微生物檢驗(yàn)操作演練計(jì)劃一、概述

微生物檢驗(yàn)操作演練計(jì)劃旨在通過系統(tǒng)化的模擬與實(shí)踐，提升檢驗(yàn)人員對(duì)微生物樣本處理、培養(yǎng)、鑒定及結(jié)果報(bào)告等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的操作技能。本計(jì)劃結(jié)合實(shí)際工作場(chǎng)景，通過角色扮演、案例分析及標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（SOP）演練，確保檢驗(yàn)人員熟練掌握各項(xiàng)操作要求，提高工作效率與結(jié)果準(zhǔn)確性。演練內(nèi)容涵蓋實(shí)驗(yàn)室環(huán)境準(zhǔn)備、樣本接收、前處理、培養(yǎng)、觀察記錄及質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)。

二、演練目標(biāo)

（一）強(qiáng)化操作技能

1.掌握微生物樣本的正確采集與保存方法。

2.熟練執(zhí)行無菌操作技術(shù)，防止環(huán)境污染。

3.熟悉常用培養(yǎng)基的制備與滅菌流程。

4.提高菌落計(jì)數(shù)與純化分離的操作效率。

（二）規(guī)范流程執(zhí)行

1.確保樣本從接收至報(bào)告的全程符合SOP要求。

2.統(tǒng)一顯微鏡觀察與革蘭染色操作標(biāo)準(zhǔn)。

3.強(qiáng)化質(zhì)控樣本的平行檢驗(yàn)與結(jié)果復(fù)核機(jī)制。

（三）提升應(yīng)急處理能力

1.模擬污染事件時(shí)的隔離與溯源措施。

2.練習(xí)特殊樣本（如厭氧菌）的檢測(cè)流程。

三、演練準(zhǔn)備

（一）人員分工

1.確定主檢人、記錄員及輔助操作員職責(zé)。

2.對(duì)參與人員進(jìn)行操作前培訓(xùn)，明確演練步驟。

（二）物資準(zhǔn)備

1.培養(yǎng)基：準(zhǔn)備肉湯培養(yǎng)基、瓊脂平板（如TSB、MAC瓊脂）各20份，需標(biāo)明批號(hào)與制備日期。

2.儀器：配置高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱（36±1℃）、顯微鏡、計(jì)數(shù)器等設(shè)備。

3.試劑：配置無菌生理鹽水、75%酒精、革蘭染色試劑包。

（三）環(huán)境布置

1.清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，確保紫外燈消毒30分鐘。

2.鋪設(shè)無菌布，擺放標(biāo)準(zhǔn)操作流程圖。

四、演練流程

（一）樣本接收與前處理（StepbyStep）

1.接收樣本時(shí)核對(duì)標(biāo)簽信息（編號(hào)、送檢時(shí)間），記錄異常情況。

2.使用75%酒精對(duì)樣本瓶外表面進(jìn)行消毒，操作時(shí)保持樣本瓶直立。

3.按需稀釋樣本：液體樣本1:10稀釋，固體樣本剪?。?mm組織塊。

（二）培養(yǎng)與觀察

1.接種培養(yǎng)：

-液體樣本接種TSB，37℃振蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)。

-固體樣本劃線接種MAC瓊脂，倒置培養(yǎng)。

2.觀察記錄：

-每隔4小時(shí)記錄菌落形態(tài)（顏色、大小、溶血性），需拍照存檔。

-厭氧樣本使用厭氧罐培養(yǎng)，檢測(cè)時(shí)間延長至48小時(shí)。

（三）鑒定與質(zhì)控

1.革蘭染色：按標(biāo)準(zhǔn)流程制片、染色、鏡檢，復(fù)核革蘭陽性/陰性菌形態(tài)。

2.菌落計(jì)數(shù)：采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度，平板法計(jì)數(shù)CFU/mL（示例范圍：102-10?CFU/mL）。

五、考核與評(píng)估

（一）操作評(píng)分

1.按照《微生物檢驗(yàn)操作評(píng)分表》逐項(xiàng)打分（滿分100分），重點(diǎn)考核無菌操作與培養(yǎng)規(guī)范。

2.異常操作（如污染）需現(xiàn)場(chǎng)糾正并記錄原因。

（二）結(jié)果分析

1.比對(duì)質(zhì)控樣本（已知菌種）的檢測(cè)結(jié)果，誤差＞5%需重新演練。

2.撰寫演練報(bào)告，總結(jié)改進(jìn)措施（如培養(yǎng)基滅菌時(shí)間優(yōu)化）。

六、注意事項(xiàng)

1.每次操作后需使用70%酒精擦拭接觸面，關(guān)閉氣閘式超凈工作臺(tái)。

2.革蘭染色時(shí)避免油鏡污染，染片需浸泡30分鐘后自然干燥。

3.培養(yǎng)箱溫度每日校準(zhǔn)，偏差＞0.5℃需暫停使用。

**三、演練準(zhǔn)備**

（一）人員分工

1.**明確職責(zé)：**演練開始前，需根據(jù)演練環(huán)節(jié)和內(nèi)容，明確各參與人員的具體職責(zé)。

***主檢人（1名）：**負(fù)責(zé)演練的整體把控，包括流程啟動(dòng)、關(guān)鍵步驟指導(dǎo)、突發(fā)狀況決策、最終結(jié)果判定與總結(jié)。需具備豐富的微生物檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和較強(qiáng)的組織協(xié)調(diào)能力。

***記錄員（1名）：**專人負(fù)責(zé)詳細(xì)記錄演練過程中的所有操作、時(shí)間節(jié)點(diǎn)、觀察結(jié)果、人員互動(dòng)及任何非預(yù)期事件。記錄需清晰、準(zhǔn)確、客觀，為后續(xù)評(píng)估提供依據(jù)。

***操作員（若干名）：**根據(jù)演練場(chǎng)景，分批或分組執(zhí)行具體的實(shí)驗(yàn)操作，如樣本處理、培養(yǎng)基準(zhǔn)備、接種、培養(yǎng)、觀察、染色等。需嚴(yán)格按照主檢人指令和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）進(jìn)行。

***觀察評(píng)估員（可選，1-2名）：**若非全員參與實(shí)操，可安排觀察員對(duì)操作員的技能執(zhí)行情況進(jìn)行旁觀記錄，側(cè)重于規(guī)范性、熟練度和細(xì)節(jié)處理。

2.**專項(xiàng)培訓(xùn)：**在演練前進(jìn)行簡(jiǎn)短培訓(xùn)，內(nèi)容涵蓋：

*演練的具體場(chǎng)景和模擬目標(biāo)。

*各自的職責(zé)和注意事項(xiàng)。

*需要重點(diǎn)練習(xí)的操作步驟及其關(guān)鍵控制點(diǎn)。

*預(yù)設(shè)的異常情況及應(yīng)對(duì)預(yù)案概要。

*強(qiáng)調(diào)安全規(guī)范，特別是生物安全等級(jí)和廢棄物處理要求。

（二）物資準(zhǔn)備

1.**培養(yǎng)基與試劑：**

***基礎(chǔ)培養(yǎng)基：**準(zhǔn)備足量且批號(hào)統(tǒng)一的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如：

*肉湯培養(yǎng)基（如TSB，TrypticSoyBroth）：至少20-30份，用于增菌和液體樣本接種。需確認(rèn)在有效期內(nèi)，并了解其pH值（標(biāo)準(zhǔn)范圍11.0-11.3）。

