微生物檢驗(yàn)規(guī)范操作指南一、概述

微生物檢驗(yàn)是評(píng)估樣品中微生物污染程度的重要手段，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境、醫(yī)療器械等領(lǐng)域。為確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必須遵循規(guī)范的操作流程。本指南旨在提供微生物檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，包括樣品處理、培養(yǎng)基制備、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

二、樣品處理

（一）樣品采集

1.選擇代表性的樣品，避免污染。

2.使用無菌工具（如無菌鑷子、剪刀）采集樣品。

3.樣品量應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康拇_定，一般為10-100克。

（二）樣品前處理

1.外部清潔：用70%酒精擦拭樣品表面，去除表面微生物。

2.破碎處理：固體樣品需均勻破碎，液體樣品需充分混勻。

3.無菌稀釋：根據(jù)樣品類型選擇合適的稀釋液（如生理鹽水、胰酪大豆胨水），按1:10、1:100等比例稀釋。

三、培養(yǎng)基制備

（一）培養(yǎng)基選擇

1.常用培養(yǎng)基包括：營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱瓊脂（MAC）、TSB（胰酪大豆胨肉湯）。

2.根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)選擇合適的培養(yǎng)基（如需計(jì)數(shù)選擇NA，需選擇性培養(yǎng)選擇MAC）。

（二）培養(yǎng)基制備步驟

1.稱量：按說明書稱取培養(yǎng)基粉末（如NA粉末約20克/升）。

2.溶解：加入蒸餾水，加熱攪拌至完全溶解。

3.分裝：將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿或試管中。

4.滅菌：高壓蒸汽滅菌（121℃，15分鐘）。

5.冷卻：培養(yǎng)皿靜置冷卻至45℃左右備用。

四、接種與培養(yǎng)

（一）平板接種

1.使用無菌接種環(huán)或涂布棒。

2.取適量樣品稀釋液，均勻涂布在瓊脂表面。

3.置于超凈工作臺(tái)操作，避免空氣污染。

（二）液體接種

1.將樣品稀釋液接種至試管培養(yǎng)基中。

2.振蕩混勻，確保微生物均勻分布。

（三）培養(yǎng)條件

1.溫度：37℃±1℃。

2.時(shí)間：需氧菌培養(yǎng)24-48小時(shí)，厭氧菌需特殊培養(yǎng)箱（如厭氧罐）。

3.培養(yǎng)方式：需氧菌敞口培養(yǎng)，厭氧菌用氣體置換或厭氧袋。

五、菌落計(jì)數(shù)

（一）平板計(jì)數(shù)法（MPN法）

1.選擇典型菌落（純色、圓形、隆起）。

2.估計(jì)菌落數(shù)：每皿計(jì)數(shù)菌落數(shù)在30-300之間。

3.計(jì)算cfu/g（colony-formingunitspergram）：

-公式：cfu/g=(平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/樣品量

（二）菌落形態(tài)觀察

1.通過顯微鏡初步鑒定菌落特征（如大小、顏色、邊緣形態(tài)）。

2.必要時(shí)進(jìn)行革蘭染色，進(jìn)一步確認(rèn)菌種。

六、結(jié)果分析

（一）陽(yáng)性結(jié)果處理

1.記錄菌落數(shù)及菌落形態(tài)。

2.必要時(shí)進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)或API鑒定。

（二）陰性結(jié)果處理

1.確認(rèn)樣品處理及培養(yǎng)過程無遺漏。

2.重復(fù)檢驗(yàn)以排除偶然誤差。

七、注意事項(xiàng)

（一）無菌操作

1.所有工具需滅菌（如高壓鍋、酒精燈）。

2.手部消毒（75%酒精擦拭）。

（二）避免污染

1.操作臺(tái)面定期消毒（如使用75%酒精噴霧）。

2.禁止非無菌物品進(jìn)入工作區(qū)域。

（三）記錄規(guī)范

1.檢驗(yàn)過程需詳細(xì)記錄（時(shí)間、溫度、菌落數(shù)等）。

2.保存原始數(shù)據(jù)（培養(yǎng)皿照片、計(jì)數(shù)表）。

八、質(zhì)量控制

（一）陽(yáng)性對(duì)照

1.每批檢驗(yàn)加入已知菌種（如大腸桿菌）作為陽(yáng)性對(duì)照。

（二）陰性對(duì)照

1.空白培養(yǎng)基檢驗(yàn)，確保無污染。

（三）重復(fù)檢驗(yàn)

1.對(duì)可疑結(jié)果進(jìn)行二次驗(yàn)證，確保準(zhǔn)確性。

**一、概述**

微生物檢驗(yàn)是評(píng)估樣品中微生物污染程度的重要手段，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境、醫(yī)療器械等領(lǐng)域。為確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必須遵循規(guī)范的操作流程。本指南旨在提供微生物檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，包括樣品處理、培養(yǎng)基制備、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。規(guī)范操作不僅能夠保證檢驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性，也是保證檢驗(yàn)人員自身安全的重要措施。本指南適用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)微生物檢驗(yàn)工作。

二、樣品處理

（一）樣品采集

1.**選擇代表性樣品**：樣品的代表性直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠诽匦?，選擇具有代表性的部位進(jìn)行采集。例如，采集固體樣品時(shí)，應(yīng)從包裝的不同部位多處取樣；采集散裝液體樣品時(shí)，應(yīng)從不同深度和位置取樣。避免僅采集表層或易受污染的部分。

