第五章微生物限度檢查法第一節(jié)概述第二節(jié)微生物總數(shù)檢查第三節(jié)控制菌檢查目錄第五章微生物限度檢查法學習目標掌握

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第五章微生物限度檢查法微生物限度檢查法的概念、檢查項目、檢查方法、限度要求及結果判斷微生物總數(shù)檢查及控制菌檢查的流程微生物限度檢查對人員環(huán)境與操作的要求、微生物限度檢查的意義、檢查方法的驗證及培養(yǎng)基的適用性檢查等內(nèi)容概述第一節(jié)第五章微生物限度檢查法第一節(jié)概述（1）概念

微生物限度檢查法系檢查非無菌制劑及其原料、輔料、內(nèi)包裝材料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌檢查（2）檢查的意義

●保證藥品質(zhì)量，保障人民的用藥安全●評價藥品生產(chǎn)過程的衛(wèi)生狀況1.微生物限度檢查法的概念及意義2.

微生物限度檢查的內(nèi)容及要求第一節(jié)概述微生物總數(shù)檢查需氧菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)1控制菌檢查耐膽鹽革蘭陰性菌大腸埃希菌沙門菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌梭菌白念珠菌檢查2微生物總數(shù)不得超過限度規(guī)定控制菌不得檢出要求依據(jù)：《中國藥典》（2020年版）第一節(jié)概述（1）總的要求

微生物限度檢查應在環(huán)境潔凈度為不低于D級背景下的B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行（2）無菌室的設置

3.微生物限度檢查法的環(huán)境要求緩沖走廊緩沖間操作間第一節(jié)概述

（3）無菌室的要求3.微生物限度檢查法的環(huán)境要求溫度：18~26℃濕度：40%~60%相鄰環(huán)境形成正壓：不低于4.9pa控溫裝置紫外消毒燈空氣過濾凈化裝置定期做潔凈度檢查第一節(jié)概述4.微生物限度標準符合各品種項下規(guī)定的標準對于限度標準的解釋101cfu：可接受的最大菌數(shù)為20102cfu：可接受的最大菌數(shù)為200103cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000依此類推微生物總數(shù)檢查第二節(jié)第五章微生物限度檢查法第二節(jié)微生物總數(shù)檢查試驗前準備檢驗過程結果判斷發(fā)放報告1324微生物總數(shù)檢查的步驟第二節(jié)微生物總數(shù)檢查1.試驗前準備取樣01無菌室的清潔與消毒

02試驗物品準備

03取多少抽樣量依據(jù)檢驗量3~5倍的檢驗量10g或10ml或100cm2；2個以上獨立包裝消毒劑：0.2%苯扎溴銨、75%乙醇等消毒流程：自上而下、先里后外；開啟紫外燈與空氣過濾裝置30分鐘以上消毒處理干熱滅菌處理：160℃2小時足夠量無菌處理濕熱滅菌處理：高壓蒸汽微生物總數(shù)檢查采用的方法：包括微生物計數(shù)法，包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法，操作過程包含：●計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查●計數(shù)方法適用性試驗●供試品的檢查2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查重點掌握：供試品的檢查（1）計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查●檢查目的●檢查方法●檢查操作：包括菌種及菌液制備、陰性對照試驗、培養(yǎng)基適用性檢查2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查培養(yǎng)基是否是無菌的培養(yǎng)基能否保證微生物的生長陰性對照試驗陽性對照試驗（計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查操作流程）2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查菌種（復活）1#2#3#4#5#1#或2#3#或4#3#或5#培養(yǎng)基30~35℃18~24hr20~25℃2~3天20~25℃5~7天新鮮培養(yǎng)物分別接種1#或2#稀釋液3#或4#適宜濃度菌液1#/2#/3#菌液分別接種不大于100cfu2個平皿2支2#培養(yǎng)基管1#培養(yǎng)基注入30~35℃不超過3天4#/5#菌液分別接種不大于100cfu2個平皿2個平皿3#培養(yǎng)基注入30~35℃不超過5天20~25℃不超過5天1#培養(yǎng)基結果①平皿的平均菌落數(shù)的比值應在0.5~2之間與對照培養(yǎng)基同條件下比較：②平皿的菌落形態(tài)、大小一致③液體培養(yǎng)基管試驗菌生長良好菌種1#：金黃色葡萄球菌2#：銅綠假單胞菌3#：枯草芽孢桿菌4#：白念珠菌5#：黑曲霉菌培養(yǎng)基1#：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基2#：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基3#：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基4#：沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基5#：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基稀釋液1#：

PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液2#：0.9%無菌氯化鈉溶液3#：0.05%聚山梨酯80的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液4#：0.05%聚山梨酯80的

