《食品商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)熱穩(wěn)定CO2傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)控呼吸信號(hào)法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明一、背景簡(jiǎn)況及任務(wù)來(lái)源1.背景簡(jiǎn)況商業(yè)無(wú)菌是罐頭食品、瓶裝即食燕窩、UHT（超高溫瞬時(shí)滅菌）乳、調(diào)制乳等采用特定的工藝處理的產(chǎn)品，以達(dá)到商業(yè)無(wú)菌的狀態(tài)。根據(jù)GB4789.26-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)商業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)》對(duì)商業(yè)無(wú)菌的定義為“食品經(jīng)過(guò)適度的熱殺菌,不含有致病性微生物，也不含有在通常溫度下能在其中繁殖的非致病性微生物的狀態(tài)。”。國(guó)際上通行的對(duì)于“商業(yè)無(wú)菌”的定義為“商業(yè)無(wú)菌是指在正常的非冷藏條件下，食品中沒(méi)有能夠在其中生長(zhǎng)的微生物，在制造、分銷和儲(chǔ)存過(guò)程中也沒(méi)有微生物生長(zhǎng)”。食品在高溫后（135°C–150°C）在極短的時(shí)間（3-5s）下處理后，無(wú)菌灌裝到各種類型的包裝中，包括紙板箱、塑料瓶和鋁箔包裝。UHT加工和無(wú)菌灌裝物旨在達(dá)到商業(yè)無(wú)菌，但是微生物污染可以發(fā)生在生產(chǎn)過(guò)程的每個(gè)階段。例如，熱處理不足或原料被微生物高度污染都有可能導(dǎo)致食品變質(zhì)，不恰當(dāng)?shù)那鍧嵑拖炯庸ず凸嘌b設(shè)備、或有缺陷的包裝，都可能導(dǎo)致食品加工后污染，特別是嗜高溫和中溫形成芽孢微生物引起的食品污染最為常見(jiàn)。熱處理最初用于罐頭食品，后來(lái)擴(kuò)展到各種食品。在超高溫（UHT）下加工和無(wú)菌灌裝的即食產(chǎn)品因其便利性而被消費(fèi)者所廣泛接受。滅菌和無(wú)菌灌裝是生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，食品企業(yè)經(jīng)營(yíng)者必須通過(guò)一定的方式證明產(chǎn)品是商業(yè)無(wú)菌，.通常用于證明商業(yè)無(wú)菌的方法起源于罐頭行業(yè)，方法繁瑣且耗時(shí)。例如，我國(guó)現(xiàn)行有效的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.26-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)商業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)》對(duì)于商業(yè)無(wú)菌項(xiàng)目的檢驗(yàn)采用傳統(tǒng)的保溫方法，需要在36°C±1°C條件下罐頭食品需要10天保溫，UHT乳需要7天保溫，再進(jìn)行感官檢查、pH測(cè)定和涂片染色鏡檢等多個(gè)步驟來(lái)進(jìn)行檢測(cè)判斷，整體的檢測(cè)流程較復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間久。這種冗長(zhǎng)的檢測(cè)周期給相關(guān)產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了顯著挑戰(zhàn)：?對(duì)食品生產(chǎn)企業(yè)而言：產(chǎn)品需在倉(cāng)庫(kù)中等待檢驗(yàn)結(jié)果合格后方可出廠，占用了大量庫(kù)存空間，商品放貨速率慢、延長(zhǎng)了資金周轉(zhuǎn)周期，增加了企業(yè)的運(yùn)營(yíng)成本和市場(chǎng)響應(yīng)壓力、也不利于企業(yè)的質(zhì)量管理和生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)。。?對(duì)監(jiān)管而言：在市場(chǎng)抽檢和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中，傳統(tǒng)方法時(shí)效性差，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)和控制潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。?對(duì)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新而言：漫長(zhǎng)的檢測(cè)周期限制了新產(chǎn)品研發(fā)和上市的速度。針對(duì)各種食品而言，團(tuán)標(biāo)制定的必要性、迫切性食顯而易見(jiàn)的：1）、即食燕窩、魚膠、海參等需要復(fù)雜的前處理后采用多段式燉煮殺菌技術(shù)，采用121℃/16分鐘的滅菌條件，達(dá)到商業(yè)無(wú)菌狀態(tài)?。實(shí)驗(yàn)證明在121℃/16分鐘的滅菌條件下，燕窩唾液酸的保留率仍高達(dá)95%以上，產(chǎn)品中仍然有殘留未能滅活的芽孢桿菌。2）、UHT乳和采用無(wú)菌工藝的調(diào)制乳的生產(chǎn)工藝：：將處理后的牛乳在135～150攝氏度下加熱2～5秒，進(jìn)行超高溫瞬時(shí)滅菌，以完全破壞其中可以生長(zhǎng)的微生物和芽孢。但是有些耐熱芽孢桿菌，如耐熱芽孢桿菌（Bacillussporothermodurans）和嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillusstearothermophilus）是已知能夠耐受150℃高溫5秒殺菌的芽孢桿菌，能夠在極端高溫下存活。在國(guó)標(biāo)法規(guī)定的保溫溫度36°C下保溫7天后檢測(cè)一旦漏檢，就會(huì)在質(zhì)保期內(nèi)緩慢萌發(fā)并生長(zhǎng)，使產(chǎn)品變質(zhì)。調(diào)制乳中添加了調(diào)節(jié)風(fēng)味或功能性的成分，這些成分有時(shí)候?qū)ξ⑸锲鸬奖Ｗo(hù)作用，使殺菌效率大大降低，產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)更大，但是熱損傷的微生物在傳統(tǒng)方法的檢驗(yàn)周期內(nèi)沒(méi)有表現(xiàn)出常見(jiàn)的微生物繁殖的產(chǎn)物和感官特征，如不產(chǎn)酸不結(jié)塊，從而導(dǎo)致感官檢測(cè)失效。以上兩個(gè)行業(yè)存在的共性問(wèn)題：? 傳統(tǒng)方法檢測(cè)時(shí)效性差：長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)觀察導(dǎo)致企業(yè)生產(chǎn)計(jì)劃靈活性不足，錯(cuò)過(guò)市場(chǎng)時(shí)機(jī)，難以滿足企業(yè)對(duì)產(chǎn)品快速放行和質(zhì)量實(shí)時(shí)監(jiān)控的需求。?針對(duì)性不足：傳統(tǒng)方法未充分考慮燕窩和UHT乳的產(chǎn)品特性，檢測(cè)準(zhǔn)確性和適用性受限。?成本壓力大：長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)消耗大量資源，增加企業(yè)檢測(cè)、庫(kù)存等運(yùn)營(yíng)成本。在此背景下，很多知名大型食品企業(yè)希望在得到準(zhǔn)確可靠結(jié)果的前提下縮短商業(yè)無(wú)菌項(xiàng)檢測(cè)周期，以提高食品的周轉(zhuǎn)率，減少庫(kù)存時(shí)間，以提高生產(chǎn)效率。因此，開(kāi)發(fā)和應(yīng)用快速、準(zhǔn)確的商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)技術(shù)成為行業(yè)的迫切需求。使用熱穩(wěn)定CO2傳感技術(shù)監(jiān)控呼吸信號(hào)法作為一種新興的微生物檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)監(jiān)測(cè)微生物呼吸代謝產(chǎn)生的CO2，能夠在24-36小時(shí)內(nèi)快速判斷樣品的微生物污染情況，在保證準(zhǔn)確性的同時(shí)，極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，具有巨大的應(yīng)用潛力。2.任務(wù)來(lái)源為響應(yīng)食品行業(yè)對(duì)商業(yè)無(wú)菌快速檢測(cè)技術(shù)的迫切需求，推動(dòng)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步與標(biāo)準(zhǔn)化，2024年10月，上海美凱純生物科技有限公司與中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)接洽，提出申請(qǐng)《熱穩(wěn)定CO2傳感器實(shí)時(shí)檢測(cè)呼吸信號(hào)法商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)方法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的意向，2025年3月，協(xié)會(huì)組織會(huì)議，上海美凱純向中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)介紹了國(guó)內(nèi)燕窩、魚膠、海參等健康產(chǎn)業(yè)和乳品行業(yè)商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)的相關(guān)情況，以及標(biāo)準(zhǔn)制定工作的必要性和迫切性。