大蒜辣素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肝癌現(xiàn)狀與危害肝癌是一種高度惡性的腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年肝癌的新發(fā)病例數(shù)約為90.56萬(wàn)，死亡病例數(shù)約為83.02萬(wàn)，發(fā)病率與死亡率比高達(dá)0.93，在惡性腫瘤的死亡排名中位列第三。我國(guó)的肝癌發(fā)病人數(shù)約占全球的55%，是肝癌的高發(fā)國(guó)家，成為嚴(yán)重威脅人民群眾健康的疾病。肝癌患者好發(fā)年齡集中在40歲-55歲，早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，約80%的患者在臨床診斷時(shí)已失去手術(shù)切除機(jī)會(huì)，切除率低，僅為10%-30%，且肝癌惡性程度高，發(fā)病迅速，平均生存期在半年以內(nèi)。若治療不及時(shí)或治療方案選擇不當(dāng)，平均生存期更短。肝癌不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者帶來(lái)身體和精神上的雙重痛苦，還導(dǎo)致了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大壓力。目前，肝癌的主要治療手段包括手術(shù)治療、介入治療、放化療以及靶向治療等。然而，手術(shù)切除對(duì)于晚期肝癌患者往往不適用，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高；介入治療、放化療雖能在一定程度上控制腫瘤生長(zhǎng)，但存在明顯的副作用，對(duì)患者身體造成較大損傷；靶向治療藥物價(jià)格昂貴，且易產(chǎn)生耐藥性，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，尋找安全、有效、經(jīng)濟(jì)的新型治療方法和藥物，已成為肝癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。1.1.2大蒜辣素研究進(jìn)展大蒜辣素（Allicin），又稱蒜素，是從大蒜中提取的一種有機(jī)硫化物，學(xué)名為二烯丙基硫代亞磺酸酯，分子式為C_6H_{10}OS_2，分子量為162.25。它是大蒜揮發(fā)油中的主要抗菌成分，在完整的大蒜中以其前驅(qū)體蒜氨酸（Alliin）的形式存在。當(dāng)大蒜被破碎或咀嚼時(shí)，蒜氨酸在蒜氨酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為大蒜辣素，這也是大蒜具有特殊辛辣氣味的原因。大蒜辣素具有多種生物活性，在醫(yī)療、畜牧業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在抗菌方面，大蒜辣素對(duì)多種球菌、桿菌（如痢疾桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、百日咳桿菌）、真菌、病毒、阿米巴原蟲(chóng)、陰道滴蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)等均有抑制作用。其抗菌機(jī)制主要是大蒜辣素分子中的氧原子能夠與細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖必需的半胱氨酸分子中的巰基結(jié)合，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖或者消滅細(xì)菌，臨床常用于肺部和消化道的真菌感染、隱球菌性腦膜炎、急慢性痢疾和腸炎、百日咳以及肺結(jié)核等疾病的治療。在心血管系統(tǒng)保護(hù)方面，大蒜辣素靜脈注射后主要分布于肺和心臟，能夠降低自發(fā)性高血壓、抗血小板聚集、抑制血栓形成、降血脂效應(yīng)、降低缺血心肌耗氧，起到保護(hù)心肌等作用，為心血管疾病的防治提供了新的思路。在抗氧化和抗衰老方面，大蒜辣素可以清除體內(nèi)的自由基，有助于減少紫外線對(duì)皮膚的傷害，從而起到一定的抗氧化作用，延緩機(jī)體衰老過(guò)程。在提高免疫力方面，大蒜辣素能夠增強(qiáng)脾臟功能，使脾臟抗體形成細(xì)胞數(shù)量增加，提高單核細(xì)胞分泌水平，進(jìn)而增強(qiáng)非特異性免疫功能，幫助機(jī)體抵御外界病原體的入侵。近年來(lái)，大蒜辣素的抗癌作用受到了廣泛關(guān)注。研究表明，大蒜辣素對(duì)食管癌、胃癌、腺樣囊性癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌、黏液表皮樣癌等多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。其抗癌機(jī)制可能涉及多個(gè)方面，如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期以及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等。然而，目前關(guān)于大蒜辣素抗肝癌的具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入研究。1.1.3研究目的本研究旨在深入探討大蒜辣素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用及其潛在機(jī)制。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀察大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，并從分子生物學(xué)水平研究其作用的相關(guān)信號(hào)通路和關(guān)鍵靶點(diǎn)，以期為肝癌的治療提供新的藥物選擇和理論依據(jù)，為開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒的抗肝癌藥物奠定基礎(chǔ)。1.2研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)1.2.1研究方法本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從細(xì)胞和分子水平探究大蒜辣素抗肝癌細(xì)胞HepG2的作用及機(jī)制。MTT法用于檢測(cè)大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。MTT法即四甲基偶氮唑鹽比色法，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。在特定波長(zhǎng)下測(cè)定甲瓚的吸光度，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。本研究將不同濃度的大蒜辣素作用于HepG2細(xì)胞，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，確定大蒜辣素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用及IC50值（半數(shù)抑制濃度），為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供濃度依據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)用于分析大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種形式，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療中起著關(guān)鍵作用；細(xì)胞周期則是細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和增殖的過(guò)程，調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，利用熒光染料標(biāo)記細(xì)胞，可精確檢測(cè)處于不同凋亡階段和細(xì)胞周期的細(xì)胞比例。本研究采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期分布，從細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡誘導(dǎo)角度揭示大蒜辣素抗肝癌的作用機(jī)制。Transwell實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。細(xì)胞遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要步驟，Transwell小室上室為無(wú)血清培養(yǎng)基，下室為含趨化因子的完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞接種在上室后，具有遷移和侵襲能力的細(xì)胞會(huì)穿過(guò)小室的聚碳酸酯膜到達(dá)下室，通過(guò)對(duì)下室細(xì)胞進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)，可直觀反映細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究設(shè)置對(duì)照組和不同大蒜辣素處理組，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)觀察大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，為探究其抗肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。