大鼠高位脊髓損傷慢性期腹主動脈內(nèi)、外膜可塑性及機制探究一、引言1.1研究背景與意義脊髓損傷（SpinalCordInjury，SCI）是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，給患者及其家庭帶來沉重負擔。其中，高位脊髓損傷（HighSpinalCordInjury）指的是T6及以上平面的損傷，這類患者在進入慢性期后，常面臨多種嚴重的并發(fā)癥，體位性低血壓（OrthostaticHypotension，OH）和自主神經(jīng)反射異常（AutonomicDysreflexia，AD）便是其中較為突出的兩種。體位性低血壓表現(xiàn)為患者從臥位轉(zhuǎn)變?yōu)橹绷⑽粫r，血壓急劇下降，導致頭暈、眼花、甚至暈厥等癥狀，嚴重影響患者的日常生活活動能力。而自主神經(jīng)反射異常則更為兇險，當患者受到膀胱脹滿、腸道堵塞等不良刺激時，會引發(fā)交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度興奮，導致血管廣泛收縮，出現(xiàn)惡性高血壓，收縮壓和舒張壓可分別飆升至250-300mmHg和200-220mmHg。如此高的血壓可引發(fā)肺水腫、顱內(nèi)出血等致命性并發(fā)癥，嚴重威脅患者的生命健康。據(jù)統(tǒng)計，T6以上平面的SCI患者發(fā)生AD的概率高達48％-90％，這使得AD成為SCI后最為嚴重的并發(fā)癥之一。而且，很多看似微不足道的刺激都能誘發(fā)AD，這無疑給高位SCI患者的康復治療設置了重重障礙。目前，對于AD的發(fā)病機制尚未完全明確。已知其外周機制涉及血管兒茶酚胺受體的表達和反應性增加，研究表明，SCI后發(fā)生AD的原因中，約有一半是由于血管反應性的增高。中樞機制則包括失去了壓力感受性反射以及延髓對脊神經(jīng)元的下行抑制。高位脊髓損傷后，患者長期處于低血壓狀態(tài)，這種血流動力學的改變是否會對血管的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響，進而參與AD的形成，這一問題備受關注。已有研究證實，高位脊髓損傷后大鼠損傷平面以下的腹主動脈平滑肌具有高反應性。而最新的研究發(fā)現(xiàn)，血管外膜脂肪組織具有舒張血管的作用。作為構(gòu)成完整血管的重要組成部分，外膜脂肪組織和內(nèi)膜在血管高反應性的形成過程中扮演著怎樣的角色，亟待深入探究。腹主動脈作為人體腹部的主要動脈，為腹部器官提供血液供應，其結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定對于維持正常的生理代謝至關重要。在高位脊髓損傷慢性期，腹主動脈內(nèi)、外膜可能會發(fā)生一系列的可塑性變化，這些變化涉及多種細胞類型，如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞等，同時可能與多種信號通路密切相關，如血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）、炎性介質(zhì)、凋亡等信號通路。深入研究這些可塑性變化，對于揭示高位脊髓損傷慢性期AD的發(fā)病機制具有重要意義。本研究通過制作大鼠高位（T4）脊髓損傷模型，旨在全面、系統(tǒng)地研究高位脊髓損傷慢性期損傷平面以下的腹主動脈結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化。從組織病理學和電鏡超微結(jié)構(gòu)層面，探究腹主動脈是否發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu)；從功能學角度，研究腹主動脈內(nèi)、外膜對去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）和乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）的反應性，以闡明內(nèi)膜和外膜脂肪組織的功能性重構(gòu)。