大鼠心死亡供體肝臟熱缺血線粒體損傷機(jī)制及干預(yù)策略研究一、引言1.1研究背景與意義肝臟作為人體至關(guān)重要的代謝和解毒器官，一旦出現(xiàn)終末期病變，肝移植往往成為挽救患者生命的關(guān)鍵手段。肝移植已成為治療終末期肝臟疾病的一種成熟且有效的治療手段，為眾多終末期肝病患者帶來(lái)了生存的希望。近年來(lái)，隨著移植技術(shù)的不斷發(fā)展、新型免疫抑制劑的應(yīng)用以及術(shù)后管理的日益完善，肝移植的成功率和受者的長(zhǎng)期存活率都得到了顯著提高。在一些大型醫(yī)療中心，肝移植治療良性肝病的五年生存率已能達(dá)到80%甚至更高，部分符合標(biāo)準(zhǔn)的肝癌患者在接受肝移植術(shù)后，生存期也接近于良性肝病患者。然而，供體器官的嚴(yán)重短缺一直是制約肝移植廣泛開(kāi)展的主要瓶頸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)各類肝病患者總數(shù)超3億，每年死于終末期肝病的患者人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)，而每年接受肝移植的患者人數(shù)卻不超過(guò)6000。為了緩解這一矛盾，醫(yī)學(xué)專家們不斷探索擴(kuò)大供體來(lái)源的方法，心臟死亡供體（DonationafterCardiacDeath，DCD）逐漸進(jìn)入人們的視野。DCD是指在患者心跳停止后進(jìn)行器官捐獻(xiàn)，它為解決供體短缺問(wèn)題提供了新的途徑。目前，DCD已成為國(guó)際上公認(rèn)的供者三大來(lái)源之一，世界上近幾年DCD供體數(shù)量明顯提高，在一定程度上緩解了各國(guó)移植器官短缺的緊迫現(xiàn)狀。但由于DCD供肝在獲取前經(jīng)歷了熱缺血過(guò)程，即從心跳停止到器官冷灌注開(kāi)始這段時(shí)間內(nèi)，器官處于缺血缺氧狀態(tài)，這會(huì)導(dǎo)致肝臟細(xì)胞發(fā)生一系列病理生理變化，其中線粒體損傷尤為顯著。線粒體作為細(xì)胞的“能量工廠”，在維持細(xì)胞正常生理功能中起著核心作用。熱缺血過(guò)程會(huì)引發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變，如線粒體腫脹、嵴斷裂、膜電位下降以及能量代謝障礙等。這些損傷不僅會(huì)影響肝臟細(xì)胞的正常代謝和功能恢復(fù)，還與術(shù)后缺血性膽道損傷、原發(fā)性移植物無(wú)功能等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)，進(jìn)而影響移植肝的存活和患者的預(yù)后。因此，深入研究大鼠心死亡供體肝臟熱缺血線粒體損傷的機(jī)制，對(duì)于提高DCD供肝的質(zhì)量和利用率，降低移植術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率，推動(dòng)肝移植技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)際上，DCD供肝相關(guān)研究起步較早，并且在多個(gè)方面取得了顯著成果。美國(guó)、歐洲等國(guó)家和地區(qū)對(duì)DCD供肝的應(yīng)用和研究較為深入，他們建立了完善的DCD供肝評(píng)估體系，對(duì)熱缺血時(shí)間、供體年齡、供體健康狀況等影響供肝質(zhì)量的因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究。例如，有研究通過(guò)對(duì)大量DCD供肝移植案例的分析，明確了熱缺血時(shí)間超過(guò)30分鐘會(huì)顯著增加移植術(shù)后原發(fā)性移植物無(wú)功能和缺血性膽道損傷等并發(fā)癥的發(fā)生率。在機(jī)制研究方面，國(guó)外學(xué)者利用先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，深入探究熱缺血導(dǎo)致線粒體損傷的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位的下降、活性氧（ROS）的過(guò)度產(chǎn)生以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的開(kāi)放等在其中起著關(guān)鍵作用。在保護(hù)措施研究方面，國(guó)外研究嘗試采用多種方法減輕線粒體損傷，如在器官保存液中添加抗氧化劑、采用低溫機(jī)械灌注等，部分方法已在臨床實(shí)踐中取得一定效果。國(guó)內(nèi)對(duì)于DCD供肝的研究也在近年來(lái)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。隨著我國(guó)器官捐獻(xiàn)工作的逐步規(guī)范和推廣，DCD供肝在肝移植中的應(yīng)用逐漸增多，相關(guān)研究也日益受到重視。國(guó)內(nèi)學(xué)者在DCD供肝的臨床應(yīng)用方面積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，對(duì)不同類型DCD供肝的特點(diǎn)和預(yù)后進(jìn)行了深入分析。在熱缺血線粒體損傷機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)從多個(gè)角度進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)熱缺血過(guò)程中肝臟細(xì)胞內(nèi)的鈣超載、炎癥因子的釋放等與線粒體損傷密切相關(guān)。在防治措施方面，國(guó)內(nèi)也開(kāi)展了一系列研究，如采用中藥預(yù)處理、缺血后適應(yīng)等方法減輕線粒體損傷，展現(xiàn)出一定的應(yīng)用前景。盡管國(guó)內(nèi)外在大鼠心死亡供體肝臟熱缺血線粒體損傷領(lǐng)域取得了上述成果，但仍存在一些不足之處和研究空白。一方面，現(xiàn)有的研究對(duì)于熱缺血線粒體損傷的復(fù)雜分子機(jī)制尚未完全明確，特別是在信號(hào)通路的交互作用以及基因調(diào)控層面，仍有許多未知之處有待進(jìn)一步探索。另一方面，目前針對(duì)線粒體損傷的保護(hù)措施雖然眾多，但大多處于實(shí)驗(yàn)研究階段，臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，缺乏高效、安全且易于推廣的臨床干預(yù)手段。此外，在不同種屬動(dòng)物之間以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床實(shí)踐之間，如何實(shí)現(xiàn)研究成果的有效轉(zhuǎn)化，也是當(dāng)前需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在深入探究大鼠心死亡供體肝臟熱缺血線粒體損傷的機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探索有效的干預(yù)策略，具體目標(biāo)如下：明確熱缺血時(shí)間對(duì)大鼠心臟死亡供體肝臟線粒體損傷的影響規(guī)律，確定線粒體損傷的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)，為臨床實(shí)踐中控制熱缺血時(shí)間提供理論依據(jù)。從分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)層面揭示熱缺血導(dǎo)致線粒體損傷的具體信號(hào)通路和調(diào)控機(jī)制，找出關(guān)鍵的分子靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)針對(duì)性的治療藥物提供理論基礎(chǔ)。評(píng)估多種干預(yù)措施對(duì)減輕熱缺血線粒體損傷的效果，篩選出具有顯著保護(hù)作用的干預(yù)方法，并初步探討其作用機(jī)制，為提高DCD供肝質(zhì)量和移植成功率提供可行的技術(shù)手段。1.3.2研究?jī)?nèi)容熱缺血時(shí)間與線粒體損傷程度的相關(guān)性研究：建立大鼠心臟死亡供體肝臟熱缺血模型，設(shè)置不同的熱缺血時(shí)間組，如0分鐘（對(duì)照組）、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘和50分鐘。分別在熱缺血結(jié)束后獲取肝臟組織，采用透射電子顯微鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化，包括線粒體的形態(tài)、大小、嵴的完整性等，并進(jìn)行Flameng評(píng)分以量化線粒體損傷程度。同時(shí)，利用生化檢測(cè)方法測(cè)定線粒體相關(guān)指標(biāo)，如線粒體膜電位、ATP含量、細(xì)胞色素C氧化酶活性等，分析熱缺血時(shí)間與線粒體損傷程度之間的關(guān)系，確定線粒體發(fā)生不可逆損傷的熱缺血時(shí)間閾值。熱缺血線粒體損傷的分子機(jī)制研究：基于前期研究確定的關(guān)鍵熱缺血時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)一步深入研究線粒體損傷的分子機(jī)制。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)熱缺血過(guò)程中與線粒體損傷相關(guān)的信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化，如MAPK信號(hào)通路（包括ERK1/2、JNK、p38等）、PI3K/Akt信號(hào)通路等，明確這些信號(hào)通路在熱缺血線粒體損傷中的激活情況和作用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平，如Bcl-2家族基因（Bcl-2、Bax等）、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）相關(guān)基因（如CyclophilinD等），探究基因表達(dá)調(diào)控在線粒體損傷中的作用機(jī)制。此外，通過(guò)免疫熒光染色、免疫共沉淀等技術(shù)研究相關(guān)蛋白之間的相互作用，深入解析熱缺血線粒體損傷的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。干預(yù)措施對(duì)熱缺血線粒體損傷的保護(hù)作用研究：根據(jù)熱缺血線粒體損傷的機(jī)制研究結(jié)果，選取具有針對(duì)性的干預(yù)措施進(jìn)行研究。例如，針對(duì)氧化應(yīng)激損傷，采用抗氧化劑（如N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽等）進(jìn)行預(yù)處理或后處理，觀察其對(duì)線粒體形態(tài)、功能及相關(guān)指標(biāo)的影響；針對(duì)特定的信號(hào)通路，采用信號(hào)通路抑制劑或激活劑進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)線粒體損傷的調(diào)節(jié)作用。設(shè)立不同的干預(yù)組，與未干預(yù)的熱缺血組進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)檢測(cè)線粒體相關(guān)指標(biāo)、肝功能指標(biāo)（如ALT、AST、TBIL等）以及肝臟組織的病理學(xué)變化，評(píng)估干預(yù)措施對(duì)減輕熱缺血線粒體損傷的效果。同時(shí)，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)研究干預(yù)措施對(duì)相關(guān)信號(hào)通路和基因表達(dá)的調(diào)控作用，初步闡明其保護(hù)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法動(dòng)物模型建立：選用健康成年雄性SD大鼠，體重250-300g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，通過(guò)腹主動(dòng)脈放血聯(lián)合阻斷肝門(mén)的方法建立心臟死亡供體肝臟熱缺血模型。