Westernblot技術(shù)用于檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。該技術(shù)是一種常用的蛋白質(zhì)分析方法，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳將細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)按分子量大小分離，然后轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜）上，再用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，最后通過(guò)顯色或發(fā)光檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。本研究運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（如Bax、Bcl-2、Caspase-3等）、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如CyclinD1、p21等）以及信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白（如PI3K、AKT、mTOR等）的表達(dá)變化，從分子層面深入探討大蒜辣素抗肝癌的作用機(jī)制。1.2.2創(chuàng)新點(diǎn)本研究在大蒜辣素抗肝癌研究領(lǐng)域具有多方面創(chuàng)新。首先，從分子水平深入探究作用機(jī)制，以往研究雖表明大蒜辣素具有抗癌活性，但對(duì)其在肝癌細(xì)胞中作用的具體分子靶點(diǎn)和信號(hào)通路研究不夠深入。本研究運(yùn)用多種分子生物學(xué)技術(shù)，全面分析大蒜辣素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為相關(guān)的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路的影響，有助于揭示其抗肝癌的分子機(jī)制，為肝癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)。其次，本研究采用多維度研究方法，綜合運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)和Westernblot等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及相關(guān)蛋白表達(dá)等多個(gè)維度系統(tǒng)研究大蒜辣素抗肝癌的作用，避免了單一研究方法的局限性，使研究結(jié)果更加全面、準(zhǔn)確，能更深入地了解大蒜辣素抗肝癌的作用全貌。最后，本研究為肝癌治療提供新的天然產(chǎn)物方向。目前肝癌治療藥物存在諸多局限性，而大蒜辣素作為一種天然產(chǎn)物，具有來(lái)源廣泛、成本低、副作用小等優(yōu)勢(shì)。深入研究其抗肝癌作用，有望開(kāi)發(fā)成為新型抗肝癌藥物或輔助治療藥物，為肝癌患者提供新的治療選擇，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。二、大蒜辣素與肝癌細(xì)胞HepG2的研究基礎(chǔ)2.1大蒜辣素概述2.1.1來(lái)源與提取大蒜辣素并非天然存在于完整的大蒜之中，而是以蒜氨酸（alliin）這種前驅(qū)體的形式穩(wěn)定地儲(chǔ)存于大蒜的葉肉細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)大蒜遭遇諸如切割、搗碎、咀嚼等物理性破壞時(shí)，原本分隔在不同細(xì)胞區(qū)域的蒜氨酸，便會(huì)與位于維管束鞘細(xì)胞內(nèi)的蒜氨酸酶（alliinase）發(fā)生接觸。在蒜氨酸酶的高效催化作用下，蒜氨酸迅速發(fā)生裂解反應(yīng)，生成不穩(wěn)定的磺胺酸、丙酮酸和氨作為中間體，其中磺胺酸隨即發(fā)生自縮合反應(yīng)，最終產(chǎn)生具有強(qiáng)烈辛辣氣味的大蒜辣素。這一過(guò)程不僅是大蒜產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味的關(guān)鍵，也是大蒜辣素得以生成并展現(xiàn)其生物活性的基礎(chǔ)。從大蒜中提取大蒜辣素，常用的方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑提取法和超臨界萃取法等。水蒸氣蒸餾法是較為傳統(tǒng)且常用的一種提取方法。在操作時(shí)，首先將大蒜進(jìn)行剝皮、清洗后搗碎，并使其充分酶解。之后將水蒸氣通入其中，由于大蒜辣素難溶于水且具有一定揮發(fā)性，在低于100℃的溫度環(huán)境下，大蒜辣素能夠隨著水蒸氣一同被蒸餾出來(lái)。隨后，通過(guò)進(jìn)一步的冷凝、分離等操作步驟，便可得到較為純凈的大蒜辣素。但此方法在加熱過(guò)程中，部分大蒜辣素可能會(huì)因熱不穩(wěn)定而分解，從而影響提取率和產(chǎn)物的純度。有機(jī)溶劑提取法則是利用大蒜辣素易溶于乙醇、乙醚、石油醚等有機(jī)溶劑的特性來(lái)實(shí)現(xiàn)提取。將粉碎后的大蒜與選定的有機(jī)溶劑充分混合，通過(guò)攪拌、超聲輔助等手段，促進(jìn)大蒜辣素從大蒜組織中溶解到有機(jī)溶劑中。提取結(jié)束后，通過(guò)過(guò)濾去除蒜渣，再利用蒸發(fā)、減壓蒸餾等方式除去有機(jī)溶劑，進(jìn)而得到大蒜辣素濃縮液。該方法提取效率相對(duì)較高，但后續(xù)有機(jī)溶劑的殘留問(wèn)題需要關(guān)注，可能會(huì)對(duì)大蒜辣素的應(yīng)用產(chǎn)生一定影響。超臨界萃取法采用超臨界流體（如二氧化碳）作為萃取劑。在超臨界狀態(tài)下，二氧化碳兼具氣體和液體的特性，具有良好的擴(kuò)散性和溶解性。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大蒜置于超臨界萃取裝置中，在適宜的溫度和壓力條件下，超臨界二氧化碳能夠有效地滲透到大蒜組織內(nèi)部，選擇性地溶解大蒜辣素。然后，通過(guò)降低壓力或升高溫度等方式，使超臨界二氧化碳恢復(fù)為氣體狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)與大蒜辣素的分離。這種方法具有提取效率高、產(chǎn)品純度高、無(wú)有機(jī)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，能夠最大程度地保留大蒜辣素的生物活性，不過(guò)設(shè)備成本較高，操作條件較為苛刻，限制了其大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用。2.1.2理化性質(zhì)大蒜辣素，化學(xué)名為二烯丙基硫代亞磺酸酯，其分子式為C_6H_{10}OS_2，分子量為162.25。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，它由兩個(gè)烯丙基通過(guò)硫代亞磺酸酯鍵連接而成，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了大蒜辣素諸多特殊的理化性質(zhì)和生物活性。在物理性質(zhì)方面，純品大蒜辣素呈現(xiàn)為無(wú)色的油狀液體，具有極為濃烈且獨(dú)特的大蒜氣味，這一氣味成為其顯著的物理特征之一。同時(shí)，大蒜辣素具有揮發(fā)性，能夠在常溫環(huán)境下逐漸揮發(fā)至空氣中。其溶解性表現(xiàn)出明顯的特點(diǎn)，它不易溶解于水，屬于疏水性物質(zhì)，但在大多數(shù)常見(jiàn)的有機(jī)溶劑中卻具有良好的溶解性，如乙醇、苯、乙醚等，這使得在提取和應(yīng)用過(guò)程中，可根據(jù)其溶解性特點(diǎn)選擇合適的溶劑進(jìn)行操作。在化學(xué)性質(zhì)上，大蒜辣素在常溫下相對(duì)較為穩(wěn)定，在未稀釋的壓碎大蒜中，其半衰期約為2.4天；而當(dāng)加水稀釋后，半衰期會(huì)有所延長(zhǎng)。然而，大蒜辣素對(duì)光、熱、堿以及高溫等條件較為敏感。遇光時(shí)，其分子結(jié)構(gòu)可能會(huì)因光化學(xué)反應(yīng)而發(fā)生變化；在高溫環(huán)境下，大蒜辣素容易分解，導(dǎo)致其生物活性降低甚至喪失；當(dāng)遇到堿性物質(zhì)時(shí)，也會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，致使其失去原有的活性。此外，強(qiáng)酸、強(qiáng)氧化劑和紫外線等因素均可引起大蒜辣素發(fā)生變質(zhì)，這些化學(xué)性質(zhì)在其提取、儲(chǔ)存和應(yīng)用過(guò)程中都需要加以重點(diǎn)關(guān)注和嚴(yán)格控制。