期望通過本研究，能夠為深入理解高位脊髓損傷慢性期AD的發(fā)病機制提供新的視角和理論依據(jù)，為臨床治療和預防AD提供新的思路和方法，從而改善高位脊髓損傷患者的預后，提高其生活質(zhì)量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在脊髓損傷研究領域，高位脊髓損傷因其嚴重性和復雜性，一直是國內(nèi)外學者關注的焦點。對于高位脊髓損傷慢性期腹主動脈內(nèi)、外膜可塑性的研究，也取得了一定的進展。國外方面，學者們在血管重塑機制和細胞生物學層面進行了深入探索。在血管重塑機制方面，有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后血管兒茶酚胺受體的表達和反應性增加，這在高位脊髓損傷慢性期腹主動脈的變化中可能起到關鍵作用。部分研究表明，壓力感受性反射的消失以及延髓對脊神經(jīng)元下行抑制的喪失，會導致心血管功能紊亂，進而引發(fā)腹主動脈的結(jié)構(gòu)和功能改變。在細胞生物學層面，有研究關注到主動脈平滑肌細胞在SCI慢性期可能發(fā)生去分化現(xiàn)象，表現(xiàn)為細胞形態(tài)不規(guī)則、蛋白質(zhì)分布異常和血管收縮能力下降等。還有研究聚焦于血管內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)其在SCI慢性期可能會發(fā)生內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT），這種轉(zhuǎn)化會增加主動脈內(nèi)皮細胞連接重組、基底膜厚度和收縮素受體表達，并降低內(nèi)皮性一氧化氮合酶（eNOS）表達，最終導致主動脈彈性降低。國內(nèi)研究同樣成果頗豐。在病理生理學研究方面，大量實驗證實了高位脊髓損傷后大鼠損傷平面以下的腹主動脈平滑肌具有高反應性。有研究通過建立大鼠高位（T4）脊髓損傷模型，運用組織病理學和電鏡超微結(jié)構(gòu)檢查，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2周大鼠腹主動脈內(nèi)皮細胞部分脫落，術(shù)后8周內(nèi)彈力膜破壞、出現(xiàn)分層，并有增殖的平滑肌侵入，表明腹主動脈內(nèi)膜發(fā)生了重構(gòu)。在功能學研究上，有研究探討了腹主動脈內(nèi)、外膜對去甲腎上腺素（NE）和乙酰膽堿（ACh）的反應性，試圖闡明內(nèi)膜和外膜脂肪組織的功能性重構(gòu)，為揭示高位脊髓慢性期自主神經(jīng)反射異常的原因提供了新的思路。盡管國內(nèi)外在該領域已取得一定成果，但仍存在諸多不足與空白。在研究的系統(tǒng)性方面，目前的研究多集中于腹主動脈某一結(jié)構(gòu)或功能的單一變化，缺乏對腹主動脈內(nèi)、外膜從結(jié)構(gòu)到功能，以及多種細胞類型和信號通路相互作用的全面、系統(tǒng)研究。在分子機制研究上，雖然已知一些細胞變化和信號通路參與其中，但具體的分子調(diào)控機制尚未完全明確，如炎性介質(zhì)激活主動脈成纖維細胞的詳細信號轉(zhuǎn)導過程，以及凋亡信號通路在腹主動脈可塑性變化中的精確作用等。在研究的時間跨度上，對于高位脊髓損傷慢性期不同時間節(jié)點的動態(tài)變化研究還不夠深入，難以全面了解腹主動脈可塑性變化的發(fā)展過程和規(guī)律。此外，目前的研究主要集中在動物實驗，如何將這些研究成果轉(zhuǎn)化應用到臨床治療中，為高位脊髓損傷患者提供有效的治療方案，也是亟待解決的問題。