目錄中文摘要……………1英文摘要……………3前言……………5文獻綜述……………6正文……………10分析討論……………16結(jié)論……………17參考文獻……………18致謝……………12個人簡歷……………13摘要目的：漢城細辛是細辛的藥用植物來源之一，研究漢城細辛的葉綠體基因組全序列意在補充馬兜鈴科細辛屬藥用植物葉綠體基因組的相關(guān)信息，豐富葉綠體基因組庫，為細辛的鑒定、植物親緣關(guān)系判斷、物種進化史、葉綠體農(nóng)藝性狀改良等相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。方法：選用文獻查閱的方法。二、選用離心技術(shù)對葉綠體DNA進行提取。三、選用以高通量測序法為主對葉綠體DNA進行測序。四、選用MEGA6軟件對包括漢城細辛在內(nèi)的十一種植物建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果：查閱文獻確定了DNA的提取方法（離心技術(shù)）、測序方法（以高通量測序法為主）以及建立系統(tǒng)發(fā)育樹所使用的的軟件（MEGA6軟件）。以高通量測序法為主進行測序得到漢城細辛葉綠體基因組圖譜（詳見圖一）。使用MEGA6軟件對包括漢城細辛在內(nèi)的11種植物的系統(tǒng)發(fā)育分析得到系統(tǒng)發(fā)育樹圖（詳見圖二）。結(jié)論：漢城細辛完整葉綠體基因組長167,293bp，總GC含量為37.90％，總AT含量為62.10％，具有由SSC（21,415bp）和LSC（89,840bp）分開的一對IR（28,019bp）組成的典型四分體結(jié)構(gòu)。漢城細辛cp基因組編碼132個獨特的基因，包括88個蛋白編碼基因，36個tRNA基因和8個rRNA基因，以及41個在IR區(qū)復(fù)制的基因。選用MEGA6軟件對包括漢城細辛在內(nèi)的11種藥用植物進行系統(tǒng)發(fā)育分析，漢城細辛與細辛的系統(tǒng)發(fā)育位置密切相關(guān)，其次為國外的細辛屬植物和馬蹄香。與圖中馬兜鈴科植物北馬兜鈴、馬兜鈴、耳葉馬兜鈴、寶興馬兜鈴、大葉馬兜鈴、尋骨風關(guān)系較遠；燈盞細辛距離漢城細辛關(guān)系最遠。關(guān)鍵詞：漢城細辛，葉綠體，基因組

AbstractPurpose：AsarumsieboldiiMiq.f.isoneofthesourcesofAsarumsieboldiiMiq.'smedicinalplants.ThestudyonthecompletesequenceofAsarumsieboldiiMiq.f.'schloroplastgenomeisintendedtosupplementtherelevantinformationofthechloroplastgenomeofAristolochiaceaeandAsarum'smedicinalplants,enrichthechloroplastgenomelibrary,andlayafoundationfortheidentificationofAsarumsieboldiiMiq.f.,thejudgmentofplantrelationship,theevolutionhistoryofspecies,andtheimprovementofchloroplastagronomictraits.Materialandmethod：Methodsofliteraturereview.ThechloroplastDNAwasextractedbycentrifugation.ChloroplastDNAwassequencedmainlybyhigh-throughputsequencing.MEGA6softwarewasusedtoestablishphylogenetictreesof11plantsincludingasarumseouli.Results：LiteraturereviewconfirmedtheextractionmethodofDNA(centrifugaltechnique),sequencingmethod(mainlyhigh-throughputsequencingmethod)andsoftwareusedtoestablishphylogenetictree(MEGA6software).ThegenomemapofKoreanasarumchloroplastwasobtainedbyhigh-throughputsequencing(seefigure1).PhylogenetictreemapwasobtainedbyusingMEGA6softwareforphylogeneticanalysisof11plantsincludingasarumseongata(seefigure2fordetails).Conclusion：AsarumsieboldiiMiq.f.isoneofthemedicinalplantsourcesofAsarumsieboldiiMiq..ThestudyonthecompletesequenceofthechloroplastgenomeofAsarumsieboldiiMiq.f.isintendedtosupplementtherelevantinformationofthechloroplastgenomeoftheAristolochiaceaeandAsarummedicinalplant,enrichthechloroplastgenomelibrary,andlayafoundationfortheidentificationofAsarumsieboldiiMiq.f.,thejudgmentofplantrelationship,theevolutionhistoryofspecies,andtheimprovementofchloroplastagronomictraits.AsarumsieboldiiMiq.f.,Ahhh,completechloroplastgenelength167,293bp,ThetotalGCcontentis37.90%andthetotalATcontentis62.10%,withatypicaltetradstructureconsistingofapairofIR(28,019bp)separatedbySSC(21,415bp)andLSC(89,840bp).TheSeoulasarumcpgenomeencodes132uniquegenes,including88protein-codinggenes,36tRNAgenesand8rRNAgenes,and41genesthatreplicateintheIRregion.MEGA6softwarewasusedforphylogeneticanalysisof11medicinalplantsincludingAsarumsieboldiiMiq.f..AsarumsieboldiiMiq.f.iscloselyrelatedtothephylogeneticlocationofAsarumsieboldiiMiq.,followedbyAsarumsakawanumandSarumahenryi.ItisfarfromtheAristolochiaceae'sAristolochiacontorta,Aristolochiadebilis,Aristolochiatagala,Aristolochiamoupinensis,Aristolochiakaempferi,Aristolochiamollissima,Sarumahenryiinthepicture.ErigeronbreviscapusisthefurthestfromAsarumsieboldiiMiq.f..Keyword：chloroplasts,genomes,AsarumsieboldiiMiq.f.

前言葉綠體是細胞器的一種，存在于植物細胞和真核藻類。大多數(shù)葉綠體基因組結(jié)構(gòu)包括四個區(qū)域：大單拷貝區(qū)(LSC)、小單拷貝區(qū)(SSC)和逆向重復(fù)區(qū)A(IRA)、逆向重復(fù)區(qū)B(IRB)。葉綠體基因組的特點是具相同或相關(guān)功能的基因組成復(fù)合操縱子結(jié)構(gòu)。這一特點有利于葉綠體基因的表達與調(diào)控。通過質(zhì)體基因工程實驗，實驗中植物的根和葉表現(xiàn)出較高的耐鹽性，到目前為止，轉(zhuǎn)基因作物的耐鹽性最高。目前，一些轉(zhuǎn)基因通過葉綠體基因工程獲得昆蟲和病原抗性、抗旱性、植物修復(fù)性、耐鹽性、CMS等農(nóng)藝性狀，轉(zhuǎn)基因葉綠體技術(shù)已被用于在植物中表達藥物蛋白或食用疫苗。漢城細辛是細辛的藥用植物來源之一，研究漢城細辛葉綠體基因組完整序列可以豐富葉綠體基因組庫，為細辛的鑒定、植物親緣關(guān)系判斷、物種進化史、葉綠體農(nóng)藝性狀改良等相關(guān)研究提供必要的科學(xué)依據(jù)。