*瓊脂平板：準(zhǔn)備多種選擇，如MacConkey瓊脂（MAC，用于腸道桿菌屬分離）、TSB瓊脂（用于通用培養(yǎng)）、血平板（用于觀察溶血性）、XLD平板（用于沙門氏菌/志賀氏菌選擇性分離）等，每種至少10-15份平板。同樣需檢查批號(hào)、生產(chǎn)日期和有效期，并確認(rèn)已正確滅菌。

***特殊培養(yǎng)基：**根據(jù)演練場(chǎng)景需要，準(zhǔn)備特定培養(yǎng)基，如：

*厭氧培養(yǎng)基（如厭氧肉湯、厭氧瓊脂）：用于模擬厭氧菌培養(yǎng)場(chǎng)景。需準(zhǔn)備配套的厭氧罐或氣體發(fā)生系統(tǒng)。

*選擇性培養(yǎng)基：如含特定抑制劑（如伊紅亞甲基藍(lán)、四環(huán)素等）的培養(yǎng)基。

***染色試劑：**配備完整的革蘭染色全套試劑，包括：

*結(jié)晶紫染液

*碘液（碘化鉀溶液）

*95%乙醇或丙酮（脫色劑）

*熒光素（如沙弗寧或堿性復(fù)紅，用于鏡后復(fù)染）

*需確保試劑新鮮配制或使用在有效期內(nèi)的商業(yè)染液包。

***其他試劑：**無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）、75%乙醇（用于手部和物體表面消毒）、接種環(huán)/針消毒液（如70%乙醇或有效氯溶液）、pH試紙（用于檢查培養(yǎng)基pH值）。

2.**儀器與設(shè)備：**

***滅菌設(shè)備：**高壓蒸汽滅菌鍋，需確保其處于良好工作狀態(tài)，并有校準(zhǔn)證書。準(zhǔn)備足量的滅菌棉簽、紗布、牛皮紙/金屬滅菌袋/容器。

***培養(yǎng)設(shè)備：**恒溫培養(yǎng)箱，需能精確控制在36±1℃（或其他特定溫度，如厭氧培養(yǎng)溫度），并提前預(yù)熱。準(zhǔn)備培養(yǎng)皿（至少20套）、培養(yǎng)皿架。

***微生物觀察設(shè)備：**光學(xué)顯微鏡，需配備不同倍數(shù)物鏡（至少包括低倍鏡10x、高倍鏡40x），并確保清潔、功能完好。準(zhǔn)備擦鏡紙、擦鏡液。

***無菌操作設(shè)備：**超凈工作臺(tái)（生物安全柜），需在演練前進(jìn)行空間清潔、紫外燈照射消毒（30分鐘以上）、通風(fēng)確認(rèn)，并檢查風(fēng)閥是否正常。

***輔助工具：**天平（用于稱量培養(yǎng)基粉末或試劑）、量筒/移液器/移液管（用于準(zhǔn)確量取液體）、水浴鍋（如需預(yù)熱培養(yǎng)基或進(jìn)行特定溫度操作）、接種環(huán)/針/鏟、記號(hào)筆、標(biāo)簽紙、計(jì)時(shí)器。

3.**模擬樣本（可選）：**

*準(zhǔn)備已知菌種的模擬樣本，用于考核鑒定能力和質(zhì)控。菌種可包括常見需氧菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）、非典型菌或特殊菌（如酵母菌、霉菌）。樣本形式可為液體或固體（組織塊）。

*也可準(zhǔn)備含有已知“污染”菌的樣本，用于演練污染發(fā)現(xiàn)與處理流程。

4.**記錄與評(píng)估材料：**

*《微生物檢驗(yàn)操作演練記錄表》：包含樣本信息、操作步驟、時(shí)間記錄、觀察結(jié)果、人員簽名等字段。

*《微生物檢驗(yàn)操作評(píng)分表》：根據(jù)SOP制定，包含各操作項(xiàng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和扣分細(xì)則。

*空白培養(yǎng)皿、空白實(shí)驗(yàn)報(bào)告單。

*個(gè)人防護(hù)用品（PPE）：實(shí)驗(yàn)服、口罩、手套（一次性）、護(hù)目鏡（可選）。

*廢物收集桶：分類放置，如感染性廢物、化學(xué)性廢物（廢棄染液）、生活垃圾。

（三）環(huán)境布置

1.**區(qū)域劃分：**確定演練區(qū)域，盡量模擬實(shí)際工作流程，劃分功能區(qū)：

*樣本接收與初步處理區(qū)。

*培養(yǎng)基制備與滅菌區(qū)。

*無菌操作接種區(qū)（超凈工作臺(tái)內(nèi)）。

*培養(yǎng)區(qū)。

*觀察與鑒定區(qū)（顯微鏡操作臺(tái)）。

*記錄與清潔區(qū)。

2.**環(huán)境準(zhǔn)備：**

***清潔消毒：**對(duì)所有操作區(qū)域進(jìn)行徹底清潔，必要時(shí)使用消毒劑（如70-75%酒精或有效氯溶液）進(jìn)行表面消毒。確保地面、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面無污漬、無障礙物。

***設(shè)備檢查與預(yù)熱：**提前檢查所有儀器設(shè)備是否運(yùn)行正常，按需預(yù)熱（如培養(yǎng)箱、顯微鏡、超凈工作臺(tái)）。超凈工作臺(tái)需進(jìn)行風(fēng)速和靜壓測(cè)試。

***物品擺放：**將所有準(zhǔn)備好的物資按演練流程有序擺放，方便取用。培養(yǎng)基、試劑應(yīng)標(biāo)識(shí)清晰，分類存放。高壓滅菌鍋排氣閥打開，處于待滅菌狀態(tài)。

***SOP與圖示：**在顯眼位置張貼相關(guān)操作的SOP關(guān)鍵步驟圖或流程圖，供操作員參考。

***安全標(biāo)識(shí)：**確保安全出口標(biāo)識(shí)清晰可見，急救設(shè)備（如洗眼器、應(yīng)急噴淋）位置明確，并有狀態(tài)指示。

**四、演練流程**

（一）樣本接收與前處理（StepbyStep）

1.**模擬樣本接收：**

***(1)信息核對(duì)：**主檢人模擬接收1-2個(gè)（或更多，根據(jù)演練規(guī)模）裝有模擬樣本的容器。記錄員核對(duì)標(biāo)簽信息：樣本編號(hào)、送檢單位（模擬信息）、樣本類型（如血液、尿液、糞便、組織）、送檢時(shí)間、臨床初步信息（如有）。確認(rèn)信息完整、無筆誤。

***(2)外部消毒：**操作員使用75%酒精棉簽或噴霧器對(duì)外部樣本容器（瓶口、管壁等）進(jìn)行規(guī)范消毒。消毒時(shí)保持容器直立，避免酒精流入內(nèi)部。記錄消毒操作。

***(3)環(huán)境評(píng)估：**主檢人檢查接收區(qū)域環(huán)境是否符合要求（如清潔度、無氣流干擾）。

2.**樣本前處理：**

***(1)玻璃器皿準(zhǔn)備：**在超凈工作臺(tái)內(nèi)，檢查接種環(huán)/針、試管、離心管等玻璃器皿是否清潔、干燥、無裂紋，必要時(shí)進(jìn)行滅菌（如干熱滅菌或高壓滅菌）。

***(2)樣本開蓋與混勻：**

*使用無菌鑷子（或經(jīng)滅菌處理的工具）打開樣本容器蓋（如試管蓋、瓶蓋），動(dòng)作輕柔，避免污染。記錄開蓋時(shí)間。

*對(duì)液體樣本，用無菌接種環(huán)沿管壁輕輕攪動(dòng)或吹打，確保樣本均勻。

*對(duì)固體樣本（如組織塊），用無菌剪刀（需滅菌）剪取大小適中的塊狀（建議＜3mm3），置于無菌容器或直接接種。

***(3)稀釋（如需）：**

*根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮湍M場(chǎng)景，進(jìn)行適當(dāng)稀釋。例如：

