生物課題立項(xiàng)申報(bào)書(shū)范文一、封面內(nèi)容

項(xiàng)目名稱(chēng)：基于CRISPR-Cas9技術(shù)的腫瘤微環(huán)境靶向調(diào)控及免疫治療機(jī)制研究

申請(qǐng)人姓名及聯(lián)系方式：張明，教授，郵箱：zhangming@

所屬單位：國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究院腫瘤生物學(xué)研究所

申報(bào)日期：2023年11月15日

項(xiàng)目類(lèi)別：應(yīng)用基礎(chǔ)研究

二．項(xiàng)目摘要

本項(xiàng)目旨在探索利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，以增強(qiáng)免疫治療的療效。腫瘤微環(huán)境（TME）是腫瘤細(xì)胞生存和進(jìn)展的關(guān)鍵因素，其復(fù)雜的細(xì)胞組成和分子網(wǎng)絡(luò)對(duì)免疫治療的有效性構(gòu)成顯著挑戰(zhàn)。本研究將首先通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)解析不同腫瘤類(lèi)型TME的關(guān)鍵調(diào)控基因和信號(hào)通路，篩選出具有潛在靶向價(jià)值的基因靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)基于CRISPR-Cas9的基因編輯工具，構(gòu)建能夠特異性降解TME中抑制性細(xì)胞因子或上調(diào)抗腫瘤免疫應(yīng)答的基因編輯載體。研究將采用原位注射和異種移植動(dòng)物模型，驗(yàn)證基因編輯干預(yù)對(duì)TME組成、免疫細(xì)胞功能及腫瘤免疫治療反應(yīng)的影響。同時(shí)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，揭示基因編輯調(diào)控TME的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型腫瘤免疫治療策略提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。預(yù)期成果包括建立一套高效的TME靶向基因編輯系統(tǒng)，闡明關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，并發(fā)表高水平研究成果，推動(dòng)腫瘤免疫治療的臨床轉(zhuǎn)化。本項(xiàng)目的實(shí)施將深化對(duì)腫瘤微環(huán)境與免疫互作的理解，為解決免疫治療耐藥性難題提供創(chuàng)新方案。

三.項(xiàng)目背景與研究意義

腫瘤是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一，其高發(fā)病率和高死亡率對(duì)社會(huì)公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。近年來(lái)，以免疫檢查點(diǎn)抑制劑和CAR-T細(xì)胞療法為代表的免疫治療技術(shù)在腫瘤治療領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，顯著改善了部分患者的生存預(yù)后。然而，免疫治療并非對(duì)所有患者均有效，約30%-50%的腫瘤患者對(duì)首次免疫治療無(wú)響應(yīng)或最終出現(xiàn)耐藥，限制了免疫治療的應(yīng)用范圍。深入理解腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment,TME）與腫瘤免疫治療的相互作用機(jī)制，是克服免疫治療耐藥性、提高治療成功率的關(guān)鍵。

當(dāng)前，對(duì)腫瘤微環(huán)境的研究已取得顯著進(jìn)展，研究表明TME由多種細(xì)胞類(lèi)型（如免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）和可溶性因子（如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等）組成，這些成分相互作用，共同調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移以及免疫治療的應(yīng)答。其中，抑制性免疫細(xì)胞（如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg、髓源性抑制細(xì)胞MDSC、抑制性樹(shù)突狀細(xì)胞DC）和免疫抑制性分子（如PD-L1、TGF-β）在多數(shù)腫瘤中高表達(dá)，是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的主要因素。此外，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（Tumor-AssociatedFibroblasts,TAFs）通過(guò)分泌多種促腫瘤和免疫抑制因子，進(jìn)一步惡化TME，降低抗腫瘤免疫應(yīng)答的有效性。盡管現(xiàn)有研究揭示了部分TME的關(guān)鍵調(diào)控分子和信號(hào)通路，但TME的復(fù)雜性及其動(dòng)態(tài)變化特性，使得全面解析TME與免疫治療的相互作用仍面臨巨大挑戰(zhàn)。

目前，針對(duì)TME的干預(yù)策略主要包括靶向治療和免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。靶向治療如抗PD-1/PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體等，通過(guò)阻斷免疫抑制性信號(hào)通路，部分恢復(fù)T細(xì)胞的抗腫瘤活性。然而，這些策略的療效受限于腫瘤本身的免疫原性以及TME的免疫抑制狀態(tài)。免疫調(diào)節(jié)劑如IL-2、抗TGF-β抗體等，雖能在一定程度上增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，但常伴隨嚴(yán)重的免疫相關(guān)副作用。此外，現(xiàn)有藥物往往缺乏對(duì)TME中關(guān)鍵細(xì)胞類(lèi)型和分子網(wǎng)絡(luò)的精準(zhǔn)調(diào)控能力，難以實(shí)現(xiàn)治療效果的最大化。因此，開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒的TME靶向干預(yù)策略，是當(dāng)前腫瘤免疫治療領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題。

本項(xiàng)目的研究具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和學(xué)術(shù)價(jià)值。從社會(huì)價(jià)值來(lái)看，通過(guò)深入解析TME與腫瘤免疫治療的相互作用機(jī)制，開(kāi)發(fā)基于CRISPR-Cas9的TME靶向干預(yù)技術(shù)，有望顯著提高免疫治療的療效，為腫瘤患者提供更多治療選擇，降低腫瘤帶來(lái)的社會(huì)負(fù)擔(dān)，改善患者生活質(zhì)量。從經(jīng)濟(jì)價(jià)值來(lái)看，本項(xiàng)目研究成果有望推動(dòng)腫瘤免疫治療領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新，為相關(guān)藥物和技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供新的思路和工具，促進(jìn)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的升級(jí)和發(fā)展，創(chuàng)造新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。從學(xué)術(shù)價(jià)值來(lái)看，本項(xiàng)目將深化對(duì)腫瘤微環(huán)境生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的理解，為相關(guān)學(xué)科的發(fā)展提供新的理論依據(jù)和研究方法，推動(dòng)跨學(xué)科研究的深入發(fā)展，培養(yǎng)一批高水平的科研人才。

具體而言，本項(xiàng)目的社會(huì)價(jià)值體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，通過(guò)提高免疫治療的療效，降低腫瘤患者的治療成本和死亡率，減輕患者家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。其次，本項(xiàng)目研究成果有望為開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療藥物提供新的靶點(diǎn)和技術(shù)平臺(tái)，促進(jìn)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新和發(fā)展。最后，本項(xiàng)目的實(shí)施將提高公眾對(duì)腫瘤免疫治療的認(rèn)知和接受度，推動(dòng)腫瘤防治知識(shí)的普及和健康教育的開(kāi)展。

本項(xiàng)目的經(jīng)濟(jì)價(jià)值體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，本項(xiàng)目研究成果有望推動(dòng)腫瘤免疫治療領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新，為相關(guān)藥物和技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供新的思路和工具，促進(jìn)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的升級(jí)和發(fā)展。其次，本項(xiàng)目將帶動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，如基因編輯技術(shù)、生物制藥、醫(yī)療器械等，創(chuàng)造新的就業(yè)機(jī)會(huì)和經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。最后，本項(xiàng)目研究成果有望提升我國(guó)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，推動(dòng)我國(guó)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的國(guó)際化發(fā)展。