2.**使用無菌工具**：所有用于采集樣品的工具必須是無菌的，包括鑷子、剪刀、取樣袋/容器等。使用前需用70%-75%酒精進(jìn)行表面消毒，并確保工具在無菌環(huán)境中打開和使用。

3.**控制樣品量**：樣品量應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠奉愋痛_定。一般固體樣品采集量為10-100克，液體樣品采集量為100-1000毫升。樣品量過少可能無法檢出微生物，樣品量過多則可能增加后續(xù)處理的工作量。

4.**記錄樣品信息**：詳細(xì)記錄樣品名稱、來源、采集日期、批號(hào)、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期等信息，并做好樣品標(biāo)識(shí)，防止混淆。

（二）樣品前處理

1.**外部清潔**：對(duì)于表面可能存在污染的樣品（如水果、蔬菜、肉類等），需先進(jìn)行外部清潔。使用無菌軟刷蘸取70%-75%酒精輕輕刷洗樣品表面，去除污垢和表面微生物，然后立即用清水沖洗（若后續(xù)檢驗(yàn)不受清水影響）或直接進(jìn)行下一步處理。

2.**破碎處理**：對(duì)于固體樣品，特別是組織樣品或含有多孔結(jié)構(gòu)的樣品，需要進(jìn)行破碎處理以確保內(nèi)部微生物的充分釋放。可以使用無菌研缽、剪刀、絞肉機(jī)等工具進(jìn)行破碎，直至樣品成為均勻的糊狀或糜狀。

3.**無菌稀釋**：根據(jù)樣品的物理狀態(tài)和預(yù)期的微生物含量，選擇合適的稀釋液。常用稀釋液包括0.1%無菌生理鹽水、0.9%無菌生理鹽水、胰酪大豆胨水（TSB）等。將破碎后的樣品加入無菌稀釋液中，按照一定的比例進(jìn)行稀釋。例如，進(jìn)行10倍系列稀釋，即取1克（或1毫升）樣品加入9克（或9毫升）稀釋液中，混勻后得到10^-1稀釋液；再取1毫升10^-1稀釋液加入9毫升稀釋液中，得到10^-2稀釋液，依此類推。稀釋過程中需確保充分混勻。

4.**選擇合適的稀釋梯度**：根據(jù)初步估計(jì)的樣品污染水平，選擇合適的稀釋梯度。若樣品污染水平較高，可先進(jìn)行較高稀釋倍數(shù)的稀釋；若樣品污染水平較低，則應(yīng)選擇較低稀釋倍數(shù)的稀釋，以確保平板上菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)（通常為30-300個(gè)菌落）。

三、培養(yǎng)基制備

（一）培養(yǎng)基選擇

1.**營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）**：通用培養(yǎng)基，適用于大多數(shù)需氧細(xì)菌和酵母菌的分離培養(yǎng)。常用于總菌落數(shù)計(jì)數(shù)和一般性細(xì)菌鑒定。

2.**麥康凱瓊脂（MAC）**：選擇性培養(yǎng)基，含有伊紅美藍(lán)染料，能選擇性抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，適用于大腸菌群等腸桿菌科細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)。

3.**TSB（胰酪大豆胨肉湯）**：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，適用于微生物的增菌培養(yǎng)或保存。也可用于某些微生物的快速檢測(cè)，如氧化酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)等。

4.**其他培養(yǎng)基**：根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，可能還需要使用其他特殊培養(yǎng)基，如血瓊脂平板（用于培養(yǎng)需氧菌兼性厭氧菌，觀察溶血現(xiàn)象）、沙氏葡萄糖瓊脂（用于真菌培養(yǎng)）等。

（二）培養(yǎng)基制備步驟

1.**稱量**：根據(jù)培養(yǎng)基說明書的要求，準(zhǔn)確稱取培養(yǎng)基粉末。例如，制備1升營(yíng)養(yǎng)瓊脂，需稱取20克營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉末。使用分析天平進(jìn)行稱量，確保精度。

2.**溶解**：將稱量好的培養(yǎng)基粉末加入適量的蒸餾水或去離子水中（通常為1升），用小火或中火加熱并不斷攪拌，直至培養(yǎng)基粉末完全溶解。注意有些培養(yǎng)基成分（如瓊脂）需要充分溶解才能避免沉淀。

3.**調(diào)節(jié)pH（如需要）**：某些培養(yǎng)基需要調(diào)節(jié)pH值至特定范圍。使用pH計(jì)測(cè)量培養(yǎng)基溶液的pH值，必要時(shí)用無菌NaOH或HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。記錄最終pH值。

4.**分裝**：將制備好的培養(yǎng)基溶液冷卻至適宜溫度（通常為45℃-50℃）后，倒入無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入約15-20毫升。對(duì)于試管培養(yǎng)基，使用無菌吸管或傾注法將培養(yǎng)基分裝到試管中，裝量約為試管高度的1/5至1/4。

5.**封口與滅菌**：將分裝好的培養(yǎng)皿和試管口用無菌棉塞或硅膠塞封好，或用鋁箔紙封口。然后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。通常采用高壓蒸汽滅菌鍋，設(shè)置參數(shù)為121℃、15-20分鐘（根據(jù)培養(yǎng)基體積和類型調(diào)整滅菌時(shí)間）。

6.**冷卻與保存**：滅菌后的培養(yǎng)基需冷卻至適宜接種的溫度，通常為45℃-50℃（用于平板劃線或傾注）、室溫（約25℃-28℃）或4℃冰箱（用于長(zhǎng)期保存）。冷卻后的瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)立即用于接種，或在室溫下保存?zhèn)溆茫灰碎L(zhǎng)時(shí)間放置，以免污染或培養(yǎng)基質(zhì)量下降。