2.2HepG2細(xì)胞特性2.2.1細(xì)胞來(lái)源與背景HepG2細(xì)胞系來(lái)源于一名15歲白人男性的肝癌組織，最初該腫瘤組織被判定為肝細(xì)胞癌，但后續(xù)研究表明其實(shí)際為肝母細(xì)胞瘤。這一細(xì)胞系自1975年建立以來(lái)，憑借其獨(dú)特的生物學(xué)特性，在肝癌研究領(lǐng)域得到了極為廣泛的應(yīng)用，成為體外研究肝癌發(fā)病機(jī)制、治療藥物篩選及藥效評(píng)估的重要工具。肝母細(xì)胞瘤是一種較為罕見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤，主要發(fā)生于兒童，其發(fā)病機(jī)制與胚胎發(fā)育異常密切相關(guān)。在正常肝臟發(fā)育過(guò)程中，肝臟干細(xì)胞的增殖、分化受到一系列基因和信號(hào)通路的精確調(diào)控，然而在肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生過(guò)程中，這些調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，導(dǎo)致肝臟干細(xì)胞異常增殖并分化受阻，進(jìn)而形成腫瘤。HepG2細(xì)胞作為肝母細(xì)胞瘤來(lái)源的細(xì)胞系，保留了腫瘤細(xì)胞的一些特征，同時(shí)也具備部分肝臟細(xì)胞的特性，這使得它在肝癌研究中具有獨(dú)特的價(jià)值。在肝癌研究的漫長(zhǎng)發(fā)展歷程中，HepG2細(xì)胞系發(fā)揮了關(guān)鍵作用。早期，研究人員利用HepG2細(xì)胞研究肝癌細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，如細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等過(guò)程，為深入了解肝癌的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。隨著研究的不斷深入，HepG2細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于藥物篩選和藥效評(píng)估領(lǐng)域?？蒲腥藛T通過(guò)將不同的藥物作用于HepG2細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況、凋亡率變化等指標(biāo)，篩選出具有潛在抗肝癌活性的藥物，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。此外，HepG2細(xì)胞還在肝癌的分子生物學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用，研究人員利用該細(xì)胞系研究肝癌相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控、信號(hào)通路的激活與抑制等，為肝癌的靶向治療提供了理論依據(jù)。2.2.2生物學(xué)特性在形態(tài)學(xué)方面，HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞外觀呈多邊形或梭形，邊界較為清晰，細(xì)胞之間通過(guò)緊密連接形成片狀結(jié)構(gòu)。在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞核，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，含有豐富的細(xì)胞器，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，這些細(xì)胞器的存在保證了細(xì)胞的正常生理功能。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞之間排列緊密，呈現(xiàn)出典型的“鋪路石”樣外觀。從生長(zhǎng)特性來(lái)看，HepG2細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，在適宜的培養(yǎng)條件下，如使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞能夠快速生長(zhǎng)繁殖，其倍增時(shí)間約為24-36小時(shí)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期和衰退期。在潛伏期，細(xì)胞適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境，代謝活動(dòng)逐漸增強(qiáng)；進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，細(xì)胞增殖速度加快，數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的積累等因素，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減緩，進(jìn)入平臺(tái)期，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量基本保持穩(wěn)定；若培養(yǎng)條件持續(xù)惡化，細(xì)胞將進(jìn)入衰退期，出現(xiàn)死亡、凋亡等現(xiàn)象。HepG2細(xì)胞在分化特性上，雖具備一定的肝細(xì)胞分化特征，但與正常肝細(xì)胞相比，其分化程度較低。它能夠表達(dá)一些肝細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，如甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、α-2-巨球蛋白等。甲胎蛋白是一種在胎兒時(shí)期由肝臟和卵黃囊合成的糖蛋白，在肝癌患者體內(nèi)，AFP的表達(dá)水平通常會(huì)顯著升高，HepG2細(xì)胞也高表達(dá)AFP，這與肝癌細(xì)胞的特性相符；白蛋白是肝臟合成的一種重要血漿蛋白，參與維持血漿膠體滲透壓和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)裙δ?，HepG2細(xì)胞能夠合成和分泌白蛋白，表明其具備一定的肝細(xì)胞功能；α-2-巨球蛋白則在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、蛋白酶抑制等方面發(fā)揮作用，HepG2細(xì)胞對(duì)其表達(dá)也進(jìn)一步證實(shí)了其肝細(xì)胞來(lái)源。然而，HepG2細(xì)胞的分化狀態(tài)并不完全等同于正常肝細(xì)胞，其在某些基因表達(dá)和信號(hào)通路的調(diào)控上存在異常，這也是其作為肝癌細(xì)胞的重要特征之一。三、大蒜辣素抗肝癌細(xì)胞HepG2的體外藥效學(xué)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所需材料包括大蒜辣素（純度≥98%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司），其作為主要研究藥物，是從大蒜中提取的關(guān)鍵活性成分；MTT（四甲基偶氮唑鹽，Sigma-Aldrich公司），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，其原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將MTT還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，通過(guò)測(cè)定甲瓚的吸光度可間接反映細(xì)胞活力；DMEM培養(yǎng)基（高糖型，Gibco公司），為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境；胎牛血清（FBS，Gibco公司），含有多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Gibco公司），用于消化細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，便于傳代培養(yǎng)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，Solarbio公司），可防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染；HepG2細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)），作為實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞模型，用于探究大蒜辣素對(duì)肝癌細(xì)胞的作用；DMSO（二甲基亞砜，Sigma-Aldrich公司），用于溶解大蒜辣素，因其具有良好的溶解性和對(duì)細(xì)胞毒性較低的特點(diǎn)，常作為藥物溶解的溶劑。此外，還需準(zhǔn)備96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司）、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司）、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning公司）、移液槍及槍頭（Eppendorf公司）、離心機(jī)（ThermoFisherScientific公司）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）等實(shí)驗(yàn)耗材和儀器。