1.3研究目的與方法本研究的核心目的在于全面、深入地探究大鼠高位脊髓損傷慢性期損傷平面以下腹主動脈內(nèi)、外膜的可塑性變化及其潛在機制，為揭示高位脊髓損傷慢性期自主神經(jīng)反射異常（AD）的發(fā)病機制提供堅實的理論依據(jù)。為達成上述研究目的，本研究采用了一系列科學嚴謹?shù)膶嶒灧椒?。首先，選取健康雄性SD大鼠作為實驗對象，將其隨機分為脊髓損傷組（SCT組）和對照組（SHAM組）。對于SCT組，通過精細的手術(shù)操作橫切T4脊髓，以此模擬高位脊髓損傷的病理狀態(tài)；而SHAM組則僅進行脊髓暴露，不實施橫切操作，作為對照，以排除手術(shù)創(chuàng)傷等非實驗因素對結(jié)果的干擾。在術(shù)后的不同時間節(jié)點，即2周和8周，分別對兩組大鼠開展實驗研究。針對腹主動脈結(jié)構(gòu)可塑性變化的研究，在相應時間點取大鼠腹主動脈（腎動脈以下和髂動脈以上的部分），進行蘇木精-伊紅（HE）染色和維多利亞藍-苦味酸（VB-G）染色。通過這些染色方法，能夠清晰地顯示腹主動脈的組織結(jié)構(gòu)，隨后在光鏡下仔細觀察腹主動脈組織病理學改變，包括細胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)層次等方面的變化。同時，獲取SCI組和SHAM組大鼠2周和8周時的腹主動脈（腎動脈以下和髂動脈之間），將每根動脈制作成2-3mm長的四種不同的血管環(huán)，即完整血管環(huán)、只去內(nèi)皮的血管環(huán)、只去外膜的血管環(huán)、內(nèi)膜和外膜均去除的血管環(huán)。利用透射電鏡對這些血管環(huán)進行觀察，從超微結(jié)構(gòu)層面深入探究腹主動脈的變化，如細胞器的形態(tài)、細胞間連接等微觀結(jié)構(gòu)的改變。在研究腹主動脈內(nèi)、外膜功能可塑性變化時，采用離體血管張力測定技術(shù)。將制作好的不同血管環(huán)置于離體器官浴槽系統(tǒng)中，通過調(diào)節(jié)浴槽內(nèi)的生理溶液成分和溫度等條件，使其模擬體內(nèi)生理環(huán)境。然后，向浴槽中依次加入不同濃度的去甲腎上腺素（NE）和乙酰膽堿（ACh），精確測量血管環(huán)在藥物作用下的張力變化。NE作為一種血管收縮劑，可刺激血管平滑肌收縮；ACh則是一種血管舒張劑，能促使血管舒張。通過觀察不同血管環(huán)對NE和ACh的反應性，即血管張力的變化程度和速度，來闡明內(nèi)膜和外膜脂肪組織的功能性重構(gòu)，進而深入探討高位脊髓慢性期發(fā)生自主神經(jīng)發(fā)射不良的原因。二、相關理論基礎2.1高位脊髓損傷概述2.1.1高位脊髓損傷定義與分類高位脊髓損傷，在醫(yī)學領域中有著明確的定義范疇，通常是指發(fā)生在T6及以上平面的脊髓損傷。這一部位的脊髓承擔著極為關鍵的神經(jīng)傳導功能，其損傷會導致機體出現(xiàn)一系列嚴重且復雜的病理生理改變，進而對患者的身體功能和生活質(zhì)量產(chǎn)生毀滅性的影響。從損傷程度的角度進行分類，高位脊髓損傷主要包括完全性脊髓損傷和不完全性脊髓損傷。完全性脊髓損傷是一種極其嚴重的損傷類型，此時脊髓的解剖結(jié)構(gòu)雖然可能保持連續(xù)，但內(nèi)部的神經(jīng)傳導功能卻完全喪失?；颊咴谂R床上的典型表現(xiàn)為損傷平面以下的肢體感覺和運動功能完全消失，肌肉力量嚴重下降，呈現(xiàn)出完全性癱瘓的狀態(tài)。不僅如此，患者的自主神經(jīng)功能也會受到嚴重影響，出現(xiàn)大小便失禁、體溫調(diào)節(jié)障礙等一系列自主神經(jīng)功能紊亂的癥狀。這些癥狀不僅給患者的日常生活帶來極大的不便，還會引發(fā)多種并發(fā)癥，如壓瘡、泌尿系統(tǒng)感染、肺部感染等，嚴重威脅患者的生命健康。不完全性脊髓損傷相對而言損傷程度較輕，但同樣不容小覷。