ICS11.220

CCSB41

54

西藏自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB54/T0462—2025

羊傳染性膿皰病診斷技術(shù)規(guī)范

2025-05-10發(fā)布2025-06-10實(shí)施

西藏自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局??發(fā)布

DB54/T0462—2025

目次

前言..................................................................................II

1范圍................................................................................1

2規(guī)范性引用文件......................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義..........................................................................1

4生物安全措施........................................................................2

5臨床診斷............................................................................2

6病毒分離培養(yǎng)........................................................................3

7分子生物學(xué)診斷......................................................................4

8綜合判定............................................................................5

附錄A（資料性）相關(guān)癥狀圖片..........................................................6

附錄B（資料性）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物電泳圖.........................................9

附錄C（資料性）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果圖...............................................10

I

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提出。

本文件由西藏農(nóng)業(yè)農(nóng)村標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本文件起草單位：西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)。

本文件主要起草人：四朗玉珍、富國(guó)文、格桑卓嘎、班旦、樊月圓、拉巴次旦、吳金措姆。

II

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羊傳染性膿皰病診斷技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件提出了羊傳染性膿皰病的生物安全措施、臨床診斷、病毒分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)要

求。

本文件適用于羊傳染性膿皰病的診斷。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫

NY/T3235羊傳染性膿皰診斷技術(shù)

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

羊傳染性膿皰病

亦稱羊口瘡、羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎，由羊傳染性膿皰病毒導(dǎo)致的山羊、綿羊接觸

性、嗜上皮性傳染病。

3.2

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

英文全稱PolymeraseChainReaction，縮寫為PCR，由引物選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的檢測(cè)方

法。

3.3

雙蒸水

雙蒸水，是重蒸水的一種，是將經(jīng)過(guò)一次蒸餾后的水再次蒸餾所得到的水（二級(jí)水）。

3.4

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)預(yù)混液

英文名稱PCRMasterMix，PCR試驗(yàn)時(shí)使用的預(yù)混物。

1

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3.5

DNA標(biāo)記物

英文名稱DNAMarker，特定分子量大小的DNA片段混合物，用于估算樣品DNA分子量的大小。

3.6

熒光定量PCR探針?lè)?/p>

除了引物外另外設(shè)置一個(gè)探針，在探針的兩端分別帶上發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，此時(shí)，兩個(gè)基團(tuán)平衡

不發(fā)光；當(dāng)DNA通過(guò)引物合成時(shí)，探針被折斷，釋放出發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，兩個(gè)距離較遠(yuǎn)，發(fā)光基團(tuán)

產(chǎn)生熒光，被機(jī)器收集到信號(hào)，從而檢測(cè)基因的量。

3.7

循環(huán)閾值

也稱Ct值，在熒光定量PCR中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4生物安全措施

樣品采集及處理的生物安全措施按GB19489的規(guī)定執(zhí)行。

5臨床診斷

5.1流行病學(xué)

綿羊和山羊均易感，各年齡段的羊均可發(fā)病，以1月齡～6月齡多發(fā)，成年羊呈散發(fā)。除能感染羊外，

該病毒對(duì)其他反芻動(dòng)物和人類也具有感染能力。

一年四季均可發(fā)病，常呈群發(fā)性流行。自然放牧條件下，冬春季節(jié)多發(fā)。

病羊是該病的主要傳染源，受到污染的圈舍、欄桿、墊草、飼槽以及飼草等都存在病毒，可經(jīng)皮膚

黏膜損傷處感染其他羊。

5.2臨床癥狀

5.2.1唇型

唇型的臨床癥狀及病理變化表現(xiàn)為上唇、鼻鏡、口角等部位出現(xiàn)小紅疹，逐漸演變?yōu)樾〗Y(jié)節(jié)和疣狀，

最后破潰形成硬痂，癥狀見(jiàn)附錄A.1。

5.2.2蹄型

蹄型多見(jiàn)于綿羊，常表現(xiàn)為一肢患病，其臨床癥狀及病理變化表現(xiàn)為蹄叉、蹄冠、系部皮膚出現(xiàn)水

皰、膿皰，破潰后形成潰瘍，癥狀見(jiàn)附錄A.2。

5.2.3外陰型

外陰型較少見(jiàn)，母羊臨床特征及病理變化主要表現(xiàn)為有膿性或黏性陰道分泌物，陰唇及周圍皮膚有

潰瘍，癥狀見(jiàn)附錄A.3；公羊出現(xiàn)陰鞘腫脹、膿皰、潰瘍。

2

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5.2.4乳房型

乳房型表現(xiàn)為乳頭和乳房皮膚出現(xiàn)膿皰，后形成痂垢，癥狀見(jiàn)附錄A.4。

5.2.5其他類型

體表皮膚感染臨床癥狀與病理變化與唇型相似。小腸和腸系膜感染其臨床特征及病理變化主要表現(xiàn)