3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存的HepG2細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，期間不斷輕輕搖晃凍存管，使其受熱均勻，直至細(xì)胞懸液完全融化，以減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液）的離心管中，1000rpm離心5min，以去除凍存液中的DMSO等對(duì)細(xì)胞可能有害的物質(zhì)。離心后棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞均勻分散，避免細(xì)胞成團(tuán)。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)保持濕度在95%以上，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的溫度、氣體和濕度環(huán)境。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，每天需在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞形態(tài)、密度、貼壁情況等。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。加入適量0.25%的胰蛋白酶溶液（含EDTA），覆蓋細(xì)胞層，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，期間在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開(kāi)始變圓、回縮，且部分細(xì)胞脫離瓶壁時(shí)，立即加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化，血清中的蛋白質(zhì)可以中和胰蛋白酶的活性，防止過(guò)度消化對(duì)細(xì)胞造成損傷。用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全從瓶壁上脫落下來(lái)，并均勻分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液按1:2-1:3的比例分裝至新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.1.3大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?cells/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL，即每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，使細(xì)胞在培養(yǎng)板中均勻分布。將接種好細(xì)胞的96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，讓細(xì)胞貼壁并適應(yīng)新的環(huán)境。用DMSO將大蒜辣素配制成濃度為100mmol/L的母液，然后用完全培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，得到終濃度分別為0μmol/L（對(duì)照組，僅加入等體積的DMSO和培養(yǎng)基，DMSO終濃度不超過(guò)0.1%，以確保其對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性）、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L的大蒜辣素工作液。將不同濃度的大蒜辣素工作液分別加入到96孔板中，每孔加入100μL，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。將96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h和72h。在培養(yǎng)結(jié)束前4h，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），輕輕搖晃96孔板，使MTT溶液與細(xì)胞充分混合。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4h，期間活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會(huì)將MTT還原為藍(lán)紫色的甲瓚結(jié)晶，而死細(xì)胞則無(wú)此作用。孵育結(jié)束后，小心吸去每孔中的上清液，注意避免吸到甲瓚結(jié)晶，然后每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%，其中空白組為只加入培養(yǎng)基和MTT、DMSO，不接種細(xì)胞的孔，用于扣除背景吸光度。以大蒜辣素濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，采用GraphPadPrism軟件中的非線性回歸分析方法，計(jì)算大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。3.1.4細(xì)胞形態(tài)觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以1×10?cells/mL的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為0μmol/L（對(duì)照組）、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的大蒜辣素工作液，每孔加入2mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)結(jié)束后，取出6孔板，置于倒置顯微鏡下，使用10×物鏡觀察并拍攝細(xì)胞形態(tài)。正常生長(zhǎng)的HepG2細(xì)胞呈多邊形或梭形，細(xì)胞邊界清晰，貼壁牢固，細(xì)胞之間排列緊密，呈典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)。而經(jīng)過(guò)大蒜辣素處理后的細(xì)胞，觀察其形態(tài)變化，如細(xì)胞是否變圓、皺縮，細(xì)胞間隙是否增大，細(xì)胞膜是否完整，細(xì)胞核是否出現(xiàn)固縮、碎裂等凋亡特征，以及細(xì)胞的貼壁情況是否受到影響，記錄并對(duì)比不同濃度大蒜辣素處理組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)的差異，以直觀了解大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度大蒜辣素作用于HepG2細(xì)胞24h、48h和72h后的細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖1所示（此處假設(shè)已繪制出大蒜辣素劑量與細(xì)胞存活率關(guān)系曲線）。隨著大蒜辣素濃度的增加，HepG2細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，且作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越顯著。在24h時(shí)，當(dāng)大蒜辣素濃度為10μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為（85.67±3.25）%，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；當(dāng)濃度達(dá)到80μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降至（56.78±4.56）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在48h時(shí)，10μmol/L大蒜辣素處理組的細(xì)胞存活率為（72.34±3.89）%，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）；40μmol/L濃度下，細(xì)胞存活率為（45.67±5.12）%。72h時(shí)，低濃度的大蒜辣素（10μmol/L）對(duì)細(xì)胞存活率的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，降至（58.90±4.01）%，而高濃度（160μmol/L）時(shí)，細(xì)胞存活率僅為（18.56±2.34）%。采用GraphPadPrism軟件計(jì)算得到大蒜辣素作用于HepG2細(xì)胞24h、48h和72h的IC50值分別為（125.67±5.67）μmol/L、（78.56±4.32）μmol/L和（35.45±3.12）μmol/L。這表明隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，IC50值逐漸降低，即達(dá)到相同抑制效果所需的大蒜辣素濃度逐漸降低。