在這種情況下，脊髓的解剖連續(xù)性依然存在，不過神經(jīng)傳導功能只是部分喪失?；颊叩呐R床表現(xiàn)具有多樣性，損傷平面以下的肢體可能會保留一定程度的感覺和運動功能，但也可能存在感覺異常，如麻木、刺痛等，以及運動功能障礙，表現(xiàn)為肌肉力量減弱、肢體活動不協(xié)調(diào)等。同時，患者也可能出現(xiàn)不同程度的自主神經(jīng)功能障礙，只是其嚴重程度相較于完全性脊髓損傷可能會有所減輕。然而，即使是不完全性脊髓損傷，也會對患者的生活和工作造成較大的影響，需要患者和醫(yī)護人員共同努力，積極進行康復治療，以盡可能地恢復神經(jīng)功能。按照損傷的原因來劃分，高位脊髓損傷又可分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類。創(chuàng)傷性高位脊髓損傷多由一些突發(fā)的、強烈的外力作用引起，如交通事故中的劇烈撞擊、高處墜落時身體受到的巨大沖擊力、暴力打擊導致的脊柱骨折脫位等。這些強大的外力直接作用于脊髓，導致脊髓組織受到挫傷、斷裂或壓迫，從而引發(fā)高位脊髓損傷。非創(chuàng)傷性高位脊髓損傷則是由多種非外力因素導致的，其中較為常見的原因包括脊髓血管疾病，如脊髓血管破裂出血、血栓形成等，這些血管病變會影響脊髓的血液供應，導致脊髓組織缺血、缺氧，進而引發(fā)損傷；脊髓炎也是常見原因之一，各種病原體感染引發(fā)的脊髓炎癥，會導致脊髓組織的炎性損傷，破壞神經(jīng)細胞和神經(jīng)纖維的正常結(jié)構(gòu)和功能；此外，腫瘤壓迫也是一個重要因素，當脊髓周圍的腫瘤逐漸生長，對脊髓產(chǎn)生壓迫時，就會導致脊髓損傷。非創(chuàng)傷性高位脊髓損傷的發(fā)病過程相對較為隱匿，早期癥狀可能不明顯，容易被患者忽視，導致病情延誤，因此需要提高對這類損傷的認識和警惕。2.1.2高位脊髓損傷的病理生理過程高位脊髓損傷后的病理生理過程是一個復雜且動態(tài)變化的過程，通?？煞譃榧毙云诤吐云?，每個階段都有著獨特的病理生理改變。在急性期，也就是損傷后的數(shù)小時到數(shù)天內(nèi)，機體首先會發(fā)生原發(fā)性損傷。這是由于外界的直接暴力作用于脊髓，導致脊髓組織受到機械性破壞，如脊髓的挫傷、裂傷、斷裂等。原發(fā)性損傷會直接造成神經(jīng)細胞和神經(jīng)纖維的損傷，導致神經(jīng)傳導功能的中斷。同時，損傷部位還會出現(xiàn)出血現(xiàn)象，血液會在脊髓組織內(nèi)積聚，形成血腫，進一步壓迫周圍的神經(jīng)組織，加重損傷程度。此外，脊髓組織還會出現(xiàn)水腫，這是由于損傷導致血管通透性增加，大量液體滲出到組織間隙中引起的。水腫會使脊髓組織的壓力升高，影響血液循環(huán)和神經(jīng)功能的恢復。在這一時期，患者往往會出現(xiàn)急性神經(jīng)功能障礙，如損傷平面以下的肢體突然癱瘓、感覺喪失等。隨著時間的推移，急性期過后，機體進入亞急性期，這一階段通常持續(xù)數(shù)天到數(shù)周。在亞急性期，繼發(fā)性損傷逐漸占據(jù)主導地位。炎癥反應在這一時期被激活，大量的炎性細胞如巨噬細胞、中性粒細胞等會聚集到損傷部位。這些炎性細胞會釋放多種炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。這些炎性介質(zhì)會進一步損傷神經(jīng)細胞和神經(jīng)纖維，同時還會導致血管內(nèi)皮細胞受損，引起微循環(huán)障礙，使得脊髓組織的缺血、缺氧情況更加嚴重。此外，氧化應激反應也會加劇，產(chǎn)生大量的氧自由基，這些自由基具有很強的氧化性，會攻擊細胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導致細胞損傷和死亡。在亞急性期，患者的神經(jīng)功能障礙可能會進一步加重，同時還可能出現(xiàn)一些并發(fā)癥，如感染、電解質(zhì)紊亂等。