0.9%無菌氯化鈉溶液陽性對照菌液的制備（2）計數(shù)方法的適用性試驗●檢查目的：確認所采用方法適合產(chǎn)品微生物計數(shù)（產(chǎn)品的抑菌性）●適用范圍：新產(chǎn)品或生產(chǎn)工藝變更的舊產(chǎn)品●檢查方法：微生物回收試驗法●檢查操作包括：供試液的制備（見教材）

陽性對照菌液制備同“培養(yǎng)基的適用性檢查”回收試驗：平皿法和薄膜過濾法操作流程見下圖2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查（計數(shù)方法的適用性試驗操作流程—平皿法）2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查試驗組供試品對照組菌液對照組菌液適量供試液各1ml2個平皿菌液適量稀釋液（含菌≤100cfu/ml）傾注15-20ml適宜培養(yǎng)基規(guī)定條件培養(yǎng)計算各組平均菌落數(shù)結果判斷（試驗組平均菌落數(shù)供試品對照組平均菌落數(shù)）菌液對照組平均菌落數(shù)應在0.5~2范圍內(nèi)。1#：金黃色葡萄球菌2#：銅綠假單胞菌3#：枯草芽孢桿菌4#：白色念珠菌5#：黑曲霉菌試驗用菌液對應培養(yǎng)基對應培養(yǎng)條件胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基30~35℃不超過3天20~25℃不超過5天一般供試液的制備：稱取供試品10g100ml稀釋液中1:10供試液（最低稀釋級），再根據(jù)需求做10倍遞增稀釋每種菌株均需驗證供試液（含菌≤100cfu/ml）00cfu1ml/皿2個平皿1ml/皿2個平皿（計數(shù)方法的適用性試驗操作流程—薄膜過濾法）2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查濾膜的要求沖洗量的規(guī)定每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜試驗組供試品對照組菌液對照組培養(yǎng)計數(shù)同平皿法分別取10ml或適量過濾沖洗濾膜取下濾膜菌面朝上相應培養(yǎng)基平板上結果判斷貼于（3）供試品的檢查2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查平皿法無抑菌活性的供試品薄膜過濾法MPN法有抑菌活性的供試品僅適于需氧菌總數(shù)測定檢查項目：需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)所用培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度及時間：30~35℃3~5天（需氧菌總數(shù)測定）；20~25℃

5~7天（霉菌和酵母菌總數(shù)測定）（3）供試品的檢查—平皿法操作流程2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查供試品10g10ml100cm2稀釋液1:10供試液1ml9ml稀釋液1:100供試液分別注入1ml/皿2個平皿2個平皿分別注入1ml/皿2個平皿2個平皿15-20ml/皿胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30~35℃

培養(yǎng)3~5天計數(shù)15-20ml/皿沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20~25℃

培養(yǎng)5~7天計數(shù)結果報告重點強調(diào)：計數(shù)時：①點計平板上所有的菌落數(shù)；②若同稀釋級兩個平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上用稀釋液代替供試液同法操作進行陰性對照試驗2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查01需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告的依據(jù)03如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)02取最髙的平均菌落數(shù)，計算lg、lml或10cm2供試品中所含的微生物數(shù)（3）供試品的檢查—平皿法菌數(shù)報告規(guī)則2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查（3）供試品的檢查—平皿法菌數(shù)報告示例各稀釋級需氧菌總數(shù)平均菌落計數(shù)（cfu）菌數(shù)報告數(shù)（cfu/g，ml，10cm2）

1:10

1:1006486404206464000.50<10（3）供試品的檢查—薄膜過濾法操作流程2.

操作過程第二節(jié)微生物總數(shù)檢查重點強調(diào)：①用稀釋液代替供試液同法操作進行陰性對照試驗②計數(shù)時每張濾膜上的菌落數(shù)應不超過100cfu，否則做進一步的10遞增倍稀釋供試品10g10ml100cm2稀釋液1:10供試液10ml1個平皿1個平皿15-20ml/皿胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30~35℃

培養(yǎng)3~5天計數(shù)15-20ml/皿沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20~25℃

培養(yǎng)5~7天過濾器結果報告10ml過濾沖洗濾膜取下濾膜菌面朝上菌數(shù)報告規(guī)則：以相當于lg、lml或10cm2供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以＜1報告菌數(shù)或＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)3.