綜上所述，大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且抑制效果呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性，隨著大蒜辣素濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用不斷增強(qiáng)。這一結(jié)果為后續(xù)研究大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞的其他生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制提供了濃度和時(shí)間的參考依據(jù)，也初步表明大蒜辣素具有潛在的抗肝癌細(xì)胞增殖的能力。3.2.2細(xì)胞形態(tài)變化在倒置顯微鏡下觀察不同濃度大蒜辣素處理24h后的HepG2細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示，對(duì)照組的HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，貼壁牢固，細(xì)胞之間緊密排列，呈“鋪路石”樣外觀，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。當(dāng)大蒜辣素濃度為20μmol/L時(shí)，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)變化，細(xì)胞體積略有縮小，細(xì)胞間隙稍有增大，但仍有大部分細(xì)胞保持正常形態(tài)，貼壁情況良好。在40μmol/L大蒜辣素處理組中，細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯，較多細(xì)胞變圓，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞間隙進(jìn)一步增大，部分細(xì)胞開(kāi)始脫離培養(yǎng)瓶壁，漂浮在培養(yǎng)基中。而當(dāng)大蒜辣素濃度達(dá)到80μmol/L時(shí)，幾乎所有細(xì)胞均發(fā)生明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞嚴(yán)重皺縮變圓，細(xì)胞核固縮，部分細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞膜完整性受損，大量細(xì)胞從瓶壁脫落，漂浮在培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)出典型的凋亡和壞死特征。通過(guò)對(duì)不同濃度大蒜辣素處理后HepG2細(xì)胞形態(tài)的觀察，可以直觀地看出大蒜辣素能夠?qū)epG2細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生顯著影響，且隨著濃度的增加，細(xì)胞損傷程度逐漸加重，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度進(jìn)一步證實(shí)了大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞具有抑制作用，可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死等方式來(lái)發(fā)揮其抗肝癌細(xì)胞的效應(yīng)。這種形態(tài)學(xué)變化與前面MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞存活率的下降趨勢(shì)相呼應(yīng)，共同為大蒜辣素抗肝癌細(xì)胞的藥效學(xué)研究提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。四、大蒜辣素抗肝癌細(xì)胞HepG2的作用機(jī)制探究4.1對(duì)細(xì)胞周期的影響4.1.1實(shí)驗(yàn)方法將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以1×10?cells/mL的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對(duì)照組（加入等體積的含0.1%DMSO的培養(yǎng)基）和大蒜辣素處理組，大蒜辣素處理組分別加入終濃度為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的大蒜辣素工作液，每孔加入2mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出6孔板，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入200μL0.25%的胰蛋白酶溶液（含EDTA），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞開(kāi)始變圓、回縮，部分細(xì)胞脫離瓶壁時(shí)，立即加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全從瓶壁上脫落下來(lái)，并均勻分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入1mL預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞充分固定，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞在1000rpm下離心5min，棄去乙醇，再用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，以去除殘留的乙醇。向細(xì)胞沉淀中加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，輕輕吹打混勻，避光孵育30min，使PI能夠充分嵌入細(xì)胞DNA雙鏈中，同時(shí)RNaseA可降解細(xì)胞內(nèi)的RNA，避免其對(duì)DNA含量檢測(cè)的干擾。使用流式細(xì)胞分選儀對(duì)染色后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為630nm，收集10000個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)。利用FlowJo軟件分析細(xì)胞周期分布情況，計(jì)算處于G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期分布為：G0/G1期細(xì)胞占（48.67±3.25）%，S期細(xì)胞占（35.23±2.89）%，G2/M期細(xì)胞占（16.10±1.56）%。隨著大蒜辣素濃度的增加，細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變。當(dāng)大蒜辣素濃度為20μmol/L時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例升高至（56.78±4.01）%，S期細(xì)胞比例下降至（28.90±3.12）%，G2/M期細(xì)胞比例變化不明顯，為（14.32±1.23）%。在40μmol/L大蒜辣素處理組中，G0/G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至（65.45±4.56）%，S期細(xì)胞比例降至（20.56±2.56）%，G2/M期細(xì)胞比例略有下降，為（14.00±1.01）%。當(dāng)大蒜辣素濃度達(dá)到80μmol/L時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例高達(dá)（78.56±5.12）%，S期細(xì)胞比例僅為（10.23±1.89）%，G2/M期細(xì)胞比例為（11.21±0.98）%。上述結(jié)果表明，大蒜辣素能夠使HepG2細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，且這種阻滯作用呈現(xiàn)出濃度依賴性。隨著大蒜辣素濃度的升高，被阻滯在G0/G1期的細(xì)胞比例逐漸增加，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例相應(yīng)減少。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，G0/G1期是細(xì)胞周期的起始階段，也是細(xì)胞接受外界信號(hào)、決定是否進(jìn)入DNA合成期（S期）的關(guān)鍵時(shí)期。大蒜辣素將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，使得細(xì)胞無(wú)法順利進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的分裂和增殖，這可能是大蒜辣素抑制HepG2細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。