馬兜鈴科藥用植物葉綠體基因組相關(guān)研究1.葉綠體基因組研究進展 1.1結(jié)構(gòu)與特征葉綠體是細胞器的一種，存在于植物細胞和真核藻類。葉綠體作為光合作用的場所，是世界上主要的食物來源，它們維持著地球上的生命。葉綠體中含有葉綠體基因，葉綠體基因組也稱為葉綠體DNA(cpDNA)，根據(jù)調(diào)查表明cpDNA大多是以共價的（covalently）、環(huán)狀的（circledna）、封閉的（closed）形式保存的(cccDNA)，其DNA雙鏈大小接近噬菌體基因組大小。大多數(shù)葉綠體基因組結(jié)構(gòu)包括四個區(qū)域：大單拷貝區(qū)(LargeSingleCopy，LSC)、小單拷貝區(qū)(SmallSingleCopy，SSC)和逆向重復(fù)區(qū)A(invertedrepeatregionA,IRA)、逆向重復(fù)區(qū)B(invertedrepeatregionB,IRB)。有些豆科植物只有一套RNA的編碼基因，無逆向重復(fù)區(qū)（IR）[1]。所有的陸地植物的葉綠體基因組，除了幾個罕見的之外，在大小、結(jié)構(gòu)、基因含量和基因方面高度保守并具母系遺傳的特性；鑒定cpDNA純度的關(guān)鍵因素為葉綠體內(nèi)部是否含有5-甲基胞嘧啶[2]。1.2葉綠體基因組測序技術(shù)葉綠體基因組首次發(fā)現(xiàn)在20世紀60年代，1986年日本名古屋大學(xué)基因研究中心陸續(xù)發(fā)布了雙子葉植物煙草（155,941bp）[3]和單子葉植物水稻（134,525bp）[4]的完整葉綠體DNA測序結(jié)果。第1代用于測序的技術(shù)主要有Sanger[5]發(fā)明的雙脫氧核糖核酸鏈末端終止法；第2代測序技術(shù)為循環(huán)陣列合成測序法也稱為高通量測序法，而此測序法的復(fù)雜程度、花費的時間與預(yù)算等都有待提高；第3代測序技術(shù)——直接測序法，將基因組拍段重新排列成基因組探針，其結(jié)果更為精準。基因組測序技術(shù)的發(fā)展，使\t"/item/DNA%E6%B5%8B%E5%BA%8F%E6%96%B9%E6%B3%95/_blank"基因的表達呈現(xiàn)數(shù)字化，為后續(xù)研究提供堅實基礎(chǔ)。2.藥用植物葉綠體基因組應(yīng)用2.1葉綠體基因組的農(nóng)藝性狀改良通過對克服抗昆蟲核轉(zhuǎn)基因植物的觀察發(fā)現(xiàn)：葉綠體轉(zhuǎn)基因植物表達出非常高水平的抗蟲性[6]。葉綠體基因組被一種抗菌肽所改造，開發(fā)抗細菌和抗真菌植物病原體，由于質(zhì)體基因組的母系遺傳，葉綠體衍生的除草劑抗性克服了核轉(zhuǎn)基因植物的外交的問題。測試葉綠體基因組的可用性，在選擇不使用抗生素或在選擇過程完成后切除抗生素耐藥性基因，這為細胞表達外來基因提供了額外的條件[7]。通過質(zhì)體基因工程，用胡蘿卜進行實驗，實驗中胡蘿卜的根和葉表現(xiàn)出較高的耐鹽性，在細胞培養(yǎng)中BADH高度表達，轉(zhuǎn)基因胡蘿卜在高濃度的NaCl(高達400him)下生長表達BADH[8]，到目前為止，轉(zhuǎn)基因作物的耐鹽性最高，因此有可能培育出健壯的耐旱雜草，并將不受歡迎的多效性性狀遺傳給相關(guān)作物。葉綠體轉(zhuǎn)化還應(yīng)克服核轉(zhuǎn)化導(dǎo)致外源基因表達水平較低的一些缺點，如通過位置效應(yīng)或基因沉默抑制基因[9]。目前，一些轉(zhuǎn)基因通過葉綠體基因工程獲得昆蟲和病原抗性、抗旱性、植物修復(fù)性、耐鹽性、CMS等農(nóng)藝性狀，轉(zhuǎn)基因葉綠體技術(shù)已被用于在植物中表達藥物蛋白或食用疫苗[10]。2.2葉綠體是生物制藥的反應(yīng)器第一次觀察到葉綠體缺失突變體是在單細胞藻類衣藻中[11]。第一個外源基因的表達是在分離的黃瓜質(zhì)體[12]和通過粒子轟擊的方法在培養(yǎng)煙草細胞的質(zhì)體[13]和可再生植物組織中觀察到的。后來在煙草中觀察到，葉綠體表達載體自主復(fù)制或通過整合到質(zhì)體基因組，來穩(wěn)定表達抗生素耐藥基因。[14]葉綠體轉(zhuǎn)基因植物有許多優(yōu)點，包括生產(chǎn)成本低、儲存和運輸便捷、熱穩(wěn)定性強等。當治療性蛋白口服給藥時，植物細胞通過生物膠囊保護胃中的抗原，除了發(fā)展全身和粘膜免疫外，不需要昂貴的純化和無菌注射。葉綠體基因工程提供了幾個優(yōu)勢，包括高水平的轉(zhuǎn)基因表達、通過母系遺傳的轉(zhuǎn)基因攔阻和在單個轉(zhuǎn)化中的多基因表達。