2205年6月，中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)進(jìn)出口食品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)同意《食品商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)熱穩(wěn)定CO2傳感技術(shù)實(shí)時(shí)檢測(cè)法--呼吸信號(hào)法》（團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)）提案申請(qǐng)。并于2025年6月20日，在協(xié)會(huì)召開(kāi)《食品商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)熱穩(wěn)定CO2傳感技術(shù)實(shí)時(shí)檢測(cè)法--呼吸信號(hào)法》立項(xiàng)評(píng)估會(huì)，上海美凱純生物科技有限公司作為起草單位參加會(huì)議，接受專家質(zhì)詢?cè)u(píng)審。該標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)已于2025年7月22日經(jīng)中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)正式批準(zhǔn)立項(xiàng)（立項(xiàng)編號(hào)：P/CIOA-239-2025），并成立了多家行業(yè)內(nèi)領(lǐng)先的食品生產(chǎn)企業(yè)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)共同組成的標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，由上海美凱純生物科技有限公司和中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)進(jìn)出口食品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)為組長(zhǎng)單位，正式啟動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)的研制工作。工作組認(rèn)真查閱相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)內(nèi)外技術(shù)資料，進(jìn)行了大量研究分析、資料查證工作，結(jié)合試劑應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上，編制出《食品商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)熱穩(wěn)定CO2傳感器實(shí)時(shí)檢測(cè)法--呼吸信號(hào)法團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)》標(biāo)準(zhǔn)草案初稿和編制說(shuō)明。2025年7-9月，邀請(qǐng)中檢科（北京）測(cè)試技術(shù)有限公司，沈陽(yáng)海關(guān)技術(shù)中心，浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院3個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了協(xié)同驗(yàn)證試驗(yàn)，9月匯總驗(yàn)證數(shù)據(jù)形成了靈敏度和包容性、檢測(cè)限LOD95的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)報(bào)告。經(jīng)工作組專家研討后，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案初稿進(jìn)行了認(rèn)真的修改，于2025年11月形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿及其編制說(shuō)明等相關(guān)附件，報(bào)中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)進(jìn)出口食品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)秘書處（該實(shí)驗(yàn)報(bào)告與征求意見(jiàn)正在進(jìn)行中）3、主要參加的單位和工作組成員及其所作工作：本標(biāo)準(zhǔn)由上海美凱純生物科技有限公司、廈門燕之屋絲濃食品有限公司、河北省產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)中心、廈門海關(guān)技術(shù)中心、中檢科（北京）測(cè)試技術(shù)有限公司、浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院、沈陽(yáng)海關(guān)技術(shù)中心、君樂(lè)寶乳業(yè)集團(tuán)、南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司、伊利乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司、山東熊貓乳業(yè)集團(tuán)、燕鴻基健康美（廈門）食品有限公司、北大荒完達(dá)山乳業(yè)有限公司、山西牧同乳業(yè)有限公司、上海天噯生物科技有限公司、山西九牛牧業(yè)有限公司起草。