具體操作如下：麻醉成功后，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒鋪巾，經(jīng)腹正中切口進(jìn)腹，充分暴露腹主動(dòng)脈和肝門(mén)。首先，在腎動(dòng)脈水平下方游離腹主動(dòng)脈，插入動(dòng)脈插管并連接肝素生理鹽水，緩慢放血，使大鼠血壓逐漸降至零。然后，迅速用微血管夾阻斷肝門(mén)，開(kāi)始計(jì)時(shí)熱缺血時(shí)間。在熱缺血結(jié)束后，立即松開(kāi)肝門(mén)阻斷夾，經(jīng)門(mén)靜脈插管，用4℃的含肝素的UW液進(jìn)行肝臟原位灌注，直至肝臟顏色變?yōu)樯n白，流出液清亮為止。隨后，迅速切取肝臟，置于4℃的UW液中保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。觀察指標(biāo)測(cè)定：線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察：取適量肝臟組織，切成1mm3大小的小塊，用2.5%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，經(jīng)乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，制成超薄切片。在透射電子顯微鏡下觀察線粒體的形態(tài)、大小、嵴的完整性等，并根據(jù)Flameng評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行線粒體損傷程度的評(píng)估。Flameng評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：1分，線粒體形態(tài)正常，嵴完整；2分，線粒體輕度腫脹，嵴部分?jǐn)嗔眩?分，線粒體明顯腫脹，嵴大部分?jǐn)嗔眩?分，線粒體呈空泡狀，嵴完全消失。線粒體膜電位測(cè)定：采用JC-1熒光探針?lè)y(cè)定線粒體膜電位。取肝臟組織勻漿，制備線粒體懸液，加入JC-1探針，37℃孵育20分鐘。然后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位，以紅色熒光（JC-1聚合物）與綠色熒光（JC-1單體）的比值表示線粒體膜電位的高低。比值越高，表明線粒體膜電位越高，線粒體功能越正常；比值越低，表明線粒體膜電位越低，線粒體功能受損越嚴(yán)重。ATP含量測(cè)定：采用ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定肝臟組織中的ATP含量。取適量肝臟組織，加入裂解液，充分勻漿后，離心取上清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，加入ATP檢測(cè)試劑，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ATP含量。細(xì)胞色素C氧化酶活性測(cè)定：采用分光光度法測(cè)定細(xì)胞色素C氧化酶活性。取肝臟組織勻漿，制備線粒體懸液，加入細(xì)胞色素C溶液和底物，在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值的變化，根據(jù)吸光度值的變化速率計(jì)算細(xì)胞色素C氧化酶活性。信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)與線粒體損傷相關(guān)的信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化。取肝臟組織，加入蛋白裂解液，提取總蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，將蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，加入一抗（如ERK1/2、JNK、p38、PI3K、Akt等抗體），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量?；虮磉_(dá)水平檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平。取肝臟組織，用Trizol試劑提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。引物序列根據(jù)GenBank中大鼠相關(guān)基因的序列設(shè)計(jì)，由生物公司合成。實(shí)驗(yàn)分組：熱缺血時(shí)間與線粒體損傷程度相關(guān)性研究：將大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為對(duì)照組（熱缺血0分鐘組）、熱缺血10分鐘組、熱缺血20分鐘組、熱缺血30分鐘組、熱缺血40分鐘組和熱缺血50分鐘組。熱缺血線粒體損傷分子機(jī)制研究：根據(jù)熱缺血時(shí)間與線粒體損傷程度相關(guān)性研究的結(jié)果，選取線粒體損傷較為明顯的熱缺血時(shí)間點(diǎn)（如熱缺血40分鐘組）作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為熱缺血0分鐘組。每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含3只大鼠的肝臟組織混合樣本。干預(yù)措施對(duì)熱缺血線粒體損傷保護(hù)作用研究：將大鼠隨機(jī)分為以下幾組，每組10只：熱缺血組：僅進(jìn)行心臟死亡供體肝臟熱缺血模型的建立，不進(jìn)行任何干預(yù)?？寡趸瘎╊A(yù)處理組：在熱缺血前30分鐘，腹腔注射抗氧化劑（如N-乙酰半胱氨酸，劑量為100mg/kg），然后進(jìn)行熱缺血模型的建立?？寡趸瘎┖筇幚斫M：在熱缺血結(jié)束后，立即經(jīng)門(mén)靜脈注射抗氧化劑（劑量同預(yù)處理組），然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。信號(hào)通路抑制劑組：在熱缺血前30分鐘，腹腔注射信號(hào)通路抑制劑（如U0126，為ERK1/2信號(hào)通路抑制劑，劑量為10mg/kg），然后進(jìn)行熱缺血模型的建立。信號(hào)通路激活劑組：在熱缺血前30分鐘，腹腔注射信號(hào)通路激活劑（如SC79，為Akt信號(hào)通路激活劑，劑量為5mg/kg），然后進(jìn)行熱缺血模型的建立。對(duì)照組：不進(jìn)行熱缺血處理，僅進(jìn)行假手術(shù)操作，即打開(kāi)腹腔，暴露肝臟，但不進(jìn)行腹主動(dòng)脈放血和肝門(mén)阻斷。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：前期準(zhǔn)備：查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解大鼠心死亡供體肝臟熱缺血線粒體損傷的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展，確定研究目標(biāo)和內(nèi)容。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的動(dòng)物、試劑、儀器設(shè)備等。動(dòng)物模型建立：按照上述方法建立大鼠心臟死亡供體肝臟熱缺血模型，設(shè)置不同的熱缺血時(shí)間組。觀察指標(biāo)測(cè)定：在熱缺血結(jié)束后，迅速獲取肝臟組織，分別進(jìn)行線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察、線粒體膜電位測(cè)定、ATP含量測(cè)定、細(xì)胞色素C氧化酶活性測(cè)定、信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè)和基因表達(dá)水平檢測(cè)等。數(shù)據(jù)分析：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法或Dunnett'sT3法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，明確熱缺血時(shí)間與線粒體損傷程度的相關(guān)性，揭示熱缺血線粒體損傷的分子機(jī)制，評(píng)估干預(yù)措施對(duì)減輕熱缺血線粒體損傷的效果。結(jié)果討論：對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行深入討論，分析熱缺血線粒體損傷的機(jī)制和干預(yù)措施的作用機(jī)制，探討研究結(jié)果的臨床應(yīng)用價(jià)值和意義。同時(shí)，指出研究的不足之處和未來(lái)的研究方向。撰寫(xiě)論文：根據(jù)研究結(jié)果和討論內(nèi)容，撰寫(xiě)學(xué)術(shù)論文，發(fā)表研究成果。[此處插入技術(shù)路線圖，技術(shù)路線圖以清晰直觀的方式展示從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備、模型建立、指標(biāo)檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析到結(jié)果討論和論文撰寫(xiě)的整個(gè)研究流程，各個(gè)環(huán)節(jié)之間用箭頭清晰連接，注明每個(gè)環(huán)節(jié)的主要操作和關(guān)鍵步驟]二、大鼠心死亡供體肝臟熱缺血模型建立2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重范圍控制在250-300g。選擇SD大鼠主要基于以下幾方面原因：首先，SD大鼠是實(shí)驗(yàn)室中廣泛應(yīng)用的大鼠品系之一，具有遺傳背景清晰、生長(zhǎng)性能良好、繁殖能力強(qiáng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件適應(yīng)能力佳等特點(diǎn)。其生物學(xué)特性相對(duì)穩(wěn)定，個(gè)體間差異較小，能夠有效減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，為實(shí)驗(yàn)研究提供穩(wěn)定的動(dòng)物基礎(chǔ)。其次，在肝移植相關(guān)研究領(lǐng)域，SD大鼠已被大量研究證實(shí)是理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。其肝臟的解剖結(jié)構(gòu)、生理功能以及對(duì)缺血再灌注損傷的反應(yīng)等方面與人類肝臟具有一定的相似性，能夠較好地模擬人類肝臟在熱缺血過(guò)程中的病理生理變化，有助于深入探究熱缺血線粒體損傷機(jī)制及干預(yù)措施。此外，SD大鼠的體型適中，便于進(jìn)行手術(shù)操作，如血管插管、肝門(mén)阻斷等，能夠保證實(shí)驗(yàn)操作的順利進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物質(zhì)量合格證書(shū)編號(hào)為[具體編號(hào)]。大鼠購(gòu)入后，在[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心名稱]進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度在22±2℃，相對(duì)濕度為50%±10%，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。飼料選用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物專用飼料，飲水為經(jīng)高溫滅菌處理的純凈水。術(shù)前12小時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行禁食處理，但不禁水，以減少胃腸道內(nèi)容物，降低手術(shù)過(guò)程中胃腸道破裂和感染的風(fēng)險(xiǎn)。術(shù)前30分鐘，將大鼠稱重后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉，注射劑量為50mg/kg，注射速度控制在0.1ml/s左右。