葉綠體中的伴侶蛋白和酶促進了復(fù)雜的多亞基蛋白的組裝，并通過二硫鍵調(diào)節(jié)了人類血液蛋白的折疊。葉綠體的功能的派生疫苗抗原和治療性蛋白質(zhì)已經(jīng)被幾個化驗證明,包括巨噬細胞裂解試驗,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂綁定化驗,應(yīng)承擔的保護海拉細胞或人類肺癌細胞對腦心肌炎病毒,系統(tǒng)性免疫反應(yīng),防止病原體的挑戰(zhàn),和增長或抑制細胞培養(yǎng)。[15]因此，轉(zhuǎn)基因葉綠體是理想的生物反應(yīng)器生產(chǎn)的功能，人類和動物治療蛋白在環(huán)境中友好共存的方式。3.馬兜鈴科藥用植物葉綠體研究進展3.1細辛屬（Asarum）細辛（AsarumsieboldiiMiq.）--馬兜鈴科(Aristolochiaceae)細辛屬（Asarum）的藥用植物。細辛藥用部位是細辛（AsarumsieboldiiMiq.）、遼細辛（AsarumsieboldiiMiq.）、漢城細辛（AsarumsieboldiiMiq.f.）的干燥根及根莖，根狀莖直立或橫走，其根和根莖具三棱，對溫度有抵抗力。其主要藥用成分是揮發(fā)油，具祛風散寒、溫肺化痰、通竅鎮(zhèn)痛的作用?？捎糜谥委煴侨?、鼻竇炎、風濕、齒齦炎、口腔炎、頭痛等；是止痛水、牙痛藥等中成藥的主要原料。細辛中揮發(fā)油成分還可刺激頭發(fā)生長，治療脫發(fā)癥狀。3.1.1細辛細辛（AsarumsieboldiiMiq.）葉綠體基因組根據(jù)第一代測序技術(shù)，使用Illumina公司MiSeq平臺和高質(zhì)量成對的葉綠體基因組ca.1.7Gb。測得完整基因組長193,356bp,RefSeq:NC_037190.1,具有典型的三部結(jié)構(gòu)，由大單拷貝區(qū)（LSC）和一對逆向重復(fù)區(qū)(IR)組成。它包括78個蛋白編碼基因(protein-codinggenes)，30個rRNA基因，4個tRNA基因。GC總含量為36.2％，AT總含量為63.8％，總識別基因編碼112個，其中12個基因在IRs的SSC區(qū)中復(fù)制。[16]3.1.2遼細辛遼細辛（AsarumsieboldiiMiq.）葉綠體基因組使用MEGA6平臺進行系統(tǒng)發(fā)育分析。完整基因組序列長159,944bp，GC總含量為38.5%，與SSC(16,677BP)和LSC(88,253bp)形成一個單獨的IR(27,261bp)，由四個典型結(jié)構(gòu)組成。有152個獨特的基因編碼,其中包括103個蛋白質(zhì)編碼基因(protein-codinggenes)，8個rRNA基因，41個tRNA基因。含有兩個內(nèi)含子的ycf3.15基因含有一個基因內(nèi)區(qū):trnF-AAA,trnY-ATA,trnDATC,psbA,atpF,trnI-TAT,trnN-ATT,rpoC1,rpl2,ycf2,ycf15,ndhB、ndhA、ycf1和rps12。[17]3.2馬兜鈴屬（Aristolochia）馬兜鈴（AristolochiadebilisSieb.）--馬兜鈴科(Aristolochiaceae)馬兜鈴屬（Aristolochia）藥用植物，草質(zhì)藤本、攀援植物。馬兜鈴入藥部位為馬兜鈴（AristolochiadebilisSieb.）和北馬兜鈴（AristolochiacontortaBge.）的干燥成熟果實[18]；北馬兜鈴（AristolochiacontortaBge.）的根、莖分別可做為青木香、天仙藤入藥。其主要成分為馬兜鈴酸，使用不當可導(dǎo)致腎衰竭等腎臟疾病。果實作為馬兜鈴入藥，止咳平喘、消痣清腸、清肺平氣，是雞鳴定喘丸的主要原料。3.2.1馬兜鈴馬兜鈴（AristolochiadebilisSieb.）測得完整葉綠體基因組為159,793bp是一個典型的四方結(jié)構(gòu)的環(huán)狀分子，RefSeq:NC_036153.1。具一個大單拷貝區(qū)(LSC)89,609bp和一個小單拷貝區(qū)(SSC)19,834bp，被一對逆向重復(fù)區(qū)(IRs)隔開，每個重復(fù)序列長度為25,175bp。GC含量為38.3%，每個基因組131個基因中包括85個蛋白編碼基因，37個tRNA，8個rRNA和1個偽基因(ycf1)。其中6個蛋白編碼基因,7個tRNA基因和所有rRNA基因在IR區(qū)域重復(fù)。