*血液樣本：可能需要1:10或1:100稀釋于無菌生理鹽水中。

*尿液樣本：直接接種或離心后取上清。

*糞便樣本：可能需要沙氏運(yùn)送液或生理鹽水稀釋，并可能進(jìn)行劃線接種。

*使用移液器準(zhǔn)確吸取定量樣本和稀釋液，轉(zhuǎn)移至目標(biāo)容器（如試管、離心管），記錄稀釋倍數(shù)。

***(4)無菌接種（核心步驟）：**

***進(jìn)入超凈工作臺(tái)：**操作員洗手、消毒雙手，穿戴PPE，按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)入超凈工作臺(tái)，啟動(dòng)通風(fēng)，等待內(nèi)部潔凈。

***放置樣本：**將準(zhǔn)備好的樣本和培養(yǎng)基（如TSB肉湯）置于工作臺(tái)內(nèi)操作區(qū)域，盡量減少移動(dòng)。

***接種操作（以TSB為例）：**用無菌接種環(huán)蘸取適量（如0.1mL）處理后的樣本，快速、準(zhǔn)確地接種至TSB肉湯管內(nèi)。接種動(dòng)作需快速完成，避免培養(yǎng)基濺出或接觸環(huán)外表面。

***蓋緊管蓋：**立即蓋緊試管蓋，用記號(hào)筆標(biāo)記操作者、日期和時(shí)間。

***操作后處理：**取出接種后的樣本管，放入指定區(qū)域。用酒精棉簽擦拭操作臺(tái)接觸面，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。

***(5)接種平板（如需）：**如需進(jìn)行平板接種（如MAC瓊脂），則：

*左手持皿，皿蓋半開，右手持接種環(huán)（已滅菌并沾取適量樣本）。

*在皿內(nèi)做zigzag或spiral式劃線。確保劃線次數(shù)固定（如3次），線條間距適當(dāng)。

*劃完后蓋好皿蓋，標(biāo)記。接種后的平板立即倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入培養(yǎng)箱。

（二）培養(yǎng)與觀察

1.**培養(yǎng)基制備與滅菌（如演練包含此環(huán)節(jié)）：**

***(1)稱量：**按照培養(yǎng)基說明書要求的配方，精確稱量培養(yǎng)基粉末（如MacConkey瓊脂粉）。記錄稱量值和培養(yǎng)基名稱、批號(hào)。

***(2)溶解：**將培養(yǎng)基粉末加入適量去離子水（按說明書比例，如每包粉末配1000mL），攪拌使其完全溶解。檢查有無結(jié)塊。

***(3)調(diào)pH（如需）：**使用pH試紙檢查培養(yǎng)基pH值，如需調(diào)整，按說明書加入酸或堿調(diào)節(jié)至標(biāo)準(zhǔn)范圍（如MAC瓊脂為pH7.2±0.2）。

***(4)分裝：**將配好的培養(yǎng)基分裝至滅菌容器（如錐形瓶、培養(yǎng)皿），避免產(chǎn)生氣泡。

***(5)滅菌：**將分裝好的培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中，設(shè)定合適參數(shù)（如壓力121kPa，時(shí)間15-20分鐘，根據(jù)培養(yǎng)基種類和體積調(diào)整）。滅菌前檢查鍋內(nèi)是否有積水。滅菌后，待壓力降至零后開蓋。

***(6)冷卻與傾注平板（如需）：**將滅菌后的培養(yǎng)基置于水浴鍋或室溫冷卻至適宜傾注溫度（約45-50℃）?？焖?、均勻地將培養(yǎng)基傾注入滅菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿約15-20mL。立即蓋上皿蓋，水平旋轉(zhuǎn)混勻，靜置待凝固。

2.**接種后培養(yǎng)：**

***(1)標(biāo)記：**確保所有接種后的培養(yǎng)物（肉湯管、平板）均有清晰、規(guī)范的標(biāo)識(shí)，包括樣本編號(hào)、培養(yǎng)基類型、接種日期、操作者等。

***(2)放入培養(yǎng)箱：**將接種后的肉湯管放入36±1℃恒溫培養(yǎng)箱，采用振蕩培養(yǎng)（如TSB）或靜置培養(yǎng)。將平板同樣放入培養(yǎng)箱，保持倒置狀態(tài)。

***(3)培養(yǎng)時(shí)間：**根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目和樣本類型，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)時(shí)間。常見培養(yǎng)時(shí)間為：

*一般需氧菌：18-24小時(shí)。

*厭氧菌：需使用厭氧罐，培養(yǎng)時(shí)間通常為48-72小時(shí)。

*需氧菌特殊染色（如分枝桿菌）：可能需要更長時(shí)間（如1-2周）。

*記錄培養(yǎng)開始時(shí)間。

3.**培養(yǎng)物觀察與記錄：**

***(1)定期觀察：**演練中設(shè)定觀察時(shí)間點(diǎn)（如培養(yǎng)開始后4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)等），由指定人員（操作員或記錄員）進(jìn)入培養(yǎng)區(qū)（或觀察窗）檢查培養(yǎng)狀態(tài)。

***(2)肉湯管觀察：**

*觀察液體是否渾濁（指示生長）。

*觀察是否有氣體產(chǎn)生（如產(chǎn)氣腸桿菌科）。

*觀察是否有沉淀或絮狀物。

*觀察是否有顏色變化（如某些假單胞菌在TSB中可能變綠）。

*記錄陽性結(jié)果（渾濁、氣體等）出現(xiàn)的最早時(shí)間。

***(3)平板觀察：**

*評(píng)估菌落生長情況：菌落計(jì)數(shù)（選擇典型區(qū)域計(jì)數(shù)并換算成CFU/mL）、菌落形態(tài)（大小、形狀、顏色、透明度、邊緣、表面、溶血性等）。