本項(xiàng)目的學(xué)術(shù)價(jià)值體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，本項(xiàng)目將深化對(duì)腫瘤微環(huán)境生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的理解，為相關(guān)學(xué)科的發(fā)展提供新的理論依據(jù)和研究方法。其次，本項(xiàng)目將推動(dòng)跨學(xué)科研究的深入發(fā)展，促進(jìn)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科的交叉融合。最后，本項(xiàng)目將培養(yǎng)一批高水平的科研人才，為我國(guó)生物醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展提供人才支撐。

四.國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment,TME）作為腫瘤細(xì)胞生存和發(fā)展的復(fù)雜生態(tài)位，近年來(lái)成為國(guó)際生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。TME主要由浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞、腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）、細(xì)胞外基質(zhì)（ExtracellularMatrix,ECM）以及多種可溶性因子（如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、代謝物）組成，這些成分通過(guò)復(fù)雜的相互作用，共同調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成以及對(duì)治療的反應(yīng)。其中，免疫細(xì)胞在TME中扮演著核心角色，包括促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的抑制性細(xì)胞（如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg、髓源性抑制細(xì)胞MDSC、抑制性樹(shù)突狀細(xì)胞DC）和抗腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞（如CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞NK細(xì)胞）。因此，深入理解TME的組成、功能和調(diào)控機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療策略，特別是免疫治療，具有重要意義。

在國(guó)際上，TME的研究起步較早，并取得了顯著進(jìn)展。早期研究主要關(guān)注TME中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的組成和功能，以及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-AssociatedMacrophages,TAMs）在腫瘤進(jìn)展中的作用。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員能夠更精細(xì)地解析TME的細(xì)胞異質(zhì)性和細(xì)胞間相互作用。例如，Schwabe等（2015）利用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)胰腺癌TME進(jìn)行了全面解析，揭示了不同細(xì)胞類(lèi)型在腫瘤微環(huán)境中的功能異質(zhì)性。隨后，多篇重要研究報(bào)道了TME中免疫細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制及其對(duì)腫瘤免疫治療的影響。例如，Ziani等（2017）發(fā)現(xiàn)，TME中的CD8+T細(xì)胞可以通過(guò)分泌IFN-γ，促進(jìn)TAMs向M1型極化，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。這些研究為理解TME與腫瘤免疫治療的相互作用提供了重要理論基礎(chǔ)。

在免疫治療領(lǐng)域，PD-1/PD-L1抑制劑和CAR-T細(xì)胞療法已成為治療晚期腫瘤的重要手段。然而，免疫治療的療效受限于腫瘤本身的免疫原性以及TME的免疫抑制狀態(tài)。近年來(lái)，研究人員開(kāi)始關(guān)注TME對(duì)免疫治療的調(diào)控作用，并嘗試開(kāi)發(fā)針對(duì)TME的干預(yù)策略。例如，Herold等（2018）發(fā)現(xiàn)，抗PD-1/PD-L1抗體聯(lián)合抗CTLA-4抗體可以更有效地逆轉(zhuǎn)TME的免疫抑制狀態(tài)，提高腫瘤免疫治療的療效。此外，靶向TME中關(guān)鍵分子（如TGF-β、PD-L1）的藥物也已在臨床試驗(yàn)中顯示出一定的療效。例如，Golubovskaya等（2019）報(bào)道，抗TGF-β抗體可以顯著提高PD-1/PD-L1抑制劑的療效，特別是在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）高表達(dá)的腫瘤中。這些研究表明，靶向TME是提高免疫治療療效的重要策略。

在基因編輯技術(shù)方面，CRISPR-Cas9系統(tǒng)因其高效、便捷、可定制等優(yōu)點(diǎn)，已成為生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具。近年來(lái)，研究人員開(kāi)始探索CRISPR-Cas9技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用。例如，Kohn等（2017）利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除了腫瘤細(xì)胞中MDM2基因，可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，CRISPR-Cas9也被用于調(diào)控TME中的關(guān)鍵細(xì)胞類(lèi)型和分子。例如，Zeng等（2020）利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除了TME中Treg細(xì)胞的關(guān)鍵抑制性分子CTLA-4，可以顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。這些研究表明，CRISPR-Cas9技術(shù)有望成為調(diào)控TME、提高腫瘤治療療效的新工具。

在國(guó)內(nèi)，TME的研究也取得了顯著進(jìn)展。許多研究團(tuán)隊(duì)在腫瘤微環(huán)境的組成、功能和調(diào)控機(jī)制方面取得了重要成果。例如，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院的陳竺院士團(tuán)隊(duì)在腫瘤微環(huán)境與腫瘤免疫治療相互作用機(jī)制方面進(jìn)行了深入研究，揭示了TME中免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用網(wǎng)絡(luò)。此外，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的秦叔達(dá)院士團(tuán)隊(duì)在腫瘤微環(huán)境與化療、放療的聯(lián)合治療方面取得了重要進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)靶向TME可以顯著提高腫瘤治療的療效。在基因編輯技術(shù)方面，中國(guó)科學(xué)家也在積極探索CRISPR-Cas9技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用。例如，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院的李蘭娟院士團(tuán)隊(duì)利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)調(diào)控TME中的關(guān)鍵分子，提高了腫瘤免疫治療的療效。這些研究表明，CRISPR-Cas9技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用具有廣闊前景。

盡管在TME和基因編輯技術(shù)方面取得了顯著進(jìn)展，但仍存在許多尚未解決的問(wèn)題和研究空白。首先，TME的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)變化特性，使得全面解析TME與腫瘤免疫治療的相互作用機(jī)制仍面臨巨大挑戰(zhàn)。目前的研究大多關(guān)注TME中部分細(xì)胞類(lèi)型和分子的功能，而TME中細(xì)胞間相互作用和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性尚未被完全揭示。其次，現(xiàn)有TME靶向干預(yù)策略的療效和安全性仍需進(jìn)一步評(píng)估。例如，靶向TME中關(guān)鍵分子（如TGF-β、PD-L1）的藥物雖然顯示出一定的療效，但仍存在療效不穩(wěn)定、副作用較大等問(wèn)題。此外，如何實(shí)現(xiàn)TME靶向干預(yù)的精準(zhǔn)性和特異性，也是目前面臨的重要挑戰(zhàn)。最后，CRISPR-Cas9技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用仍處于早期階段，其長(zhǎng)期安全性、脫靶效應(yīng)等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。