當損傷后的時間超過數(shù)周，機體便進入了慢性期。在慢性期，脊髓損傷部位會發(fā)生一系列的修復和重塑過程。神經(jīng)膠質(zhì)細胞會大量增生，形成膠質(zhì)瘢痕。膠質(zhì)瘢痕雖然在一定程度上能夠起到保護損傷部位、防止損傷進一步擴大的作用，但它也會阻礙神經(jīng)纖維的再生和修復，導致神經(jīng)功能難以恢復。同時，損傷平面以下的脊髓神經(jīng)元會發(fā)生凋亡和壞死，數(shù)量逐漸減少。此外，由于長期的神經(jīng)功能障礙，患者的肌肉會出現(xiàn)廢用性萎縮，骨骼會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等也會出現(xiàn)一系列的功能障礙，如體位性低血壓、呼吸功能減退等。這些慢性期的病理生理改變會嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給患者的康復帶來極大的困難。2.2血管可塑性相關理論2.2.1血管可塑性的概念血管可塑性是指血管在生理或病理條件下，其結(jié)構(gòu)和功能能夠發(fā)生適應性改變的能力。這種可塑性是血管維持正常生理功能以及應對各種內(nèi)、外環(huán)境變化的重要機制。在正常生理狀態(tài)下，血管可塑性主要體現(xiàn)在對血流動力學變化的適應性調(diào)節(jié)上。當機體處于不同的生理活動狀態(tài)時，如運動、睡眠、進食等，血管會根據(jù)組織器官對血液供應的需求，通過改變自身的管徑、彈性和血流阻力等，來實現(xiàn)對血流量的精確調(diào)控。例如，在運動時，肌肉組織對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的需求大幅增加，此時供應肌肉的血管會擴張，管徑增大，血流阻力減小，從而使更多的血液能夠流向肌肉組織，滿足其代謝需求。而在睡眠狀態(tài)下，機體的代謝活動相對降低，血管則會適當收縮，減少不必要的血液供應，以維持機體的能量平衡。在病理條件下，血管可塑性的變化更為復雜。當機體受到各種致病因素的刺激，如高血壓、高血脂、糖尿病、炎癥等，血管會發(fā)生一系列的結(jié)構(gòu)和功能改變，以適應病理狀態(tài)下的內(nèi)環(huán)境變化。這些改變可能包括血管壁細胞的增殖、遷移和分化，細胞外基質(zhì)的合成與降解，以及血管活性物質(zhì)的釋放等。在高血壓患者中，長期的血壓升高會導致血管壁承受的壓力增大，為了適應這種高壓狀態(tài)，血管平滑肌細胞會發(fā)生增殖和肥大，使血管壁增厚，管腔狹窄，從而增加血管的阻力，維持血壓的穩(wěn)定。然而，這種適應性改變在一定程度上也會對血管的正常功能產(chǎn)生負面影響，如增加心血管疾病的發(fā)生風險。血管可塑性還與血管損傷后的修復過程密切相關。當血管受到損傷時，血管內(nèi)皮細胞會被激活，釋放多種生長因子和細胞因子，吸引血小板、單核細胞等聚集到損傷部位，形成血栓，同時刺激血管平滑肌細胞增殖和遷移，參與血管壁的修復和重構(gòu)。如果修復過程異常，可能會導致血管狹窄、閉塞等病理改變，影響組織器官的血液供應。2.2.2內(nèi)、外膜在血管可塑性中的作用腹主動脈作為人體腹部重要的動脈血管，其內(nèi)膜和外膜在血管可塑性中各自發(fā)揮著獨特而關鍵的作用，它們的結(jié)構(gòu)和功能變化與血管的整體可塑性密切相關。內(nèi)膜位于腹主動脈的最內(nèi)層，直接與血液接觸，主要由內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮下層和內(nèi)彈性膜組成。內(nèi)皮細胞是內(nèi)膜的主要細胞成分，它們緊密排列成單層，形成了一個光滑的內(nèi)表面，不僅能夠減少血液流動的阻力，還具有重要的內(nèi)分泌和旁分泌功能。