[19]3.2.2北馬兜鈴北馬兜鈴（AristolochiacontortaBge.）完整的葉綠體基因組長度為160,576bp，RefSeq:NC_036152.1其結(jié)構(gòu)與馬兜鈴（AristolochiadebilisSieb.）一致為一個典型的四方結(jié)構(gòu)的環(huán)狀分子。分為一個大單拷貝區(qū)（LSC）89,781bp，一個小單拷貝區(qū)(SSC)19,877bp和兩個逆向重復(fù)區(qū)（IRs），每個長度25,459bp。有38.3％的GC堿基對，每個葉綠體中含有18個內(nèi)含子基因基因組，包括atpF、rpoC1、ycf3、rps12、rpl2、rpl16、clpP、petB、petD、rps16、ndhA、ndhB和6個tRNA。[20]綜上所述，通過葉綠體基因工程可以獲得昆蟲和病原抗性、抗旱性、植物修復(fù)性、耐鹽性、CMS等農(nóng)藝性狀，轉(zhuǎn)基因葉綠體技術(shù)已被用于在植物中表達藥物蛋白或食用疫苗生物制藥的反應(yīng)器中，同時葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)在各領(lǐng)域應(yīng)用發(fā)揮著重要作用。[21]而對于馬兜鈴科細辛屬的葉綠體基因組測序尚未完善，需進一步探究。

正文實驗方法文獻查閱1.1查閱了葉綠體基因組相關(guān)文獻，確定了葉綠體測序的必要性。1.2查閱了DNA提取方法的相關(guān)文獻，確定使用離心技術(shù)對葉綠體DNA進行提取。1.3查閱了葉綠體基因組測序方法相關(guān)文獻，確定使用高通量測序方法進行測序。1.4查閱了建立系統(tǒng)發(fā)育樹的相關(guān)文獻，確定使用MEGA6軟件對系統(tǒng)發(fā)育進行分析并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。漢城細辛葉綠體DNA的提取2.1材料2.1.1樣品（漢城細辛AsarumsieboldiiMiq.f）采集地點：遼寧省大洼縣樣品數(shù)量：12.1.2實驗儀器臺式冷凍離心機（3-18K，Sigma），梯度PCR儀（ApplideBiosysterms），水平電泳槽（Bio-RAD），電泳儀（powerpacuniversal，Bio-RAD），凝膠成像系統(tǒng)（SynGeneGboxF3,GeneCompanyLimited），恒溫水浴鍋（HH-S型，鞏義市予華儀器有限責任公司）。2.1.3試劑2×CTAB提取緩沖液（PH8.0），20╳TAE緩沖液（上海Sangon公司），溴酚藍染色劑，瓊脂糖（Solarbio公司），TaqMasterMix（康為世紀），引物（invitrogen公司），DNALadder2000（近岸蛋白質(zhì)科技有限公司），其余的試劑皆為分析純。2.2漢城細辛葉綠體DNA的提取2.2.1取漢城細辛植物新鮮組織約100mg或干重組織約30mg，加入液氮中充分研磨。2.2.2將研磨好的粉末訊速轉(zhuǎn)移至之前準備好的裝有700μL65℃預(yù)熱緩沖液GP1的離心管中（實驗前在預(yù)熱的GP1中加入巰基乙醇使其最終的濃度為0.1％），快速混勻后，把離心管放在65℃水浴1h，水浴過程中要顛倒離心管以混合樣品數(shù)次。2.2.3加入700μL氯仿，混勻充分，12,000rpm(~13,400×g)進行離心5min。2.2.4將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入新離心管中，加入700μL緩沖液GP2，混勻充分。2.2.5將混勻充分的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12,000rpm(~13,400×g)進行離心30s，棄去廢液。（吸附柱容積為700μL左右，可分次加入離心）。2.2.6向吸附柱CB3加入500μL緩沖液GD，12,000rpm(~13,400×g)進行離心30，棄去廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。2.2.7向吸附柱CB3加入600μL漂洗液PW，12,000rpm(~13,400×g)進行離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。2.2.8重復(fù)操作步驟7。2.2.9將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)進行離心2min，棄去廢液，將吸附柱CB3置于室溫中放置45min，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。