徐敦明主持全面協(xié)調(diào)工作，負(fù)責(zé)對(duì)個(gè)階段標(biāo)準(zhǔn)的審核；李雁鵬為本標(biāo)準(zhǔn)的主要執(zhí)筆人，負(fù)責(zé)本標(biāo)準(zhǔn)的具體起草與編制；張耀廣、范群艷負(fù)責(zé)國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)和資料的收集、分析及資料查證，柳訓(xùn)才、李飛對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、性能和使用經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)和歸納。廖江、呂新峰負(fù)責(zé)對(duì)國(guó)內(nèi)外產(chǎn)品和技術(shù)的現(xiàn)狀與發(fā)展情況進(jìn)行全面調(diào)研，袁莉紅、李小偉負(fù)責(zé)對(duì)各方面的意見(jiàn)及建議進(jìn)行歸納和整理。二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則本次在標(biāo)準(zhǔn)的編制過(guò)程中，起草工作組始終堅(jiān)持以下基本原則：1.科學(xué)性原則：標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)內(nèi)容建立在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈墨I(xiàn)查證和驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)之上。由于商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)方法的特殊性，目前已有的方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)或驗(yàn)證指南，例如GB4789.45-2023食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證通則、ISO16140-2，AOAC驗(yàn)證指南等無(wú)法用于指導(dǎo)商業(yè)無(wú)菌替代方法的驗(yàn)證。本驗(yàn)證方案參照發(fā)表在FoodControl雜志的文獻(xiàn)《Validationprotocolforcommercialsterilitytestingmethods》，發(fā)表機(jī)構(gòu)為瑞士雀巢研究院食品安全部門（DepartmentofFoodSafetyResearch,NestléResearch,CH-1000,Lausanne,Switzerland）。根據(jù)該文獻(xiàn)，對(duì)于商業(yè)無(wú)菌替代方法需要驗(yàn)證的指標(biāo)有：包容性和方法檢出限（LOD95）。工作組根據(jù)GB4789.45-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)驗(yàn)證方法》、GB4789.26-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)商業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)》進(jìn)行了參考方法的實(shí)驗(yàn)。對(duì)熱穩(wěn)定CO2傳感器法的檢測(cè)限、包容性、假陰性率等關(guān)鍵性能指標(biāo)進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估，并與傳統(tǒng)培養(yǎng)法（參考方法）進(jìn)行了比對(duì)，確保該方法的科學(xué)性和可靠性。2.先進(jìn)性原則：本標(biāo)準(zhǔn)采納了國(guó)際先進(jìn)的微生物快速檢測(cè)技術(shù)，旨在替代或補(bǔ)充傳統(tǒng)耗時(shí)又不完全可靠的保溫感官檢測(cè)法和具有局限性的平皿培養(yǎng)法，體現(xiàn)了微生物快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的方向，符合現(xiàn)代化、智能化的產(chǎn)業(yè)升級(jí)趨勢(shì)。3.適用性原則：標(biāo)準(zhǔn)緊密圍繞即食精燉燕窩等健康產(chǎn)品、UHT乳、調(diào)制乳產(chǎn)品的物理化學(xué)特性（如粘度、營(yíng)養(yǎng)成分、固形物、可能存在的耐熱菌等），對(duì)樣品前處理、檢測(cè)參數(shù)設(shè)置、結(jié)果判讀等環(huán)節(jié)進(jìn)行了針對(duì)性的規(guī)定，確保標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)際應(yīng)用中具有高度的可操作性和適用性。結(jié)核我國(guó)的企業(yè)和檢驗(yàn)行業(yè)的實(shí)際需求情況，對(duì)方法進(jìn)行深入詳細(xì)的研究和實(shí)驗(yàn)，邀請(qǐng)各企業(yè)和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證和征求意見(jiàn)。