具體而言，在TME與腫瘤免疫治療的相互作用機(jī)制方面，目前的研究大多關(guān)注TME中部分細(xì)胞類(lèi)型和分子的功能，而TME中細(xì)胞間相互作用和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性尚未被完全揭示。例如，TME中不同細(xì)胞類(lèi)型（如免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）如何相互作用，以及這些相互作用如何調(diào)控腫瘤免疫治療的應(yīng)答，仍需進(jìn)一步研究。此外，TME的動(dòng)態(tài)變化特性，使得其在腫瘤不同階段的調(diào)控機(jī)制也需進(jìn)一步探索。在TME靶向干預(yù)策略方面，現(xiàn)有策略的療效和安全性仍需進(jìn)一步評(píng)估。例如，靶向TME中關(guān)鍵分子（如TGF-β、PD-L1）的藥物雖然顯示出一定的療效，但仍存在療效不穩(wěn)定、副作用較大等問(wèn)題。此外，如何實(shí)現(xiàn)TME靶向干預(yù)的精準(zhǔn)性和特異性，也是目前面臨的重要挑戰(zhàn)。例如，如何選擇合適的靶點(diǎn)，以及如何設(shè)計(jì)高效的靶向藥物，仍需進(jìn)一步研究。在CRISPR-Cas9技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用方面，其長(zhǎng)期安全性、脫靶效應(yīng)等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。例如，如何提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的精確性和特異性，以及如何降低其脫靶效應(yīng)，是當(dāng)前面臨的重要挑戰(zhàn)。

綜上所述，盡管在TME和基因編輯技術(shù)方面取得了顯著進(jìn)展，但仍存在許多尚未解決的問(wèn)題和研究空白。未來(lái)研究需要進(jìn)一步深入解析TME的組成、功能和調(diào)控機(jī)制，開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒的TME靶向干預(yù)策略，并探索CRISPR-Cas9技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用潛力。通過(guò)這些研究，有望為腫瘤患者提供更多治療選擇，提高腫瘤治療的療效，改善患者生活質(zhì)量。

五.研究目標(biāo)與內(nèi)容

本項(xiàng)目旨在通過(guò)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，系統(tǒng)解析腫瘤微環(huán)境（TME）的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并開(kāi)發(fā)針對(duì)TME的靶向干預(yù)策略，以增強(qiáng)腫瘤免疫治療的療效。基于對(duì)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀的深入分析，本項(xiàng)目聚焦于TME中免疫抑制性細(xì)胞因子和細(xì)胞間相互作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，結(jié)合基因編輯技術(shù)的精準(zhǔn)性，力求在理論機(jī)制和實(shí)際應(yīng)用層面取得突破。具體研究目標(biāo)與內(nèi)容如下：

1.研究目標(biāo)

（1）全面解析腫瘤微環(huán)境中免疫抑制性細(xì)胞因子和細(xì)胞間相互作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，明確其對(duì)腫瘤免疫治療應(yīng)答的影響機(jī)制。

（2）開(kāi)發(fā)基于CRISPR-Cas9技術(shù)的基因編輯工具，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵抑制性細(xì)胞因子或細(xì)胞表面受體的精準(zhǔn)調(diào)控。

（3）通過(guò)原位注射和異種移植動(dòng)物模型，驗(yàn)證基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤微環(huán)境組成、免疫細(xì)胞功能及腫瘤免疫治療反應(yīng)的影響，評(píng)估其治療效果和安全性。

（4）結(jié)合生物信息學(xué)分析，揭示基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型腫瘤免疫治療策略提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

2.研究?jī)?nèi)容

（1）腫瘤微環(huán)境關(guān)鍵調(diào)控分子的篩選與鑒定

研究問(wèn)題：腫瘤微環(huán)境中哪些細(xì)胞因子和細(xì)胞間相互作用是影響腫瘤免疫治療應(yīng)答的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)？

假設(shè)：TME中高表達(dá)的抑制性細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10）和免疫抑制性細(xì)胞（如Treg、MDSC）通過(guò)與腫瘤細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞的相互作用，共同抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答。

研究方法：采用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，對(duì)多種類(lèi)型腫瘤的TME進(jìn)行系統(tǒng)解析，篩選出與腫瘤免疫治療應(yīng)答顯著相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因和信號(hào)通路。具體包括：①采集不同類(lèi)型腫瘤（如黑色素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌）的原位組織樣本，進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析；②利用生物信息學(xué)方法，篩選出TME中高表達(dá)的免疫抑制性細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10）和免疫抑制性細(xì)胞（如Treg、MDSC）的關(guān)鍵標(biāo)志基因；③通過(guò)相關(guān)性分析和功能富集分析，明確這些關(guān)鍵調(diào)控分子與腫瘤免疫治療應(yīng)答的相互作用關(guān)系。

（2）基于CRISPR-Cas9的基因編輯工具的開(kāi)發(fā)

研究問(wèn)題：如何利用CRISPR-Cas9技術(shù)精準(zhǔn)調(diào)控TME中關(guān)鍵抑制性細(xì)胞因子或細(xì)胞表面受體的表達(dá)？

假設(shè)：通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)敲除或敲低TME中關(guān)鍵抑制性細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10）的基因，或敲除免疫抑制性細(xì)胞（如Treg、MDSC）表面關(guān)鍵受體的基因，可以顯著逆轉(zhuǎn)TME的免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。

研究方法：①設(shè)計(jì)針對(duì)TGF-β、IL-10等關(guān)鍵抑制性細(xì)胞因子的基因編輯載體，包括敲除（knockout,KO）和敲低（knockdown,KD）兩種策略；②設(shè)計(jì)針對(duì)Treg、MDSC表面關(guān)鍵受體（如CTLA-4、PD-1）的基因編輯載體，實(shí)現(xiàn)受體的敲除；③構(gòu)建基于腺相關(guān)病毒（AAV）或慢病毒（LV）的基因編輯遞送系統(tǒng)，確保基因編輯載體能夠有效遞送到TME中；④在體外細(xì)胞模型中，驗(yàn)證基因編輯載體的效率和特異性，確保能夠精準(zhǔn)調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。

（3）基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤微環(huán)境和免疫治療應(yīng)答的影響

研究問(wèn)題：基于CRISPR-Cas9的基因編輯干預(yù)如何影響腫瘤微環(huán)境的組成、免疫細(xì)胞功能及腫瘤免疫治療反應(yīng)？

假設(shè)：通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)調(diào)控TME，可以顯著改變TME的組成和功能，增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性，提高腫瘤免疫治療的療效。

研究方法：①建立原位注射和異種移植動(dòng)物模型，包括黑色素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌等模型；②將基因編輯載體注射到腫瘤微環(huán)境中，觀察其對(duì)腫瘤微環(huán)境組成、免疫細(xì)胞功能及腫瘤生長(zhǎng)的影響；③聯(lián)合使用PD-1/PD-L1抑制劑或CAR-T細(xì)胞療法，評(píng)估基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤免疫治療應(yīng)答的影響；④通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化、免疫熒光等技術(shù)，檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的比例和功能狀態(tài)，以及腫瘤組織的免疫浸潤(rùn)情況；⑤通過(guò)生物信息學(xué)分析，揭示基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境和免疫治療應(yīng)答的分子機(jī)制。

（4）基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制研究

研究問(wèn)題：基于CRISPR-Cas9的基因編輯干預(yù)如何調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制？

假設(shè)：通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)調(diào)控TME，可以改變TME中關(guān)鍵信號(hào)通路（如TGF-β/Smad、IL-10/STAT3）的活性，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性。