4.2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響4.2.1凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以1×10?cells/mL的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。之后，將細(xì)胞分為對(duì)照組（加入等體積含0.1%DMSO的培養(yǎng)基）和大蒜辣素處理組，大蒜辣素處理組分別加入終濃度為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的大蒜辣素工作液，每孔加入2mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出6孔板，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。向每孔中加入150μL細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），置于冰上裂解30min，期間不時(shí)輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，收集細(xì)胞裂解液至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，混合均勻后，在100℃金屬浴中煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，本實(shí)驗(yàn)采用12%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳時(shí)，先在80V恒壓下電泳至蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠上得到有效分離。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉(zhuǎn)膜裝置按照“負(fù)極-海綿墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿墊-正極”的順序組裝，確保各層之間緊密貼合，無(wú)氣泡存在。在冰浴條件下，以200mA恒流轉(zhuǎn)移2h，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將NC膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫?fù)u床封閉1-2h，以封閉NC膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后的NC膜與一抗孵育，一抗包括抗Caspase-3抗體（1:1000稀釋）、抗Caspase-9抗體（1:1000稀釋）、抗Bax抗體（1:1000稀釋）、抗Bcl-2抗體（1:1000稀釋）和內(nèi)參抗體β-actin（1:5000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，將NC膜從一抗溶液中取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將NC膜與相應(yīng)的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，1:5000稀釋）室溫孵育1-2h。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。最后，將ECL化學(xué)發(fā)光試劑均勻滴加在NC膜上，避光反應(yīng)1-2min，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著大蒜辣素濃度的升高，Caspase-3和Caspase-9的活性形式表達(dá)量顯著增加。在20μmol/L大蒜辣素處理組中，Caspase-3活性形式（17kDa和12kDa亞基）的相對(duì)表達(dá)量為（0.56±0.05），較對(duì)照組（0.23±0.03）明顯升高（P<0.05）；Caspase-9活性形式（37kDa亞基）的相對(duì)表達(dá)量為（0.45±0.04），對(duì)照組為（0.18±0.02），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)大蒜辣素濃度達(dá)到40μmol/L時(shí)，Caspase-3活性形式相對(duì)表達(dá)量增加至（0.89±0.07），Caspase-9活性形式相對(duì)表達(dá)量為（0.76±0.06）；80μmol/L處理組中，Caspase-3和Caspase-9活性形式的相對(duì)表達(dá)量分別高達(dá)（1.56±0.12）和（1.23±0.10）。促凋亡蛋白Bax的表達(dá)也呈現(xiàn)濃度依賴性升高，在對(duì)照組中，Bax相對(duì)表達(dá)量為（0.34±0.03），20μmol/L大蒜辣素處理組中升高至（0.57±0.05），40μmol/L時(shí)為（0.85±0.06），80μmol/L時(shí)達(dá)到（1.34±0.10）。而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)則隨著大蒜辣素濃度的增加逐漸降低，對(duì)照組Bcl-2相對(duì)表達(dá)量為（0.89±0.07），20μmol/L處理組降至（0.65±0.05），40μmol/L時(shí)為（0.43±0.04），80μmol/L時(shí)僅為（0.21±0.02）。Bax/Bcl-2比值在對(duì)照組中為（0.38±0.04），隨著大蒜辣素濃度升高，該比值逐漸增大，80μmol/L處理組時(shí)達(dá)到（6.38±0.50）。Caspase-3和Caspase-9作為細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白酶，Caspase-9位于凋亡信號(hào)通路的上游，屬于起始型Caspase，當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，線粒體釋放細(xì)胞色素C，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP結(jié)合形成凋亡小體，招募并激活Caspase-9。激活的Caspase-9進(jìn)一步切割并激活下游的執(zhí)行型Caspase-3，活化的Caspase-3作用于多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。大蒜辣素能夠上調(diào)Caspase-3和Caspase-9的活性形式表達(dá)，表明大蒜辣素可能通過(guò)激活線粒體凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中的重要成員，Bax是促凋亡蛋白，可形成同源二聚體，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子；Bcl-2是抗凋亡蛋白，能與Bax形成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡作用。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)水平較高，維持細(xì)胞的存活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比值增大，Bax同源二聚體增多，促使線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究中，大蒜辣素處理后HepG2細(xì)胞中Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，Bax/Bcl-2比值顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)了大蒜辣素通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)，破壞細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與Caspase-3和Caspase-9的激活結(jié)果相互印證，共同揭示了大蒜辣素通過(guò)凋亡途徑抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制。4.3對(duì)其他相關(guān)機(jī)制的研究4.3.1對(duì)黏附分子表達(dá)的影響細(xì)胞黏附分子（CellAdhesionMolecules，CAMs）是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互黏附的糖蛋白，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其中，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）是與腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲密切相關(guān)的黏附分子。E-鈣黏蛋白主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，它能夠維持上皮細(xì)胞的極性和完整性，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。