（這一步的目的是去除吸附柱中殘余的漂洗液，漂洗液中的乙醇殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗）。2.2.10將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μL洗脫緩沖液TE，室溫放置5min，12,000rpm(~13,400×g)進行離心2min，將溶液收集到離心管中。（洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過少影響回收效率。洗脫液的PH值對于洗脫效率有很大影響，若用ddH?O做洗脫液應(yīng)保證PH值在7.0－8.5范圍之內(nèi)，PH值低于7.0會降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保持在-20℃，以防DNA降解。為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min,12,000rpm(~13,400×g)進行離心2min）。3.漢城細辛葉綠體DNA的測序3.1基因組組裝先使用SOAPdenovo進行初步組裝，得到contig序列。再用BLAT將組裝得到的長序列定位到近緣物種的葉綠體參考基因組上，得到contig序列之間的相對位置；根據(jù)其相對位置對contig進行拼接并校正組裝錯誤，得到葉綠體基因組全長框架圖。再使用GapCloser軟件用高質(zhì)量的短序列對框架圖序列上的gap進行填補，之后用一代測序?qū)κＳ嗟膅ap及可疑區(qū)域進行補充和確證，再對LSC、SSC、IR區(qū)域連接處進行驗證，最終得到一條環(huán)形的葉綠體基因組完成圖序列。3.2基因組注釋使用CpGAVAS對葉綠體基因組序列進行注釋3.3基因組圖譜根據(jù)注釋結(jié)果確定使用OrganellarGenomeDRAW，繪制葉綠體基因組圖譜。4.確立構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的十一種種植物查閱《中國藥典》、《遼寧植物志》、《中國植物志》、《東北植物志》。確定研究以下十一種植物在系統(tǒng)發(fā)育上與遼細辛的位置關(guān)系（1）北馬兜鈴（Aristolochiacontorta）NC_036152.1；（2）馬兜鈴（Aristolochiadebilis）NC_036153.1；（3）耳葉馬兜鈴（Aristolochiatagala）NC_041455.1；（4）寶興馬兜鈴（Aristolochiamoupinensis）NC_041454.1；（5）大葉馬兜鈴（Aristolochiakaempferi）NC_041452.1；（6）尋骨風（Aristolochiamollissima）NC_041457.1；（7）馬蹄香（Sarumahenryi）NC_039933.1；（8）國外的細辛屬植物（Asarumsakawanum）AP017908.1；（9）細辛（Asarumsieboldii）NC_037190.1；（10）漢城細辛（Asarumsieboldiinew）（11）燈盞細辛（Erigeronbreviscapus）NC_043882.1。二、實驗結(jié)果確定實驗方法得到DNA的方法，測序方法，系統(tǒng)發(fā)育樹的方法確定樣品為大連市大洼縣的漢城細辛新鮮葉片。確定使用離心技術(shù)提取漢城細辛葉綠體DNA，并將所得DNA進行鑒別，確定其為漢城細辛葉綠體基因組DNA。確定使用高通量測序方法對漢城細辛葉綠體基因組進行測序、分析得到漢城細辛葉綠體基因組圖譜（圖一）。確定使用MEGA6軟件對包括漢城細辛在內(nèi)的十一種植物進行植物系統(tǒng)發(fā)育分析的方法。使用高通量測序法（主要測序方法）得到的漢城細辛葉綠體基因組圖譜（圖一）圖一漢城細辛葉綠體基因組圖譜由圖譜得到漢城細辛完整葉綠體基因組長167,293bp，總GC含量為37.90％，總AT含量為62.10％，具有由SSC（21,415bp）和LSC（89,840bp）分開的一對IR（28,019bp）組成的典型四分體結(jié)構(gòu)。漢城細辛cp基因組編碼132個獨特的基因，包括88個蛋白編碼基因，36個tRNA基因和8個rRNA基因，以及41個在IR區(qū)復(fù)制的基因。