1.提取目基因:

既從人DNA中提取胰島素基因,可使用限制性?xún)?nèi)切酶將目基因從原DNA中分離.

2.提取質(zhì)粒：

使用細(xì)胞工程，培養(yǎng)大腸桿菌，從大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中提取質(zhì)粒，質(zhì)粒為環(huán)狀DNA.

3.基因重組：

取出目基因與質(zhì)粒，先運(yùn)用同種限制性?xún)?nèi)切酶將質(zhì)粒切開(kāi),再使用DNA連接酶將

目基因與質(zhì)?！翱p合”，形成一種能表達(dá)出胰島素DNA質(zhì)粒.

4.將質(zhì)粒送回大腸桿菌：

再大腸桿菌培養(yǎng)液中加入具有Ca+物質(zhì)，如CaCI2,這使細(xì)胞會(huì)吸取外源基因.此

時(shí)將重組質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中，大腸桿菌便會(huì)將重組質(zhì)粒吸取.

5.胰島素產(chǎn)生：

再大腸桿菌內(nèi)，質(zhì)粒通過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄與翻譯后，便產(chǎn)生出胰島素蛋白質(zhì).通過(guò)大腸桿

菌大量繁衍，便可大量生產(chǎn)出胰島素！

K學(xué)習(xí)規(guī)定》懂得DNA粗提取與鑒定原理；掌握并能分析DNA粗提取技術(shù)辦法和

規(guī)定；學(xué)會(huì)DNA分子鑒定辦法

【預(yù)習(xí)指引】在課前時(shí)間通過(guò)閱讀教材、同窗交流和討論，完畢下列問(wèn)題，并

初步鞏固。

一、基本知識(shí)

【活動(dòng)1］閱讀教材P54“基本知識(shí)”，討論并回答下列問(wèn)題：

1.（記憶）提取生物大分子基本思路是運(yùn)用它們理化性質(zhì)不同進(jìn)行分離。

2.（記憶）DNA溶解性特點(diǎn):

DNA在不同濃度同Cl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精而蛋廣I質(zhì)溶于酒精。

【思考1】據(jù)圖5—1分析：

DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度有何特點(diǎn)？在0.14mol/L時(shí)溶解度最?。?/p>

要使DNA溶解，需要使用什么濃度？較高濃度，可使DNA溶解；

要使DNA析出，又需要使用什么濃度?0.14mol/L可使DNA析出。

【思考2］運(yùn)用DNA不溶于酒精原理，可以達(dá)到將DNA和蛋臼質(zhì)進(jìn)一步分離目。

3.（記憶）DNA耐受性特點(diǎn)：

蛋白酶能分解蛋白質(zhì)而不能分解DNA；在60?80℃時(shí)蛋白質(zhì)變性沉淀而DNA

分子不變性。選送劑能與蛋白質(zhì)結(jié)合崩潰細(xì)胞膜而不破壞DNA分子。

4.（記憶）DNA鑒定原理

當(dāng)鑒定提取出物質(zhì)與否是DNA時(shí)，需要使用二苯胺（甲基綠）進(jìn)行鑒定。在

沸水浴條件下,該試劑與DNA反映，呈現(xiàn)（淺）藍(lán)色。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

【活動(dòng)2】閱讀教材P55“實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)”，討論并回答下列問(wèn)題：

1.（記憶）實(shí)驗(yàn)材料選用：選用材料時(shí)應(yīng)木著DNA含量高、材料易得、便于提

取原則。

【思考3］你以為教材提供材料中哺乳動(dòng)物血液K適合提取DNAo

2.（記憶）破碎細(xì)胞，獲取含DNA濾液:

雞血：向雞血細(xì)胞液中加入一定量蒸窗水并玻棒攪拌，用紗布過(guò)濾后,收集

濾液。

洋蔥：向研缽中加入一定量洗滌劑和食鹽,攪拌研磨，用紗布過(guò)濾后,收集

濾液。

【思考4】在以上實(shí)驗(yàn)中，蒸馀水作用是使血細(xì)胞大量吸水而脹裂,洗滌劑作用

是崩潰細(xì)胞膜,食鹽作用是溶解DNA物質(zhì)。

3.（學(xué)會(huì)）去除濾液中雜質(zhì)：

方案一：30mL濾液一加NaCl使DNA溶解f過(guò)濾得濾液一加蒸儲(chǔ)水使DNA析

出f過(guò)濾得過(guò)濾物放到2mol/LNaCl溶液中溶解一DNA—NaCl溶解液

方案二：30mL濾液一加嫩肉粉（木瓜蛋白酶）靜置10分鐘一得DNA源液

方案三：30mL濾液-60?67℃解決一過(guò)濾得DNA濾液

【思考5】以上三個(gè)方案原理分別是什么？

方案一原理：DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;

方案二原理：蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA；

方案三原理：DNA耐高溫而蛋白質(zhì)不耐高溫。

【思考6】方案一中：“加NaCl使DNA溶解一過(guò)濾得濾液”目是除去不溶（可

溶、不溶）于NaCl溶液中細(xì)胞雜質(zhì)；“加蒸儲(chǔ)水使DNA析出一過(guò)濾得過(guò)茂物”

目是除去可溶（可溶、不溶）于NaCl溶液中細(xì)胞雜質(zhì)。

4.（記憶）DNA析出：

DNA濾液與等體積冷卻酒糖混合，靜置一段時(shí)間后析出白色絲狀物就是DNAO

5.（記憶）DNA鑒定：

取2支干凈試管，編號(hào)甲、乙，各加入等量2mol/LNaCl溶液。甲中放入少

量白色絲狀物，使之溶解。在甲、乙試管中各加41nL二苯胺,混合均勻。沸水浴

5min,觀(guān)測(cè)顏色變化，甲試管呈現(xiàn)藍(lán)色。

三、操作提示

【活動(dòng)3】（記憶）閱讀教材P56“操作提示”和P57“課題延伸”，關(guān)注下列

注意事項(xiàng)：

1.在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固;雞血靜置或離心后除去血漿,以提高細(xì)胞

懸液濃度。

2.實(shí)驗(yàn)中使用塑料燒杯和尼龍布,以免DNA被吸附。

3.玻棒沿同一方向緩慢攪拌（細(xì)胞破裂時(shí)迅速攪拌），玻棒不要遇到燒杯壁。

4.二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.為提高DNA純度，實(shí)驗(yàn)中普通使用洗滌劑有CTAB、SDS等。

【活動(dòng)4】觀(guān)看視頻：觀(guān)看“DNA粗提取與鑒定”視頻，體會(huì)并學(xué)會(huì)有關(guān)技術(shù)辦

法。

K課后學(xué)習(xí)工

1.嘗試從植物組織中提取DNA分子。

2.基本訓(xùn)練冊(cè)：將基本知識(shí)整頓到作業(yè)本上；完畢該節(jié)訓(xùn)練題。

K學(xué)習(xí)規(guī)定》

嘗試PCR技術(shù)基本操作，體驗(yàn)PCR技術(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)辦法;理解PCR技術(shù)原理;

討論P(yáng)CR技術(shù)應(yīng)用

【預(yù)習(xí)指引】在課前時(shí)間通過(guò)閱讀教材、同窗交流和討論，完畢下列問(wèn)題，并

初步鞏固。

一、基本知識(shí)

【活動(dòng)1】閱讀教材P58"PCR原理”,討論并回答下列問(wèn)題：

1.（記憶）PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程類(lèi)似。

【思考1】填寫(xiě)下表：（記憶）細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析

條件參加組分在DNA分子復(fù)制中作用

模板DNA兩條單鏈提供復(fù)制模板

原料四種脫氧核甘酸合成DNA子鏈原料

解旋酶打開(kāi)DNA雙螺旋

RNA聚合酶合成RNA引物

酶

DNA聚合酶催化合成DNA子鏈；切除引物

DNA連接酶將不持續(xù)DNA子鏈連接起來(lái)