四、接種與培養(yǎng)

（一）平板接種

1.**平板劃線法**：適用于從混合菌樣中分離純種。常用四區(qū)劃線法。

*(1)將無菌接種環(huán)在火焰上燒至紅熱，冷卻。

*(2)開啟樣品管蓋，用冷卻后的接種環(huán)蘸取少量樣品。

*(3)在第一區(qū)劃線，接種環(huán)在瓊脂表面作來回直線劃線，劃約30-50條線，線條應(yīng)盡量密集但不重疊。

*(4)將接種環(huán)再次火焰滅菌并冷卻。

*(5)從第一區(qū)末端開始，用接種環(huán)輕輕挑起少量菌苔，移至第二區(qū)，劃線方法同第一區(qū)。

*(6)重復(fù)步驟(4)和(5)，依次劃第三區(qū)、第四區(qū)。每區(qū)劃線后，接種環(huán)均需火焰滅菌并冷卻。

*(7)劃線結(jié)束后，蓋上皿蓋，將平板置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，倒置培養(yǎng)（防止冷凝水滴落污染菌落）。

2.**傾注平板法**：適用于計(jì)數(shù)和培養(yǎng)兼性厭氧菌。

*(1)將平板底部打開約三分之一，用無菌吸管吸取1-5毫升（根據(jù)樣品稀釋液濃度和預(yù)計(jì)菌落數(shù)確定）樣品稀釋液，倒入平板中。

*(2)迅速蓋上皿蓋，輕輕搖晃平板，使培養(yǎng)基均勻覆蓋整個(gè)皿底。

*(3)靜置凝固（約15-30分鐘）。

*(4)開啟皿蓋，將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.**涂布平板法**：適用于均勻分散菌液，獲得單菌落。

*(1)將平板底部打開約三分之一，用無菌涂布棒蘸取少量菌液（或樣品稀釋液）。

*(2)在皿中央輕輕涂抹，使菌液均勻分布。

*(3)將涂布棒再次火焰滅菌。

*(4)將平板傾斜，用無菌吸管沿皿壁緩慢加入適量菌液（或樣品稀釋液），使菌液沿皿壁流動(dòng)，覆蓋整個(gè)表面。

*(5)靜置凝固（約15-30分鐘）。

*(6)開啟皿蓋，將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（二）液體接種

1.**試管接種**：適用于增菌培養(yǎng)或進(jìn)行某些生理生化試驗(yàn)。

*(1)將試管口在火焰上燒灼滅菌，冷卻。

*(2)開啟樣品管蓋，用接種環(huán)或接種針蘸取少量樣品。

*(3)將菌樣接種到試管培養(yǎng)基中，通常接種量為1-3毫升。

*(4)混勻（若為液體樣品）或輕輕吹打（若為固體樣品粉末）。

*(5)如需進(jìn)行動(dòng)力試驗(yàn)，可制作雙線接種（平行接種兩條線）。

*(6)蓋上管蓋，將試管置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（三）培養(yǎng)條件

1.**溫度**：最常用的培養(yǎng)溫度為37℃±1℃。某些微生物（如酵母菌、霉菌）可能需要較低溫度（如25℃-28℃）。厭氧菌則需要特定的厭氧培養(yǎng)箱，溫度通常為35℃-37℃。

2.**時(shí)間**：大多數(shù)需氧細(xì)菌和酵母菌在37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)可見典型菌落。某些緩慢生長(zhǎng)的微生物可能需要更長(zhǎng)時(shí)間（如72小時(shí)或更長(zhǎng)）。厭氧菌的培養(yǎng)時(shí)間通常更長(zhǎng)，可能需要48-72小時(shí)或更久。

3.**培養(yǎng)方式**：

***需氧培養(yǎng)**：將培養(yǎng)皿或試管敞口放入培養(yǎng)箱中，或使用氣體發(fā)生袋（如含CO2的袋）提供富氧環(huán)境。

***厭氧培養(yǎng)**：將培養(yǎng)皿或試管放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，或使用厭氧罐、厭氧袋等裝置，通過置換氣體或使用化學(xué)產(chǎn)氣劑（如連二亞硫酸鈉）創(chuàng)造無氧或低氧環(huán)境。

***二氧化碳培養(yǎng)**：某些專性二氧化碳依賴菌需要在含有5%-10%CO2的氣體環(huán)境中培養(yǎng)。

五、菌落計(jì)數(shù)

（一）平板計(jì)數(shù)法（MPN法）

1.**選擇典型菌落**：計(jì)數(shù)前，需仔細(xì)觀察平板上的菌落，選擇典型的、孤立的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。避免計(jì)數(shù)邊緣模糊、合并的菌落，以及被雜菌污染或生長(zhǎng)不良的菌落。

2.**估計(jì)菌落數(shù)**：選擇菌落數(shù)在30-300個(gè)范圍內(nèi)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。若一個(gè)稀釋度下菌落數(shù)過多，可取其子稀釋液進(jìn)行計(jì)數(shù)；若菌落數(shù)過少，則應(yīng)采用其上稀釋液進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于每個(gè)稀釋度，通常計(jì)數(shù)3個(gè)平板，取其平均值。

3.**計(jì)算cfu/g（colony-formingunitspergram）**：根據(jù)平板計(jì)數(shù)值和稀釋倍數(shù)，計(jì)算每克樣品中的菌落數(shù)。