使用MEGA6軟件對漢城細辛等11種植物建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖二）圖二十一種植物系統(tǒng)發(fā)育樹圖注：從上到下依次為植物北馬兜鈴（Aristolochiacontorta）NC_036152.1；馬兜鈴（Aristolochiadebilis）NC_036153.1；耳葉馬兜鈴（Aristolochiatagala）NC_041455.1；寶興馬兜鈴（Aristolochiamoupinensis）NC_041454.1；大葉馬兜鈴（Aristolochiakaempferi）NC_041452.1；尋骨風（Aristolochiamollissima）NC_041457.1；馬蹄香（Sarumahenryi）NC_039933.1；國外的細辛屬植物（Asarumsakawanum）AP017908.1；細辛（Asarumsieboldii）NC_037190.1；漢城細辛（Asarumsieboldiinew）燈盞細辛（Erigeronbreviscapus）NC_043882.1。由圖可得漢城細辛與細辛的系統(tǒng)發(fā)育位置密切相關(guān)，其次為國外的細辛屬植物和馬蹄香。與圖中馬兜鈴科植物北馬兜鈴、馬兜鈴、耳葉馬兜鈴、寶興馬兜鈴、大葉馬兜鈴、尋骨風關(guān)系較遠；燈盞細辛距離漢城細辛關(guān)系最遠。

分析討論基因圖譜通過高通量測序法得到的基因圖譜（圖一）顯示漢城細辛具有88個蛋白編碼基因，這些是已經(jīng)得到的基因。下一步可以研究這些基因具體的表達過程等內(nèi)容。并且也得到了漢城細辛的132個獨特的編碼基因，可以就此研究它的鑒別等相關(guān)內(nèi)容。系統(tǒng)發(fā)育樹從圖二中可以看出在這十一種植物中距離細辛所屬馬兜鈴科藥用植物細辛與本次研究的漢城細辛關(guān)系最為密切；菊科飛蓬屬燈盞細辛與漢城細辛關(guān)系最遠。可以大致的結(jié)合文獻看出它的一個進化位置。三、研究意義從文獻以及各種資料來看，細辛屬植物甚至包括整個馬兜鈴科藥用植物來講，馬兜鈴科的葉綠體基因相關(guān)信息十分缺少。因此，研究漢城細辛的葉綠體基因組，對補充基因組庫很有意義。

結(jié)論漢城細辛完整葉綠體基因組長167,293bp，總GC含量為37.90％，具有由SSC（21,415bp）和LSC（89,840bp）分開的一對IR（28,019bp）組成的典型四分體結(jié)構(gòu)。漢城細辛cp基因組編碼132個獨特的基因，包括88個蛋白編碼基因，36個tRNA基因和8個rRNA基因，以及41個在IR區(qū)復(fù)制的基因。細辛完整葉綠體基因組編碼152個獨特的基因，包括103個蛋白編碼基因，41個tRNA基因和8個rRNA基因，以及44個在IR區(qū)復(fù)制的基因。1個基因含有2個內(nèi)含子：ycf3。15個基因含有1個內(nèi)含子：trnF-AAA，trnY-ATA，trnD-ATC，psbA，atpF，trnI-TAT，trnN-ATT，rpoC1，rpl2，ycf2，ycf15，ndhB，ndhA，ycf1，rps12。[22]使用MEGA6軟件對包括漢城細辛在內(nèi)的11種藥用植物的系統(tǒng)發(fā)育分析，得漢城細辛與細辛的系統(tǒng)發(fā)育位置密切相關(guān)，其次為國外的細辛屬植物和馬蹄香。與圖中馬兜鈴科植物北馬兜鈴、馬兜鈴、耳葉馬兜鈴、寶興馬兜鈴、大葉馬兜鈴、尋骨風關(guān)系較遠；燈盞細辛距離漢城細辛關(guān)系最遠。

參考文獻[1]ShinozakiK,OhmeM,TanakaM,etal.Thecompletenucleotidesequenceofthetobaccochloroplastgenome:itsgeneorganizationandexpression[J].TheEMBOjournal,1986,5(9):2043-2049.[2]胡建林.基于化學(xué)反應(yīng)的5—醛基胞嘧啶和5—羥甲基胞嘧啶的熒光檢測新策略[D].武漢大學(xué),2015.[3]李緒英,肖炳光,高玉龍,姬廣海.煙草葉綠體基因組和線粒體基因組SSR位點分析[J].西北植物學(xué)報,2011,31(12):2399-2405.[4]孫崇榮.高等植物葉綠體基因組的特征[J].生命的化學(xué)(中國生物化學(xué)會通訊),1990(04):1-3.[5]NerSS,GoodinDB,PielakGJ,etal.ArapiddropletmethodforSangerdideoxysequencing[J].Biotechniques,1988,6(5):408-412.