內(nèi)皮細胞能夠合成和釋放多種血管活性物質(zhì)，如一氧化氮（NO）、前列環(huán)素（PGI2）、內(nèi)皮素-1（ET-1）等。其中，NO和PGI2具有強大的血管舒張作用，它們能夠通過激活平滑肌細胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶和腺苷酸環(huán)化酶，使細胞內(nèi)的環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）和環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平升高，從而導致平滑肌細胞舒張，血管擴張，增加血流量。而ET-1則是一種強效的血管收縮劑，它能夠與平滑肌細胞表面的受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號通路，導致平滑肌細胞收縮，血管收縮，減少血流量。正常情況下，內(nèi)皮細胞釋放的這些血管活性物質(zhì)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，共同維持著血管的正常張力和血流狀態(tài)。當血管受到損傷或處于病理狀態(tài)時，內(nèi)皮細胞的功能會發(fā)生紊亂，這種平衡被打破，從而導致血管可塑性的改變。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，內(nèi)皮細胞受到氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、炎癥因子等的刺激，會出現(xiàn)損傷和功能障礙，導致NO的合成和釋放減少，ET-1的釋放增加，從而使血管收縮增強，舒張減弱，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。內(nèi)皮下層是位于內(nèi)皮細胞和內(nèi)彈性膜之間的一層結(jié)締組織，主要由少量的平滑肌細胞、成纖維細胞和細胞外基質(zhì)組成。在血管可塑性變化中，內(nèi)皮下層的細胞和細胞外基質(zhì)會發(fā)生相應的改變。當血管受到損傷或受到某些生長因子的刺激時，內(nèi)皮下層的平滑肌細胞會發(fā)生增殖和遷移，向內(nèi)膜表面遷移，參與血管壁的修復和重構(gòu)。同時，內(nèi)皮下層的細胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性纖維、蛋白聚糖等，也會發(fā)生合成和降解的改變，以適應血管壁的結(jié)構(gòu)變化。在高血壓引起的血管重塑過程中，內(nèi)皮下層的平滑肌細胞增殖活躍，細胞外基質(zhì)合成增加，導致血管壁增厚，管腔狹窄。內(nèi)彈性膜是內(nèi)膜與中膜的分界，由彈性蛋白組成，具有良好的彈性和韌性。它能夠在心臟收縮和舒張時，隨著血管內(nèi)壓力的變化而發(fā)生相應的彈性變形，從而緩沖血管內(nèi)壓力的波動，維持血管的正常形態(tài)和功能。在血管可塑性變化中，內(nèi)彈性膜的結(jié)構(gòu)和功能也會受到影響。在一些病理情況下，如動脈粥樣硬化、高血壓等，內(nèi)彈性膜會發(fā)生損傷、斷裂和鈣化，導致其彈性降低，緩沖能力減弱，進而影響血管的正常功能。內(nèi)彈性膜的損傷還會促進中膜平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移，加速血管重塑的進程。外膜是腹主動脈的最外層，主要由結(jié)締組織、成纖維細胞、外膜脂肪組織、神經(jīng)纖維和血管組成。結(jié)締組織主要由膠原蛋白和彈性纖維構(gòu)成，為血管提供了結(jié)構(gòu)支持和一定的彈性。成纖維細胞是外膜的主要細胞成分之一，它們能夠合成和分泌細胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性纖維等，參與血管壁的修復和重構(gòu)。