ICS67.220.20CCSX60T/CIQA113-2025L-蘋果酸（發(fā)酵法）本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)進(jìn)出口食品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（CIQA/TC10）提出并歸口。。本文件起草單位：南京師范大學(xué)、天津科技大學(xué)、昊禾生物科技（常州）有限公司。本文件主要起草人：徐晴、薛鋒、劉浩本文件知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫協(xié)會(huì)所有。任何單位或個(gè)人未經(jīng)許可，不得以營(yíng)利為目的，印制、出版、翻譯、轉(zhuǎn)發(fā)或復(fù)制全文或部分文字。1T/CIQA113-2025L-蘋果酸（發(fā)酵法）本文件給出了L-蘋果酸化學(xué)名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式和相對(duì)分子質(zhì)量，規(guī)定了發(fā)酵法L-蘋果酸的技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法等。本文件適用于利用以糖質(zhì)原料、微生物一步發(fā)酵法生產(chǎn)的L-蘋果酸。2規(guī)范性引用文件GB1886.40-2015食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑L-蘋果酸GB5009.3-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定GB5009.12-2023食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測(cè)定GB5009.74-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑中重金屬限量試驗(yàn)法GB5009.75-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑中鉛的測(cè)定GB5009.76-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑中砷的測(cè)定方法GB/T601-2016化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備GB/T602-2002化學(xué)試劑雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備GB/T603-2023化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備GB/T613-2007化學(xué)試劑比旋光本領(lǐng)（比旋光度）測(cè)定通用方法GB/T6040-2019GB/T6682-2008GB/T9741-2008GB/T9729-2007紅外光譜分析方法通則分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法化學(xué)試劑灼燒殘?jiān)鼫y(cè)定通用方法化學(xué)試劑氯化物測(cè)定通用方法ASTMD6866-20StandardTestMethodsforDeterminingtheBiobasedContentofSolid,Liquid,andGaseousSamplesUsingRadiocarbonAnalysis3化學(xué)名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式和相對(duì)分子質(zhì)量3.1化學(xué)名稱L-羥基丁二酸3.2分子式C4H6O53.3結(jié)構(gòu)式3.4相對(duì)分子質(zhì)量134.09（按2022年國(guó)際相對(duì)原子質(zhì)量）2T/CIQA113-20254技術(shù)要求4.1感官要求感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1感官要求4.2理化指標(biāo)理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2理化指標(biāo)L-蘋果酸(C4H6O5)含量(w)/%≥水分，w/%-1.6～-2.6灼燒殘?jiān)?w)/%富馬酸(w)/%丁二酸(w)/%馬來酸(w)/%重金屬(以Pb計(jì))/(mg/kg)砷(以As計(jì))/(mg/kg)22T/CIQA113-20253規(guī)范性檢驗(yàn)方法試驗(yàn)方法規(guī)定的一些試驗(yàn)過程可能導(dǎo)致危險(xiǎn)情況。操作者應(yīng)采取適當(dāng)?shù)陌踩捅Ｗo(hù)措施。A.2一般規(guī)定本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑和水在沒有注明其他要求時(shí)，均指分析純?cè)噭┖虶B/T6682-2008規(guī)定的三級(jí)水。檢驗(yàn)中所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑及制品，在沒有注明其他要求時(shí)，均按GB/T601-2016、GB/T602-2002和GB/T603-2023的規(guī)定制備。試驗(yàn)中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時(shí)，均指水溶液。A.3鑒別試驗(yàn)A.3.1試劑和材料A.3.1.1氨水溶液：2體積氨水與3體積純水混溶。A.3.1.2對(duì)氨基苯磺酸溶液：10g/L。A.3.1.3亞硝酸鈉溶液：200g/L。A.3.1.4氫氧化鈉溶液：40g/L。