-公式：cfu/g=(平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/樣品量

-例如：取1克樣品稀釋10倍，取0.1毫升稀釋液涂布平板，計(jì)數(shù)三個(gè)平板，平均菌落數(shù)為150個(gè)。則cfu/g=(150×10×10)/1=15000cfu/g。

（二）菌落形態(tài)觀察

1.**宏觀觀察**：通過肉眼觀察菌落的大小、形狀（圓形、橢圓形、不規(guī)則形等）、顏色（白色、黃色、紅色等）、邊緣（整齊、波狀、鋸齒狀等）、表面（光滑、粗糙、粘液狀、絲絨狀等）、隆起程度（扁平、凸起、臍狀等）以及透明度（透明、半透明、不透明等）。

2.**顯微鏡觀察**：將挑取的菌落制成菌懸液或涂片，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌體的形狀（球菌、桿菌、螺旋菌等）、大小、顏色（革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，陰性菌呈紅色或粉色）、排列方式（單在、成對(duì)、成鏈、成簇等）以及有無莢膜、鞭毛、芽孢等特殊結(jié)構(gòu)。

3.**生化試驗(yàn)**：根據(jù)初步鑒定的結(jié)果，選擇相應(yīng)的生化試驗(yàn)（如氧化酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)等），進(jìn)一步鑒定微生物的種類。

六、結(jié)果分析

（一）陽(yáng)性結(jié)果處理

1.**記錄菌落數(shù)和菌落形態(tài)**：詳細(xì)記錄每個(gè)平板的菌落數(shù)、菌落形態(tài)特征，并拍照留存。

2.**純化培養(yǎng)**：從典型菌落中挑取菌體，接種到新的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至獲得純種。

3.**鑒定**：對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，包括形態(tài)學(xué)觀察（顯微鏡檢查）、生化試驗(yàn)系列、或分子生物學(xué)方法（如PCR、基因測(cè)序等）。根據(jù)鑒定結(jié)果，確定微生物的種或?qū)佟?/p>

4.**結(jié)果報(bào)告**：根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康模珜憴z驗(yàn)報(bào)告，包括樣品信息、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果（菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)或其他鑒定出的微生物種類及數(shù)量）、結(jié)論等。

（二）陰性結(jié)果處理

1.**確認(rèn)檢驗(yàn)過程**：回顧整個(gè)檢驗(yàn)過程，檢查是否有操作失誤，如樣品處理不當(dāng)、培養(yǎng)基制備錯(cuò)誤、接種量不足、培養(yǎng)條件不適宜等。

2.**重復(fù)檢驗(yàn)**：若確認(rèn)檢驗(yàn)過程無誤，但結(jié)果仍為陰性，建議重復(fù)檢驗(yàn)一次，以排除偶然誤差。

3.**結(jié)果報(bào)告**：在檢驗(yàn)報(bào)告中注明結(jié)果為陰性，并說明檢驗(yàn)過程已按要求嚴(yán)格執(zhí)行。

七、注意事項(xiàng)

（一）無菌操作

1.**環(huán)境要求**：所有微生物檢驗(yàn)工作應(yīng)在超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。工作前需對(duì)工作臺(tái)面進(jìn)行消毒（如使用70%-75%酒精擦拭）。

2.**工具滅菌**：所有接觸樣品和培養(yǎng)基的工具（如接種環(huán)、涂布棒、試管、培養(yǎng)皿等）必須使用高壓蒸汽滅菌鍋或干熱滅菌箱進(jìn)行滅菌。

3.**手部消毒**：操作前用70%-75%酒精對(duì)手部進(jìn)行消毒。操作過程中盡量避免手部接觸無菌區(qū)域。

4.**樣品處理**：打開樣品容器時(shí)，應(yīng)避免污染內(nèi)部。盡量在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行樣品的內(nèi)部處理和稀釋。

5.**防止氣溶膠**：接種、劃線等操作應(yīng)輕柔，避免產(chǎn)生氣溶膠。傾注平板時(shí)動(dòng)作要慢，防止培養(yǎng)基濺出。

（二）避免污染

1.**工作臺(tái)面消毒**：每次使用前后，均需用70%-75%酒精擦拭工作臺(tái)面。

2.**防止交叉污染**：不同樣品的檢驗(yàn)應(yīng)分開進(jìn)行，避免樣品間相互污染。使用不同的接種環(huán)或涂布棒處理不同樣品。

3.**蓋好容器**：樣品管、培養(yǎng)基瓶等容器應(yīng)隨時(shí)蓋好，防止空氣中微生物落入。

4.**廢棄物處理**：檢驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢棄物（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、菌液等）應(yīng)視為潛在污染源，按照規(guī)定進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后才能丟棄。

（三）記錄規(guī)范

1.**詳細(xì)記錄**：檢驗(yàn)過程中所有關(guān)鍵步驟和參數(shù)（如樣品信息、培養(yǎng)基名稱及制備日期、滅菌參數(shù)、稀釋倍數(shù)、接種量、培養(yǎng)條件、菌落數(shù)、觀察結(jié)果等）均需詳細(xì)記錄。

2.**原始數(shù)據(jù)**：保留原始數(shù)據(jù)，如培養(yǎng)皿照片（可使用手機(jī)拍照）、計(jì)數(shù)表、生化試驗(yàn)結(jié)果等。這些數(shù)據(jù)是結(jié)果分析和報(bào)告的重要依據(jù)。