充分體現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)在技術(shù)上的合理性。4.協(xié)調(diào)性原則：本標(biāo)準(zhǔn)作為對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.26的補(bǔ)充和快速篩查手段，在術(shù)語(yǔ)定義、結(jié)果判定邏輯等方面與現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)要求保持協(xié)調(diào)一致，避免產(chǎn)生歧義和沖突。5.規(guī)范性原則：本次標(biāo)準(zhǔn)的編寫格式和表述嚴(yán)格遵守中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵守GB/T1.1-20009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的規(guī)定進(jìn)行編寫，確保標(biāo)準(zhǔn)文本結(jié)構(gòu)清晰、用語(yǔ)準(zhǔn)確、邏輯嚴(yán)謹(jǐn)。三、主要內(nèi)容說(shuō)明：1、標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容1.1原理依據(jù)：檢測(cè)原理：基于微生物的呼吸代謝產(chǎn)物體包括CO?和酸，利用熱穩(wěn)定傳感技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)呼吸代謝產(chǎn)物引起的傳感器光學(xué)信號(hào)的變化。當(dāng)目標(biāo)微生物在檢測(cè)管中生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物會(huì)引起檢測(cè)管中感光試劑的光譜模式和化學(xué)特性發(fā)生變化，同時(shí)也與監(jiān)測(cè)設(shè)備中的光源的光譜趨于一致。光傳感器實(shí)時(shí)檢測(cè)到這些變化，并表達(dá)給計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，通過(guò)運(yùn)算法則完成對(duì)樣品中微生物的檢測(cè)和分析。而當(dāng)樣品中沒(méi)有活菌時(shí)，檢測(cè)管的光譜模式始終不會(huì)發(fā)生變化，監(jiān)測(cè)系統(tǒng)會(huì)判定樣品為商業(yè)無(wú)菌。檢測(cè)流程：規(guī)范燕窩、魚膠和UHT乳、滅菌乳樣品采集、前處理、加樣與檢測(cè)、溫度設(shè)置、數(shù)據(jù)采集與分析、結(jié)果判定等全流程操作。設(shè)備與試劑：明確熱穩(wěn)定呼吸信號(hào)傳感檢測(cè)設(shè)備性能指標(biāo)，以及檢測(cè)所需試劑的質(zhì)量要求與配制方法。質(zhì)量控制：建立針對(duì)該技術(shù)的質(zhì)量控制體系，包括標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)、重復(fù)性試驗(yàn)、儀器校準(zhǔn)等要求。2、方法驗(yàn)證即食燕窩、UHT乳和采用滅菌工藝生產(chǎn)的調(diào)制乳。驗(yàn)證的食品類型見(jiàn)表1。表1方法驗(yàn)證食品信息食品類型pH食品類型描述包裝形式備注UHT乳液體乳錫箔紙包裝（利樂(lè)枕）巧克力牛奶調(diào)制乳塑料即食燕窩含有燕窩成分≥5%玻璃3、驗(yàn)證步驟：3.1驗(yàn)證所選產(chǎn)品類型是否符合商業(yè)無(wú)菌選用PCA固體平板培養(yǎng)基，表面接種100ul樣品，每個(gè)樣品接種2個(gè)平板，用L棒涂勻整個(gè)平板，30°C±1°C，培養(yǎng)3天、5天和7天；同時(shí)用BioFirst方法進(jìn)行檢測(cè)，按照產(chǎn)品說(shuō)明書操作。3.2包容性對(duì)于商業(yè)無(wú)菌替代方法，方法包容性只應(yīng)考慮能夠在相應(yīng)類別食品中生長(zhǎng)的微生物。因此，在商業(yè)無(wú)菌替代方法評(píng)價(jià)中包容性是一個(gè)重要的驗(yàn)證指標(biāo)。用于包容性驗(yàn)證的菌株主要選擇腐敗微生物，包括形成芽孢的菌株和不形成芽孢的菌株；根據(jù)BioFirst的方法原理選擇好氧微生物。本驗(yàn)證使用的菌株名單見(jiàn)表2。