為體溫升高大于39.5℃、精神萎靡、腹腔積液，小腸漿膜表面出現(xiàn)黃白色潰瘍?cè)?，腸系膜上出現(xiàn)大小不

一的圓形或橢圓形膿皰，病理變化見(jiàn)附錄A.5。

5.3結(jié)果判斷

根據(jù)臨床癥狀，可判定為羊傳染性膿皰病疑似病例。

6病毒分離培養(yǎng)

6.1病料采集、處理及運(yùn)輸

6.1.1痂皮

采集發(fā)病羊患處痂塊0.5g～1.0g，用無(wú)菌生理鹽水漂洗3次后剪碎，研磨并以無(wú)菌生理鹽水按1:10

制成懸液，加青霉素、鏈霉素各2000IU/mL，置4℃冰箱過(guò)夜，3000r/min、離心l0min，取上清，當(dāng)

日不能送到實(shí)驗(yàn)室診斷，則樣品于-20℃保存，再送檢，運(yùn)輸中保證密封、低溫狀態(tài)。

6.1.2水泡液

用無(wú)菌注射器抽取丘疹水泡液，置于含2倍體積無(wú)菌生理鹽水中的滅菌離心管中，加青霉素、鏈霉

素各2000IU/mL，3000r/min離心l0min，取上清，當(dāng)日不能送到實(shí)驗(yàn)室診斷，則樣品于-20℃保存，

再送檢，運(yùn)輸中保證密封、低溫狀態(tài)。

6.2主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)、生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、透射電子顯微鏡、紫外燈、冰箱、可調(diào)

微量移液器20μL～200μL、200μL～1000μL。

6.3試劑耗材

細(xì)胞培養(yǎng)液（含DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液90%、胎牛血清10%、青霉素100IU/mL和鏈霉素100mg/mL構(gòu)成）、

細(xì)胞維持液（含DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液98%、胎牛血清2%、青霉素100IU/mL和鏈霉素100mg/mL構(gòu)成）、25cm2

細(xì)胞培養(yǎng)瓶、0.22μm濾器、15ml離心管、濾紙、碳支持膜銅網(wǎng)、2%磷鎢酸、無(wú)菌移液器槍頭20μL～

200μL、200μL～1000μL。

6.4細(xì)胞制備

犢牛睪丸原代細(xì)胞、犢牛腎原代細(xì)胞或羊皮膚細(xì)胞任一種，制備方法參照NY/T3235執(zhí)行。

6.5細(xì)胞處理方法

待6.4中的細(xì)胞長(zhǎng)成良好的單層后，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液。將6.1.1或6.1.2中病料處理液用0.22μm濾器

過(guò)濾，取1ml接種于細(xì)胞表面，37℃吸附1h。吸出病料處理液，加入細(xì)胞維持液4mL，置37℃、5%CO2

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

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將出現(xiàn)病變的細(xì)胞與培養(yǎng)液一起反復(fù)凍融3次，吸出，置于15ml離心管中，3000rpm離心30min，

取上清滴于碳支持膜銅網(wǎng)上，3min～5min后用濾紙吸去多余液體，再將2%磷鎢酸滴于碳支持膜銅網(wǎng)上，

2min～3min后用濾紙吸去多余液體，室溫放置干燥，置于透射電子顯微鏡下觀察。

6.6判定

每天觀察細(xì)胞變化，連續(xù)觀察5d。如6.4中細(xì)胞在接種后1d～5d內(nèi)出現(xiàn)變圓、腫脹、間質(zhì)增寬、

折光性增強(qiáng)、團(tuán)聚、脫落等細(xì)胞病變，于透射電子顯微鏡下觀察到橢圓形病毒粒子，長(zhǎng)250nm～280

nm，寬170nm～200nm，判為病毒分離陽(yáng)性。盲傳3代無(wú)細(xì)胞病變，則判為病毒分離陰性。

7分子生物學(xué)診斷

7.1樣品DNA提取

取6.1.1或6.1.2的痂皮或水泡液處理上清液，使用病毒DNA提取試劑盒提取核酸，操作步驟按照病

毒DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

7.2PCR檢測(cè)