3.**字跡清晰**：記錄應(yīng)字跡清晰、準(zhǔn)確無誤，避免使用模糊或易混淆的符號(hào)。

4.**及時(shí)記錄**：建議在檢驗(yàn)過程中或完成后立即記錄，避免遺忘或記錯(cuò)信息。

八、質(zhì)量控制

（一）陽(yáng)性對(duì)照

1.**目的**：驗(yàn)證培養(yǎng)基制備、滅菌、接種等環(huán)節(jié)是否正常，以及檢驗(yàn)人員操作是否得當(dāng)。

2.**操作**：每批檢驗(yàn)均需同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。通常在NA瓊脂平板上接種已知數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)菌株（如大腸桿菌）。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)能在規(guī)定時(shí)間內(nèi)（如37℃培養(yǎng)24小時(shí)后）形成典型菌落。

3.**判斷**：若陽(yáng)性對(duì)照未生長(zhǎng)，說明檢驗(yàn)過程存在問題，所有結(jié)果應(yīng)視為無效，需查找原因并重新檢驗(yàn)。

（二）陰性對(duì)照

1.**目的**：檢測(cè)培養(yǎng)基是否被污染。

2.**操作**：制備過程中應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照。例如，取少量未接種任何樣品的培養(yǎng)基（如TSB肉湯或NA瓊脂）進(jìn)行滅菌和分裝，與樣品培養(yǎng)基一同培養(yǎng)。

3.**判斷**：若陰性對(duì)照培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基或滅菌過程存在問題，所有結(jié)果應(yīng)視為無效，需查找原因并重新檢驗(yàn)。

（三）重復(fù)檢驗(yàn)

1.**目的**：提高檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，減少偶然誤差。

2.**操作**：對(duì)于可疑結(jié)果（如菌落數(shù)接近界限值、形態(tài)不典型等）或重要結(jié)果，建議進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)。重復(fù)檢驗(yàn)應(yīng)使用新的樣品和培養(yǎng)基。

3.**判斷**：若兩次檢驗(yàn)結(jié)果一致，則結(jié)果可信。若結(jié)果不一致，需進(jìn)行第三次檢驗(yàn)，并根據(jù)三次結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。若三次結(jié)果仍不一致，需查找原因，必要時(shí)咨詢有經(jīng)驗(yàn)的人員。

（四）能力驗(yàn)證

1.**目的**：定期評(píng)估實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)?zāi)芰蜋z驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.**操作**：參加由相關(guān)機(jī)構(gòu)組織的能力驗(yàn)證計(jì)劃（如室間質(zhì)評(píng)），使用盲樣進(jìn)行檢驗(yàn)，并將結(jié)果提交給組織機(jī)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.**改進(jìn)**：根據(jù)能力驗(yàn)證結(jié)果，分析實(shí)驗(yàn)室存在的不足，并采取相應(yīng)的改進(jìn)措施，不斷提高檢驗(yàn)水平。

一、概述

微生物檢驗(yàn)是評(píng)估樣品中微生物污染程度的重要手段，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境、醫(yī)療器械等領(lǐng)域。為確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必須遵循規(guī)范的操作流程。本指南旨在提供微生物檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，包括樣品處理、培養(yǎng)基制備、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

二、樣品處理

（一）樣品采集

1.選擇代表性的樣品，避免污染。

2.使用無菌工具（如無菌鑷子、剪刀）采集樣品。

3.樣品量應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康拇_定，一般為10-100克。

（二）樣品前處理

1.外部清潔：用70%酒精擦拭樣品表面，去除表面微生物。

2.破碎處理：固體樣品需均勻破碎，液體樣品需充分混勻。

3.無菌稀釋：根據(jù)樣品類型選擇合適的稀釋液（如生理鹽水、胰酪大豆胨水），按1:10、1:100等比例稀釋。

三、培養(yǎng)基制備

（一）培養(yǎng)基選擇

1.常用培養(yǎng)基包括：營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱瓊脂（MAC）、TSB（胰酪大豆胨肉湯）。

2.根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)選擇合適的培養(yǎng)基（如需計(jì)數(shù)選擇NA，需選擇性培養(yǎng)選擇MAC）。

（二）培養(yǎng)基制備步驟

1.稱量：按說明書稱取培養(yǎng)基粉末（如NA粉末約20克/升）。

2.溶解：加入蒸餾水，加熱攪拌至完全溶解。

3.分裝：將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿或試管中。

4.滅菌：高壓蒸汽滅菌（121℃，15分鐘）。

5.冷卻：培養(yǎng)皿靜置冷卻至45℃左右備用。

四、接種與培養(yǎng)

（一）平板接種

1.使用無菌接種環(huán)或涂布棒。

2.取適量樣品稀釋液，均勻涂布在瓊脂表面。

3.置于超凈工作臺(tái)操作，避免空氣污染。

（二）液體接種

1.將樣品稀釋液接種至試管培養(yǎng)基中。

2.振蕩混勻，確保微生物均勻分布。

（三）培養(yǎng)條件

1.溫度：37℃±1℃。

2.時(shí)間：需氧菌培養(yǎng)24-48小時(shí)，厭氧菌需特殊培養(yǎng)箱（如厭氧罐）。

3.培養(yǎng)方式：需氧菌敞口培養(yǎng)，厭氧菌用氣體置換或厭氧袋。

五、菌落計(jì)數(shù)