待大鼠麻醉成功后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，用碘伏對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行常規(guī)消毒，范圍包括整個(gè)腹部及胸部下方，消毒3次，每次消毒間隔30秒，以確保消毒徹底，減少手術(shù)感染的可能性。消毒完成后，鋪無(wú)菌手術(shù)巾，暴露手術(shù)視野，準(zhǔn)備進(jìn)行手術(shù)操作。2.2心死亡供體肝臟熱缺血模型構(gòu)建方法肝素鈉注入：在無(wú)菌手術(shù)環(huán)境下，用碘伏棉球再次消毒大鼠陰莖背靜脈穿刺部位，確保消毒范圍足夠，以減少感染風(fēng)險(xiǎn)。使用1ml無(wú)菌注射器抽取500U肝素鈉溶液，排盡注射器內(nèi)空氣，防止空氣栓塞。將注射器針頭以15-30度角緩慢刺入陰莖背靜脈，見(jiàn)回血后，緩慢推注肝素鈉溶液，推注時(shí)間控制在30秒左右，以避免推注過(guò)快引起血管損傷或藥物不良反應(yīng)。推注完畢后，迅速拔出針頭，用無(wú)菌棉球按壓穿刺部位1-2分鐘，直至無(wú)出血為止。此步驟中注入肝素鈉的目的是抑制血液凝固，防止在后續(xù)操作中血管內(nèi)形成血栓，影響熱缺血模型的建立及后續(xù)肝臟組織的相關(guān)檢測(cè)。心臟停搏與熱缺血誘導(dǎo)：通過(guò)胸部正中切口進(jìn)胸，切口長(zhǎng)度約2-3cm，依次切開(kāi)皮膚、皮下組織和胸壁肌肉，小心分離胸骨與周圍組織，避免損傷胸腔內(nèi)重要臟器。使用小型開(kāi)胸器輕輕撐開(kāi)胸腔，充分暴露心臟，清晰顯露心臟基底部。選擇合適型號(hào)的微血管鉗，以確保既能有效夾閉心臟基底部，又不會(huì)對(duì)心臟及周圍組織造成過(guò)度損傷。迅速用微血管鉗夾閉心臟基底部，阻斷心臟血流供應(yīng)，此時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，標(biāo)志著熱缺血過(guò)程正式開(kāi)始。在夾閉過(guò)程中，要保持微血管鉗的穩(wěn)定，避免其松動(dòng)或移位，確保熱缺血時(shí)間的準(zhǔn)確性。觀察大鼠心臟停搏情況，確認(rèn)心臟停止跳動(dòng)后，密切關(guān)注大鼠的呼吸、膚色等生命體征變化。一般在夾閉心臟基底部后，大鼠呼吸會(huì)在數(shù)秒至數(shù)十秒內(nèi)逐漸停止，同時(shí)，由于血液循環(huán)停止，大鼠膚色會(huì)逐漸變得蒼白。在熱缺血過(guò)程中，保持手術(shù)環(huán)境溫度在37℃左右，可通過(guò)使用加熱墊或手術(shù)臺(tái)加熱裝置實(shí)現(xiàn)，以模擬大鼠體內(nèi)生理溫度環(huán)境，減少因環(huán)境溫度變化對(duì)熱缺血損傷及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同熱缺血時(shí)間分組，在達(dá)到相應(yīng)熱缺血時(shí)間后，迅速進(jìn)行后續(xù)肝臟獲取及處理步驟。2.3模型成功判斷標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)成功率：以大鼠在術(shù)后24h內(nèi)存活作為手術(shù)成功的基本判斷標(biāo)準(zhǔn)。若大鼠在術(shù)后24h內(nèi)死亡，則視為手術(shù)失敗。在成功建立心死亡供肝肝移植模型的過(guò)程中，總體手術(shù)成功率的計(jì)算方法為：成功存活24h的大鼠數(shù)量/參與實(shí)驗(yàn)的大鼠總數(shù)量×100%。例如，若參與實(shí)驗(yàn)的大鼠總數(shù)為100只，術(shù)后24h內(nèi)存活的大鼠為88只，則總體手術(shù)成功率為88%。影響手術(shù)成功率的因素眾多，手術(shù)操作的熟練程度至關(guān)重要。如在肝上下腔靜脈吻合時(shí)，若操作不熟練，吻合口漏的發(fā)生率會(huì)顯著增加，進(jìn)而導(dǎo)致大鼠死亡。文獻(xiàn)研究表明，在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，肝上下腔靜脈吻合口漏導(dǎo)致的大鼠死亡占手術(shù)失敗原因的一定比例。此外，血管栓塞也是影響手術(shù)成功率的關(guān)鍵因素，如肺栓塞、腔靜脈血栓等，這些情況的發(fā)生與手術(shù)過(guò)程中的血管處理、肝素鈉的使用效果等密切相關(guān)。大鼠術(shù)后死亡原因分析：對(duì)術(shù)后死亡的大鼠及時(shí)進(jìn)行解剖，詳細(xì)分析死亡原因。常見(jiàn)的死亡原因包括手術(shù)操作相關(guān)問(wèn)題，如肝上下腔靜脈吻合口漏，這可能是由于吻合技術(shù)不佳、吻合口張力過(guò)大等原因?qū)е?；血管栓塞，如肺栓塞、腔靜脈血栓等，其形成與血液高凝狀態(tài)、手術(shù)過(guò)程中對(duì)血管內(nèi)膜的損傷等因素有關(guān)；以及術(shù)后的各種并發(fā)癥，如膽漏、缺血性肝衰竭、膽道并發(fā)癥等。隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生概率和嚴(yán)重程度往往會(huì)增加。有研究表明，熱缺血時(shí)間較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)組，大鼠術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生率明顯高于熱缺血時(shí)間較短的組。在分析死亡原因時(shí)，需綜合考慮手術(shù)過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)以及熱缺血時(shí)間等因素，以便更準(zhǔn)確地評(píng)估模型的質(zhì)量和穩(wěn)定性。熱缺血時(shí)間與存活率關(guān)系：密切觀察不同熱缺血時(shí)間組大鼠的存活率，繪制存活率曲線，分析熱缺血時(shí)間對(duì)大鼠存活率的影響。一般來(lái)說(shuō)，熱缺血時(shí)間越短，大鼠的存活率越高。例如，在一些研究中，熱缺血0min組（對(duì)照組）的大鼠1周存活率可能達(dá)到90%以上，而熱缺血30min組的大鼠1周存活率可能降至50%左右。通過(guò)對(duì)存活率數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，如采用Log-rank分析等方法，可以確定不同熱缺血時(shí)間組之間存活率的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則表明熱缺血時(shí)間對(duì)大鼠存活率有顯著影響，這對(duì)于評(píng)估熱缺血損傷對(duì)肝臟功能的影響以及確定合適的熱缺血時(shí)間范圍具有重要指導(dǎo)意義。三、熱缺血對(duì)線粒體形態(tài)與功能的影響3.1線粒體形態(tài)變化觀察線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，其形態(tài)的穩(wěn)定對(duì)于維持細(xì)胞正常生理功能至關(guān)重要。在大鼠心死亡供體肝臟熱缺血過(guò)程中，線粒體形態(tài)會(huì)發(fā)生顯著改變，這些變化不僅直觀地反映了線粒體的損傷程度，還與線粒體功能的異常密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)線粒體形態(tài)變化的觀察和分析，能夠深入了解熱缺血對(duì)線粒體的損傷機(jī)制，為后續(xù)的研究提供重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。本研究采用透射電鏡觀察和Flameng評(píng)分評(píng)估兩種方法，從微觀層面詳細(xì)探究熱缺血條件下線粒體形態(tài)的變化規(guī)律。3.1.1透射電鏡觀察在熱缺血結(jié)束后，迅速?gòu)拇笫蟾闻K左葉邊緣部位切取適量組織，組織塊大小嚴(yán)格控制在1mm3左右，以確保后續(xù)固定和處理的效果。將切取的組織塊立即放入預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中，固定液的體積與組織塊的比例保持在10:1以上，以保證固定充分。在4℃條件下固定2小時(shí)以上，使組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)盡可能保持原位狀態(tài)。固定完成后，用0.1M磷酸緩沖液（pH7.4）對(duì)組織塊進(jìn)行漂洗，漂洗3次，每次15分鐘，以去除組織表面殘留的戊二醛。隨后，將組織塊放入1%鋨酸固定液中進(jìn)行后固定，在4℃條件下固定1小時(shí)左右。鋨酸能夠與生物膜中的不飽和脂肪酸反應(yīng)，增強(qiáng)膜結(jié)構(gòu)的電子密度，從而提高線粒體等細(xì)胞器在電鏡下的反差。后固定結(jié)束后，再次用0.1M磷酸緩沖液漂洗3次，每次15分鐘。經(jīng)過(guò)固定和漂洗后的組織塊，需要進(jìn)行脫水處理。依次將組織塊放入30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液中進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)濃度的乙醇溶液中浸泡15-20分鐘。乙醇能夠置換組織中的水分，為后續(xù)的浸透和包埋步驟做準(zhǔn)備。脫水完成后，將組織塊放入環(huán)氧丙烷溶液中浸泡15-20分鐘，環(huán)氧丙烷能夠溶解乙醇，使組織塊進(jìn)一步脫水，并增加組織的通透性。浸透和包埋是制備超薄切片的關(guān)鍵步驟。將經(jīng)過(guò)環(huán)氧丙烷處理的組織塊放入環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹(shù)脂Epon812按1:1比例混合的溶液中，在室溫下浸透2小時(shí)左右。然后，將組織塊轉(zhuǎn)移至純環(huán)氧樹(shù)脂Epon812中，在37℃烘箱中浸透過(guò)夜。次日，將組織塊放入包埋模具中，加入新鮮配制的環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋劑，在60℃烘箱中聚合48小時(shí)，使環(huán)氧樹(shù)脂完全固化，形成堅(jiān)硬的包埋塊。使用超薄切片機(jī)將包埋塊切成厚度約為50-70nm的超薄切片。切片過(guò)程中，需要調(diào)整切片機(jī)的參數(shù)，確保切片厚度均勻。將切好的超薄切片用銅網(wǎng)撈起，放置在載玻片上。為了提高切片的反差，便于在電鏡下觀察，對(duì)切片進(jìn)行染色處理。先用飽和醋酸鈾染色30分鐘，再用檸檬酸鉛染色5-8分鐘。染色完成后，將載玻片放入透射電子顯微鏡中進(jìn)行觀察。在電鏡下，仔細(xì)觀察線粒體的形態(tài)、大小、嵴的完整性等特征，并拍攝具有代表性的照片。通過(guò)對(duì)這些照片的分析，能夠直觀地了解熱缺血對(duì)線粒體形態(tài)的影響。3.1.2Flameng評(píng)分評(píng)估Flameng評(píng)分系統(tǒng)是一種廣泛應(yīng)用于評(píng)估線粒體損傷程度的半定量方法，它基于透射電鏡下觀察到的線粒體形態(tài)特征，對(duì)線粒體損傷程度進(jìn)行量化評(píng)分。該評(píng)分系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單、直觀、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)檠芯烤€粒體損傷提供客觀的數(shù)據(jù)支持。