大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)梗死后心肌中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的調(diào)控及其機(jī)制的研究摘要本研究旨在探究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）對(duì)梗死后心肌中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的調(diào)控作用及其潛在機(jī)制。通過(guò)建立大鼠心肌梗死模型，采用細(xì)胞移植技術(shù)將rBMSCs注入梗死心肌區(qū)域，運(yùn)用免疫組織化學(xué)、Westernblot、RT-PCR等方法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，rBMSCs能夠顯著促進(jìn)梗死后心肌中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin等信號(hào)通路，改善心肌纖維化程度，促進(jìn)心肌修復(fù)。本研究為心肌梗死的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在治療策略。一、引言（一）研究背景心肌梗死是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的心血管疾病，其主要病理特征是心肌細(xì)胞的大量死亡和心肌纖維化。心肌梗死后，成纖維細(xì)胞被激活并發(fā)生轉(zhuǎn)型，在心肌纖維化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。過(guò)度的心肌纖維化會(huì)導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)和功能的異常，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。因此，尋找有效的干預(yù)措施來(lái)調(diào)控成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型，減輕心肌纖維化，成為心肌梗死治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是一類(lèi)具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能的成體干細(xì)胞。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，BMSCs在心肌梗死的治療中具有巨大的潛力。BMSCs可以通過(guò)旁分泌、細(xì)胞間通訊等多種方式調(diào)節(jié)微環(huán)境，促進(jìn)心肌修復(fù)。然而，BMSCs對(duì)梗死后心肌中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的調(diào)控作用及其機(jī)制尚未完全明確。（二）研究目的與意義本研究旨在明確rBMSCs對(duì)梗死后心肌中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的調(diào)控作用，并深入探討其潛在的分子機(jī)制。通過(guò)本研究，有望揭示rBMSCs治療心肌梗死的新機(jī)制，為心肌梗死的臨床治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞選用健康雄性SD大鼠（體重200-220g），購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心名稱(chēng)]。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）由本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)并鑒定。（二）主要試劑與儀器TGF-β1抗體、Smad2/3抗體、β-catenin抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體等抗體；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒等分子生物學(xué)試劑；Westernblot相關(guān)試劑；二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等儀器。（三）實(shí)驗(yàn)方法rBMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定：取SD大鼠股骨和脛骨，采用全骨髓貼壁法分離rBMSCs，在含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD44、CD90、CD34、CD45）鑒定rBMSCs。大鼠心肌梗死模型的建立：采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。在麻醉狀態(tài)下，開(kāi)胸暴露心臟，于左心耳下緣2-3mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，以心電圖ST段抬高和心肌顏色變蒼白作為心肌梗死成功的標(biāo)志。細(xì)胞移植：將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、心肌梗死模型組、rBMSCs移植組。rBMSCs移植組在心肌梗死后7天，將培養(yǎng)至第3代的rBMSCs（濃度為1×10?個(gè)/10μL）注射到梗死心肌邊緣區(qū)，每個(gè)部位注射10μL，共注射6個(gè)部位；假手術(shù)組僅進(jìn)行開(kāi)胸操作，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈；心肌梗死模型組不進(jìn)行細(xì)胞移植。樣本采集與處理：細(xì)胞移植后4周，處死大鼠，取梗死心肌組織。一部分組織用于制作石蠟切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色；另一部分組織用于提取蛋白質(zhì)和RNA，分別進(jìn)行Westernblot和RT-PCR檢測(cè)。免疫組織化學(xué)染色：檢測(cè)梗死心肌組織中α-SMA、Vimentin的表達(dá)，觀察成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型情況。Westernblot檢測(cè)：檢測(cè)TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白（TGF-β1、Smad2/3、β-catenin）的表達(dá)水平。RT-PCR檢測(cè)：檢測(cè)TGF-β1、α-SMA、Vimentin等基因的mRNA表達(dá)水平。（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果（一）rBMSCs的鑒定結(jié)果分離培養(yǎng)的rBMSCs呈長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)均一。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞高表達(dá)CD44（98.5%）和CD90（97.8%），低表達(dá)CD34（1.2%）和CD45（0.8%），符合rBMSCs的表面標(biāo)志物特征。（二）心肌梗死模型的鑒定術(shù)后大鼠心電圖顯示ST段明顯抬高，心肌梗死區(qū)域顏色蒼白，與周?chē)Ｐ募〗M織界限清晰，表明心肌梗死模型建立成功。（三）rBMSCs對(duì)梗死后心肌中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與心肌梗死模型組相比，rBMSCs移植組梗死心肌組織中α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P<0.05），Vimentin陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量也有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明rBMSCs能夠促進(jìn)梗死后心肌中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型。（四）rBMSCs對(duì)TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響Westernblot和RT-PCR結(jié)果顯示，rBMSCs移植組梗死心肌組織中TGF-β1、Smad2/3、β-catenin的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著高于心肌梗死模型組（P<0.05），表明rBMSCs可能通過(guò)激活TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)調(diào)控成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型。（五）rBMSCs對(duì)心肌纖維化的影響Masson染色結(jié)果顯示，與心肌梗死模型組相比，rBMSCs移植組心肌纖維化面積顯著減小（P<0.05），表明rBMSCs能夠改善心肌纖維化程度。四、討論（一）rBMSCs對(duì)梗死后心肌中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的調(diào)控作用本研究結(jié)果表明，rBMSCs能夠促進(jìn)梗死后心肌中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型。肌成纖維細(xì)胞具有收縮功能，在心肌梗死后的早期修復(fù)過(guò)程中，肌成纖維細(xì)胞的形成有助于維持梗死區(qū)域的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，防止心室壁破裂。然而，過(guò)度的肌成纖維細(xì)胞形成和持續(xù)存在會(huì)導(dǎo)致心肌纖維化的加重。本研究中，rBMSCs在促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的同時(shí)，還能改善心肌纖維化程度，可能是由于rBMSCs通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路，使肌成纖維細(xì)胞的形成和消退達(dá)到一個(gè)平衡狀態(tài)，從而有利于心肌的修復(fù)。（二）rBMSCs調(diào)控成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的潛在機(jī)制TGF-β/Smad信號(hào)通路：TGF-β1是一種重要的細(xì)胞因子，在心肌纖維化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TGF-β1通過(guò)與受體結(jié)合，激活Smad2/3蛋白，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，rBMSCs移植后能夠顯著上調(diào)TGF-β1、Smad2/3的表達(dá)水平，提示rBMSCs可能通過(guò)激活TGF-β/Smad信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型。同時(shí)，TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活也可能參與了rBMSCs對(duì)心肌纖維化的調(diào)節(jié)作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路：Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和遷移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。β-catenin是該信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，其穩(wěn)定性和活性受到多種因素的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，rBMSCs移植后β-catenin的表達(dá)水平顯著升高，表明rBMSCs可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)調(diào)控成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)型。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可能與rBMSCs促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化以及改善心肌纖維化有關(guān)。（三）本研究的局限性與展望本研究?jī)H在大鼠體內(nèi)進(jìn)行了初步探索，對(duì)于rBMSCs調(diào)控成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)型的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。此外，rBMSCs的來(lái)源、移植時(shí)間、移植劑量等因素對(duì)治療效果的影響也需要進(jìn)一步優(yōu)化。未來(lái)的研究可以結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)和更先進(jìn)的技術(shù)手段，深入探討rBMSCs在心肌梗死治療中的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù)。五、結(jié)論本研究證實(shí)了rBMSCs能夠顯著促進(jìn)梗死后心肌中成纖維