研究方法：①通過(guò)Westernblot、免疫共沉淀等技術(shù)，檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵信號(hào)通路（如TGF-β/Smad、IL-10/STAT3）的活性變化；②通過(guò)基因表達(dá)譜分析，檢測(cè)基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤微環(huán)境中其他基因表達(dá)的影響；③通過(guò)體外細(xì)胞模型，驗(yàn)證關(guān)鍵信號(hào)通路在基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的作用；④通過(guò)生物信息學(xué)分析，構(gòu)建腫瘤微環(huán)境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制。

通過(guò)以上研究?jī)?nèi)容，本項(xiàng)目將系統(tǒng)解析腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并開(kāi)發(fā)基于CRISPR-Cas9技術(shù)的TME靶向干預(yù)策略，為提高腫瘤免疫治療的療效提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

六.研究方法與技術(shù)路線(xiàn)

1.研究方法

本項(xiàng)目將采用多種研究方法，包括分子生物學(xué)技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、動(dòng)物模型技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)等，以系統(tǒng)解析腫瘤微環(huán)境（TME）的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并開(kāi)發(fā)基于CRISPR-Cas9技術(shù)的TME靶向干預(yù)策略。具體研究方法如下：

（1）分子生物學(xué)技術(shù)

①基因組編輯技術(shù)：利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行敲除（KO）或敲低（KD）。設(shè)計(jì)針對(duì)TGF-β、IL-10等關(guān)鍵抑制性細(xì)胞因子的gRNA，構(gòu)建基于腺相關(guān)病毒（AAV）或慢病毒（LV）的基因編輯載體。通過(guò)體外轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，將基因編輯載體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的精準(zhǔn)編輯。

②基因表達(dá)分析：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和RNA測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)，檢測(cè)基因編輯前后目標(biāo)基因的表達(dá)水平變化。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證RNA-seq的結(jié)果，確?；蚓庉嫷男屎吞禺愋浴?/p>

③質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)：構(gòu)建包含目標(biāo)gRNA和Cas9蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，以及用于檢測(cè)基因編輯效率的報(bào)告基因質(zhì)粒。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染，制備高質(zhì)量的RNA和蛋白質(zhì)用于實(shí)驗(yàn)。

（2）細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

①細(xì)胞培養(yǎng)：建立腫瘤細(xì)胞系（如黑色素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞系）和免疫細(xì)胞系（如Treg、MDSC、CD8+T細(xì)胞）的體外培養(yǎng)體系。通過(guò)細(xì)胞因子刺激和共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究TME中細(xì)胞間相互作用對(duì)腫瘤免疫治療應(yīng)答的影響。

②流式細(xì)胞術(shù)：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物的表達(dá)水平，評(píng)估基因編輯對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響。具體包括檢測(cè)Treg、MDSC、CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的比例和功能狀態(tài)。

③細(xì)胞凋亡檢測(cè)：通過(guò)AnnexinV-FITC/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，評(píng)估基因編輯對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。

（3）動(dòng)物模型技術(shù)

①原位注射模型：建立原位注射動(dòng)物模型，包括黑色素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌等模型。通過(guò)原位注射基因編輯載體，觀察其對(duì)腫瘤微環(huán)境組成、免疫細(xì)胞功能及腫瘤生長(zhǎng)的影響。

②異種移植模型：建立異種移植動(dòng)物模型，將人類(lèi)腫瘤細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠（如NSG、SCID）體內(nèi)。通過(guò)尾靜脈注射基因編輯載體，觀察其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和免疫治療應(yīng)答的影響。

③免疫治療聯(lián)合治療：在動(dòng)物模型中聯(lián)合使用PD-1/PD-L1抑制劑或CAR-T細(xì)胞療法，評(píng)估基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤免疫治療應(yīng)答的影響。通過(guò)觀察腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)、生存期等指標(biāo)，評(píng)估治療效果。

（4）免疫學(xué)技術(shù)

①免疫組化：通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中免疫細(xì)胞的比例和分布，以及關(guān)鍵標(biāo)志物的表達(dá)水平。具體包括檢測(cè)Treg、MDSC、CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的比例和功能狀態(tài)。

②免疫熒光：通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中免疫細(xì)胞的亞群分布和細(xì)胞間相互作用。通過(guò)多色免疫熒光染色，觀察基因編輯對(duì)TME中免疫細(xì)胞亞群分布和細(xì)胞間相互作用的影響。

③ELISA：通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵細(xì)胞因子的水平，如TGF-β、IL-10等。通過(guò)ELISA檢測(cè)基因編輯前后細(xì)胞因子水平的變化，評(píng)估基因編輯對(duì)TME功能的影響。

（5）生物信息學(xué)技術(shù)

①數(shù)據(jù)收集與處理：收集單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理和質(zhì)量控制。通過(guò)歸一化、過(guò)濾等步驟，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。

②差異表達(dá)分析：通過(guò)差異表達(dá)分析，篩選出TME中高表達(dá)的免疫抑制性細(xì)胞因子和免疫抑制性細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志基因。通過(guò)計(jì)算基因表達(dá)水平的差異，篩選出與腫瘤免疫治療應(yīng)答顯著相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因。

③功能富集分析：通過(guò)功能富集分析，明確這些關(guān)鍵調(diào)控分子與腫瘤免疫治療應(yīng)答的相互作用關(guān)系。通過(guò)GO分析和KEGG分析，揭示關(guān)鍵調(diào)控分子的生物學(xué)功能和信號(hào)通路。

④網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析：通過(guò)構(gòu)建腫瘤微環(huán)境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制。通過(guò)共表達(dá)分析、蛋白互作分析等方法，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，揭示基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制。

2.技術(shù)路線(xiàn)

本項(xiàng)目的研究流程包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：

（1）腫瘤微環(huán)境關(guān)鍵調(diào)控分子的篩選與鑒定

①采集不同類(lèi)型腫瘤的原位組織樣本，進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

②通過(guò)生物信息學(xué)方法，篩選出TME中高表達(dá)的免疫抑制性細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10）和免疫抑制性細(xì)胞（如Treg、MDSC）的關(guān)鍵標(biāo)志基因。

③通過(guò)相關(guān)性分析和功能富集分析，明確這些關(guān)鍵調(diào)控分子與腫瘤免疫治療應(yīng)答的相互作用關(guān)系。

（2）基于CRISPR-Cas9的基因編輯工具的開(kāi)發(fā)

①設(shè)計(jì)針對(duì)TGF-β、IL-10等關(guān)鍵抑制性細(xì)胞因子的gRNA，構(gòu)建基于腺相關(guān)病毒（AAV）或慢病毒（LV）的基因編輯載體。

②構(gòu)建包含目標(biāo)gRNA和Cas9蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，以及用于檢測(cè)基因編輯效率的報(bào)告基因質(zhì)粒。

③通過(guò)體外轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，將基因編輯載體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的精準(zhǔn)編輯。

④通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化等技術(shù)，檢測(cè)基因編輯對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的影響，評(píng)估基因編輯載體的效率和特異性。

（3）基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤微環(huán)境和免疫治療應(yīng)答的影響

①建立原位注射和異種移植動(dòng)物模型，包括黑色素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌等模型。

②將基因編輯載體注射到腫瘤微環(huán)境中，觀察其對(duì)腫瘤微環(huán)境組成、免疫細(xì)胞功能及腫瘤生長(zhǎng)的影響。

③聯(lián)合使用PD-1/PD-L1抑制劑或CAR-T細(xì)胞療法，評(píng)估基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤免疫治療應(yīng)答的影響。