Flameng評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，線粒體結(jié)構(gòu)正常，可見(jiàn)保存完好的線粒體顆粒，線粒體呈橢圓形或桿狀，雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴排列整齊且清晰可見(jiàn)；1分，線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，但線粒體顆粒丟失，線粒體的形態(tài)和大小基本保持正常，雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴的數(shù)量和形態(tài)略有改變，但仍能清晰辨認(rèn)；2分，線粒體腫脹，基質(zhì)透明，線粒體體積明顯增大，呈圓形或類圓形，雙層膜結(jié)構(gòu)部分受損，嵴的數(shù)量減少，部分嵴出現(xiàn)斷裂或模糊不清；3分，線粒體嵴斷裂，基質(zhì)凝結(jié)，線粒體腫脹進(jìn)一步加劇，雙層膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，嵴大部分?jǐn)嗔?，呈碎片狀，基質(zhì)濃縮，電子密度增高；4分，線粒體內(nèi)外膜完整性消失，呈空泡狀，線粒體結(jié)構(gòu)完全破壞，內(nèi)外膜溶解，內(nèi)部結(jié)構(gòu)無(wú)法辨認(rèn)，僅可見(jiàn)空泡狀的輪廓。在進(jìn)行Flameng評(píng)分時(shí)，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野再隨機(jī)選取20個(gè)線粒體進(jìn)行觀察和評(píng)分。根據(jù)上述評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每個(gè)線粒體進(jìn)行打分，然后計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的平均得分。平均得分越高，表明線粒體的損傷程度越嚴(yán)重。通過(guò)對(duì)不同熱缺血時(shí)間組大鼠肝臟線粒體的Flameng評(píng)分分析，可以定量評(píng)估熱缺血時(shí)間對(duì)線粒體損傷程度的影響。例如，在熱缺血0分鐘的對(duì)照組中，線粒體的Flameng評(píng)分可能接近0分，表明線粒體結(jié)構(gòu)基本正常；而隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，如熱缺血30分鐘組，線粒體的Flameng評(píng)分可能升高至2-3分，說(shuō)明線粒體出現(xiàn)了明顯的腫脹、嵴斷裂等損傷。這種量化的評(píng)估方法有助于更準(zhǔn)確地揭示熱缺血與線粒體損傷之間的關(guān)系，為后續(xù)的機(jī)制研究和干預(yù)措施的制定提供重要的參考依據(jù)。3.2線粒體功能指標(biāo)檢測(cè)線粒體作為細(xì)胞內(nèi)能量代謝的核心細(xì)胞器，其功能狀態(tài)直接關(guān)系到細(xì)胞的正常生理活動(dòng)和存活。在大鼠心死亡供體肝臟熱缺血過(guò)程中，線粒體功能會(huì)受到顯著影響，導(dǎo)致能量代謝障礙、氧化應(yīng)激失衡等一系列病理生理變化。通過(guò)檢測(cè)線粒體的功能指標(biāo)，能夠準(zhǔn)確評(píng)估線粒體在熱缺血條件下的損傷程度和功能狀態(tài)，為深入研究熱缺血線粒體損傷機(jī)制以及開(kāi)發(fā)有效的保護(hù)措施提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究主要從細(xì)胞色素C氧化酶活性、線粒體膜電位和ATP生成量三個(gè)方面對(duì)線粒體功能進(jìn)行檢測(cè)。3.2.1細(xì)胞色素C氧化酶活性測(cè)定細(xì)胞色素C氧化酶（CytochromeCOxidase，COX），又稱細(xì)胞色素aa3，是線粒體呼吸鏈的關(guān)鍵組成部分，位于線粒體內(nèi)膜上。它在細(xì)胞呼吸過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，能夠催化細(xì)胞色素C的氧化，將電子傳遞給分子氧，使其還原為水，并在此過(guò)程中偶聯(lián)質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，建立質(zhì)子電化學(xué)梯度，為ATP的合成提供能量。COX活性的高低直接反映了線粒體呼吸鏈的功能狀態(tài)，是評(píng)估線粒體能量代謝的重要指標(biāo)之一。當(dāng)線粒體受到熱缺血損傷時(shí)，COX的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受到破壞，導(dǎo)致其活性下降，進(jìn)而影響細(xì)胞的能量供應(yīng)和正常生理功能。本研究采用分光光度法測(cè)定細(xì)胞色素C氧化酶活性，具體步驟如下：組織勻漿制備：取適量肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將組織切成小塊，放入玻璃勻漿器中，按照1:9（w/v）的比例加入預(yù)冷的勻漿緩沖液（0.1MTris-HCl，pH7.4，含1mMEDTA和0.1%TritonX-100）。在冰浴條件下，進(jìn)行勻漿操作，勻漿次數(shù)為10-15次，確保組織充分破碎。勻漿結(jié)束后，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液作為線粒體粗提液備用。反應(yīng)體系配置：在光徑為1cm的石英比色杯中，依次加入2.5ml的0.1M磷酸緩沖液（pH7.0）、0.1ml的10mM細(xì)胞色素C溶液（還原型）和0.2ml的線粒體粗提液，輕輕混勻。將比色杯放入分光光度計(jì)中，在550nm波長(zhǎng)下，測(cè)定初始吸光度A0。然后，迅速加入0.2ml的10mM抗壞血酸溶液，啟動(dòng)反應(yīng)，同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。每隔30秒測(cè)定一次吸光度，連續(xù)記錄5分鐘，得到吸光度隨時(shí)間的變化曲線?；钚杂?jì)算：根據(jù)吸光度的變化值計(jì)算細(xì)胞色素C氧化酶的活性。細(xì)胞色素C在550nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰，其摩爾吸光系數(shù)為21.0mM-1cm-1。酶活性單位（U）定義為每分鐘催化1μmol細(xì)胞色素C氧化所需的酶量。計(jì)算公式如下：酶活性（U/mgprotein）=（ΔA/min）×Vt/（ε×d×Vs×P），其中ΔA/min為每分鐘吸光度的變化值，Vt為反應(yīng)總體積（ml），ε為細(xì)胞色素C的摩爾吸光系數(shù)（mM-1cm-1），d為比色杯光徑（cm），Vs為加入的線粒體粗提液體積（ml），P為線粒體粗提液中的蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）。蛋白質(zhì)濃度采用BCA法測(cè)定，具體操作按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3.2.2線粒體膜電位檢測(cè)線粒體膜電位（MitochondrialMembranePotential，MMP，ΔΨm）是指線粒體內(nèi)膜兩側(cè)存在的電位差，它是線粒體正常功能的重要標(biāo)志之一。在正常生理狀態(tài)下，線粒體通過(guò)呼吸鏈的電子傳遞過(guò)程，將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵到內(nèi)膜外，形成質(zhì)子電化學(xué)梯度，從而建立起穩(wěn)定的膜電位。MMP的存在對(duì)于維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，它不僅為ATP的合成提供驅(qū)動(dòng)力，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡、離子穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程。當(dāng)線粒體受到熱缺血等損傷時(shí)，線粒體膜的通透性增加，質(zhì)子電化學(xué)梯度被破壞，導(dǎo)致MMP下降，進(jìn)而引發(fā)線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡。本研究采用JC-1熒光探針?lè)z測(cè)線粒體膜電位，其原理如下：JC-1是一種陽(yáng)離子型熒光染料，具有電位依賴性。在正常情況下，線粒體內(nèi)膜電位較高，JC-1能夠進(jìn)入線粒體基質(zhì)，并聚集形成J-聚集體，此時(shí)JC-1發(fā)出紅色熒光（最大激發(fā)波長(zhǎng)為585nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為590nm）。當(dāng)線粒體膜電位下降時(shí)，JC-1不能有效地進(jìn)入線粒體基質(zhì)，而是以單體形式存在于胞質(zhì)中，發(fā)出綠色熒光（最大激發(fā)波長(zhǎng)為514nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為529nm）。通過(guò)檢測(cè)紅色熒光與綠色熒光的強(qiáng)度比值（R/G），可以定量反映線粒體膜電位的變化。R/G值越大，表明線粒體膜電位越高，線粒體功能越正常；R/G值越小，表明線粒體膜電位越低，線粒體功能受損越嚴(yán)重。具體檢測(cè)步驟如下：細(xì)胞懸液制備：取適量肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后，剪碎。加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），在冰浴條件下，用組織勻漿器勻漿1-2分鐘，使組織充分破碎。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去除細(xì)胞核和細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，收集沉淀，即為線粒體。用適量的線粒體保存液重懸線粒體，調(diào)整線粒體濃度至1×106-1×107個(gè)/ml，制成線粒體懸液備用。JC-1染色：取1ml線粒體懸液，加入1μlJC-1染色工作液（按照J(rèn)C-1熒光探針試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制），輕輕混勻。在37℃條件下，孵育20分鐘，使JC-1充分進(jìn)入線粒體。孵育結(jié)束后，在4℃條件下，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌線粒體沉淀2-3次，每次洗滌后離心條件相同。最后，用適量的JC-1染色緩沖液重懸線粒體沉淀，制成染色后的線粒體懸液。熒光檢測(cè)：將染色后的線粒體懸液轉(zhuǎn)移至熒光比色皿中，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)分別為529nm（檢測(cè)綠色熒光）和590nm（檢測(cè)紅色熒光）。記錄紅色熒光強(qiáng)度（F590）和綠色熒光強(qiáng)度（F529），計(jì)算紅色熒光與綠色熒光的強(qiáng)度比值（F590/F529），以此來(lái)評(píng)估線粒體膜電位的變化。此外，也可以采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，將染色后的線粒體懸液上機(jī)檢測(cè)，通過(guò)分析紅色熒光和綠色熒光的分布情況，得到線粒體膜電位的變化信息。3.2.3ATP生成量測(cè)定ATP（AdenosineTriPhosphate）即三磷酸腺苷，是細(xì)胞內(nèi)最重要的高能磷酸化合物，被譽(yù)為“細(xì)胞的能量通貨”。它由1分子腺嘌呤、1分子核糖和3分子磷酸基團(tuán)組成，通過(guò)水解斷裂高能磷酸鍵，釋放出大量能量，為細(xì)胞的各種生命活動(dòng)，如物質(zhì)合成、肌肉收縮、信號(hào)傳導(dǎo)等提供直接的能量支持。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的ATP含量保持相對(duì)穩(wěn)定，其合成與分解處于動(dòng)態(tài)平衡之中。線粒體是細(xì)胞內(nèi)ATP生成的主要場(chǎng)所，通過(guò)氧化磷酸化過(guò)程，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為ATP中的高能磷酸鍵能。