表2方法包容性驗(yàn)證所使用菌株11-63蕈狀芽孢桿菌BacillusMycoidesCMCC(B)6354921-65巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium31-66枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis.lactisCMCC(B)6354241-67沙門氏菌腸亞種傷寒血清型SalmonellaEntericaSubsp.EntericaSerovarTyphiCMCC(B)5007151-68福氏志賀氏菌ShigellaFlexneriCMCC(B)5157261-69奇異變形菌ProteusmirabilisCMCC(B)4900571-70普通變形菌ProeusvulgaisCMCC(B)4902781-72腸沙門氏菌腸亞種Salmonellaentericasubsp.EutericaCMCC(B)5033591-73肺炎克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeCMCC(B)46117101-75宋內(nèi)氏志賀氏菌ShigellasonneiCMCC(B)51592111-76英諾克李斯特氏菌ListeriainnocuaCMCC(B)54103121-77臘樣芽孢桿菌BacilluscereusCMCC(B)63303131-78痢疾志賀氏菌ShigellaDysenteriaeCMCC(B)51105141-80克羅諾桿菌Cronobacterbaumannii151-82單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ListeriamonocytogenesCMCC(B)54012161-83釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeCMCC(B)9801717金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCICC2160018藤黃微球菌MicrococcusluteusCMCC2800119糞腸球菌EnterococcusfaecalisATCC2501920銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaCICC2163621白色念珠菌/白色假絲酵母CandidaalbicansCICC3238022植物乳桿菌LactobacillusplantarumCICC607423嗜熱芽孢桿菌

分類名稱變更嗜熱西米諾維奇氏菌SiminovitchiathermophilaBacillusthermophilus24巨大芽孢桿菌企業(yè)分離株3.2.1菌株活化從-80°C冰箱取出的保藏菌株，芽孢桿菌、葡萄球菌、微球菌、腸桿菌科和假單胞菌接種BHI培養(yǎng)基（BHI；Oxoid）在30°C±1°C下培養(yǎng)24小時(shí)。乳酸菌接種在MRS培養(yǎng)基。（MRS；Oxoid）在37°C±1°C培養(yǎng)24小時(shí)。酵母接種PCA培養(yǎng)基（MEB或者PCA，Oxoid）分別在25°C±1°C下培養(yǎng)72小時(shí)和5天，每種微生物活化2次。首先，確定所選菌株39°C是否能生長(zhǎng)，將表1活化后的菌株接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中，39°C條件下，培養(yǎng)48h，酵母培養(yǎng)72h±3h。腐敗菌和酵母接種液體培養(yǎng)基或者將菌苔懸于生理鹽水中，旋渦混勻，用比濁計(jì)確定菌懸液的濃度，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，選取10-4--10-8進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。3.2.2計(jì)數(shù)腐敗菌在PCA固體培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)，39°C培養(yǎng)24h±2h；乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)，39°C培養(yǎng)48h±2h；酵母在PDA培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)39°C培養(yǎng)72h±3h。菌落計(jì)數(shù)的目的用于確定包容性的接種量，以及用于LOD95選擇接種梯度的參考。3.2.3接種接種BioFirst培養(yǎng)基，按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作，接種量為103-104CFU/mL。記錄每一種微生物的生長(zhǎng)的情況。檢出限（LOD95）檢出限（LOD95）的測(cè)定采用陽(yáng)性菌株的添加到樣品基質(zhì)中的方法，每種樣品接種三種不同微生物，一種產(chǎn)芽孢的微生物（Bacillus）代表用于熱處理失敗而引起的污染，兩個(gè)不產(chǎn)芽孢微生物，代表產(chǎn)品后處理造成的污染。用于檢出限LOD95測(cè)試的菌株見(jiàn)表3。表3用于檢出限LOD95測(cè)試的菌株序號(hào)菌株中文名稱拉丁文菌株號(hào)來(lái)源1巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium企業(yè)自分離2枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis.lactisCMCC(B)635423單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ListeriamonocytogenesCMCC(B)54012將過(guò)夜培養(yǎng)物大約108CFU/mL用食品樣品進(jìn)行梯度稀釋到10-8，一個(gè)未接種的樣品作為陰性對(duì)照（接種樣品作為陰性對(duì)照），將106-100CFU/mL，以及陰性樣品對(duì)照接種BioFirst培養(yǎng)基，按照產(chǎn)品說(shuō)明書操作。