A.3.2儀器和設(shè)備A.3.2.1紅外光譜儀A.3.2.2水浴鍋A.3.2.3旋光測(cè)定儀A.3.3鑒別方法A.3.3.1蘋果酸氨鹽呈色試驗(yàn)稱取0.5g試樣，精確至0.01g，置于50mL試管中，加入10mL水溶解。用氨水溶液中和至中性，加入1mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，在沸水浴中加熱5min。加入5mL亞硝酸鈉溶液，再置于水浴加熱3min后，加入5mL氫氧化鈉溶液，試驗(yàn)溶液應(yīng)立即呈紅色。A.3.3.2旋光特性試驗(yàn)試驗(yàn)方法同A.5，試樣水溶液應(yīng)呈左旋特性。A.4L-蘋果酸(C4H6O5)、丁二酸、富馬酸、馬來酸含量的測(cè)定A.4.1原理用高效液相色譜法，在選定的工作條件下，通過色譜柱使試樣溶液中各組分分離，用紫外吸收檢測(cè)器檢測(cè)，用外標(biāo)法定量，計(jì)算試樣中L-蘋果酸、丁二酸、富馬酸、馬來酸的含量。A.4.2試劑和材料A.4.2.1氫氧化鈉溶液：20g/L4T/CIQA113-2025A.4.2.20.1%磷酸-甲醇：量取1mL±0.02mL磷酸（優(yōu)級(jí)純?cè)噭┯?000mL容量瓶中，加入100mL甲醇（HPLC級(jí)試劑可根據(jù)柱效調(diào)整加入量加水稀釋至刻度，再經(jīng)0.45μm濾膜過濾。A.4.2.3L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.0%；A.4.2.4丁二酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.0%；A.4.2.5富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.0%；A.4.2.6馬來酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.0%；A.4.3儀器和設(shè)備A.4.3.1高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器。A.4.3.2分析天平：感量0.1mg。A.4.3.3離心機(jī)。A.4.4參考色譜條件推薦的色譜柱及典型操作條件見表A.1，富馬酸和馬來酸含量測(cè)定典型高效液相色譜圖參見附錄B圖B.1，各組分的相對(duì)保留時(shí)間（見附錄表B1，L-蘋果酸：3.9min，馬來酸：4.2min，丁二酸：5.6min，富馬酸：6.4min）。其他能達(dá)到同等分離程度的色譜柱和色譜操作條件均可使用。表A.1色譜柱和典型色譜操作條件40℃,控制精度±1℃流動(dòng)速度/(mL/min)A.4.5分析步驟A.4.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備A.4.5.1.1L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)中間液配制：稱取500mgL-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.1mg，溶于適量水（必要時(shí)加入少量氫氧化鈉溶液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，用磷酸溶液稀釋至刻度，臨用前配置。標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制：分別吸取L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)中間液0.5mL，1.0mL，2.5mL，5mL，10.0mL于20mL容量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的溶液分別為：5.0mg/mL，2.5mg/mL，1.25mg/mL,0.5mg/mL，0.25mg/mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣，臨用前配置。A.4.5.1.2富馬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備富馬酸標(biāo)準(zhǔn)中間液配制：稱取50mg富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.1mg，溶于適量水（必要時(shí)加入少量氫氧化鈉溶液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，用磷酸溶液稀釋至刻度。標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制：分別吸取富馬酸標(biāo)準(zhǔn)中間液0.5mL，1mL，2.5mL，5mL，10.0mL于100T/CIQA113-2025mL容量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的溶液分別為：0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.025mg/mL,0.01mg/mL，0.005mg/mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣，臨用前配置。A.4.5.1.3丁二酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備丁二酸標(biāo)準(zhǔn)中間液配制：稱取50mg丁二酸標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.1mg，溶于適量水（必要時(shí)加入少量氫氧化鈉溶液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，用磷酸溶液稀釋至刻度。標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制：分別吸取丁二酸標(biāo)準(zhǔn)中間液0.2ml,0.5ml,1.0mL，2.5mL，5mL于10毫升容量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的溶液分別為：0.02mg/mL,0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.25mg/mL,0.5mg/mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣，臨用前配置。A.4.5.1.4馬來酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備馬來酸標(biāo)準(zhǔn)中間液配制：稱取50mg馬來酸標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.1mg，溶于適量水（必要時(shí)加入少量氫氧化鈉溶液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，用磷酸溶液稀釋至刻度。標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制：分別吸取馬來酸標(biāo)準(zhǔn)中間液0.5mL，1mL，2.5mL，5mL，10.0mL于100毫升容量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的溶液分別為：0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.025mg/mL,0.01mg/mL，0.005mg/mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣，臨用前配置。A.4.5.2試樣溶液的制備稱取0.2g試樣，精確至0.0002g，置于50mL容量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，再經(jīng)超聲波脫氣處理。A.4.5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制在A.4.4參考色譜條件下，分別將L-蘋果酸等標(biāo)準(zhǔn)系列工作液注入高效液相色譜儀，進(jìn)行色譜分析，測(cè)定相應(yīng)的峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。A.4.5.4樣品測(cè)定將樣品溶液注入高效液相色譜儀，得到相應(yīng)的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中L-蘋果酸、富馬酸、丁二酸和馬來酸的濃度。（必要時(shí)，對(duì)待測(cè)液進(jìn)行稀釋檢測(cè)）A.4.6結(jié)果計(jì)算蘋果酸、丁二酸、富馬酸或馬來酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)wi，按公式(A.1)計(jì)算：Ai——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品溶液中各組分的含量，單位是毫克每毫升（mg/mlV——標(biāo)準(zhǔn)溶液定容體積，單位是毫升（mLf——試液的稀釋倍數(shù)；mi——樣品質(zhì)量，單位為毫克(mg)。A.5比旋光度的測(cè)定A.5.1稱取4.25g試樣，精確至0.1mg，加入20mL水溶解，移至50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。其余步驟按照GB/T613-2007的規(guī)定執(zhí)行。比旋光度αm(20℃,D)數(shù)值以“(o)·dm2·kg-1”表示，按公式(A.2)計(jì)算：α——試樣溶液在20℃測(cè)得的旋光度的數(shù)值，單位為度(°);l——旋光管長(zhǎng)度的數(shù)值，單位為分米（dm）；ρ——溶液中有效組分的質(zhì)量濃度，單位為克每毫升(g/mL)。A.6ee值的測(cè)定A.6.1原理用高效液相色譜法，在選定的工作條件下，通過手性色譜柱使試樣蘋果酸中D,L構(gòu)型分開，用紫外吸收檢測(cè)器檢測(cè)，用外標(biāo)法定量，計(jì)算試樣中L-蘋果酸在總蘋果酸的含量的占比。A.6.2儀器和設(shè)備高效液相色譜，配備紫外檢測(cè)器A.6.3參考色譜條件A.6.3.1色譜柱CHIRALPAK-AD-H（4.6×250mm;5μm）A.6.3.3檢測(cè)波長(zhǎng)220nmA.6.3.4柱溫30℃A.6.3.5流速1.0ml/minA.6.3.6進(jìn)樣量10μlA.6.4分析步驟稱取50mg試樣，精確至0.1mg，置于50mL容量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，再經(jīng)超聲波脫氣處理。在A6.3參考色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，D-蘋果酸的相對(duì)保留時(shí)間為7.5min，L-蘋果酸的相對(duì)保留時(shí)間為8.5min（見附錄表C1分析得到試樣中D-蘋果酸和L-蘋果酸的峰面積，以面積歸一化法定量。A6.5結(jié)果計(jì)算L-蘋果酸光學(xué)純度ee值，按公式A.3計(jì)算其中[L]和[D]分別表示蘋果酸的L和D構(gòu)型對(duì)映體在HPLC圖譜中的各自峰面積。試驗(yàn)結(jié)果以平行測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值為準(zhǔn)。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不大于0.1%。A.7灼燒殘?jiān)臏y(cè)定稱取2.5g試樣，精確至0.1mg。其他按GB/T9741-2008的