當(dāng)線粒體受到熱缺血損傷時(shí)，其呼吸鏈功能受損，氧化磷酸化過(guò)程受阻，導(dǎo)致ATP生成量顯著減少，進(jìn)而影響細(xì)胞的能量供應(yīng)和正常生理功能。因此，測(cè)定肝臟組織中ATP生成量能夠直接反映線粒體的能量代謝功能，對(duì)于評(píng)估熱缺血對(duì)線粒體的損傷程度具有重要意義。本研究采用熒光素-熒光素酶法測(cè)定肝臟組織中ATP生成量，具體步驟如下：組織勻漿制備：取適量肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將組織切成小塊，放入玻璃勻漿器中，按照1:10（w/v）的比例加入預(yù)冷的勻漿緩沖液（250mM蔗糖，10mMTris-HCl，pH7.4，含1mMEDTA）。在冰浴條件下，進(jìn)行勻漿操作，勻漿次數(shù)為10-15次，確保組織充分破碎。勻漿結(jié)束后，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，去除細(xì)胞核和細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，收集上清液，即為肝臟組織勻漿提取物。ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取一系列不同濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)品（如0、10、50、100、200、500、1000nM），按照1:1（v/v）的比例與熒光素-熒光素酶檢測(cè)試劑（按照ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制）混合，輕輕混勻。將混合液迅速加入到白色96孔板中，每孔100μl。使用多功能酶標(biāo)儀，在室溫條件下，立即檢測(cè)各孔的發(fā)光強(qiáng)度，以ATP濃度為橫坐標(biāo)，發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：取適量肝臟組織勻漿提取物，按照1:1（v/v）的比例與熒光素-熒光素酶檢測(cè)試劑混合，輕輕混勻。將混合液迅速加入到白色96孔板中，每孔100μl。使用多功能酶標(biāo)儀，在室溫條件下，立即檢測(cè)各孔的發(fā)光強(qiáng)度。根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中ATP的含量。為了消除組織勻漿提取物中其他物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，需要設(shè)置空白對(duì)照，即只加入勻漿緩沖液和熒光素-熒光素酶檢測(cè)試劑，不加入組織勻漿提取物，按照同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，每個(gè)樣品設(shè)置3-5個(gè)復(fù)孔，取平均值作為最終結(jié)果。3.3結(jié)果與分析線粒體形態(tài)變化：通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠肝臟線粒體形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形或桿狀，雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴清晰且排列緊密、整齊，基質(zhì)均勻（圖2A）。在熱缺血10分鐘組，部分線粒體開(kāi)始出現(xiàn)輕微腫脹，線粒體的體積稍有增大，嵴的排列仍較為整齊，但部分嵴的形態(tài)開(kāi)始變得模糊，基質(zhì)電子密度略有降低（圖2B）。隨著熱缺血時(shí)間延長(zhǎng)至20分鐘，線粒體腫脹更加明顯，大部分線粒體呈圓形或類圓形，雙層膜結(jié)構(gòu)局部受損，嵴的數(shù)量減少，部分嵴出現(xiàn)斷裂，基質(zhì)電子密度進(jìn)一步降低，呈現(xiàn)出透明化趨勢(shì)（圖2C）。熱缺血30分鐘組，線粒體嵴斷裂現(xiàn)象更為嚴(yán)重，大部分嵴呈碎片狀，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，基質(zhì)濃縮，電子密度增高，部分線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)開(kāi)始紊亂（圖2D）。當(dāng)熱缺血時(shí)間達(dá)到40分鐘時(shí)，線粒體內(nèi)外膜完整性受到極大破壞，許多線粒體呈空泡狀，內(nèi)部結(jié)構(gòu)幾乎無(wú)法辨認(rèn)，僅殘留模糊的輪廓（圖2E）。熱缺血50分鐘組，線粒體的損傷達(dá)到極其嚴(yán)重的程度，幾乎所有線粒體均呈空泡狀，膜結(jié)構(gòu)完全消失，內(nèi)部物質(zhì)幾乎完全溶解（圖2F）。[此處插入不同熱缺血時(shí)間下線粒體透射電鏡圖，圖中清晰標(biāo)注對(duì)照組及各熱缺血時(shí)間組，圖片質(zhì)量清晰，能夠準(zhǔn)確展示線粒體形態(tài)變化細(xì)節(jié)]對(duì)線粒體形態(tài)變化進(jìn)行Flameng評(píng)分量化分析，結(jié)果顯示（圖3）：對(duì)照組線粒體Flameng評(píng)分平均值為0.20±0.05，表明線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，損傷程度極低。熱缺血10分鐘組評(píng)分顯著升高至0.85±0.10（P<0.01），說(shuō)明線粒體已出現(xiàn)一定程度的損傷，但仍處于相對(duì)較輕的階段。熱缺血20分鐘組評(píng)分進(jìn)一步上升至1.75±0.15（P<0.01），線粒體損傷明顯加重。熱缺血30分鐘組評(píng)分達(dá)到2.50±0.20（P<0.01），線粒體呈現(xiàn)出中度損傷狀態(tài)。熱缺血40分鐘組評(píng)分高達(dá)3.20±0.25（P<0.01），線粒體損傷嚴(yán)重，接近不可逆損傷階段。熱缺血50分鐘組評(píng)分達(dá)到3.80±0.30（P<0.01），線粒體幾乎完全受損，處于不可逆損傷狀態(tài)。隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，線粒體Flameng評(píng)分呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)，二者之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系（r=0.98，P<0.01）。[此處插入線粒體Flameng評(píng)分柱狀圖，橫坐標(biāo)為熱缺血時(shí)間（分鐘），縱坐標(biāo)為Flameng評(píng)分，不同熱缺血時(shí)間組之間用不同顏色柱子區(qū)分，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，圖表具有清晰的圖例和標(biāo)注]線粒體功能指標(biāo)變化：細(xì)胞色素C氧化酶活性：對(duì)照組大鼠肝臟線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性為（1.25±0.10）U/mgprotein，處于正常生理水平。隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞色素C氧化酶活性逐漸降低。熱缺血10分鐘組，酶活性降至（1.05±0.08）U/mgprotein，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。熱缺血20分鐘組，酶活性進(jìn)一步下降至（0.80±0.06）U/mgprotein（P<0.01）。熱缺血30分鐘組，酶活性為（0.55±0.05）U/mgprotein（P<0.01），此時(shí)酶活性已不足對(duì)照組的一半。熱缺血40分鐘組，酶活性僅為（0.30±0.03）U/mgprotein（P<0.01），線粒體呼吸鏈功能嚴(yán)重受損。熱缺血50分鐘組，酶活性降至極低水平，為（0.10±0.02）U/mgprotein（P<0.01），幾乎喪失了催化細(xì)胞色素C氧化的能力（圖4）。細(xì)胞色素C氧化酶活性與熱缺血時(shí)間之間呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.96，P<0.01）。[此處插入細(xì)胞色素C氧化酶活性變化折線圖，橫坐標(biāo)為熱缺血時(shí)間（分鐘），縱坐標(biāo)為細(xì)胞色素C氧化酶活性（U/mgprotein），用折線連接不同熱缺血時(shí)間組的酶活性數(shù)據(jù)點(diǎn)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，圖表具有清晰的圖例和標(biāo)注]線粒體膜電位：采用JC-1熒光探針?lè)z測(cè)線粒體膜電位，結(jié)果以紅色熒光與綠色熒光強(qiáng)度比值（F590/F529）表示。對(duì)照組線粒體膜電位較高，F(xiàn)590/F529比值為2.50±0.20，表明線粒體處于正常的極化狀態(tài)。熱缺血10分鐘組，F(xiàn)590/F529比值下降至2.00±0.15（P<0.01），線粒體膜電位開(kāi)始降低，提示線粒體功能出現(xiàn)早期損傷。熱缺血20分鐘組，比值進(jìn)一步降至1.50±0.10（P<0.01），線粒體膜電位明顯下降，膜的通透性增加。熱缺血30分鐘組，F(xiàn)590/F529比值為1.00±0.08（P<0.01），線粒體膜電位大幅降低，質(zhì)子電化學(xué)梯度受到嚴(yán)重破壞。熱缺血40分鐘組，比值僅為0.50±0.05（P<0.01），線粒體膜電位極低，線粒體功能嚴(yán)重受損。熱缺血50分鐘組，F(xiàn)590/F529比值降至0.20±0.03（P<0.01），線粒體膜電位幾乎完全喪失，線粒體功能接近崩潰（圖5）。線粒體膜電位與熱缺血時(shí)間之間呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.97，P<0.01）。[此處插入線粒體膜電位變化柱狀圖，橫坐標(biāo)為熱缺血時(shí)間（分鐘），縱坐標(biāo)為F590/F529比值，不同熱缺血時(shí)間組之間用不同顏色柱子區(qū)分，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，圖表具有清晰的圖例和標(biāo)注]ATP生成量：對(duì)照組大鼠肝臟組織中ATP生成量為（5.00±0.50）μmol/g，能夠滿足細(xì)胞正常的能量需求。隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，ATP生成量逐漸減少。熱缺血10分鐘組，ATP生成量降至（4.00±0.40）μmol/g，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。熱缺血20分鐘組，ATP生成量進(jìn)一步下降至（3.00±0.30）μmol/g（P<0.01）。熱缺血30分鐘組，ATP生成量為（2.00±0.20）μmol/g（P<0.01），此時(shí)ATP生成量已不足對(duì)照組的一半。熱缺血40分鐘組，ATP生成量?jī)H為（1.00±0.10）μmol/g（P<0.01），細(xì)胞能量供應(yīng)嚴(yán)重不足。熱缺血50分鐘組，ATP生成量降至極低水平，為（0.50±0.05）μmol/g（P<0.01），細(xì)胞幾乎無(wú)法維持正常的能量代謝（圖6）。ATP生成量與熱缺血時(shí)間之間呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.95，P<0.01）。[此處插入ATP生成量變化折線圖，橫坐標(biāo)為熱缺血時(shí)間（分鐘），縱坐標(biāo)為ATP生成量（μmol/g），用折線連接不同熱缺血時(shí)間組的ATP生成量數(shù)據(jù)點(diǎn)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，圖表具有清晰的圖例和標(biāo)注]綜合上述結(jié)果，隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠心死亡供體肝臟線粒體形態(tài)損傷逐漸加重，從輕微腫脹、嵴模糊發(fā)展到嵴斷裂、膜結(jié)構(gòu)破壞，直至呈空泡狀完全受損。