*記錄典型菌落特征。

***(4)拍照存檔（可選）：**對(duì)典型菌落或特殊生長現(xiàn)象進(jìn)行拍照，以便后續(xù)學(xué)習(xí)和討論。

***(5)記錄更新：**及時(shí)在《微生物檢驗(yàn)操作演練記錄表》上更新觀察結(jié)果和時(shí)間。

（三）鑒定與質(zhì)控

1.**革蘭染色與鏡檢：**

***(1)制片：**從生長良好的肉湯管或平板上挑取少量純菌落，制備涂片。對(duì)液體樣本，可取少許渾濁液直接涂片。確保制作均勻、無重疊的細(xì)菌涂片。

***(2)固定：**將涂片置于酒精燈火焰上快速通過（固定），待冷卻。

***(3)染色步驟（標(biāo)準(zhǔn)革蘭染色法）：**

*滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘。蓋上蓋玻片（或直接晾干）。

*滴加碘液（碘化鉀溶液），媒染1分鐘。蓋上蓋玻片（或直接晾干）。

*滴加95%乙醇或丙酮，脫色30秒至1分鐘。注意觀察顏色變化，及時(shí)傾去脫色劑。輕輕晃動(dòng)或吹氣加速干燥。

*滴加沙弗寧或堿性復(fù)紅復(fù)染液，染色30秒至1分鐘。

*蒸餾水沖洗（或吸水紙吸干）。

***(4)鏡檢：**使用光學(xué)顯微鏡，依次在低倍鏡（10x）和高倍鏡（40x）下觀察。

*先在低倍鏡下找到細(xì)菌聚集區(qū)域，再換高倍鏡仔細(xì)觀察。

*判斷細(xì)菌是革蘭陽性（呈紫色）還是革蘭陰性（呈紅色或粉色）。

*觀察細(xì)菌形態(tài)（球菌、桿菌、螺旋菌等）、大小、有無莢膜、芽孢、鞭毛等特殊結(jié)構(gòu)。

*記錄革蘭染色結(jié)果和典型形態(tài)。

***(5)記錄：**在《微生物檢驗(yàn)操作演練記錄表》上詳細(xì)記錄革蘭染色結(jié)果。

2.**菌落計(jì)數(shù)（平板法）：**

***(1)選擇平板：**選擇菌落分布均勻、計(jì)數(shù)范圍在30-300CFU/皿的平板。

***(2)計(jì)數(shù)方法：**采用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)方法，如：

*三點(diǎn)法：計(jì)數(shù)皿內(nèi)三個(gè)相距較遠(yuǎn)區(qū)域（如三等分）的菌落數(shù)，取平均值。

*四角法：計(jì)數(shù)直徑9cm平板上的四個(gè)角（1、3、7、9點(diǎn)）及中心點(diǎn)的菌落數(shù)，取平均值。

***(3)計(jì)算CFU/mL：**將平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，再乘以稀釋液稀釋體積的倒數(shù)（如1mL/0.1mL=10）。公式：CFU/mL=(平均菌落數(shù)/平板面積)×稀釋倍數(shù)×(1/稀釋液取用量，mL)。

***(4)記錄：**記錄計(jì)算得到的CFU/mL值，并評(píng)估樣本污染程度（如每克糞便>10?CFU/mL可能提示腸道菌群失調(diào)）。

***(5)質(zhì)控：**同時(shí)計(jì)數(shù)質(zhì)控樣本（已知菌落數(shù)的菌懸液）的平板，評(píng)估計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。允許誤差范圍需參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

3.**純化分離（如需）：**

***(1)選擇單菌落：**在平板上挑取形態(tài)典型、孤立的單個(gè)菌落。

***(2)接種新平板：**使用無菌接種環(huán)，將單個(gè)菌落接種至新的、合適的瓊脂平板（如血平板、TSB平板）上。

***(3)培養(yǎng)：**按標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)，觀察是否有純菌落生長。

***(4)純度判斷：**確保新平板上的菌落形態(tài)一致、無雜菌污染。

4.**質(zhì)控樣本檢驗(yàn)：**

***(1)平行檢驗(yàn)：**對(duì)同一樣質(zhì)控樣本（如已知大腸桿菌的菌懸液），由不同操作員（或同一操作員重復(fù)操作）進(jìn)行平行檢驗(yàn)。

***(2)結(jié)果比對(duì)：**比較平行檢驗(yàn)的革蘭染色結(jié)果、菌落計(jì)數(shù)結(jié)果等。

***(3)誤差分析：**如平行結(jié)果超出允許誤差范圍，需分析原因（如操作失誤、培養(yǎng)基問題、設(shè)備故障等），并采取糾正措施。

**五、考核與評(píng)估**

（一）操作評(píng)分

1.**評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：**依據(jù)預(yù)先制定的《微生物檢驗(yàn)操作評(píng)分表》進(jìn)行評(píng)分。該評(píng)分表應(yīng)覆蓋演練中的關(guān)鍵操作環(huán)節(jié)，每個(gè)環(huán)節(jié)設(shè)定明確的評(píng)分項(xiàng)和分值。示例評(píng)分項(xiàng)及分值參考：

***樣本接收與核對(duì)（10分）：**標(biāo)簽信息核對(duì)完整性（5分），外部消毒規(guī)范性（5分）。

***無菌操作（30分）：**超凈工作臺(tái)內(nèi)操作規(guī)范性（15分），無菌概念掌握程度（15分）。

***培養(yǎng)基制備（20分）：**稱量準(zhǔn)確性（10分），溶解與調(diào)pH正確性（5分），滅菌參數(shù)設(shè)置合理性（5分）。

***接種技術(shù)（20分）：**肉湯接種準(zhǔn)確性（10分），平板劃線均勻性（10分）。

***革蘭染色（20分）：**染色步驟正確性（15分），鏡檢判斷準(zhǔn)確性（5分）。

***記錄與報(bào)告（10分）：**記錄清晰完整性（5分），觀察描述準(zhǔn)確性（5分）。

***總分（100分）：**60分及以上為合格，80分及以上為良好，90分及以上為優(yōu)秀。

2.**評(píng)分執(zhí)行：**由觀察評(píng)估員或主檢人根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)表現(xiàn)，對(duì)照評(píng)分表逐項(xiàng)打分。對(duì)于操作中的不足之處，應(yīng)進(jìn)行即時(shí)反饋或記錄。

3.**異常操作處理：**演練中如出現(xiàn)嚴(yán)重異常操作（如明顯污染、培養(yǎng)基制備失敗、錯(cuò)誤接種等），應(yīng)暫停該環(huán)節(jié)，由主檢人或觀察員進(jìn)行糾正說明，并在評(píng)分表中酌情扣分，同時(shí)記錄問題點(diǎn)。

（二）結(jié)果分析

1.**質(zhì)控結(jié)果評(píng)估：**重點(diǎn)分析質(zhì)控樣本的檢驗(yàn)結(jié)果。計(jì)算質(zhì)控樣本檢測(cè)值與標(biāo)示值（或參考值）之間的偏差。例如，若質(zhì)控樣本標(biāo)示值為103CFU/mL，允許偏差±5%，則檢測(cè)結(jié)果在950-1050CFU/mL之間為合格。偏差超出范圍時(shí)，需評(píng)估整個(gè)檢驗(yàn)過程的可靠性。

2.**模擬結(jié)果比對(duì)（如使用模擬樣本）：**如果演練使用了已知菌種的模擬樣本，將操作員鑒定出的結(jié)果（菌種、革蘭染色等）與預(yù)設(shè)的“標(biāo)準(zhǔn)答案”進(jìn)行比對(duì)，評(píng)估鑒定能力和準(zhǔn)確性。

3.**流程效率分析：**記錄各環(huán)節(jié)的實(shí)際耗時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)操作時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，分析是否存在瓶頸或可優(yōu)化之處。例如，樣本前處理時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間、染色鏡檢時(shí)間等。

4.**問題匯總：**收集演練過程中所有記錄的觀察結(jié)果、評(píng)分反饋、質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，匯總操作中普遍存在的問題和個(gè)體差異。例如，多次出現(xiàn)劃線不均、脫色時(shí)間掌握不準(zhǔn)、記錄不規(guī)范等問題。

5.**撰寫評(píng)估報(bào)告：**匯總以上分析結(jié)果，撰寫《微生物檢驗(yàn)操作演練評(píng)估報(bào)告》。報(bào)告應(yīng)包含：