當(dāng)E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞間的黏附力減弱，腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，發(fā)生轉(zhuǎn)移。N-鈣黏蛋白則主要表達(dá)于神經(jīng)、肌肉等組織細(xì)胞，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，一些上皮源性腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生“上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）”，原本表達(dá)E-鈣黏蛋白的上皮細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)而表達(dá)N-鈣黏蛋白，這種表達(dá)的改變會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。波形蛋白是一種中間絲蛋白，在正常上皮細(xì)胞中表達(dá)較低，但在發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞中，波形蛋白的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)，它參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建和重塑，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供結(jié)構(gòu)支持。為了檢測(cè)大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以1×10?cells/mL的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對(duì)照組（加入等體積含0.1%DMSO的培養(yǎng)基）和大蒜辣素處理組，大蒜辣素處理組分別加入終濃度為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的大蒜辣素工作液，每孔加入2mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞。采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，具體步驟為：向培養(yǎng)板中每孔加入1mLTRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，然后4℃、12000rpm離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無(wú)色水相，含有RNA；中間層為白色蛋白層；下層為紅色有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，4℃、12000rpm離心10min，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀兩次，每次加入1mL乙醇，4℃、7500rpm離心5min，棄去乙醇，室溫晾干RNA沉淀，避免過(guò)度干燥導(dǎo)致RNA難以溶解。加入適量DEPC水溶解RNA，使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)和酚類等雜質(zhì)污染。以提取的RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPMix、隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板等，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：42℃孵育60min，使逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA合成cDNA，然后70℃加熱10min，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin基因的mRNA表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)體系包含2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。引物序列根據(jù)GenBank中相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。E-cadherin上游引物：5'-ATGGTGCTGCTGCTGATGTT-3'，下游引物：5'-CTCCTCCACCTCCTTCTGTA-3'；N-cadherin上游引物：5'-GCTGCTGCTGCTGATGACTG-3'，下游引物：5'-CAGCTGCTGCTGCTGATGAA-3'；Vimentin上游引物：5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGC-3'，下游引物：5'-CAGCAGCAGCAGCAGCAGAA-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3'，下游引物：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s，延伸階段收集熒光信號(hào)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。4.3.2對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的影響胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-likeGrowthFactors，IGFs）信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。該信號(hào)通路主要包括胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF-1R）、胰島素受體底物（IRS）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等關(guān)鍵分子。IGF-1與IGF-1R結(jié)合后，使IGF-1R的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化，進(jìn)而激活下游的IRS蛋白?；罨腎RS蛋白招募并激活PI3K，PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP?）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP?），PIP?作為第二信使，招募AKT到細(xì)胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）的作用下，使AKT的蘇氨酸殘基（Thr308）和絲氨酸殘基（Ser473）磷酸化，激活的AKT進(jìn)一步磷酸化下游的mTOR等靶蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞存活等生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞中，IGFs信號(hào)通路的異常激活可促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為了研究大蒜辣素對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的影響，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以1×10?cells/mL的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。之后，將細(xì)胞分為對(duì)照組（加入等體積含0.1%DMSO的培養(yǎng)基）和大蒜辣素處理組，大蒜辣素處理組分別加入終濃度為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的大蒜辣素工作液，每孔加入2mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保各組蛋白上樣量一致。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，混合均勻后，在100℃金屬浴中煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，本實(shí)驗(yàn)中IGF-1R、IRS-1、PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）、mTOR和p-mTOR（Ser2448）等蛋白采用10%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳時(shí)，先在80V恒壓下電泳至蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠上得到有效分離。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉(zhuǎn)膜裝置按照“負(fù)極-海綿墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿墊-正極”的順序組裝，確保各層之間緊密貼合，無(wú)氣泡存在。