（一）平板計(jì)數(shù)法（MPN法）

1.選擇典型菌落（純色、圓形、隆起）。

2.估計(jì)菌落數(shù)：每皿計(jì)數(shù)菌落數(shù)在30-300之間。

3.計(jì)算cfu/g（colony-formingunitspergram）：

-公式：cfu/g=(平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/樣品量

（二）菌落形態(tài)觀察

1.通過顯微鏡初步鑒定菌落特征（如大小、顏色、邊緣形態(tài)）。

2.必要時(shí)進(jìn)行革蘭染色，進(jìn)一步確認(rèn)菌種。

六、結(jié)果分析

（一）陽(yáng)性結(jié)果處理

1.記錄菌落數(shù)及菌落形態(tài)。

2.必要時(shí)進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)或API鑒定。

（二）陰性結(jié)果處理

1.確認(rèn)樣品處理及培養(yǎng)過程無遺漏。

2.重復(fù)檢驗(yàn)以排除偶然誤差。

七、注意事項(xiàng)

（一）無菌操作

1.所有工具需滅菌（如高壓鍋、酒精燈）。

2.手部消毒（75%酒精擦拭）。

（二）避免污染

1.操作臺(tái)面定期消毒（如使用75%酒精噴霧）。

2.禁止非無菌物品進(jìn)入工作區(qū)域。

（三）記錄規(guī)范

1.檢驗(yàn)過程需詳細(xì)記錄（時(shí)間、溫度、菌落數(shù)等）。

2.保存原始數(shù)據(jù)（培養(yǎng)皿照片、計(jì)數(shù)表）。

八、質(zhì)量控制

（一）陽(yáng)性對(duì)照

1.每批檢驗(yàn)加入已知菌種（如大腸桿菌）作為陽(yáng)性對(duì)照。

（二）陰性對(duì)照

1.空白培養(yǎng)基檢驗(yàn)，確保無污染。

（三）重復(fù)檢驗(yàn)

1.對(duì)可疑結(jié)果進(jìn)行二次驗(yàn)證，確保準(zhǔn)確性。

**一、概述**

微生物檢驗(yàn)是評(píng)估樣品中微生物污染程度的重要手段，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境、醫(yī)療器械等領(lǐng)域。為確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必須遵循規(guī)范的操作流程。本指南旨在提供微生物檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，包括樣品處理、培養(yǎng)基制備、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及結(jié)果分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。規(guī)范操作不僅能夠保證檢驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性，也是保證檢驗(yàn)人員自身安全的重要措施。本指南適用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)微生物檢驗(yàn)工作。

二、樣品處理

（一）樣品采集

1.**選擇代表性樣品**：樣品的代表性直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠诽匦?，選擇具有代表性的部位進(jìn)行采集。例如，采集固體樣品時(shí)，應(yīng)從包裝的不同部位多處取樣；采集散裝液體樣品時(shí)，應(yīng)從不同深度和位置取樣。避免僅采集表層或易受污染的部分。

2.**使用無菌工具**：所有用于采集樣品的工具必須是無菌的，包括鑷子、剪刀、取樣袋/容器等。使用前需用70%-75%酒精進(jìn)行表面消毒，并確保工具在無菌環(huán)境中打開和使用。

3.**控制樣品量**：樣品量應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠奉愋痛_定。一般固體樣品采集量為10-100克，液體樣品采集量為100-1000毫升。樣品量過少可能無法檢出微生物，樣品量過多則可能增加后續(xù)處理的工作量。

4.**記錄樣品信息**：詳細(xì)記錄樣品名稱、來源、采集日期、批號(hào)、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期等信息，并做好樣品標(biāo)識(shí)，防止混淆。

（二）樣品前處理

1.**外部清潔**：對(duì)于表面可能存在污染的樣品（如水果、蔬菜、肉類等），需先進(jìn)行外部清潔。使用無菌軟刷蘸取70%-75%酒精輕輕刷洗樣品表面，去除污垢和表面微生物，然后立即用清水沖洗（若后續(xù)檢驗(yàn)不受清水影響）或直接進(jìn)行下一步處理。

2.**破碎處理**：對(duì)于固體樣品，特別是組織樣品或含有多孔結(jié)構(gòu)的樣品，需要進(jìn)行破碎處理以確保內(nèi)部微生物的充分釋放?？梢允褂脽o菌研缽、剪刀、絞肉機(jī)等工具進(jìn)行破碎，直至樣品成為均勻的糊狀或糜狀。

3.**無菌稀釋**：根據(jù)樣品的物理狀態(tài)和預(yù)期的微生物含量，選擇合適的稀釋液。常用稀釋液包括0.1%無菌生理鹽水、0.9%無菌生理鹽水、胰酪大豆胨水（TSB）等。將破碎后的樣品加入無菌稀釋液中，按照一定的比例進(jìn)行稀釋。例如，進(jìn)行10倍系列稀釋，即取1克（或1毫升）樣品加入9克（或9毫升）稀釋液中，混勻后得到10^-1稀釋液；再取1毫升10^-1稀釋液加入9毫升稀釋液中，得到10^-2稀釋液，依此類推。稀釋過程中需確保充分混勻。

4.**選擇合適的稀釋梯度**：根據(jù)初步估計(jì)的樣品污染水平，選擇合適的稀釋梯度。若樣品污染水平較高，可先進(jìn)行較高稀釋倍數(shù)的稀釋；若樣品污染水平較低，則應(yīng)選擇較低稀釋倍數(shù)的稀釋，以確保平板上菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)（通常為30-300個(gè)菌落）。

三、培養(yǎng)基制備

（一）培養(yǎng)基選擇

1.**營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）**：通用培養(yǎng)基，適用于大多數(shù)需氧細(xì)菌和酵母菌的分離培養(yǎng)。常用于總菌落數(shù)計(jì)數(shù)和一般性細(xì)菌鑒定。