記錄24小時(shí)、48小時(shí)和的生長(zhǎng)情況。3.4協(xié)同驗(yàn)證3家協(xié)同驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行了兩種產(chǎn)品的協(xié)同驗(yàn)證。三家實(shí)驗(yàn)室分別是：實(shí)驗(yàn)室1：中檢科（北京）測(cè)試技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)室2：沈陽(yáng)海關(guān)技術(shù)中心；實(shí)驗(yàn)室3：浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院3.5驗(yàn)證結(jié)論：1.方法包容性驗(yàn)證：所選取的24株微生物在BioFirstBFS-TCD商業(yè)無(wú)菌增菌管生長(zhǎng)良好，20株菌在BioFirst實(shí)時(shí)微生物熒光光電快速檢測(cè)儀給出陽(yáng)性結(jié)果時(shí)間在12h以內(nèi)，酵母菌、藤黃微球菌和植物乳植桿菌給出陽(yáng)性結(jié)果時(shí)間在18~24h左右；2.LOD95檢出限：BioFirst實(shí)時(shí)微生物熒光光電快速檢測(cè)儀作為商業(yè)無(wú)菌的快速檢測(cè)方法其方法檢出限LOD95＜1log10CFU/mL。3.檢測(cè)時(shí)間：在方法檢出限LOD95給出陽(yáng)性結(jié)果時(shí)間在19小時(shí)以內(nèi)（依據(jù)本次驗(yàn)證LOD95檢出限的最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間），與“GB4789.26-2023食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)商業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)”需要培養(yǎng)10天相比，極大的縮短了檢測(cè)時(shí)間。四、主要實(shí)驗(yàn)情況：本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)是2025年7-9月由3個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)兩個(gè)品牌的精燉燕窩、兩個(gè)品牌的UHT如和調(diào)制乳樣品進(jìn)行測(cè)試的。該測(cè)試是在GB4789.45-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)驗(yàn)證方法》、GB4789.26-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)商業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)》方法規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)列表如下：包容性驗(yàn)證結(jié)果表4包容性驗(yàn)證結(jié)果序號(hào)菌株中文名拉丁文菌株編號(hào)39℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)儀器檢出時(shí)間（小時(shí)）1巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium/企業(yè)自分離株生長(zhǎng)6.32枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis.lactisATCC6633生長(zhǎng)6.73蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusCICC21261生長(zhǎng)5.34單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ListeriamonocytogenesCICC21633生長(zhǎng)11.25英諾克李斯特氏菌ListeriainnocuaCICC10417生長(zhǎng)11.66腸沙門氏菌腸亞種嬰兒血清型Salmonellaentericasubsp.EntericaserovarInfantisCICC21482生長(zhǎng)6.67金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCICC21600生長(zhǎng)7.08銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaCICC21636生長(zhǎng)7.49阪崎克洛諾斯桿菌(阪崎克羅諾桿菌)CronobactersakazakiiCICC21544生長(zhǎng)6.410糞腸球菌EnterococcusfaecalisCICC25019生長(zhǎng)6.411藤黃微球菌MicrococcusluteusCMCC(B)28001生長(zhǎng)23.412植物乳植桿菌LactiplantibacillusplantarumCICC6076生長(zhǎng)18.813蕈狀芽孢桿菌BacillusMycoidesCMCC(B)63549生長(zhǎng)1.914巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumACCC10245生長(zhǎng)4.315沙門氏菌（腸亞種傷寒血清型）SalmonellaEntericaSubsp.EntericaSerovarTyphiCMCC(B)50071生長(zhǎng)4.916福氏志賀氏菌ShigellaFlexneriCMCC(B)51572生長(zhǎng)5.417奇異變形菌ProteusmirabilisCMCC(B)49005生長(zhǎng)4.518普通變形菌ProeusvulgaisCMCC(B)49027生長(zhǎng)2.119肺炎克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeCMCC(B)46117生長(zhǎng)5.020宋內(nèi)氏志賀氏菌ShigellasonneiCMCC(B)51592生長(zhǎng)5.721痢疾志賀氏菌ShigellaDysenteriaeCMCC(B)51105生長(zhǎng)5.522大腸埃希氏菌EscherichiacoliATCC25922生長(zhǎng)4.523白假絲酵母CandidaalbicansCICC32380生長(zhǎng)17.924釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeATCC9763生長(zhǎng)24.82、檢測(cè)限（LOD95）驗(yàn)證結(jié)果匯總3家實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)下表。實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證結(jié)果數(shù)據(jù)匯總按基質(zhì)分類序號(hào)菌株名稱稀釋梯度樣品基質(zhì)燕窩實(shí)驗(yàn)室11小仙燉實(shí)驗(yàn)室21燕之屋實(shí)驗(yàn)室31小仙燉儀器檢出時(shí)間h平板計(jì)數(shù)結(jié)果CFU/mL儀器檢出時(shí)間h平板計(jì)數(shù)結(jié)果儀器檢出時(shí)間h平板計(jì)數(shù)結(jié)果CFU/mLCFU/mL1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌-9未檢出3/0315818.81/042-815.12012.88618.98/73-713.219411.2TNTC15.478/814-611.1TNTC29.6TNTC13.5TNTC5-59.3TNTC7.6TNTC11.4TNTC1巨大芽孢桿菌-9未檢出0未檢出0未檢出0/02-8未檢出07.73未檢出0/03-77.956156.97/64-66.5495.41256.634/315-55.8TNTC4.4TNTC5.6TNTC1枯草芽孢桿菌-99.518.21未檢出0/02-88.857.13未檢出0/03-78.1476.532未檢出1/04-67.1TNTC5.42238.117/145-56.1TNTC4.5TNTC7.2117/129序號(hào)菌株名稱稀釋梯度樣品基質(zhì)UHT乳實(shí)驗(yàn)室1君樂(lè)寶UHT乳實(shí)驗(yàn)室2南京衛(wèi)崗UHT乳儀器檢出時(shí)間h平板計(jì)數(shù)結(jié)果CFU/mL儀器檢出時(shí)間h平板計(jì)數(shù)結(jié)果CFU/mL1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌-918.2416.732-816.93114.7513-713.930012TNTC4-612.5TNTC10.1TNTC5-59.2TNTC8.2TNTC1巨大芽孢桿菌-9未檢出0未檢出02-810.715.833-7765.4204-66.4444.6985-55.7TNTC3.9TNTC1枯草芽孢桿菌-99.11未檢出02-8887.423-77856.3194-66.2TNTC51155-55.4TNTC3.9TNTC序號(hào)菌株名稱稀釋梯度樣品基質(zhì)調(diào)制乳實(shí)驗(yàn)室1南京衛(wèi)崗高鈣乳實(shí)驗(yàn)室3君樂(lè)寶調(diào)制乳儀器檢出時(shí)間h平板計(jì)數(shù)結(jié)果CFU/mL儀器檢出時(shí)間h平板計(jì)數(shù)結(jié)果CFU/mL1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌-915.4413.11/12-8143417.88/53-711.9TNTC14.797/844-610.4TNTC13.1TNTC5-58.4TNTC10.9TNTC1巨大芽孢桿菌-9未檢出0未檢出0/02-8未檢出0未檢出0/03-77.278.21/04-66.7526.69/115-55.6TNTC5.7123/1411枯草芽孢桿菌-98.81未檢出0/02-88.57未檢出0/03-77.97313.52/14-