[6]KotaM,DaniellH,VarmaS,etal.OverexpressionoftheBacillusthuringiensis(Bt)Cry2Aa2proteininchloroplastsconfersresistancetoplantsagainstsusceptibleandBt-resistantinsects[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1999,96(5):1840-1845.[7]LeeSB,KwonHB,KwonSJ,etal.Accumulationoftrehalosewithintransgenicchloroplastsconfersdroughttolerance[J].MolecularBreeding,2003,11(1):1-13.[8]KumarS,DhingraA,DaniellH.Plastid-expressedbetainealdehydedehydrogenasegeneincarrotculturedcells,roots,andleavesconfersenhancedsalttolerance[J].PlantPhysiology,2004,136(1):2843-2854.[9]FinneganJ,McElroyD.Transgeneinactivation:plantsfightback![J].Biotechnology,1994,12(9):883.[10]Fernández‐SanMillánA,Mingo‐CastelA,MillerM,etal.Achloroplasttransgenicapproachtohyper‐expressandpurifyHumanSerumAlbumin,aproteinhighlysusceptibletoproteolyticdegradation[J].PlantBiotechnologyJournal,2003,1(2):71-79.[11]BoyntonJE,GillhamNW,HarrisEH,etal.ChloroplasttransformationinChlamydomonaswithhighvelocitymicroprojectiles[J].Science,1988,240(4858):1534-1538.[12]DaniellH,McFaddenBA.Uptakeandexpressionofbacterialandcyanobacterialgenesbyisolatedcucumberetioplasts[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1987,84(18):6349-6353.[13]DaniellH,VivekanandaJ,NielsenBL,etal.Transientforeigngeneexpressioninchloroplastsofculturedtobaccocellsafterbiolisticdeliveryofchloroplastvectors[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1990,87(1):88-92.[14]DaniellH,VivekanandaJ,NielsenBL,etal.Transientforeigngeneexpressioninchloroplastsofculturedtobaccocellsafterbiolisticdeliveryofchloroplastvectors[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1990,87(1):88-92.[15]DaniellH.Productionofbiopharmaceuticalsandvaccinesinplantsviathechloroplastgenome[J].BiotechnologyJournal:HealthcareNutritionTechnology,2006,1(10):1071-1079.[16]LimCE,LeeSC,SoS,etal.ThecompletechloroplastgenomesequenceofAsarumsieboldiiMiq.(Aristolochiaceae),amedicinalplantinKorea[J].MitochondrialDNAPartB,2018,3(1):118-119.[17]ZhaoR,XingY