2.**麥康凱瓊脂（MAC）**：選擇性培養(yǎng)基，含有伊紅美藍(lán)染料，能選擇性抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，適用于大腸菌群等腸桿菌科細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)。

3.**TSB（胰酪大豆胨肉湯）**：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，適用于微生物的增菌培養(yǎng)或保存。也可用于某些微生物的快速檢測(cè)，如氧化酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)等。

4.**其他培養(yǎng)基**：根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，可能還需要使用其他特殊培養(yǎng)基，如血瓊脂平板（用于培養(yǎng)需氧菌兼性厭氧菌，觀察溶血現(xiàn)象）、沙氏葡萄糖瓊脂（用于真菌培養(yǎng)）等。

（二）培養(yǎng)基制備步驟

1.**稱量**：根據(jù)培養(yǎng)基說明書的要求，準(zhǔn)確稱取培養(yǎng)基粉末。例如，制備1升營(yíng)養(yǎng)瓊脂，需稱取20克營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉末。使用分析天平進(jìn)行稱量，確保精度。

2.**溶解**：將稱量好的培養(yǎng)基粉末加入適量的蒸餾水或去離子水中（通常為1升），用小火或中火加熱并不斷攪拌，直至培養(yǎng)基粉末完全溶解。注意有些培養(yǎng)基成分（如瓊脂）需要充分溶解才能避免沉淀。

3.**調(diào)節(jié)pH（如需要）**：某些培養(yǎng)基需要調(diào)節(jié)pH值至特定范圍。使用pH計(jì)測(cè)量培養(yǎng)基溶液的pH值，必要時(shí)用無菌NaOH或HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。記錄最終pH值。

4.**分裝**：將制備好的培養(yǎng)基溶液冷卻至適宜溫度（通常為45℃-50℃）后，倒入無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入約15-20毫升。對(duì)于試管培養(yǎng)基，使用無菌吸管或傾注法將培養(yǎng)基分裝到試管中，裝量約為試管高度的1/5至1/4。

5.**封口與滅菌**：將分裝好的培養(yǎng)皿和試管口用無菌棉塞或硅膠塞封好，或用鋁箔紙封口。然后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。通常采用高壓蒸汽滅菌鍋，設(shè)置參數(shù)為121℃、15-20分鐘（根據(jù)培養(yǎng)基體積和類型調(diào)整滅菌時(shí)間）。

6.**冷卻與保存**：滅菌后的培養(yǎng)基需冷卻至適宜接種的溫度，通常為45℃-50℃（用于平板劃線或傾注）、室溫（約25℃-28℃）或4℃冰箱（用于長(zhǎng)期保存）。冷卻后的瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)立即用于接種，或在室溫下保存?zhèn)溆茫灰碎L(zhǎng)時(shí)間放置，以免污染或培養(yǎng)基質(zhì)量下降。

四、接種與培養(yǎng)

（一）平板接種

1.**平板劃線法**：適用于從混合菌樣中分離純種。常用四區(qū)劃線法。

*(1)將無菌接種環(huán)在火焰上燒至紅熱，冷卻。

*(2)開啟樣品管蓋，用冷卻后的接種環(huán)蘸取少量樣品。

*(3)在第一區(qū)劃線，接種環(huán)在瓊脂表面作來回直線劃線，劃約30-50條線，線條應(yīng)盡量密集但不重疊。

*(4)將接種環(huán)再次火焰滅菌并冷卻。

*(5)從第一區(qū)末端開始，用接種環(huán)輕輕挑起少量菌苔，移至第二區(qū)，劃線方法同第一區(qū)。

*(6)重復(fù)步驟(4)和(5)，依次劃第三區(qū)、第四區(qū)。每區(qū)劃線后，接種環(huán)均需火焰滅菌并冷卻。

*(7)劃線結(jié)束后，蓋上皿蓋，將平板置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，倒置培養(yǎng)（防止冷凝水滴落污染菌落）。

2.**傾注平板法**：適用于計(jì)數(shù)和培養(yǎng)兼性厭氧菌。

*(1)將平板底部打開約三分之一，用無菌吸管吸取1-5毫升（根據(jù)樣品稀釋液濃度和預(yù)計(jì)菌落數(shù)確定）樣品稀釋液，倒入平板中。

*(2)迅速蓋上皿蓋，輕輕搖晃平板，使培養(yǎng)基均勻覆蓋整個(gè)皿底。

*(3)靜置凝固（約15-30分鐘）。

*(4)開啟皿蓋，將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.**涂布平板法**：適用于均勻分散菌液，獲得單菌落。

*(1)將平板底部打開約三分之一，用無菌涂布棒蘸取少量菌液（或樣品稀釋液）。

*(2)在皿中央輕輕涂抹，使菌液均勻分布。

*(3)將涂布棒再次火焰滅菌。

*(4)將平板傾斜，用無菌吸管沿皿壁緩慢加入適量菌液（或樣品稀釋液），使菌液沿皿壁流動(dòng)，覆蓋整個(gè)表面。

*(5)靜置凝固（約15-30分鐘）。

*(6)開啟皿蓋，將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（二）液體接種

1.**試管接種**：適用于增菌培養(yǎng)或進(jìn)行某些生理生化試驗(yàn)。

*(1)將試管口在火焰上燒灼滅菌，冷卻。

*(2)開啟樣品管蓋，用接種環(huán)或接種針蘸取少量樣品。

*(3)將菌樣接種到試管培養(yǎng)基中，通常接種量為1-3毫升。

*(4)混勻（若為液體樣品）或輕輕吹打（若為固體樣品粉末）。

*(5)如需進(jìn)行動(dòng)力試驗(yàn)，可制作雙線接種（平行接種兩條線）。

*(6)蓋上管蓋，將試管置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（三）培養(yǎng)條件

1.**溫度**：最常用的培養(yǎng)溫度為37℃±1℃。某些微生物（如酵母菌、霉菌）可能需要較低溫度（如25℃-28℃）。厭氧菌則需要特定的厭氧培養(yǎng)箱，溫度通常為35℃-37℃。