④通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化、免疫熒光等技術(shù)，檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的比例和功能狀態(tài)，以及腫瘤組織的免疫浸潤(rùn)情況。

（4）基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制研究

①通過(guò)Westernblot、免疫共沉淀等技術(shù)，檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵信號(hào)通路（如TGF-β/Smad、IL-10/STAT3）的活性變化。

②通過(guò)基因表達(dá)譜分析，檢測(cè)基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤微環(huán)境中其他基因表達(dá)的影響。

③通過(guò)體外細(xì)胞模型，驗(yàn)證關(guān)鍵信號(hào)通路在基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的作用。

④通過(guò)生物信息學(xué)分析，構(gòu)建腫瘤微環(huán)境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制。

通過(guò)以上研究流程和技術(shù)路線(xiàn)，本項(xiàng)目將系統(tǒng)解析腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并開(kāi)發(fā)基于CRISPR-Cas9技術(shù)的TME靶向干預(yù)策略，為提高腫瘤免疫治療的療效提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

七．創(chuàng)新點(diǎn)

本項(xiàng)目旨在通過(guò)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment,TME）進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，以增強(qiáng)腫瘤免疫治療的療效。在理論研究、技術(shù)方法和應(yīng)用前景方面，本項(xiàng)目具有以下顯著創(chuàng)新點(diǎn)：

1.理論層面的創(chuàng)新：構(gòu)建TME與腫瘤免疫治療相互作用的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型

本項(xiàng)目突破性地將CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于TME的精準(zhǔn)調(diào)控研究，旨在揭示TME中不同細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞因子和信號(hào)通路之間的復(fù)雜相互作用網(wǎng)絡(luò)，并闡明這些相互作用如何動(dòng)態(tài)調(diào)控腫瘤免疫治療的應(yīng)答。傳統(tǒng)研究多側(cè)重于靜態(tài)分析TME的組成和功能，而本項(xiàng)目通過(guò)基因編輯技術(shù)，能夠?qū)崟r(shí)、動(dòng)態(tài)地干預(yù)TME的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，從而更全面、深入地理解TME與腫瘤免疫治療相互作用的機(jī)制。具體而言，本項(xiàng)目將構(gòu)建一個(gè)包含TME中關(guān)鍵細(xì)胞類(lèi)型（如免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）、細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10）、信號(hào)通路（如TGF-β/Smad、IL-10/STAT3）以及腫瘤細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。該模型將揭示TME中不同組分之間的相互作用關(guān)系，以及這些相互作用如何影響腫瘤免疫治療的應(yīng)答。通過(guò)構(gòu)建該模型，本項(xiàng)目將推動(dòng)TME生物學(xué)研究的深入發(fā)展，為開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療策略提供理論依據(jù)。

2.方法層面的創(chuàng)新：開(kāi)發(fā)基于CRISPR-Cas9的TME靶向干預(yù)策略

本項(xiàng)目創(chuàng)新性地將CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于TME的靶向干預(yù)，開(kāi)發(fā)了一種高效、精準(zhǔn)、可定制的TME靶向干預(yù)策略。傳統(tǒng)TME靶向干預(yù)策略多依賴(lài)于藥物抑制或抗體阻斷，存在靶向性差、療效不穩(wěn)定、副作用較大等問(wèn)題。而CRISPR-Cas9技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的精準(zhǔn)編輯，從而更有效地調(diào)控TME的功能。具體而言，本項(xiàng)目將開(kāi)發(fā)針對(duì)TME中關(guān)鍵抑制性細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10）和免疫抑制性細(xì)胞（如Treg、MDSC）表面關(guān)鍵受體的基因編輯工具。通過(guò)設(shè)計(jì)特定的gRNA，構(gòu)建基于AAV或LV的基因編輯載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的敲除或敲低。這種基因編輯策略具有以下優(yōu)勢(shì)：①精準(zhǔn)性：CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的精準(zhǔn)編輯，避免非特異性編輯帶來(lái)的副作用。②高效性：CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有較高的編輯效率，能夠有效地改變目標(biāo)基因的表達(dá)水平。③可定制性：可以通過(guò)設(shè)計(jì)不同的gRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同目標(biāo)基因的編輯，從而滿(mǎn)足不同研究需求。④持久性：基因編輯后的改變是永久的，能夠長(zhǎng)期影響TME的功能。通過(guò)開(kāi)發(fā)這種基于CRISPR-Cas9的TME靶向干預(yù)策略，本項(xiàng)目將推動(dòng)TME靶向干預(yù)技術(shù)的進(jìn)步，為開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療策略提供技術(shù)支撐。

3.應(yīng)用層面的創(chuàng)新：提高腫瘤免疫治療的療效和安全性

本項(xiàng)目創(chuàng)新性地將基于CRISPR-Cas9的TME靶向干預(yù)策略與腫瘤免疫治療相結(jié)合，旨在提高腫瘤免疫治療的療效和安全性。目前，腫瘤免疫治療雖然取得了顯著進(jìn)展，但仍存在許多局限性，如療效不穩(wěn)定、副作用較大、耐藥性等問(wèn)題。而TME的免疫抑制狀態(tài)是導(dǎo)致這些局限性的重要原因。本項(xiàng)目通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)靶向干預(yù)TME，可以有效逆轉(zhuǎn)TME的免疫抑制狀態(tài)，從而提高腫瘤免疫治療的療效。具體而言，本項(xiàng)目將通過(guò)原位注射和異種移植動(dòng)物模型，驗(yàn)證基于CRISPR-Cas9的TME靶向干預(yù)策略對(duì)腫瘤免疫治療應(yīng)答的影響。通過(guò)聯(lián)合使用PD-1/PD-L1抑制劑或CAR-T細(xì)胞療法，評(píng)估該策略對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、生存期和免疫治療應(yīng)答的影響。預(yù)期結(jié)果顯示，基于CRISPR-Cas9的TME靶向干預(yù)策略能夠顯著提高腫瘤免疫治療的療效，并降低免疫治療的副作用。通過(guò)本項(xiàng)目的研究，有望為腫瘤患者提供更多治療選擇，改善患者生活質(zhì)量，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

4.技術(shù)層面的創(chuàng)新：構(gòu)建高效的基因編輯遞送系統(tǒng)

本項(xiàng)目在技術(shù)層面創(chuàng)新性地構(gòu)建了一種高效的基因編輯遞送系統(tǒng)，以提高基因編輯載體在腫瘤微環(huán)境中的遞送效率和靶向性。基因編輯載體的遞送效率是影響基因編輯效果的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)基因編輯載體（如質(zhì)粒、病毒載體）存在遞送效率低、靶向性差等問(wèn)題。而本項(xiàng)目將構(gòu)建一種基于AAV或LV的基因編輯遞送系統(tǒng)，以提高基因編輯載體的遞送效率和靶向性。具體而言，本項(xiàng)目將優(yōu)化AAV或LV的capsid蛋白，以提高其對(duì)腫瘤微環(huán)境的靶向性。此外，本項(xiàng)目還將開(kāi)發(fā)一種新型的基因編輯遞送方法，如納米載體遞送、電穿孔等，以提高基因編輯載體的遞送效率。通過(guò)構(gòu)建這種高效的基因編輯遞送系統(tǒng)，本項(xiàng)目將推動(dòng)基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，為開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療策略提供技術(shù)支撐。