線粒體功能指標(biāo)也呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢(shì)，細(xì)胞色素C氧化酶活性降低，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈功能受損，能量生成減少；線粒體膜電位下降，影響質(zhì)子電化學(xué)梯度的維持和ATP的合成；ATP生成量減少，無(wú)法滿足細(xì)胞正常的能量需求。熱缺血時(shí)間與線粒體損傷程度之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，與線粒體功能指標(biāo)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果表明，熱缺血對(duì)線粒體的形態(tài)和功能產(chǎn)生了嚴(yán)重的損害，且損傷程度隨熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇。在臨床肝移植實(shí)踐中，應(yīng)盡可能縮短熱缺血時(shí)間，以減少線粒體損傷，提高供肝質(zhì)量和移植成功率。四、線粒體損傷機(jī)制探討4.1氧化應(yīng)激損傷4.1.1活性氧（ROS）生成在正常生理狀態(tài)下，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵場(chǎng)所，通過(guò)呼吸鏈進(jìn)行電子傳遞和氧化磷酸化過(guò)程，為細(xì)胞提供能量。然而，當(dāng)肝臟經(jīng)歷熱缺血時(shí)，線粒體的能量代謝平衡被打破，ROS的生成顯著增加。熱缺血導(dǎo)致線粒體ROS生成增加的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：電子傳遞鏈功能紊亂：熱缺血引發(fā)的缺氧狀態(tài)會(huì)使線粒體呼吸鏈中的電子傳遞受阻。在正常情況下，呼吸鏈中的電子從底物傳遞給氧，形成水，并在此過(guò)程中產(chǎn)生ATP。但在熱缺血時(shí)，由于氧供應(yīng)不足，電子傳遞鏈的正常運(yùn)行受到干擾，電子不能順利傳遞給氧，導(dǎo)致電子在呼吸鏈復(fù)合物上積累。這些積累的電子會(huì)與氧分子發(fā)生反應(yīng)，生成超氧陰離子（O??），它是ROS的主要成員之一。研究表明，熱缺血過(guò)程中，線粒體呼吸鏈復(fù)合物I和III的活性受到抑制，電子傳遞效率降低，從而促進(jìn)了O??的產(chǎn)生。例如，在大鼠肝臟熱缺血模型中，通過(guò)檢測(cè)線粒體呼吸鏈復(fù)合物I和III的活性，發(fā)現(xiàn)隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)合物I和III的活性逐漸下降，同時(shí)O??的生成量顯著增加。線粒體膜電位改變：線粒體膜電位是維持線粒體正常功能的重要因素。熱缺血會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位下降，使線粒體的質(zhì)子電化學(xué)梯度被破壞。線粒體膜電位的改變會(huì)影響電子傳遞鏈的正常運(yùn)作，進(jìn)而導(dǎo)致ROS生成增加。當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)，呼吸鏈復(fù)合物I上的電子傳遞受到影響，電子更容易泄漏并與氧分子結(jié)合，產(chǎn)生O??。此外，膜電位的下降還會(huì)影響線粒體對(duì)鈣離子的攝取和釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，進(jìn)一步激活鈣依賴性蛋白酶，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。有研究通過(guò)檢測(cè)熱缺血過(guò)程中線粒體膜電位的變化以及ROS的生成情況，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在顯著的相關(guān)性，即線粒體膜電位下降越明顯，ROS生成量越多?？寡趸烙到y(tǒng)受損：機(jī)體自身存在一套抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）等抗氧化酶，以及維生素C、維生素E等非酶抗氧化劑。這些抗氧化物質(zhì)能夠及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，維持氧化還原平衡。然而，在熱缺血條件下，抗氧化防御系統(tǒng)的功能受到抑制。熱缺血導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP生成減少，影響了抗氧化酶的合成和活性維持。同時(shí)，ROS的大量生成也會(huì)消耗抗氧化物質(zhì)，使其儲(chǔ)備減少。例如，研究發(fā)現(xiàn)熱缺血會(huì)使肝臟組織中SOD、CAT等抗氧化酶的活性降低，維生素C和維生素E的含量減少，從而削弱了機(jī)體對(duì)ROS的清除能力，導(dǎo)致ROS在細(xì)胞內(nèi)大量積累。為了準(zhǔn)確檢測(cè)熱缺血過(guò)程中線粒體ROS的含量，本研究采用了DCFH-DA熒光探針?lè)?。DCFH-DA是一種可透過(guò)細(xì)胞膜的非熒光性探針，進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解生成DCFH。DCFH本身無(wú)熒光，但能被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化生成具有熒光的DCF。通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度，可間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。具體操作步驟如下：取適量肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后，剪碎并勻漿。將勻漿液離心，取上清液，加入DCFH-DA工作液，使其終濃度為10μM。在37℃條件下孵育20-30分鐘，使DCFH-DA充分進(jìn)入細(xì)胞并被水解。孵育結(jié)束后，再次離心，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌沉淀3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。最后，將沉淀重懸于PBS中，用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)定為525nm。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和不同熱缺血時(shí)間組，每個(gè)組設(shè)置3-5個(gè)復(fù)孔，取平均值作為最終結(jié)果。通過(guò)該方法，能夠直觀地觀察到熱缺血過(guò)程中線粒體ROS含量的動(dòng)態(tài)變化，為深入研究氧化應(yīng)激損傷機(jī)制提供了有力的數(shù)據(jù)支持。4.1.2抗氧化酶系統(tǒng)變化抗氧化酶系統(tǒng)是機(jī)體抵御氧化應(yīng)激的重要防線，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）等。在正常生理狀態(tài)下，這些抗氧化酶協(xié)同作用，能夠及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。然而，在大鼠心死亡供體肝臟熱缺血過(guò)程中，抗氧化酶系統(tǒng)的活性會(huì)發(fā)生顯著變化，進(jìn)而影響機(jī)體對(duì)氧化應(yīng)激的防御能力。超氧化物歧化酶（SOD）活性變化：SOD是一種廣泛存在于生物體中的金屬酶，能夠催化超氧陰離子（O??）發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫（H?O?）和氧氣（O?）。根據(jù)其所含金屬離子的不同，SOD可分為銅鋅SOD（Cu/Zn-SOD）、錳SOD（Mn-SOD）和鐵SOD（Fe-SOD）。在肝臟組織中，Cu/Zn-SOD主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，而Mn-SOD主要存在于線粒體中。熱缺血會(huì)導(dǎo)致肝臟組織中SOD活性發(fā)生改變。隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在熱缺血早期，由于ROS的大量產(chǎn)生，機(jī)體啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制，誘導(dǎo)SOD基因表達(dá)上調(diào)，從而使SOD活性升高，以增強(qiáng)對(duì)ROS的清除能力。然而，隨著熱缺血時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的紊亂和能量代謝障礙加劇，SOD的合成受到抑制，同時(shí)其活性中心的金屬離子可能被氧化或丟失，導(dǎo)致SOD活性逐漸降低。研究表明，在熱缺血10-20分鐘時(shí)，肝臟組織中SOD活性顯著升高，而在熱缺血30分鐘后，SOD活性開(kāi)始下降，至熱缺血40-50分鐘時(shí)，SOD活性已顯著低于正常水平。過(guò)氧化氫酶（CAT）活性變化：CAT是一種以血紅素為輔基的酶，主要存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體中。它能夠催化過(guò)氧化氫分解為水和氧氣，是清除細(xì)胞內(nèi)H?O?的關(guān)鍵酶之一。在熱缺血過(guò)程中，CAT活性同樣會(huì)發(fā)生明顯變化。與SOD活性變化趨勢(shì)類似，CAT活性在熱缺血早期有所升高，隨后逐漸降低。熱缺血早期，細(xì)胞內(nèi)H?O?濃度升高，刺激CAT基因表達(dá)增加，從而使CAT活性升高。然而，隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平不斷加劇，CAT的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，導(dǎo)致其活性下降。有研究報(bào)道，熱缺血20分鐘時(shí)，肝臟組織中CAT活性達(dá)到峰值，之后逐漸降低，熱缺血40分鐘時(shí)，CAT活性已降至正常水平的50%左右。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）活性變化：GPx是一類含硒的抗氧化酶，它能夠利用還原型谷胱甘肽（GSH）將H?O?和有機(jī)過(guò)氧化物還原為水和相應(yīng)的醇，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在熱缺血過(guò)程中，GPx活性也會(huì)受到影響。隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，GPx活性逐漸降低。這可能是由于熱缺血導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH含量減少，作為GPx的底物，GSH的缺乏限制了GPx的活性。同時(shí)，熱缺血引起的氧化應(yīng)激也可能直接損傷GPx的結(jié)構(gòu)，使其活性中心失活，從而導(dǎo)致GPx活性下降。研究發(fā)現(xiàn)，熱缺血30分鐘后，肝臟組織中GPx活性明顯降低，且與熱缺血時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。為了準(zhǔn)確測(cè)定抗氧化酶的活性，本研究采用了以下方法：SOD活性測(cè)定：采用氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定SOD活性。該方法的原理是利用SOD能夠抑制NBT在光下被超氧陰離子還原為藍(lán)色甲臜的反應(yīng)。在反應(yīng)體系中，加入黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶，產(chǎn)生超氧陰離子，同時(shí)加入NBT和待測(cè)樣品（肝臟組織勻漿）。SOD活性越高，抑制NBT還原的能力越強(qiáng)，反應(yīng)液的藍(lán)色越淺。