*演練基本信息（時(shí)間、參與人員、演練場(chǎng)景）。

*各項(xiàng)操作考核得分及排名。

*質(zhì)控樣本檢驗(yàn)結(jié)果分析。

*演練中發(fā)現(xiàn)的主要問題及原因分析。

*改進(jìn)建議和后續(xù)培訓(xùn)計(jì)劃。

**六、注意事項(xiàng)**

1.**生物安全防護(hù)：**

*所有參與人員必須全程穿戴合適的PPE，包括實(shí)驗(yàn)服、口罩、手套。處理潛在污染樣本時(shí)，必要時(shí)佩戴護(hù)目鏡或面屏。

*操作過程中始終保持手部衛(wèi)生，接觸不同樣本或操作不同區(qū)域前后需徹底洗手或使用手消毒劑。

*嚴(yán)禁在非指定區(qū)域飲食、飲水或吸煙。

*操作中產(chǎn)生的廢棄物（如廢棄培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、試管、受污染的PPE等）必須按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)定分類收集，放入指定的感染性廢物或化學(xué)性廢物容器中，交由專業(yè)機(jī)構(gòu)處理。嚴(yán)禁隨意丟棄。

2.**無菌操作規(guī)范：**

*進(jìn)入超凈工作臺(tái)前必須嚴(yán)格執(zhí)行手消毒和穿戴PPE程序。操作臺(tái)內(nèi)禁止無關(guān)活動(dòng)，避免快速移動(dòng)或產(chǎn)生渦流。

*所有接觸樣本、培養(yǎng)基、儀器的物品必須是無菌的。使用后的一次性物品直接丟棄，可重復(fù)使用的器械需按規(guī)定滅菌。

*接種環(huán)、針等工具在使用前后需嚴(yán)格滅菌。制作涂片時(shí)動(dòng)作要快，減少暴露時(shí)間。

*培養(yǎng)基傾注平板時(shí)需快速、平穩(wěn)，避免產(chǎn)生氣泡和飛濺。

*注意防止環(huán)境中的微生物污染，如避免說話、咳嗽、打噴嚏時(shí)面向操作區(qū)。

3.**儀器設(shè)備使用：**

*嚴(yán)格按照操作規(guī)程使用高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、顯微鏡等設(shè)備。使用前檢查設(shè)備狀態(tài)，使用后及時(shí)清潔和關(guān)機(jī)。

*高壓滅菌鍋排氣閥必須完全打開后再進(jìn)行壓力滅菌。

*顯微鏡使用后需用擦鏡紙和擦鏡液清潔物鏡和目鏡。

4.**培養(yǎng)物管理：**

*培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)物需擺放有序，便于觀察，避免交叉污染。

*培養(yǎng)物需保持倒置狀態(tài)，防止冷凝水滴落污染菌落。

*達(dá)到培養(yǎng)時(shí)間后，及時(shí)處理或觀察結(jié)果。廢棄培養(yǎng)物需先滅菌（如高壓滅菌）再按廢棄物規(guī)定處理。

5.**應(yīng)急處理準(zhǔn)備：**

*演練中如發(fā)生小范圍污染（如工作臺(tái)表面污染、少量樣本溢出），應(yīng)立即停止操作，按照預(yù)定程序進(jìn)行消毒處理（如使用75%酒精擦拭、廢棄物處理等）。

*了解實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急聯(lián)絡(luò)方式和處理流程（如發(fā)生較大污染事件時(shí)的上報(bào)和隔離措施）。

6.**記錄與溝通：**

*記錄員需實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確記錄演練過程，記錄內(nèi)容應(yīng)客觀、簡(jiǎn)潔、無歧義。

*操作員在遇到困難或疑問時(shí)，應(yīng)及時(shí)向主檢人或其他經(jīng)驗(yàn)豐富的同事請(qǐng)教。

*演練結(jié)束后，組織簡(jiǎn)短的總結(jié)會(huì)，交流經(jīng)驗(yàn)，討論問題，明確改進(jìn)方向。

一、概述

微生物檢驗(yàn)操作演練計(jì)劃旨在通過系統(tǒng)化的模擬與實(shí)踐，提升檢驗(yàn)人員對(duì)微生物樣本處理、培養(yǎng)、鑒定及結(jié)果報(bào)告等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的操作技能。本計(jì)劃結(jié)合實(shí)際工作場(chǎng)景，通過角色扮演、案例分析及標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（SOP）演練，確保檢驗(yàn)人員熟練掌握各項(xiàng)操作要求，提高工作效率與結(jié)果準(zhǔn)確性。演練內(nèi)容涵蓋實(shí)驗(yàn)室環(huán)境準(zhǔn)備、樣本接收、前處理、培養(yǎng)、觀察記錄及質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)。

二、演練目標(biāo)

（一）強(qiáng)化操作技能

1.掌握微生物樣本的正確采集與保存方法。

2.熟練執(zhí)行無菌操作技術(shù)，防止環(huán)境污染。

3.熟悉常用培養(yǎng)基的制備與滅菌流程。

4.提高菌落計(jì)數(shù)與純化分離的操作效率。

（二）規(guī)范流程執(zhí)行

1.確保樣本從接收至報(bào)告的全程符合SOP要求。

2.統(tǒng)一顯微鏡觀察與革蘭染色操作標(biāo)準(zhǔn)。

3.強(qiáng)化質(zhì)控樣本的平行檢驗(yàn)與結(jié)果復(fù)核機(jī)制。

（三）提升應(yīng)急處理能力

1.模擬污染事件時(shí)的隔離與溯源措施。

2.練習(xí)特殊樣本（如厭氧菌）的檢測(cè)流程。

三、演練準(zhǔn)備

（一）人員分工

1.確定主檢人、記錄員及輔助操作員職責(zé)。

2.對(duì)參與人員進(jìn)行操作前培訓(xùn)，明確演練步驟。

（二）物資準(zhǔn)備

1.培養(yǎng)基：準(zhǔn)備肉湯培養(yǎng)基、瓊脂平板（如TSB、MAC瓊脂）各20份，需標(biāo)明批號(hào)與制備日期。

2.儀器：配置高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱（36±1℃）、顯微鏡、計(jì)數(shù)器等設(shè)備。

3.試劑：配置無菌生理鹽水、75%酒精、革蘭染色試劑包。

（三）環(huán)境布置

1.清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，確保紫外燈消毒30分鐘。

2.鋪設(shè)無菌布，擺放標(biāo)準(zhǔn)操作流程圖。

四、演練流程

（一）樣本接收與前處理（StepbyStep）

1.接收樣本時(shí)核對(duì)標(biāo)簽信息（編號(hào)、送檢時(shí)間），記錄異常情況。

2.使用75%酒精對(duì)樣本瓶外表面進(jìn)行消毒，操作時(shí)保持樣本瓶直立。

3.按需稀釋樣本：液體樣本1:10稀釋，固體樣本剪取＜3mm組織塊。

（二）培養(yǎng)與觀察

1.接種培養(yǎng)：

-液體樣本接種TSB，37℃振蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)。

-固體樣本劃線接種MAC瓊脂，倒置培養(yǎng)。

2.觀察記錄：

-每隔4小時(shí)記錄菌落形態(tài)（顏色、大小、溶血性），需拍照存檔。

-厭氧樣本使用厭氧罐培養(yǎng)，檢測(cè)時(shí)間延長至48小時(shí)。

（三）鑒定與質(zhì)控

1.革蘭染色：按標(biāo)準(zhǔn)流程制片、染色、鏡檢，復(fù)核革蘭陽性/陰性菌形態(tài)。

2.菌落計(jì)數(shù)：采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度，平板法計(jì)數(shù)CFU/mL（示例范圍：102-10?CFU/mL）。