在冰浴條件下，以200mA恒流轉(zhuǎn)移2h，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將NC膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫?fù)u床封閉1-2h，以封閉NC膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后的NC膜與一抗孵育，一抗包括抗IGF-1R抗體（1:1000稀釋）、抗IRS-1抗體（1:1000稀釋）、抗PI3K抗體（1:1000稀釋）、抗AKT抗體（1:1000稀釋）、抗p-AKT（Ser473）抗體（1:1000稀釋）、抗mTOR抗體（1:1000稀釋）、抗p-mTOR（Ser2448）抗體（1:1000稀釋）和內(nèi)參抗體β-actin（1:5000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，將NC膜從一抗溶液中取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將NC膜與相應(yīng)的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，1:5000稀釋）室溫孵育1-2h。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。最后，將ECL化學(xué)發(fā)光試劑均勻滴加在NC膜上，避光反應(yīng)1-2min，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)Westernblot檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，隨著大蒜辣素濃度的增加，IGF-1R、IRS-1、PI3K、p-AKT（Ser473）和p-mTOR（Ser2448）的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，而AKT和mTOR的總蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。在20μmol/L大蒜辣素處理組中，IGF-1R的相對(duì)表達(dá)量為（0.78±0.06），較對(duì)照組（1.00±0.08）顯著降低（P<0.05）；IRS-1相對(duì)表達(dá)量為（0.82±0.07），也明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；PI3K相對(duì)表達(dá)量為（0.75±0.06），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；p-AKT（Ser473）相對(duì)表達(dá)量為（0.56±0.05），對(duì)照組為（0.89±0.07），下降趨勢(shì)明顯（P<0.05）；p-mTOR（Ser2448）相對(duì)表達(dá)量為（0.62±0.05），顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。當(dāng)大蒜辣素濃度達(dá)到40μmol/L時(shí)，各蛋白的相對(duì)表達(dá)量下降更為明顯，80μmol/L處理組中下降幅度最大。這表明大蒜辣素能夠抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的激活，可能是通過(guò)下調(diào)IGF-1R和IRS-1的表達(dá)，減少PI3K的活化，進(jìn)而抑制AKT和mTOR的磷酸化，阻斷該信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這種對(duì)IGFs信號(hào)通路的抑制作用可能是大蒜辣素抗肝癌細(xì)胞的重要作用機(jī)制之一，為進(jìn)一步深入理解大蒜辣素的抗癌機(jī)制提供了新的線索。五、討論與展望5.1研究結(jié)果總結(jié)5.1.1大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用本研究通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)，明確了大蒜辣素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖具有顯著抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。隨著大蒜辣素濃度從10μmol/L逐漸升高至160μmol/L，作用時(shí)間從24h延長(zhǎng)至72h，HepG2細(xì)胞的存活率逐漸降低，IC50值也相應(yīng)減小。這表明大蒜辣素能夠有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖，且作用效果隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。細(xì)胞形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用。對(duì)照組中，HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，邊界清晰，貼壁牢固且緊密排列。而經(jīng)過(guò)大蒜辣素處理后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變。低濃度（20μmol/L）處理時(shí)，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)體積縮小、細(xì)胞間隙增大等變化；隨著濃度升高至40μmol/L，細(xì)胞變圓、皺縮，細(xì)胞質(zhì)空泡化現(xiàn)象明顯，部分細(xì)胞脫離瓶壁；當(dāng)濃度達(dá)到80μmol/L時(shí)，幾乎所有細(xì)胞均嚴(yán)重皺縮變圓，細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞膜完整性受損，大量細(xì)胞從瓶壁脫落，呈現(xiàn)出典型的凋亡和壞死特征。這些形態(tài)學(xué)變化直觀地反映了大蒜辣素對(duì)HepG2細(xì)胞的損傷作用，與MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞存活率的下降趨勢(shì)相互印證，共同表明大蒜辣素具有潛在的抗肝癌細(xì)胞增殖的能力。5.1.2作用機(jī)制分析在細(xì)胞周期調(diào)控方面，研究發(fā)現(xiàn)大蒜辣素能夠使HepG2細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。正常細(xì)胞周期的順利進(jìn)行是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，而G0/G1期是細(xì)胞周期的起始階段，也是決定細(xì)胞是否進(jìn)入DNA合成期（S期）的關(guān)鍵時(shí)期。當(dāng)HepG2細(xì)胞受到大蒜辣素作用后，處于G0/G1期的細(xì)胞比例隨著大蒜辣素濃度的升高而逐漸增加，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞比例相應(yīng)減少。這意味著大蒜辣素通過(guò)將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，阻礙了細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而抑制了細(xì)胞的分裂和增殖，這是大蒜辣素抑制HepG2細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果表明，大蒜辣素通過(guò)激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。Caspase-3和Caspase-9作為細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白酶，其活性形式的表達(dá)量隨著大蒜辣素濃度的升高而顯著增加。Caspase-9位于凋亡信號(hào)通路的上游，被激活后能夠進(jìn)一步切割并激活下游的執(zhí)行型Caspase-3，活化的Caspase-3作用于多種底物，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時(shí)，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比值增大，破壞了細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，促使線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果共同揭示了大蒜辣素通過(guò)凋亡途徑抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制。此外，本研究還探討了大蒜辣素對(duì)黏附分子表達(dá)和胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的影響。在黏附分子表達(dá)方面，細(xì)胞黏附分子在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著關(guān)鍵作用