7.2.1主要儀器設(shè)備

生物安全柜、高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、旋渦混合振蕩器、電腦、冰箱、微

波爐、微量移液器2μL～20μL、0.5μL～10μL。

7.2.2試劑耗材

雙蒸水、PCRMasterMix、電泳緩沖液、DNAMarker、瓊脂糖、PCR反應(yīng)管、無(wú)菌移液器吸頭。

7.2.3引物

PCR引物序列如下：

——上游引物：5'-GAGGGCGTCGACATCACG-3'；

——下游引物：5'-CCGGCACCATCGAGAGCA-3'。

使用時(shí)配制成10μmol/L工作液，置-20℃保存。

7.2.4反應(yīng)體系與反應(yīng)程序

按25μL體系配制。取7.1中樣品DNA1μL、PCRMasterMix12.5μl、7.2.3中上下游引物各1μl、

ddH2O9.5μl。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延

伸10min。

7.2.5電泳檢測(cè)

制備1.5%電泳瓊脂糖凝膠，取5μl~8μl樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入上樣孔，同時(shí)加入陽(yáng)性和陰性對(duì)照以

及DNAMarker，于1×TAE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

7.2.6結(jié)果分析與判定

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陽(yáng)性對(duì)照、樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致，在505bp附近有明亮條帶，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)條

帶，判定為陽(yáng)性，參見(jiàn)附錄B。

樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后Blast比對(duì)結(jié)果為羊傳染性膿皰病毒B2L基因，判定結(jié)果為陽(yáng)性。

7.3熒光定量PCR檢測(cè)（探針?lè)ǎ?/p>

7.3.1主要儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、高速冷凍離心機(jī)、熒光定量PCR儀、旋渦混合振蕩器、電腦、冰箱、微量移液器2

μL～20μL、0.5μL～10μL。

7.3.2試劑耗材

雙蒸水、2×qPCRProbeMasterMix、Eppendorf管、熒光定量PCR反應(yīng)管、無(wú)菌移液器槍頭。

7.3.3引物與探針

熒光定量PCR引物及探針序列如下：

——上游引物：5'-GGGGCGGCGTATTCTTCT-3'；

——下游引物：5'-GCTGTTCTTGGCGTTCTCG-3'；

——TaqMan探針（FAM）5'-ATCGTGCGGTAGAAGCCCAG-3'（BHQ1）。

使用時(shí)配制成10μmol/L工作液，置-20℃保存。

7.3.4反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

以病毒DNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。按25μl體系配制：ddH2O8.5μl、7.3.3中上下游引物

各0.4μl、TaqMan探針0.2μl、7.1中樣品DNA0.5μl、2×qPCRProbeMasterMix10μl。

反應(yīng)程序：37℃污染消化2min；95℃預(yù)變性5min，95℃退火10s，60℃延伸30s，45個(gè)循環(huán)。

7.3.5結(jié)果分析與判定

讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，不同儀器

可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整?？瞻讓?duì)照、陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)≤35，

并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，參見(jiàn)附錄C。如陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照條件不滿足以上條件，此試驗(yàn)視為無(wú)效。

無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，表明樣品中無(wú)羊傳染性膿皰病毒核酸。Ct值≤35，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，表

示樣品中含有羊傳染性膿皰病毒核酸。Ct值＞35，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣品建議復(fù)檢。復(fù)檢仍出現(xiàn)上

述結(jié)果的，判定為陽(yáng)性。

8綜合判定

符合流行病學(xué)和臨床癥狀，可判定為羊傳染性膿皰病疑似病例。樣品病毒分離培養(yǎng)及透射電子顯微

鏡形態(tài)學(xué)觀察、PCR、熒光定量PCR結(jié)果中有一項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，可判定為羊傳染性膿皰病確診病例。

5

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A

A

附錄A

（資料性）

相關(guān)癥狀圖片

A.1口唇型：口唇處出現(xiàn)大小不等的疣狀增生

A.2蹄型：蹄部出現(xiàn)桑葚樣增生

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A.3外陰型：外陰部出現(xiàn)大小不等的疣狀增生

A.4乳房型：乳房部出現(xiàn)膿皰、痂垢

A.5其他部位病變：腸系膜上出現(xiàn)大小不一的圓形或橢圓形膿皰