能量ATP為解螺旋和合成子鏈提供能量

引物RNA為DNA聚合酶提供合成3'端起點(diǎn)

2.（理解）細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制

（l）DNA構(gòu)造：脫氧核昔酸分子通過(guò)核5一磷酸二酯鍵連接形成核昔酸長(zhǎng)鏈,兩

條脫氧核甘酸長(zhǎng)鏈反向平行排列并螺旋化，形成DNA雙螺旋構(gòu)造。

（2）DNA復(fù)制：一方面，在解旋酶作用下,由ATP供能,DNA發(fā)生解旋形成兩條

DNA單鏈。另一方面，在DNA單鏈支_端，在RNA聚合酶在作用下,合成RNA

引物。再次，在DM聚合醐作用下,從引物乙端開(kāi)始合成DNA子鏈。最后，

DNA聚合酶將引物切去,并合成空缺處DNA單鏈，再由DNA連接酶將不持續(xù)

DNA子鏈連接起來(lái)。

3.（記憶）DNA分子復(fù)制人工控制

解開(kāi)螺旋：在80?100℃時(shí)，DNA雙螺旋打開(kāi)，形成兩條DNA單鏈，稱(chēng)為變性。

恢復(fù)螺旋：在50?60℃左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋構(gòu)造，稱(chēng)為復(fù)

性。

復(fù)制條件：緩沖液，DNA模板、四種脫氧核昔酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種引

物。

控制儀器：PCR儀（溫度周期性自動(dòng)調(diào)節(jié)儀）。

【思考2】緩沖液相稱(chēng)細(xì)胞內(nèi)什么成分？核液“

【活動(dòng)2】閱讀教材P59“PCR反映過(guò)程”，討論并回答下列問(wèn)題：

1.（記憶）填寫(xiě)PCR反映流程：

2.（理解）PCR反映過(guò)程是：在升溫至四。C以上時(shí)DNA解旋；在降溫至因'C左

右時(shí)引物與DNA單鏈結(jié)合；在升溫至四℃左右時(shí)合成DNA子鏈。

二、實(shí)驗(yàn)操作

【活動(dòng)3】閱讀教材P62“實(shí)驗(yàn)操作”，討論并回答下列問(wèn)題：

1.（記憶）在PCR反映體系配方中，具有成分有緩沖液、DNA模板、四種脫氧

核苦酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物、水。

2.（理解）實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)：按照PCR反映體系配方配制反映液;將PCR反映體

系50uL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5磯）中；將微量離心管放到PCR

儀中；設(shè)立PCR儀工作參數(shù);DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。

3.（理解）水浴法：將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃恒溫水浴鍋中循環(huán)

解決。

三、操作提示

【活動(dòng)4】閱讀教材P62“操作提示”，討論并回答下列問(wèn)題：

1.（記憶）避免外源DNA污染,所用儀器、緩沖液、蒸儲(chǔ)水等使用前高壓滅菌。

2.（記憶）將緩沖液和酶分裝成小份,—20℃低溫保存。

3.（記憶）每添加一種反映成分，更換一種移液器槍頭。

4.（記憶）混勻后離心解決，使反映液集中在離心管底部。

四、成果分析與評(píng)價(jià)

【活動(dòng)4】閱讀教材P63“成果分析與評(píng)價(jià)”，討論并回答下列問(wèn)題：

1.（記憶）反映液稀釋?zhuān)喝??LPCR反映液，添加98?L蒸儲(chǔ)水。

2.（記憶）分光光度計(jì)調(diào)零：將100?L蒸儲(chǔ)水添加到比魚(yú)松中，在迦