五、考核與評(píng)估

（一）操作評(píng)分

1.按照《微生物檢驗(yàn)操作評(píng)分表》逐項(xiàng)打分（滿分100分），重點(diǎn)考核無菌操作與培養(yǎng)規(guī)范。

2.異常操作（如污染）需現(xiàn)場(chǎng)糾正并記錄原因。

（二）結(jié)果分析

1.比對(duì)質(zhì)控樣本（已知菌種）的檢測(cè)結(jié)果，誤差＞5%需重新演練。

2.撰寫演練報(bào)告，總結(jié)改進(jìn)措施（如培養(yǎng)基滅菌時(shí)間優(yōu)化）。

六、注意事項(xiàng)

1.每次操作后需使用70%酒精擦拭接觸面，關(guān)閉氣閘式超凈工作臺(tái)。

2.革蘭染色時(shí)避免油鏡污染，染片需浸泡30分鐘后自然干燥。

3.培養(yǎng)箱溫度每日校準(zhǔn)，偏差＞0.5℃需暫停使用。

**三、演練準(zhǔn)備**

（一）人員分工

1.**明確職責(zé)：**演練開始前，需根據(jù)演練環(huán)節(jié)和內(nèi)容，明確各參與人員的具體職責(zé)。

***主檢人（1名）：**負(fù)責(zé)演練的整體把控，包括流程啟動(dòng)、關(guān)鍵步驟指導(dǎo)、突發(fā)狀況決策、最終結(jié)果判定與總結(jié)。需具備豐富的微生物檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和較強(qiáng)的組織協(xié)調(diào)能力。

***記錄員（1名）：**專人負(fù)責(zé)詳細(xì)記錄演練過程中的所有操作、時(shí)間節(jié)點(diǎn)、觀察結(jié)果、人員互動(dòng)及任何非預(yù)期事件。記錄需清晰、準(zhǔn)確、客觀，為后續(xù)評(píng)估提供依據(jù)。

***操作員（若干名）：**根據(jù)演練場(chǎng)景，分批或分組執(zhí)行具體的實(shí)驗(yàn)操作，如樣本處理、培養(yǎng)基準(zhǔn)備、接種、培養(yǎng)、觀察、染色等。需嚴(yán)格按照主檢人指令和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）進(jìn)行。

***觀察評(píng)估員（可選，1-2名）：**若非全員參與實(shí)操，可安排觀察員對(duì)操作員的技能執(zhí)行情況進(jìn)行旁觀記錄，側(cè)重于規(guī)范性、熟練度和細(xì)節(jié)處理。

2.**專項(xiàng)培訓(xùn)：**在演練前進(jìn)行簡(jiǎn)短培訓(xùn)，內(nèi)容涵蓋：

*演練的具體場(chǎng)景和模擬目標(biāo)。

*各自的職責(zé)和注意事項(xiàng)。

*需要重點(diǎn)練習(xí)的操作步驟及其關(guān)鍵控制點(diǎn)。

*預(yù)設(shè)的異常情況及應(yīng)對(duì)預(yù)案概要。

*強(qiáng)調(diào)安全規(guī)范，特別是生物安全等級(jí)和廢棄物處理要求。

（二）物資準(zhǔn)備

1.**培養(yǎng)基與試劑：**

***基礎(chǔ)培養(yǎng)基：**準(zhǔn)備足量且批號(hào)統(tǒng)一的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如：

*肉湯培養(yǎng)基（如TSB，TrypticSoyBroth）：至少20-30份，用于增菌和液體樣本接種。需確認(rèn)在有效期內(nèi)，并了解其pH值（標(biāo)準(zhǔn)范圍11.0-11.3）。

*瓊脂平板：準(zhǔn)備多種選擇，如MacConkey瓊脂（MAC，用于腸道桿菌屬分離）、TSB瓊脂（用于通用培養(yǎng)）、血平板（用于觀察溶血性）、XLD平板（用于沙門氏菌/志賀氏菌選擇性分離）等，每種至少10-15份平板。同樣需檢查批號(hào)、生產(chǎn)日期和有效期，并確認(rèn)已正確滅菌。

***特殊培養(yǎng)基：**根據(jù)演練場(chǎng)景需要，準(zhǔn)備特定培養(yǎng)基，如：

*厭氧培養(yǎng)基（如厭氧肉湯、厭氧瓊脂）：用于模擬厭氧菌培養(yǎng)場(chǎng)景。需準(zhǔn)備配套的厭氧罐或氣體發(fā)生系統(tǒng)。

*選擇性培養(yǎng)基：如含特定抑制劑（如伊紅亞甲基藍(lán)、四環(huán)素等）的培養(yǎng)基。

***染色試劑：**配備完整的革蘭染色全套試劑，包括：

*結(jié)晶紫染液

*碘液（碘化鉀溶液）

*95%乙醇或丙酮（脫色劑）

*熒光素（如沙弗寧或堿性復(fù)紅，用于鏡后復(fù)染）

*需確保試劑新鮮配制或使用在有效期內(nèi)的商業(yè)染液包。

***其他試劑：**無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）、75%乙醇（用于手部和物體表面消毒）、接種環(huán)/針消毒液（如70%乙醇或有效氯溶液）、pH試紙（用于檢查培養(yǎng)基pH值）。

2.**儀器與設(shè)備：**

***滅菌設(shè)備：**高壓蒸汽滅菌鍋，需確保其處于良好工作狀態(tài)，并有校準(zhǔn)證書。準(zhǔn)備足量的滅菌棉簽、紗布、牛皮紙/金屬滅菌袋/容器。

***培養(yǎng)設(shè)備：**恒溫培養(yǎng)箱，需能精確控制在36±1℃（或其他特定溫度，如厭氧培養(yǎng)溫度），并提前預(yù)熱。準(zhǔn)備培養(yǎng)皿（至少20套）、培養(yǎng)皿架。

***微生物觀察設(shè)備：**光學(xué)顯微鏡，需配備不同倍數(shù)物鏡（至少包括低倍鏡10x、高倍鏡40x），并確保清潔、功能完好。準(zhǔn)備擦鏡紙、擦鏡液。

***無菌操作設(shè)備：**超凈工作臺(tái)（生物安全柜），需在演練前進(jìn)行空間清潔、紫外燈照射消毒（30分鐘以上）、通風(fēng)確認(rèn)，并檢查風(fēng)閥是否正常。

***輔助工具：**天平（用于稱量培養(yǎng)基粉末或試劑）、量筒/移液器/移液管（用于準(zhǔn)確量取液體）、水浴鍋（如需預(yù)熱培養(yǎng)基或進(jìn)行特定溫度操作）、接種環(huán)/針/鏟、記號(hào)筆、標(biāo)簽紙、計(jì)時(shí)器。

3.**模擬樣本（可選）：**

*準(zhǔn)備已知菌種的模擬樣本，用于考核鑒定能力和質(zhì)控。菌種可包括常見需氧菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）、非典型菌或特殊菌（如酵母菌、霉菌）。樣本形式可為液體或固體（組織塊）。

*也可準(zhǔn)備含有已知“污染”菌的樣本，用于演練污染發(fā)現(xiàn)與處理流程。

4.**記錄與評(píng)估材料：**

*《微生物檢驗(yàn)操作演練記錄表》：包含樣本信息、操作步驟、時(shí)間記錄、觀察結(jié)果、人員簽名等字段。

*《微生物檢驗(yàn)操作評(píng)分表》：根據(jù)SOP制定，包含各操作項(xiàng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和扣分細(xì)則。