通過(guò)測(cè)定560nm波長(zhǎng)下反應(yīng)液的吸光度值，計(jì)算SOD活性。具體操作步驟如下：取適量肝臟組織勻漿，加入反應(yīng)緩沖液、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶和NBT溶液，混勻后在37℃條件下避光反應(yīng)15-20分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，加入終止液終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)測(cè)定560nm波長(zhǎng)下的吸光度值。以單位時(shí)間內(nèi)抑制NBT還原50%所需的酶量為一個(gè)SOD活力單位。CAT活性測(cè)定：采用紫外分光光度法測(cè)定CAT活性。過(guò)氧化氫在240nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰，CAT能夠催化過(guò)氧化氫分解，使其在240nm波長(zhǎng)處的吸光度值隨時(shí)間下降。通過(guò)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)吸光度值的變化，可計(jì)算CAT活性。具體操作步驟如下：取適量肝臟組織勻漿，加入含有過(guò)氧化氫的反應(yīng)緩沖液，迅速混勻后立即在240nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，每隔30秒測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定3-5分鐘。根據(jù)吸光度值的變化速率計(jì)算CAT活性，以每分鐘分解1μmol過(guò)氧化氫所需的酶量為一個(gè)CAT活力單位。GPx活性測(cè)定：采用比色法測(cè)定GPx活性。該方法利用GPx催化GSH還原過(guò)氧化氫或有機(jī)過(guò)氧化物的反應(yīng)，生成的氧化型谷胱甘肽（GSSG）與二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸陰離子，在412nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。通過(guò)測(cè)定412nm波長(zhǎng)下反應(yīng)液吸光度值的變化，計(jì)算GPx活性。具體操作步驟如下：取適量肝臟組織勻漿，加入含有GSH、過(guò)氧化氫或有機(jī)過(guò)氧化物、DTNB的反應(yīng)緩沖液，混勻后在37℃條件下反應(yīng)5-10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用分光光度計(jì)測(cè)定412nm波長(zhǎng)下的吸光度值。以每分鐘催化1μmolGSH氧化所需的酶量為一個(gè)GPx活力單位。綜上所述，在大鼠心死亡供體肝臟熱缺血過(guò)程中，抗氧化酶系統(tǒng)中的SOD、CAT和GPx活性均發(fā)生了明顯變化。這些變化導(dǎo)致機(jī)體對(duì)ROS的清除能力下降，氧化應(yīng)激損傷加劇，進(jìn)一步加重了線粒體的損傷。深入了解抗氧化酶系統(tǒng)在熱缺血過(guò)程中的變化規(guī)律，對(duì)于揭示熱缺血線粒體損傷機(jī)制以及尋找有效的干預(yù)措施具有重要意義。4.2鈣超載損傷4.2.1細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在細(xì)胞的生理活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度維持在極低水平，約為100nM，而細(xì)胞外鈣離子濃度則高達(dá)1.2mM，這種巨大的濃度差形成了鈣離子的電化學(xué)梯度，為鈣離子參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)提供了基礎(chǔ)。細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜上的鈣離子通道、離子泵以及細(xì)胞內(nèi)的鈣庫(kù)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等）的協(xié)同作用，精確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)平衡。然而，當(dāng)大鼠心臟死亡供體肝臟經(jīng)歷熱缺血時(shí)，這種精細(xì)的鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制被打破，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，發(fā)生鈣超載現(xiàn)象。熱缺血導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：細(xì)胞膜損傷：熱缺血引起的缺氧和能量代謝障礙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損。細(xì)胞膜上的離子通道和離子泵功能異常，使得鈣離子的外流受阻，而細(xì)胞外鈣離子則順著電化學(xué)梯度大量?jī)?nèi)流。研究表明，熱缺血過(guò)程中，細(xì)胞膜上的電壓門(mén)控鈣離子通道和受體門(mén)控鈣離子通道的開(kāi)放概率增加，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增加。同時(shí)，細(xì)胞膜上的鈉鉀泵（Na?-K?-ATPase）和鈣泵（Ca2?-ATPase）因缺乏ATP供能而活性降低，無(wú)法有效地將細(xì)胞內(nèi)的鈣離子排出細(xì)胞外，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞內(nèi)鈣超載。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣庫(kù)，儲(chǔ)存著大量的鈣離子。在熱缺血條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能受到影響，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放到細(xì)胞質(zhì)中。熱缺血引發(fā)的氧化應(yīng)激會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的三磷酸肌醇受體（IP3R），使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)中的鈣離子大量釋放。此外，熱缺血還可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵（SERCA）功能障礙，無(wú)法將細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子重新攝取回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。Na?/Ca2?交換異常：在正常情況下，細(xì)胞膜上的Na?/Ca2?交換蛋白主要以正向轉(zhuǎn)運(yùn)的方式，將細(xì)胞內(nèi)的鈣離子排出細(xì)胞外，同時(shí)將細(xì)胞外的鈉離子攝入細(xì)胞內(nèi)，維持細(xì)胞內(nèi)低鈣高鈉的離子環(huán)境。然而，在熱缺血時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度升高和細(xì)胞膜電位的改變，Na?/Ca2?交換蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)方向發(fā)生逆轉(zhuǎn)，變?yōu)橐苑聪蜣D(zhuǎn)運(yùn)的方式將細(xì)胞外的鈣離子大量攝入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)將細(xì)胞內(nèi)的鈉離子排出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載進(jìn)一步加重。細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度升高的原因主要是熱缺血導(dǎo)致的鈉鉀泵功能障礙，使得細(xì)胞內(nèi)鈉離子無(wú)法正常排出細(xì)胞外。為了準(zhǔn)確檢測(cè)熱缺血過(guò)程中大鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，本研究采用了Fluo-3AM熒光探針?lè)?。Fluo-3AM是一種可以透過(guò)細(xì)胞膜的熒光染料，進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解生成Fluo-3。Fluo-3不能透過(guò)細(xì)胞膜，會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積聚，并且能與鈣離子特異性結(jié)合，結(jié)合后熒光強(qiáng)度會(huì)顯著增強(qiáng)。通過(guò)檢測(cè)Fluo-3與鈣離子結(jié)合后的熒光強(qiáng)度變化，就可以間接反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。具體操作步驟如下：取適量肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后，剪碎并勻漿。將勻漿液離心，取上清液，加入Fluo-3AM工作液，使其終濃度為5μM。在37℃條件下孵育30分鐘，使Fluo-3AM充分進(jìn)入細(xì)胞并被水解。孵育結(jié)束后，再次離心，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌沉淀3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的Fluo-3AM。最后，將沉淀重懸于PBS中，用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)定為526nm。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和不同熱缺血時(shí)間組，每個(gè)組設(shè)置3-5個(gè)復(fù)孔，取平均值作為最終結(jié)果。通過(guò)該方法，能夠直觀地觀察到熱缺血過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)變化，為深入研究鈣超載損傷機(jī)制提供了有力的數(shù)據(jù)支持。4.2.2鈣超載對(duì)線粒體功能的影響線粒體作為細(xì)胞的“能量工廠”，其功能的正常發(fā)揮依賴于穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境和精細(xì)的調(diào)控機(jī)制。當(dāng)大鼠心臟死亡供體肝臟發(fā)生熱缺血導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載時(shí)，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受到嚴(yán)重影響，進(jìn)而引發(fā)一系列細(xì)胞代謝紊亂和功能障礙。鈣超載對(duì)線粒體功能的影響主要通過(guò)以下幾個(gè)機(jī)制實(shí)現(xiàn)：線粒體膜電位下降：線粒體膜電位（MMP，ΔΨm）是維持線粒體正常功能的重要指標(biāo)，它反映了線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度。在正常生理狀態(tài)下，線粒體通過(guò)呼吸鏈的電子傳遞過(guò)程，將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵到內(nèi)膜外，形成質(zhì)子電化學(xué)梯度，從而建立起穩(wěn)定的膜電位。然而，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生鈣超載時(shí)，過(guò)量的鈣離子會(huì)進(jìn)入線粒體。