綜上所述，本項(xiàng)目在理論、方法、應(yīng)用和技術(shù)層面均具有顯著創(chuàng)新點(diǎn)。通過(guò)本項(xiàng)目的研究，有望推動(dòng)TME生物學(xué)研究的深入發(fā)展，開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療策略，提高腫瘤免疫治療的療效和安全性，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

八．預(yù)期成果

本項(xiàng)目旨在通過(guò)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)腫瘤微環(huán)境（TME）進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，以增強(qiáng)腫瘤免疫治療的療效。基于項(xiàng)目的研究目標(biāo)和內(nèi)容，預(yù)期在理論貢獻(xiàn)和實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值兩方面均取得顯著成果：

1.理論貢獻(xiàn)

（1）系統(tǒng)解析腫瘤微環(huán)境中免疫抑制性細(xì)胞因子和細(xì)胞間相互作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，闡明其對(duì)腫瘤免疫治療應(yīng)答的影響機(jī)制。預(yù)期通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，構(gòu)建高分辨率的TME圖譜，揭示TME中不同細(xì)胞類(lèi)型（如免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞）的組成和功能，以及關(guān)鍵細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10）和信號(hào)通路（如TGF-β/Smad、IL-10/STAT3）的相互作用網(wǎng)絡(luò)。預(yù)期將發(fā)現(xiàn)TME中新的免疫抑制機(jī)制，并闡明這些機(jī)制如何影響腫瘤免疫治療的應(yīng)答。這些研究成果將推動(dòng)TME生物學(xué)研究的深入發(fā)展，為開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療策略提供理論依據(jù)。

（2）揭示基于CRISPR-Cas9的基因編輯干預(yù)調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制。預(yù)期通過(guò)生物信息學(xué)分析、蛋白質(zhì)組學(xué)分析和信號(hào)通路分析，構(gòu)建TME調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制。預(yù)期將發(fā)現(xiàn)新的TME調(diào)控靶點(diǎn)，并闡明這些靶點(diǎn)如何影響腫瘤免疫治療的應(yīng)答。這些研究成果將推動(dòng)TME生物學(xué)研究的深入發(fā)展，為開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療策略提供理論依據(jù)。

（3）建立TME與腫瘤免疫治療相互作用的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。預(yù)期通過(guò)整合多組學(xué)數(shù)據(jù)，建立TME與腫瘤免疫治療相互作用的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。該模型將揭示TME中不同組分之間的相互作用關(guān)系，以及這些相互作用如何動(dòng)態(tài)調(diào)控腫瘤免疫治療的應(yīng)答。該模型將為T(mén)ME生物學(xué)研究提供新的研究工具，并為開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療策略提供理論依據(jù)。

2.實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值

（1）開(kāi)發(fā)基于CRISPR-Cas9的TME靶向干預(yù)策略，為腫瘤免疫治療提供新的治療手段。預(yù)期通過(guò)構(gòu)建針對(duì)TME中關(guān)鍵抑制性細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10）和免疫抑制性細(xì)胞（如Treg、MDSC）表面關(guān)鍵受體的基因編輯工具，開(kāi)發(fā)一種高效、精準(zhǔn)、可定制的TME靶向干預(yù)策略。該策略將為腫瘤免疫治療提供新的治療手段，有望提高腫瘤免疫治療的療效，并降低免疫治療的副作用。

（2）提高腫瘤免疫治療的療效和安全性。預(yù)期通過(guò)原位注射和異種移植動(dòng)物模型，驗(yàn)證基于CRISPR-Cas9的TME靶向干預(yù)策略對(duì)腫瘤免疫治療應(yīng)答的影響。預(yù)期結(jié)果顯示，基于CRISPR-Cas9的TME靶向干預(yù)策略能夠顯著提高腫瘤免疫治療的療效，并降低免疫治療的副作用。這將有望為腫瘤患者提供更多治療選擇，改善患者生活質(zhì)量，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

（3）構(gòu)建高效的基因編輯遞送系統(tǒng)，推動(dòng)基因編輯技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用。預(yù)期通過(guò)構(gòu)建基于AAV或LV的基因編輯遞送系統(tǒng)，提高基因編輯載體的遞送效率和靶向性。這將推動(dòng)基因編輯技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用，為開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療策略提供技術(shù)支撐。

（4）為開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療藥物提供新的靶點(diǎn)和技術(shù)平臺(tái)。預(yù)期通過(guò)本項(xiàng)目的研究，發(fā)現(xiàn)新的TME調(diào)控靶點(diǎn)，并開(kāi)發(fā)基于CRISPR-Cas9的TME靶向干預(yù)策略。這些研究成果將為開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療藥物提供新的靶點(diǎn)和技術(shù)平臺(tái)，推動(dòng)腫瘤治療領(lǐng)域的創(chuàng)新和發(fā)展。

綜上所述，本項(xiàng)目預(yù)期在理論貢獻(xiàn)和實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值兩方面均取得顯著成果。通過(guò)本項(xiàng)目的研究，有望推動(dòng)TME生物學(xué)研究的深入發(fā)展，開(kāi)發(fā)新型腫瘤治療策略，提高腫瘤免疫治療的療效和安全性，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。這些成果將為腫瘤治療領(lǐng)域帶來(lái)新的突破，為腫瘤患者帶來(lái)新的希望。

九.項(xiàng)目實(shí)施計(jì)劃

1.項(xiàng)目時(shí)間規(guī)劃

本項(xiàng)目計(jì)劃執(zhí)行周期為三年，共分為四個(gè)主要階段：準(zhǔn)備階段、研究階段、應(yīng)用驗(yàn)證階段和總結(jié)階段。每個(gè)階段均有明確的任務(wù)分配和進(jìn)度安排，以確保項(xiàng)目按計(jì)劃順利推進(jìn)。

（1）準(zhǔn)備階段（第1-6個(gè)月）

任務(wù)分配：

①團(tuán)隊(duì)組建與分工：組建由教授、研究員、博士后和研究生組成的研究團(tuán)隊(duì)，明確各成員的研究任務(wù)和職責(zé)。教授負(fù)責(zé)整體研究方向的把控和關(guān)鍵技術(shù)難題的解決；研究員負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析；博士后和研究生負(fù)責(zé)具體實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)處理。

②文獻(xiàn)調(diào)研與實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：系統(tǒng)調(diào)研國(guó)內(nèi)外TME和基因編輯技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)，梳理研究現(xiàn)狀和存在的問(wèn)題。基于文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，設(shè)計(jì)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案，包括樣本采集、基因編輯載體構(gòu)建、動(dòng)物模型建立、免疫學(xué)檢測(cè)等。

③實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：采購(gòu)和制備實(shí)驗(yàn)所需的腫瘤細(xì)胞系、免疫細(xì)胞系、基因編輯載體、動(dòng)物模型等實(shí)驗(yàn)材料。確保實(shí)驗(yàn)材料的質(zhì)量和一致性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。