2.**時(shí)間**：大多數(shù)需氧細(xì)菌和酵母菌在37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)可見典型菌落。某些緩慢生長(zhǎng)的微生物可能需要更長(zhǎng)時(shí)間（如72小時(shí)或更長(zhǎng)）。厭氧菌的培養(yǎng)時(shí)間通常更長(zhǎng)，可能需要48-72小時(shí)或更久。

3.**培養(yǎng)方式**：

***需氧培養(yǎng)**：將培養(yǎng)皿或試管敞口放入培養(yǎng)箱中，或使用氣體發(fā)生袋（如含CO2的袋）提供富氧環(huán)境。

***厭氧培養(yǎng)**：將培養(yǎng)皿或試管放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，或使用厭氧罐、厭氧袋等裝置，通過置換氣體或使用化學(xué)產(chǎn)氣劑（如連二亞硫酸鈉）創(chuàng)造無氧或低氧環(huán)境。

***二氧化碳培養(yǎng)**：某些專性二氧化碳依賴菌需要在含有5%-10%CO2的氣體環(huán)境中培養(yǎng)。

五、菌落計(jì)數(shù)

（一）平板計(jì)數(shù)法（MPN法）

1.**選擇典型菌落**：計(jì)數(shù)前，需仔細(xì)觀察平板上的菌落，選擇典型的、孤立的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。避免計(jì)數(shù)邊緣模糊、合并的菌落，以及被雜菌污染或生長(zhǎng)不良的菌落。

2.**估計(jì)菌落數(shù)**：選擇菌落數(shù)在30-300個(gè)范圍內(nèi)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。若一個(gè)稀釋度下菌落數(shù)過多，可取其子稀釋液進(jìn)行計(jì)數(shù)；若菌落數(shù)過少，則應(yīng)采用其上稀釋液進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于每個(gè)稀釋度，通常計(jì)數(shù)3個(gè)平板，取其平均值。

3.**計(jì)算cfu/g（colony-formingunitspergram）**：根據(jù)平板計(jì)數(shù)值和稀釋倍數(shù)，計(jì)算每克樣品中的菌落數(shù)。

-公式：cfu/g=(平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/樣品量

-例如：取1克樣品稀釋10倍，取0.1毫升稀釋液涂布平板，計(jì)數(shù)三個(gè)平板，平均菌落數(shù)為150個(gè)。則cfu/g=(150×10×10)/1=15000cfu/g。

（二）菌落形態(tài)觀察

1.**宏觀觀察**：通過肉眼觀察菌落的大小、形狀（圓形、橢圓形、不規(guī)則形等）、顏色（白色、黃色、紅色等）、邊緣（整齊、波狀、鋸齒狀等）、表面（光滑、粗糙、粘液狀、絲絨狀等）、隆起程度（扁平、凸起、臍狀等）以及透明度（透明、半透明、不透明等）。

2.**顯微鏡觀察**：將挑取的菌落制成菌懸液或涂片，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌體的形狀（球菌、桿菌、螺旋菌等）、大小、顏色（革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，陰性菌呈紅色或粉色）、排列方式（單在、成對(duì)、成鏈、成簇等）以及有無莢膜、鞭毛、芽孢等特殊結(jié)構(gòu)。

3.**生化試驗(yàn)**：根據(jù)初步鑒定的結(jié)果，選擇相應(yīng)的生化試驗(yàn)（如氧化酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)等），進(jìn)一步鑒定微生物的種類。

六、結(jié)果分析

（一）陽(yáng)性結(jié)果處理

1.**記錄菌落數(shù)和菌落形態(tài)**：詳細(xì)記錄每個(gè)平板的菌落數(shù)、菌落形態(tài)特征，并拍照留存。

2.**純化培養(yǎng)**：從典型菌落中挑取菌體，接種到新的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至獲得純種。

3.**鑒定**：對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，包括形態(tài)學(xué)觀察（顯微鏡檢查）、生化試驗(yàn)系列、或分子生物學(xué)方法（如PCR、基因測(cè)序等）。根據(jù)鑒定結(jié)果，確定微生物的種或?qū)佟?/p>

4.**結(jié)果報(bào)告**：根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康?，撰寫檢驗(yàn)報(bào)告，包括樣品信息、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果（菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)或其他鑒定出的微生物種類及數(shù)量）、結(jié)論等。

（二）陰性結(jié)果處理

1.**確認(rèn)檢驗(yàn)過程**：回顧整個(gè)檢驗(yàn)過程，檢查是否有操作失誤，如樣品處理不當(dāng)、培養(yǎng)基制備錯(cuò)誤、接種量不足、培養(yǎng)條件不適宜等。

2.**重復(fù)檢驗(yàn)**：若確認(rèn)檢驗(yàn)過程無誤，但結(jié)果仍為陰性，建議重復(fù)檢驗(yàn)一次，以排除偶然誤差。

3.**結(jié)果報(bào)告**：在檢驗(yàn)報(bào)告中注明結(jié)果為陰性，并說明檢驗(yàn)