*空白培養(yǎng)皿、空白實(shí)驗(yàn)報(bào)告單。

*個(gè)人防護(hù)用品（PPE）：實(shí)驗(yàn)服、口罩、手套（一次性）、護(hù)目鏡（可選）。

*廢物收集桶：分類放置，如感染性廢物、化學(xué)性廢物（廢棄染液）、生活垃圾。

（三）環(huán)境布置

1.**區(qū)域劃分：**確定演練區(qū)域，盡量模擬實(shí)際工作流程，劃分功能區(qū)：

*樣本接收與初步處理區(qū)。

*培養(yǎng)基制備與滅菌區(qū)。

*無菌操作接種區(qū)（超凈工作臺(tái)內(nèi)）。

*培養(yǎng)區(qū)。

*觀察與鑒定區(qū)（顯微鏡操作臺(tái)）。

*記錄與清潔區(qū)。

2.**環(huán)境準(zhǔn)備：**

***清潔消毒：**對(duì)所有操作區(qū)域進(jìn)行徹底清潔，必要時(shí)使用消毒劑（如70-75%酒精或有效氯溶液）進(jìn)行表面消毒。確保地面、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面無污漬、無障礙物。

***設(shè)備檢查與預(yù)熱：**提前檢查所有儀器設(shè)備是否運(yùn)行正常，按需預(yù)熱（如培養(yǎng)箱、顯微鏡、超凈工作臺(tái)）。超凈工作臺(tái)需進(jìn)行風(fēng)速和靜壓測(cè)試。

***物品擺放：**將所有準(zhǔn)備好的物資按演練流程有序擺放，方便取用。培養(yǎng)基、試劑應(yīng)標(biāo)識(shí)清晰，分類存放。高壓滅菌鍋排氣閥打開，處于待滅菌狀態(tài)。

***SOP與圖示：**在顯眼位置張貼相關(guān)操作的SOP關(guān)鍵步驟圖或流程圖，供操作員參考。

***安全標(biāo)識(shí)：**確保安全出口標(biāo)識(shí)清晰可見，急救設(shè)備（如洗眼器、應(yīng)急噴淋）位置明確，并有狀態(tài)指示。

**四、演練流程**

（一）樣本接收與前處理（StepbyStep）

1.**模擬樣本接收：**

***(1)信息核對(duì)：**主檢人模擬接收1-2個(gè)（或更多，根據(jù)演練規(guī)模）裝有模擬樣本的容器。記錄員核對(duì)標(biāo)簽信息：樣本編號(hào)、送檢單位（模擬信息）、樣本類型（如血液、尿液、糞便、組織）、送檢時(shí)間、臨床初步信息（如有）。確認(rèn)信息完整、無筆誤。

***(2)外部消毒：**操作員使用75%酒精棉簽或噴霧器對(duì)外部樣本容器（瓶口、管壁等）進(jìn)行規(guī)范消毒。消毒時(shí)保持容器直立，避免酒精流入內(nèi)部。記錄消毒操作。

***(3)環(huán)境評(píng)估：**主檢人檢查接收區(qū)域環(huán)境是否符合要求（如清潔度、無氣流干擾）。

2.**樣本前處理：**

***(1)玻璃器皿準(zhǔn)備：**在超凈工作臺(tái)內(nèi)，檢查接種環(huán)/針、試管、離心管等玻璃器皿是否清潔、干燥、無裂紋，必要時(shí)進(jìn)行滅菌（如干熱滅菌或高壓滅菌）。

***(2)樣本開蓋與混勻：**

*使用無菌鑷子（或經(jīng)滅菌處理的工具）打開樣本容器蓋（如試管蓋、瓶蓋），動(dòng)作輕柔，避免污染。記錄開蓋時(shí)間。

*對(duì)液體樣本，用無菌接種環(huán)沿管壁輕輕攪動(dòng)或吹打，確保樣本均勻。

*對(duì)固體樣本（如組織塊），用無菌剪刀（需滅菌）剪取大小適中的塊狀（建議＜3mm3），置于無菌容器或直接接種。

***(3)稀釋（如需）：**

*根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮湍M場(chǎng)景，進(jìn)行適當(dāng)稀釋。例如：

*血液樣本：可能需要1:10或1:100稀釋于無菌生理鹽水中。

*尿液樣本：直接接種或離心后取上清。

*糞便樣本：可能需要沙氏運(yùn)送液或生理鹽水稀釋，并可能進(jìn)行劃線接種。

*使用移液器準(zhǔn)確吸取定量樣本和稀釋液，轉(zhuǎn)移至目標(biāo)容器（如試管、離心管），記錄稀釋倍數(shù)。

***(4)無菌接種（核心步驟）：**

***進(jìn)入超凈工作臺(tái)：**操作員洗手、消毒雙手，穿戴PPE，按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)入超凈工作臺(tái)，啟動(dòng)通風(fēng)，等待內(nèi)部潔凈。

***放置樣本：**將準(zhǔn)備好的樣本和培養(yǎng)基（如TSB肉湯）置于工作臺(tái)內(nèi)操作區(qū)域，盡量減少移動(dòng)。

***接種操作（以TSB為例）：**用無菌接種環(huán)蘸取適量（如0.1mL）處理后的樣本，快速、準(zhǔn)確地接種至TSB肉湯管內(nèi)。接種動(dòng)作需快速完成，避免培養(yǎng)基濺出或接觸環(huán)外表面。

***蓋緊管蓋：**立即蓋緊試管蓋，用記號(hào)筆標(biāo)記操作者、日期和時(shí)間。

***操作后處理：**取出接種后的樣本管，放入指定區(qū)域。用酒精棉簽擦拭操作臺(tái)接觸面，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。

***(5)接種平板（如需）：**如需進(jìn)行平板接種（如MAC瓊脂），則：

*左手持皿，皿蓋半開，右手持接種環(huán)（已滅菌并沾取適量樣本）。

*在皿內(nèi)做zigzag或spiral式劃線。確保劃線次數(shù)固定（如3次），線條間距適當(dāng)。

*劃完后蓋好皿蓋，標(biāo)記。接種后的平板立即倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入培養(yǎng)箱。

（二）培養(yǎng)與觀察

1.**培養(yǎng)基制備與滅菌（如演練包含此環(huán)節(jié)）：**

***(1)稱量：**按照培養(yǎng)基說明書要求的配方，精確稱量培養(yǎng)基粉末（如MacConkey瓊脂粉）。記錄稱量值和培養(yǎng)基名稱、批號(hào)。

***(2)溶解：**將培養(yǎng)基粉末加入適量去離子水（按說明書比例，如每包粉末配1000mL），攪拌使其完全溶解。檢查有無結(jié)塊。

***(3)調(diào)pH（如需）：**使用pH試紙檢查培養(yǎng)基pH值，如需調(diào)整，按說明書加入酸或堿調(diào)節(jié)至標(biāo)準(zhǔn)范圍（如MAC瓊脂為pH7.2±0.2）。

***(4)分裝：**將配好的培養(yǎng)基分裝至滅菌容器（如錐形瓶、培養(yǎng)皿），避免產(chǎn)生氣泡。

***(5)滅菌：**將分裝好的培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中，設(shè)定合適參數(shù)（如壓力121kPa，時(shí)間15-20分鐘，根據(jù)培養(yǎng)基種類和體積調(diào)整）。滅菌前檢查鍋內(nèi)是否有積水。滅菌后，待壓力降至零后開蓋。

***(6)冷卻與傾注平板（如需）：**將滅菌后的培養(yǎng)基置于水浴鍋或室溫冷卻至適宜傾注溫度（約45-50℃）?？焖佟⒕鶆虻貙⑴囵B(yǎng)基傾注入滅菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿約15-20mL。立即蓋上皿蓋，水平旋轉(zhuǎn)混勻，靜置待凝固。