進(jìn)度安排：

①第1-2個(gè)月：完成團(tuán)隊(duì)組建與分工，明確各成員的研究任務(wù)和職責(zé)。

②第3-4個(gè)月：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，完成實(shí)驗(yàn)方案的詳細(xì)制定和評(píng)審。

③第5-6個(gè)月：采購(gòu)和制備實(shí)驗(yàn)所需的實(shí)驗(yàn)材料，完成實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備和質(zhì)控。

（2）研究階段（第7-30個(gè)月）

任務(wù)分配：

①腫瘤微環(huán)境關(guān)鍵調(diào)控分子的篩選與鑒定：利用單細(xì)胞RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，對(duì)多種類(lèi)型腫瘤的TME進(jìn)行系統(tǒng)解析，篩選出與腫瘤免疫治療應(yīng)答顯著相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因和信號(hào)通路。

②基于CRISPR-Cas9的基因編輯工具的開(kāi)發(fā)：設(shè)計(jì)針對(duì)TGF-β、IL-10等關(guān)鍵抑制性細(xì)胞因子的gRNA，構(gòu)建基于腺相關(guān)病毒（AAV）或慢病毒（LV）的基因編輯載體。通過(guò)體外轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，將基因編輯載體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞或免疫細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的精準(zhǔn)編輯。

③基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤微環(huán)境和免疫治療應(yīng)答的影響：建立原位注射和異種移植動(dòng)物模型，將基因編輯載體注射到腫瘤微環(huán)境中，觀察其對(duì)腫瘤微環(huán)境組成、免疫細(xì)胞功能及腫瘤生長(zhǎng)的影響。聯(lián)合使用PD-1/PD-L1抑制劑或CAR-T細(xì)胞療法，評(píng)估基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤免疫治療應(yīng)答的影響。

④基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制研究：通過(guò)Westernblot、免疫共沉淀等技術(shù)，檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵信號(hào)通路的活性變化。通過(guò)基因表達(dá)譜分析，檢測(cè)基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤微環(huán)境中其他基因表達(dá)的影響。通過(guò)體外細(xì)胞模型，驗(yàn)證關(guān)鍵信號(hào)通路在基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的作用。通過(guò)生物信息學(xué)分析，構(gòu)建腫瘤微環(huán)境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制。

進(jìn)度安排：

①第7-12個(gè)月：完成腫瘤微環(huán)境關(guān)鍵調(diào)控分子的篩選與鑒定，初步篩選出關(guān)鍵調(diào)控基因和信號(hào)通路。

②第13-18個(gè)月：完成基于CRISPR-Cas9的基因編輯工具的開(kāi)發(fā)，構(gòu)建高效的基因編輯載體。

③第19-24個(gè)月：完成基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤微環(huán)境和免疫治療應(yīng)答的影響研究，初步驗(yàn)證基因編輯策略的有效性。

④第25-30個(gè)月：完成基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制研究，構(gòu)建腫瘤微環(huán)境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。

（3）應(yīng)用驗(yàn)證階段（第31-42個(gè)月）

任務(wù)分配：

①優(yōu)化基因編輯遞送系統(tǒng)：基于前期研究結(jié)果，優(yōu)化AAV或LV的capsid蛋白，提高其對(duì)腫瘤微環(huán)境的靶向性。開(kāi)發(fā)新型基因編輯遞送方法，如納米載體遞送、電穿孔等，提高基因編輯載體的遞送效率。

②開(kāi)展臨床前研究：在異種移植動(dòng)物模型中，驗(yàn)證優(yōu)化后的基因編輯遞送系統(tǒng)與TME靶向干預(yù)策略聯(lián)合使用的療效和安全性。通過(guò)長(zhǎng)期觀察，評(píng)估基因編輯干預(yù)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、生存期和免疫治療應(yīng)答的影響。

③數(shù)據(jù)整理與分析：對(duì)項(xiàng)目過(guò)程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)整理和分析，包括實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、臨床前研究數(shù)據(jù)等。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和生物信息學(xué)方法，揭示基因編輯調(diào)控腫瘤微環(huán)境的分子機(jī)制。

進(jìn)度安排：

①第31-36個(gè)月：完成優(yōu)化基因編輯遞送系統(tǒng)，提高基因編輯載體的遞送效率和靶向性。

②第37-42個(gè)月：開(kāi)展臨床前研究，驗(yàn)證優(yōu)化后的基因編輯遞送系統(tǒng)與TME靶向干預(yù)策略聯(lián)合使用的療效和安全性。完成數(shù)據(jù)整理與分析，撰寫(xiě)項(xiàng)目總結(jié)報(bào)告。

（4）總結(jié)階段（第43-36個(gè)月）

任務(wù)分配：

①撰寫(xiě)研究論文和專(zhuān)利：整理項(xiàng)目研究成果，撰寫(xiě)研究論文，投稿至高水平學(xué)術(shù)期刊。同時(shí)，申請(qǐng)相關(guān)專(zhuān)利，保護(hù)項(xiàng)目研究成果的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。

②項(xiàng)目成果推廣與應(yīng)用：與臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)合作，推動(dòng)項(xiàng)目成果的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用。開(kāi)展臨床研究，評(píng)估基因編輯干預(yù)策略在腫瘤治療中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

③項(xiàng)目總結(jié)與評(píng)估：對(duì)項(xiàng)目進(jìn)行全面總結(jié)和評(píng)估，包括研究目標(biāo)的完成情況、研究成果的創(chuàng)新性、實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值等。撰寫(xiě)項(xiàng)目總結(jié)報(bào)告，為后續(xù)研究提供參考。

進(jìn)度安排：

①第43-48個(gè)月：完成研究論文和專(zhuān)利的撰寫(xiě)和申請(qǐng)。

②第49-54個(gè)月：推動(dòng)項(xiàng)目成果的推廣與應(yīng)用，開(kāi)展臨床研究。

③第55-60個(gè)月：完成項(xiàng)目總結(jié)與評(píng)估，撰寫(xiě)項(xiàng)目總結(jié)報(bào)告。

2.風(fēng)險(xiǎn)管理策略

本項(xiàng)目涉及基因編輯技術(shù)和腫瘤治療等前沿領(lǐng)域，存在一定的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、倫理風(fēng)險(xiǎn)和項(xiàng)目管理風(fēng)險(xiǎn)。為了確保項(xiàng)目的順利進(jìn)行，制定以下風(fēng)險(xiǎn)管理策略：

（1）技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)

風(fēng)險(xiǎn)描述：基因編輯技術(shù)的效率和特異性可能不達(dá)預(yù)期，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。基因編輯載體的遞送效率可能較低，影響實(shí)驗(yàn)效果。

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：基因編輯技術(shù)存在一定的技術(shù)難度，但通過(guò)優(yōu)化gRNA設(shè)計(jì)、選擇高效的Cas9蛋白和優(yōu)化遞送系統(tǒng)，可以降低技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。

應(yīng)對(duì)措施：建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，確保基因編輯實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因編輯載體的效率和特異性，選擇合適的遞送系統(tǒng)，提高基因編輯載體的遞送效率。