結果判斷第二節(jié)微生物總數(shù)檢查重點強調(diào)：①需氧菌總數(shù)是胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)(包括真菌菌落數(shù))；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)(包括細菌菌落數(shù)）②若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細菌使霉菌和酵母菌的計數(shù)結果不符合度要求，可使用含抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進行霉菌和酵母菌總數(shù)測定符合規(guī)定兩項檢査結果均符合該品種項下的規(guī)定A不符合規(guī)定B其中任一項不符合該品種項下的規(guī)定限度標準解析101cfu：最大限度為20102cfu：最大限度為200103cfu：最大限度為2000依此類推控制菌檢查第三節(jié)第五章微生物限度檢查法第三節(jié)控制菌檢查重點強調(diào)：供試品的控制菌檢查按一次檢出結果為準，不再復試控制菌（致病菌）檢查項目耐膽鹽革蘭陰性菌大腸埃希菌沙門菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌梭菌白念珠菌第三節(jié)控制菌檢查重點強調(diào)：控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查項目包括：培養(yǎng)基的促生長、抑制能力和指示特性（1）培養(yǎng)基的適用性檢查

所用菌種

1金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌大腸埃希菌乙型副傷寒沙門菌白念珠菌生孢梭菌2

菌液制備

參照教材3陰性對照培養(yǎng)基中不加陽性對照菌，其余同“適用性檢查操作”4

適用性檢查

檢查所用的菌株及檢測項目見表5-5；方法參照教材1.

培養(yǎng)基的適用性檢查與檢查方法的適用性試驗1.

培養(yǎng)基的適用性檢查與檢查方法的適用性試驗第三節(jié)控制菌檢查重點強調(diào)：控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查項目包括：培養(yǎng)基的促生長、抑制能力和指示特性（2）檢查方法的適用性試驗檢查方法及流程同“微生物計數(shù)法適用性檢查”所用陽性對照菌液不同結果判斷不同：控制菌檢查用培養(yǎng)基制藥檢出陽性對照菌即可判為無抑菌性2.

對照試驗第三節(jié)控制菌檢查陽性對照試驗重點強調(diào)：所有控制菌檢查均需做陽性對照和陰性對照試驗對照試驗目的：檢查供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜操作：同供試品操作，僅加入了不超過100cfu的陽性對照菌結果要求：應呈陽性陰性對照試驗目的：檢查操作環(huán)境、試驗物品、操作技術是否無菌操作：用稀釋劑代替供試品，其余同供試品。結果要求：應呈陰性3.

耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查第三節(jié)控制菌檢查重點強調(diào)：《中國藥典》（2015年版）用“耐膽鹽格蘭陰性菌檢查”取代2010年版藥典的“大腸菌群檢查”有菌生長（陽性）供試液制備及預培養(yǎng)供試品胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1:10供試液20~25℃培養(yǎng)2小時培養(yǎng)物定性試驗劃線接種預培養(yǎng)物1ml接種30~35℃24~48h紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板30~35℃18~24h定量試驗劃線接種分別接種腸道菌增菌液體培養(yǎng)基30~35℃24~48h紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板30~35℃18~24h腸道菌增菌液體培養(yǎng)基預培養(yǎng)物0.1/0.01/0.001ml結果判斷無菌生長（陰性）查表確定可能的菌數(shù)觀察平板有無菌落生長有菌生長4.

大腸埃希菌的檢查第三節(jié)控制菌檢查重點強調(diào)：所有口服制劑均需做這個項目的檢查結果判斷有菌生長（陽性）供試液制備及增菌培養(yǎng)供試品稀釋液1:10供試液胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物選擇培養(yǎng)預培養(yǎng)物1ml接種100ml麥康凱液體培養(yǎng)基42~44℃24~48h分離培養(yǎng)劃線接種麥康凱瓊脂平板30~35℃18~72h麥康凱液體培養(yǎng)物觀察無菌生長（陰性）分離、純化及進一步的鑒定試驗30~35℃18~24h麥康凱液體培養(yǎng)物未檢出1ml5.

沙門菌的檢查第三節(jié)控制菌檢查選擇培養(yǎng)供試液制備及增菌培養(yǎng)供試品10g/10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基預培養(yǎng)物預培養(yǎng)物0.1ml接種10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)劃線接種木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板30~35℃18~48h沙門增菌液體培養(yǎng)物觀察結果判斷若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面為紅色、底層為黃色或斜面為黃色、底層為黃色或黑色，應進行適宜鑒定試驗，確證是否為沙門菌30~35℃18~24h沙門增菌液體培養(yǎng)物若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上沒有菌落生長，或有菌落生長但鑒定結果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌18~24h30~35℃高層穿刺接種疑似菌落三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面培養(yǎng)18~24h6.

銅綠假單胞菌的檢查第三節(jié)控制菌檢查供試液制備及增菌培養(yǎng)供試品稀釋液1:10供試液胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物選擇和分離培養(yǎng)預培養(yǎng)物1ml劃線接種溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板30~35℃18~72h氧化酶試驗無菌玻棒潔凈濾紙片平板菌落滴加新配制的1%二鹽酸N，N-二甲基對苯二胺試液結果判斷30~35℃18~24h觀察平板有無菌落生長有菌生長凃于30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽性，應進行適宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌若平板上沒