2.**接種后培養(yǎng)：**

***(1)標(biāo)記：**確保所有接種后的培養(yǎng)物（肉湯管、平板）均有清晰、規(guī)范的標(biāo)識(shí)，包括樣本編號(hào)、培養(yǎng)基類型、接種日期、操作者等。

***(2)放入培養(yǎng)箱：**將接種后的肉湯管放入36±1℃恒溫培養(yǎng)箱，采用振蕩培養(yǎng)（如TSB）或靜置培養(yǎng)。將平板同樣放入培養(yǎng)箱，保持倒置狀態(tài)。

***(3)培養(yǎng)時(shí)間：**根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目和樣本類型，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)時(shí)間。常見培養(yǎng)時(shí)間為：

*一般需氧菌：18-24小時(shí)。

*厭氧菌：需使用厭氧罐，培養(yǎng)時(shí)間通常為48-72小時(shí)。

*需氧菌特殊染色（如分枝桿菌）：可能需要更長時(shí)間（如1-2周）。

*記錄培養(yǎng)開始時(shí)間。

3.**培養(yǎng)物觀察與記錄：**

***(1)定期觀察：**演練中設(shè)定觀察時(shí)間點(diǎn)（如培養(yǎng)開始后4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)等），由指定人員（操作員或記錄員）進(jìn)入培養(yǎng)區(qū)（或觀察窗）檢查培養(yǎng)狀態(tài)。

***(2)肉湯管觀察：**

*觀察液體是否渾濁（指示生長）。

*觀察是否有氣體產(chǎn)生（如產(chǎn)氣腸桿菌科）。

*觀察是否有沉淀或絮狀物。

*觀察是否有顏色變化（如某些假單胞菌在TSB中可能變綠）。

*記錄陽性結(jié)果（渾濁、氣體等）出現(xiàn)的最早時(shí)間。

***(3)平板觀察：**

*評(píng)估菌落生長情況：菌落計(jì)數(shù)（選擇典型區(qū)域計(jì)數(shù)并換算成CFU/mL）、菌落形態(tài)（大小、形狀、顏色、透明度、邊緣、表面、溶血性等）。

*記錄典型菌落特征。

***(4)拍照存檔（可選）：**對(duì)典型菌落或特殊生長現(xiàn)象進(jìn)行拍照，以便后續(xù)學(xué)習(xí)和討論。

***(5)記錄更新：**及時(shí)在《微生物檢驗(yàn)操作演練記錄表》上更新觀察結(jié)果和時(shí)間。

（三）鑒定與質(zhì)控

1.**革蘭染色與鏡檢：**

***(1)制片：**從生長良好的肉湯管或平板上挑取少量純菌落，制備涂片。對(duì)液體樣本，可取少許渾濁液直接涂片。確保制作均勻、無重疊的細(xì)菌涂片。

***(2)固定：**將涂片置于酒精燈火焰上快速通過（固定），待冷卻。

***(3)染色步驟（標(biāo)準(zhǔn)革蘭染色法）：**

*滴加結(jié)晶紫染液，染色1分鐘。蓋上蓋玻片（或直接晾干）。

*滴加碘液（碘化鉀溶液），媒染1分鐘。蓋上蓋玻片（或直接晾干）。

*滴加95%乙醇或丙酮，脫色30秒至1分鐘。注意觀察顏色變化，及時(shí)傾去脫色劑。輕輕晃動(dòng)或吹氣加速干燥。

*滴加沙弗寧或堿性復(fù)紅復(fù)染液，染色30秒至1分鐘。

*蒸餾水沖洗（或吸水紙吸干）。

***(4)鏡檢：**使用光學(xué)顯微鏡，依次在低倍鏡（10x）和高倍鏡（40x）下觀察。

*先在低倍鏡下找到細(xì)菌聚集區(qū)域，再換高倍鏡仔細(xì)觀察。

*判斷細(xì)菌是革蘭陽性（呈紫色）還是革蘭陰性（呈紅色或粉色）。

*觀察細(xì)菌形態(tài)（球菌、桿菌、螺旋菌等）、大小、有無莢膜、芽孢、鞭毛等特殊結(jié)構(gòu)。

*記錄革蘭染色結(jié)果和典型形態(tài)。

***(5)記錄：**在《微生物檢驗(yàn)操作演練記錄表》上詳細(xì)記錄革蘭染色結(jié)果。

2.**菌落計(jì)數(shù)（平板法）：**

***(1)選擇平板：**選擇菌落分布均勻、計(jì)數(shù)范圍在30-300CFU/皿的平板。

***(2)計(jì)數(shù)方法：**采用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)方法，如：

*三點(diǎn)法：計(jì)數(shù)皿內(nèi)三個(gè)相距較遠(yuǎn)區(qū)域（如三等分）的菌落數(shù)，取平均值。

*四角法：計(jì)數(shù)直徑9cm平板上的四個(gè)角（1、3、7、9點(diǎn)）及中心點(diǎn)的菌落數(shù)，取平均值。

***(3)計(jì)算CFU/mL：**將平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，再乘以稀釋液稀釋體積的倒數(shù)（如1mL/0.1mL=10）。公式：CFU/mL=(平均菌落數(shù)/平板面積)×稀釋倍數(shù)×(1/稀釋液取用量，mL)。

***(4)記錄：**記錄計(jì)算得到的CFU/mL值，并評(píng)估樣本污染程度（如每克糞便>10?CFU/mL可能提示腸道菌群失調(diào)）。

***(5)質(zhì)控：**同時(shí)計(jì)數(shù)質(zhì)控樣本（已知菌落數(shù)的菌懸液）的平板，評(píng)估計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。允許誤差范圍需參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

3.**純化分離（如需）：**

***(1)選擇單菌落：**在平板上挑取形態(tài)典型、孤立的單個(gè)菌落。

***(2)接種新平板：**使用無菌接種環(huán)，將單個(gè)菌落接種至新的、合適的瓊脂平板（如血平板、TSB平板）上。

***(3)培養(yǎng)：**按標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)，觀察是否有純菌落生長。

***(4)純度判斷：**確保新平板上的菌落形態(tài)一致、無雜菌污染。

4.**質(zhì)控樣本檢驗(yàn)：**

***(1)平行檢驗(yàn)：**對(duì)同一樣質(zhì)控樣本（如已知大腸桿菌的菌懸液），由不同操作員（或同一操作員重復(fù)操作）進(jìn)行平行檢驗(yàn)。

***(2)結(jié)果比對(duì)：**比較平行檢驗(yàn)的革蘭染色結(jié)果、菌落計(jì)數(shù)結(jié)果等。

***(3)誤差分析：**如平行結(jié)果超出允許誤差范圍，需分析原因（如操作失誤、培養(yǎng)基問題、設(shè)備故障等），并采取糾正措施。

**五、考核與評(píng)估**

（一）操作評(píng)分

1.**評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：**依據(jù)預(yù)先制定的《微生物檢驗(yàn)操作評(píng)分表》進(jìn)行評(píng)分。該評(píng)分表應(yīng)覆蓋演練中的關(guān)鍵操作環(huán)節(jié)，每個(gè)環(huán)節(jié)設(shè)定明確的評(píng)分項(xiàng)和分值。示例評(píng)分項(xiàng)及分值參考：

***樣本接收與核對(duì)（10分）：**標(biāo)簽信息核對(duì)完整性（5分），外部消毒規(guī)范性（5分）。

***無菌操作（30分）：**超凈工作臺(tái)內(nèi)操作規(guī)范性（15分），無菌概念掌握