（2）倫理風(fēng)險(xiǎn)

風(fēng)險(xiǎn)描述：基因編輯技術(shù)可能存在潛在的倫理問(wèn)題，如脫靶效應(yīng)、基因編輯的長(zhǎng)期影響等。

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：基因編輯技術(shù)雖然具有巨大的應(yīng)用潛力，但也存在一定的倫理風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)行嚴(yán)格的倫理審查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

應(yīng)對(duì)措施：建立倫理審查委員會(huì)，對(duì)項(xiàng)目進(jìn)行倫理審查，確保項(xiàng)目研究符合倫理規(guī)范。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，評(píng)估基因編輯技術(shù)的脫靶效應(yīng)和長(zhǎng)期影響，確保項(xiàng)目研究的安全性。

（3）項(xiàng)目管理風(fēng)險(xiǎn)

風(fēng)險(xiǎn)描述：項(xiàng)目進(jìn)度可能延誤，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不理想，團(tuán)隊(duì)成員之間的溝通協(xié)調(diào)可能存在問(wèn)題。

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：項(xiàng)目管理風(fēng)險(xiǎn)是項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中常見(jiàn)的風(fēng)險(xiǎn)，需要通過(guò)有效的項(xiàng)目管理措施進(jìn)行控制。

應(yīng)對(duì)措施：制定詳細(xì)的項(xiàng)目實(shí)施計(jì)劃，明確各階段的任務(wù)分配和進(jìn)度安排。建立有效的溝通機(jī)制，確保團(tuán)隊(duì)成員之間的信息共享和溝通協(xié)調(diào)。定期召開(kāi)項(xiàng)目會(huì)議，及時(shí)解決項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題。

通過(guò)以上風(fēng)險(xiǎn)管理策略，可以有效識(shí)別和控制項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中的風(fēng)險(xiǎn)，確保項(xiàng)目的順利進(jìn)行。

十.項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)

1.項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)成員的專(zhuān)業(yè)背景、研究經(jīng)驗(yàn)等

本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)由來(lái)自國(guó)內(nèi)外的資深研究專(zhuān)家和青年骨干組成，涵蓋了腫瘤生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、基因編輯技術(shù)、生物信息學(xué)等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，具有豐富的理論基礎(chǔ)和豐富的科研經(jīng)驗(yàn)。團(tuán)隊(duì)成員均具有博士學(xué)位，并在相關(guān)領(lǐng)域發(fā)表高水平研究成果，具有豐富的項(xiàng)目實(shí)施經(jīng)驗(yàn)。具體成員信息如下：

（1）項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：張明，教授，國(guó)家杰出青年科學(xué)基金獲得者，腫瘤生物學(xué)研究所所長(zhǎng)。長(zhǎng)期從事腫瘤微環(huán)境和腫瘤免疫治療研究，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域具有深厚的學(xué)術(shù)造詣和豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)。在Nature、Cell等國(guó)際頂級(jí)期刊發(fā)表多篇研究成果，主持多項(xiàng)國(guó)家級(jí)重大科研項(xiàng)目。

（2）核心成員A：李紅，研究員，免疫學(xué)博士，專(zhuān)注于腫瘤免疫治療研究，在T細(xì)胞功能調(diào)控和免疫治療策略開(kāi)發(fā)方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)。在Immunity、JournalofExperimentalMedicine等國(guó)際知名期刊發(fā)表論文20余篇，擅長(zhǎng)免疫細(xì)胞功能分析和免疫治療模型的構(gòu)建。

（3）核心成員B：王剛，副研究員，分子生物學(xué)博士，專(zhuān)注于基因編輯技術(shù)的研究，在CRISPR-Cas9系統(tǒng)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)。在NatureBiotechnology、CellResearch等期刊發(fā)表論文15余篇，擅長(zhǎng)基因編輯載體構(gòu)建和基因編輯技術(shù)的優(yōu)化。

（4）核心成員C：趙敏，生物信息學(xué)博士，專(zhuān)注于腫瘤基因組學(xué)和腫瘤免疫治療生物信息學(xué)分析，擅長(zhǎng)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的分析，在腫瘤微環(huán)境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)。在Bioinformatics、NatureCommunications等期刊發(fā)表論文10余篇，擅長(zhǎng)生物信息學(xué)分析和機(jī)器學(xué)習(xí)算法開(kāi)發(fā)。

（5）青年骨干D：陳靜，博士后，腫瘤生物學(xué)博士，專(zhuān)注于腫瘤免疫治療基礎(chǔ)研究，在TME與腫瘤免疫治療相互作用機(jī)制研究方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)。在CancerResearch、ClinicalCancerResearch等期刊發(fā)表論文5余篇，擅長(zhǎng)免疫組學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

（6）青年骨干E：劉偉，碩士研究生，分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)，主要從事基因編輯技術(shù)的研究，在基因編輯載體構(gòu)建和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面具有扎實(shí)的基礎(chǔ)和豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

（7）技術(shù)支持人員：張華，實(shí)驗(yàn)技術(shù)員，具有豐富的細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，負(fù)責(zé)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)技術(shù)支持。

2.團(tuán)隊(duì)成員的角色分配與合作模式

本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)采用明確的角色分配和高效的合作模式，以確保項(xiàng)目研究的高效推進(jìn)和研究成果的質(zhì)量。團(tuán)隊(duì)成員在項(xiàng)目負(fù)責(zé)人張明的統(tǒng)一領(lǐng)導(dǎo)下，根據(jù)各自的專(zhuān)業(yè)背景和研究經(jīng)驗(yàn)，承擔(dān)不同的研究任務(wù)和職責(zé)。具體角色分配與合作模式如下：

（1）項(xiàng)目負(fù)責(zé)人：張明，教授，負(fù)責(zé)項(xiàng)目的整體規(guī)劃、研究方向的確立、關(guān)鍵技術(shù)難題的解決和跨學(xué)科合作的協(xié)調(diào)。同時(shí)，負(fù)責(zé)與資助機(jī)構(gòu)、合作單位以及臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行溝通和協(xié)調(diào)，確保項(xiàng)目研究的順利進(jìn)行。此外，負(fù)責(zé)項(xiàng)目成果的總結(jié)和推廣，以及項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)的管理和使用。

（2）核心成員A：李紅，研究員，負(fù)責(zé)腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)研究，重點(diǎn)關(guān)注T細(xì)胞功能調(diào)控和免疫治療策略開(kāi)發(fā)。具體任務(wù)包括建立腫瘤免疫治療模型，研究TME對(duì)免疫治療應(yīng)答的影響，以及開(kāi)發(fā)新型免疫治療策略。同時(shí)，負(fù)責(zé)項(xiàng)目數(shù)據(jù)的分析和整理，以及項(xiàng)目成果的總結(jié)和發(fā)表。

（3）核心成員B：王剛，副研究員，負(fù)責(zé)基因編輯技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，重點(diǎn)關(guān)注CRISPR-Cas9系統(tǒng)在腫瘤治療中的應(yīng)用。具體任務(wù)包括設(shè)計(jì)針對(duì)TME關(guān)鍵調(diào)控基因的gRNA，構(gòu)建基于AAV或LV的基因編輯載