4）加底物顯色：固相上的辣根過氧化物酶催化加入的底物（鄰苯二胺）形成橙色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度來進行該抗原的定性或定量檢測。最后加入終止液（硫酸）終止反應(yīng)。第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法用酶標(biāo)儀在492nm波長處測定吸光度，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度做出工作曲線，由此可以測出重組生物制品中所殘留的大腸埃希菌菌體蛋白的含量。第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法SM-3酶標(biāo)儀第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法三.實例

本法采用酶聯(lián)免疫法測定大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品中菌體蛋白質(zhì)殘留量。（《中國藥典》（2015年版）三部通則3412）1.方法原理重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液原液的宿主菌蛋白質(zhì)殘留量測定

（1）溶液的配制第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法2.實驗步驟2.實驗步驟132465包被液（pH9.6碳酸鹽緩沖液）磷酸鹽緩沖液（pH7.4）洗滌液（pH7.4）濃稀釋液底物緩沖液78底物液終止液稀釋液（PH7.4）

（2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備按菌體蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品說明書加水復(fù)溶，精密量取適量，用稀釋液稀釋成每1ml中含菌體蛋白質(zhì)500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng的溶液。第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法

（3）供試品溶液的制備取供試品適量，用稀釋液稀釋成每1ml中約含250μg的溶液。如供試品每1ml中含量小于500μg時，用濃稀釋液稀釋1倍。

（4）測定法a.取兔抗大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)抗體適量，用包被液溶解并稀釋成每1ml中含10μg的溶液，以100μl/孔加至96孔酶標(biāo)板內(nèi)，4℃放置過夜（16～18小時）。b.用洗滌液洗板3次；用洗滌液制備l%牛血清白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶標(biāo)板內(nèi)，37℃放置2小時。c.將封閉好的酶標(biāo)板用洗滌液洗板3次；以100μl/孔加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，每個稀釋度做雙孔，同時加入2孔空白對照(稀釋液)，37℃放置2小時。第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法

d.用稀釋液稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)抗體1000倍，以100μl/孔加至酶標(biāo)板內(nèi)，37℃放置1小時，用洗滌液洗板10次，以100μl/孔加入至酶標(biāo)板內(nèi)，37℃避光放置40分鐘，以50μl/孔加入終止液終止反應(yīng)。e.用酶標(biāo)儀在波長492nm處測定吸光度，應(yīng)用計算機分析軟件進行讀數(shù)和數(shù)據(jù)分析，也可使用手工作圖法計算。第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法以標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度對其相應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以供試品溶液吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到相應(yīng)菌體蛋白質(zhì)含量。按式（10-1）計算:供試品菌體蛋白質(zhì)殘留量（%）=式（10-1）式中c為供試品溶液中菌體蛋白質(zhì)含量，ng/ml；n為供試品稀釋倍數(shù)；T為供試品蛋白質(zhì)含量，mg/ml。第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法3.計算重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液原液的宿主菌蛋白質(zhì)殘留量應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.10%。第二節(jié)宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法4.結(jié)果外源性DNA殘留量的檢查法第三節(jié)第十章生物制品的生物測定法第三節(jié)外源性DNA殘留量的檢查法一.外源性DNA的測定方法

目前對生物制品中殘留外源性DNA的測定方法主要包括：分子雜交技術(shù)、基于DNA結(jié)合蛋白分析系統(tǒng)及實時定量PCR（Q-PCR）3類檢測技術(shù)，其中以分子雜交技術(shù)最為常用。第三節(jié)外源性DNA殘留量的檢查法1.分子雜交技術(shù)的基本原理

采用DNA探針來檢測固定在硝酸纖維素膜上的變性的宿主細(xì)胞DNA。供試品中的外源性DNA經(jīng)變性成為單鏈，再吸附在固相膜上，在一定溫度下可與相匹配的單鏈DNA復(fù)性而重新結(jié)合成雙鏈DNA，稱為雜交。陽性對照和標(biāo)記探針的DNA可由生產(chǎn)供試品所用的傳代細(xì)胞、工程菌及雜交瘤細(xì)胞提取純化來制備。第三節(jié)外源性DNA殘留量的檢查法2.實驗步驟01用標(biāo)記物來標(biāo)記特異性的單鏈DNA探針與吸附在固相膜上的供試品單鏈DNA雜交02030405使用與標(biāo)記物相對應(yīng)的顯示系統(tǒng)來顯示雜交結(jié)果與已知含量的陽性DNA對照對比測出供試品中外源性DNA的含量，其靈敏度可達(dá)10pg以下第三節(jié)外源性DNA殘留量的檢查法3.注意事項(1)DNA殘留量在1.25～80ng/ml范圍內(nèi)，本法線性較好。(2)供試品首次應(yīng)用本法測定時需要進行方法學(xué)驗證，驗證內(nèi)容至少包括精密度試驗和回收率試驗。鼠IgG殘留量的檢查法第四節(jié)第十章生物制品的生物測定法第四節(jié)鼠IgG殘留量的檢查法一.試驗原理