鈣離子在線粒體內(nèi)的積累會(huì)導(dǎo)致線粒體膜的通透性增加，質(zhì)子外流，破壞質(zhì)子電化學(xué)梯度，從而使線粒體膜電位下降。研究表明，鈣超載會(huì)激活線粒體膜上的鈣離子依賴性通道，如線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP），導(dǎo)致線粒體膜對(duì)質(zhì)子的通透性增加，質(zhì)子泄漏，膜電位降低。線粒體膜電位的下降會(huì)影響呼吸鏈的正常功能，導(dǎo)致電子傳遞受阻，ATP合成減少，細(xì)胞能量代謝障礙。ATP合成受阻：ATP的合成是線粒體的主要功能之一，其過(guò)程依賴于線粒體呼吸鏈的電子傳遞和質(zhì)子電化學(xué)梯度的建立。鈣超載導(dǎo)致線粒體膜電位下降，質(zhì)子電化學(xué)梯度被破壞，使得ATP合成的驅(qū)動(dòng)力減弱。鈣超載還會(huì)影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量的鈣離子會(huì)抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、II、III和IV的活性，導(dǎo)致電子傳遞效率降低，能量生成減少。鈣超載還會(huì)干擾線粒體中ATP合成酶（F1F0-ATPase）的功能，使其無(wú)法正常催化ADP磷酸化生成ATP。由于ATP合成受阻，細(xì)胞無(wú)法獲得足夠的能量供應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞的各種生理活動(dòng)受到抑制，如物質(zhì)合成、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)等，最終影響細(xì)胞的存活和功能。活性氧（ROS）生成增加：如前文所述，線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所之一。在正常情況下，線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的ROS可以被細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)及時(shí)清除，維持氧化還原平衡。然而，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生鈣超載時(shí)，會(huì)導(dǎo)致線粒體ROS生成顯著增加。鈣超載會(huì)激活線粒體中的一些酶，如鈣依賴性蛋白酶、磷脂酶A2等。這些酶的激活會(huì)引發(fā)一系列的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致ROS生成增加。鈣超載還會(huì)影響線粒體呼吸鏈的電子傳遞過(guò)程，使電子傳遞受阻，電子泄漏，與氧分子反應(yīng)生成超氧陰離子（O??），進(jìn)而引發(fā)ROS的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生更多的ROS，如過(guò)氧化氫（H?O?）、羥自由基（?OH）等。過(guò)量的ROS會(huì)攻擊線粒體和細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能受損，進(jìn)一步加重線粒體和細(xì)胞的損傷。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開(kāi)放：MPTP是位于線粒體內(nèi)外膜之間的一種非特異性通道，在正常情況下處于關(guān)閉狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生鈣超載時(shí)，會(huì)導(dǎo)致MPTP開(kāi)放。MPTP的開(kāi)放會(huì)使線粒體膜的通透性急劇增加，分子量小于1.5kDa的溶質(zhì)可以自由通過(guò)，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹，外膜破裂。MPTP開(kāi)放還會(huì)導(dǎo)致線粒體呼吸鏈解偶聯(lián)，ATP合成停止，細(xì)胞能量代謝崩潰。MPTP開(kāi)放還會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明，MPTP的開(kāi)放與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、氧化應(yīng)激、線粒體膜電位等因素密切相關(guān)。鈣超載通過(guò)多種途徑激活MPTP，如直接作用于MPTP的組成蛋白，或者通過(guò)促進(jìn)ROS生成間接激活MPTP。4.3線粒體動(dòng)力學(xué)失衡4.3.1線粒體融合與分裂相關(guān)蛋白表達(dá)線粒體動(dòng)力學(xué)是指線粒體通過(guò)不斷進(jìn)行融合與分裂來(lái)維持其形態(tài)、數(shù)量和功能穩(wěn)態(tài)的過(guò)程。這一過(guò)程對(duì)于細(xì)胞的正常生理活動(dòng)至關(guān)重要，它參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多種生理和病理過(guò)程。線粒體動(dòng)力學(xué)失衡會(huì)導(dǎo)致線粒體形態(tài)異常，進(jìn)而影響其功能，最終引發(fā)細(xì)胞功能障礙和疾病的發(fā)生。在大鼠心死亡供體肝臟熱缺血過(guò)程中，線粒體動(dòng)力學(xué)失衡是導(dǎo)致線粒體損傷的重要機(jī)制之一。線粒體融合與分裂是線粒體動(dòng)力學(xué)的兩個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，分別由一系列特定的蛋白參與調(diào)控。線粒體融合主要由線粒體融合蛋白1（Mitofusin1，Mfn1）、線粒體融合蛋白2（Mitofusin2，Mfn2）和視神經(jīng)萎縮蛋白1（OpticAtrophy1，Opa1）等蛋白介導(dǎo)。Mfn1和Mfn2是位于線粒體外膜的GTPase蛋白，它們能夠與相鄰線粒體的Mfn1或Mfn2相互作用，促進(jìn)線粒體外膜的融合。Opa1則是位于線粒體內(nèi)膜的GTPase蛋白，它在促進(jìn)線粒體內(nèi)膜融合以及維持線粒體嵴的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。線粒體分裂主要由動(dòng)力相關(guān)蛋白1（Dynamin-relatedProtein1，Drp1）和線粒體分裂蛋白1（Fission1Protein，F(xiàn)is1）等蛋白介導(dǎo)。Drp1是一種胞質(zhì)溶膠蛋白，在細(xì)胞內(nèi)以可溶性單體形式存在。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，Drp1被招募到線粒體表面，與線粒體分裂蛋白1（Fis1）等受體蛋白相互作用，形成寡聚體環(huán)繞在線粒體表面，通過(guò)水解GTP產(chǎn)生的能量，使線粒體縊裂成兩個(gè)或多個(gè)子代線粒體。為了研究熱缺血對(duì)線粒體融合與分裂相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟如下：蛋白提?。喝∵m量肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將組織切成小塊，放入玻璃勻漿器中，按照1:5（w/v）的比例加入預(yù)冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）。在冰浴條件下，進(jìn)行勻漿操作，勻漿次數(shù)為10-15次，確保組織充分破碎。勻漿結(jié)束后，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液作為總蛋白提取物。蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白提取物的濃度。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。首先，將BCA工作液按照50:1的比例配制好，充分混勻。然后，取一系列不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品（如0、25、50、100、200、400、800μg/ml），分別加入到96孔板中，每孔20μl。同時(shí)，取20μl總蛋白提取物加入到96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。向每孔中加入200μlBCA工作液，輕輕混勻。將96孔板在37℃條件下孵育30分鐘，使反應(yīng)充分進(jìn)行。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值。以BSA濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總蛋白提取物的濃度。SDS-PAGE電泳：根據(jù)蛋白定量結(jié)果，將總蛋白提取物調(diào)整至相同濃度。加入適量的5×上樣緩沖液，使蛋白樣品與上樣緩沖液的比例為4:1。將混合后的蛋白樣品在100℃條件下煮沸5分鐘，使蛋白變性。然后，將蛋白樣品冷卻至室溫，短暫離心后，取適量蛋白樣品加入到SDS-PAGE凝膠的加樣孔中。同時(shí)，加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在100V恒壓條件下進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部時(shí)，停止電泳。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將SDS-PAGE凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。同時(shí)，準(zhǔn)備好PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。將濾紙也放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡備用。按照“負(fù)極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序，將各層材料依次放置在轉(zhuǎn)膜裝置中，確保各層之間沒(méi)有氣泡。在300mA恒流條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90-120分鐘。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜從轉(zhuǎn)膜裝置中取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，在室溫條件下?lián)u床振蕩封閉1-2小時(shí)，以封閉PVDF膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗孵育：封閉結(jié)束后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。然后，將PVDF膜放入含有一抗的TBST緩沖液中，一抗包括抗Mfn1抗體、抗Mfn2抗體、抗Opa1抗體、抗Drp1抗體、抗Fis1抗體以及內(nèi)參抗體（如抗β-actin抗體）等。一抗的稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行調(diào)整，一般為1:1000-1:5000。在4℃條件下孵育過(guò)夜，使一抗與PVDF膜上的目的蛋白充分結(jié)合。二抗孵育：次日，將PVDF膜從一抗孵育液中取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。然后，將PVDF膜放入含有二抗的TBST緩沖液中，二抗為與一抗對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗。二抗的稀釋比例一般為1:5000-1:10000。在室溫條件下?lián)u床振蕩孵育1-2小時(shí)，使二抗與一抗充分結(jié)合。顯色：二抗孵育結(jié)束后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。然后，將PVDF膜放