同宿主細(xì)胞（或菌體）蛋白殘留量的檢查法，即利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）雙抗體夾心法來測定經(jīng)單克隆抗體親和層析方法純化的重組制品中殘留的鼠IgG的含量。第四節(jié)鼠IgG殘留量的檢查法1.實驗步驟

(1)包被抗體：將特異性的抗體（山羊抗鼠IgG抗體）包被在固相載體上，洗滌除去未吸附的抗體和雜質(zhì)。

(2)加待測標(biāo)本并孵育：使標(biāo)本中的待測抗原（供試品溶液）和標(biāo)準(zhǔn)品溶液與上述固相抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，洗滌除去其他未結(jié)合的游離抗原和雜質(zhì)。

(3)加酶標(biāo)抗體孵育：使固相抗原-抗體復(fù)合物中的抗原再與對應(yīng)的經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的綿羊抗鼠IgG抗體相結(jié)合，形成固相抗體-待測抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物（即雙抗體夾心法），洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體和其他雜質(zhì)。第四節(jié)鼠IgG殘留量的檢查法

(4)加底物顯色：固相上的辣根過氧化物酶催化加入的底物（鄰苯二胺）形成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量檢測。最后加入終止液硫酸來終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在492nm波長處測定吸光度，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度做出工作曲線，由此可以測出由單克隆抗體親和層析法純化的重組制品中的殘留鼠IgG的含量。殘余抗生素的檢查法第五節(jié)第十章生物制品的生物測定法目前一些生物制品（如由大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的注射用重組人干擾素-α1b、注射用重組人干擾素-α2a等），由于在生產(chǎn)過程中使用了抗生素（如氨芐西林或四環(huán)素），根據(jù)《中國藥典》現(xiàn)行版四部的要求，對此類生物制品進行質(zhì)量檢定時，除了要在純化工藝中除去抗生素以外，還應(yīng)在原液檢定中增加殘余抗生素活性的檢測項目。第五節(jié)殘余抗生素的檢查法一、概念對生物制品殘余抗生素活性的檢測，目前采用的是瓊脂擴散法（管碟法）。殘余抗生素檢測的基本原理是在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)檢測抗生素對微生物的抑制作用，比較對照品和供試品對接種的試驗菌產(chǎn)生的抑菌圈的大小，以檢測供試品中氨芐西林或四環(huán)素的殘留量。二、原理和方法第五節(jié)殘余抗生素的檢查法瓊脂擴散法測定殘余抗生素量三.實例1.操作步驟

(1)磷酸鹽緩沖液(pH6.0)的制備稱取磷酸二氫鉀8.0g、磷酸氫二鉀2.0g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃滅菌30分鐘。(2)抗生素Ⅱ號培養(yǎng)基的制備稱取胨6g、牛肉提取粉1.5g、酵母浸出粉6g，加入適量水溶解后，加人瓊脂13～14g，加熱使之溶脹，濾過除去不溶物，加入葡萄糖lg，溶解后加水至1000ml，調(diào)pH值使滅菌后為6.5～6.6；分裝于玻璃管或錐形瓶中，經(jīng)115℃滅菌30分鐘，4℃保存。第五節(jié)殘余抗生素的檢查法

(3)對照品溶液的制備a.取氨芐西林對照品適量，用0.01mol/L鹽酸溶解并稀釋成每1ml中含氨芐西林10mg的溶液，精密量取適量，用磷酸鹽緩沖液稀釋成每1ml中含1.0μg的溶液。b.取四環(huán)素對照品適量，用生理氯化鈉溶液溶解并稀釋成每1ml中含0.125μg的溶液。第五節(jié)殘余抗生素的檢查法

(4)菌懸液的制備a.金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）懸液：用于檢測氨芐西林。取金黃色葡萄球菌(CMCC26003)營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，35～37℃培養(yǎng)20～22小時。臨用時，用滅菌水或0.9%無菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。b.藤黃微球菌（Micrococcusluteus）懸液：用于檢測四環(huán)素。取藤黃微球菌[CMCC(B)28001]營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物.接種于營養(yǎng)瓊脂斜面E，置26～27℃培養(yǎng)24小時。臨用時，用0.9%無菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。第五節(jié)殘余抗生素的檢查法

(5)檢查法

取培養(yǎng)皿，注入熔化的抗生素Ⅱ號培養(yǎng)基15～20ml，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作為底層。取抗生素Ⅱ號培養(yǎng)基10～15ml置于1支50℃水浴預(yù)熱的試管中，加入0.5%～1.5%（ml/ml）的菌懸液