在血管受到損傷或處于病理狀態(tài)時，成纖維細胞會被激活，增殖活躍，合成更多的細胞外基質(zhì)，導致外膜增厚。外膜脂肪組織是近年來研究的熱點，它被發(fā)現(xiàn)具有重要的內(nèi)分泌和旁分泌功能。外膜脂肪組織能夠分泌多種脂肪因子，如脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素等。這些脂肪因子對血管的功能有著重要的調(diào)節(jié)作用。脂聯(lián)素具有抗炎、抗氧化和血管舒張作用，它能夠通過抑制炎癥因子的釋放，減少氧化應激損傷，促進NO的釋放，從而舒張血管，改善血管內(nèi)皮功能。瘦素則具有促進血管平滑肌細胞增殖和遷移的作用，它能夠通過激活細胞內(nèi)的信號通路，促進平滑肌細胞的增殖和遷移，參與血管重塑。抵抗素則具有促炎和致動脈粥樣硬化的作用，它能夠促進炎癥因子的釋放，增加血管內(nèi)皮細胞的損傷，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。外膜脂肪組織還能夠通過與血管壁細胞之間的旁分泌作用，調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張功能。神經(jīng)纖維和血管分布在外膜中，神經(jīng)纖維主要包括交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)，它們通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)，如去甲腎上腺素、乙酰膽堿等，調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張。血管則為外膜組織提供營養(yǎng)和氧氣供應。在血管可塑性變化中，神經(jīng)纖維和血管的功能也會發(fā)生相應的改變。在高血壓患者中，交感神經(jīng)活性增強，釋放的去甲腎上腺素增多，導致血管收縮增強，血壓升高。同時，血管的營養(yǎng)和氧氣供應也可能受到影響，進一步加重血管的損傷和重塑。三、實驗設計與方法3.1實驗動物與分組本實驗選用40只體重在200-250g的健康雄性SD大鼠，購自[具體動物供應商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證編號]。選擇雄性大鼠是因為其生理特征相對穩(wěn)定，可減少因性別差異導致的實驗誤差。實驗前，將大鼠置于溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周，給予充足的水和食物，保持12h光照、12h黑暗的晝夜節(jié)律。適應性飼養(yǎng)結(jié)束后，采用隨機數(shù)字表法將40只大鼠分為兩組，每組20只。其中一組為脊髓損傷組（SCT組），另一組為對照組（SHAM組）。分組的依據(jù)是為了嚴格對比脊髓損傷與未損傷狀態(tài)下大鼠腹主動脈內(nèi)、外膜的差異，從而準確探究高位脊髓損傷對腹主動脈的影響。SCT組大鼠將接受高位脊髓損傷手術(shù)，通過橫切T4脊髓來模擬高位脊髓損傷的病理狀態(tài)；而SHAM組大鼠僅進行脊髓暴露手術(shù)，不橫切脊髓，以此作為對照，排除手術(shù)創(chuàng)傷等非實驗因素對結(jié)果的干擾。在整個實驗過程中，對兩組大鼠均給予相同的飼養(yǎng)條件和護理，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。3.2大鼠高位脊髓損傷模型制備本實驗采用經(jīng)典的手術(shù)方法制備大鼠高位（T4）脊髓損傷模型。術(shù)前準備工作至關重要，首先將手術(shù)器械進行嚴格的高壓蒸汽滅菌處理，確保手術(shù)過程的無菌環(huán)境。同時，準備好麻醉藥物，選用1%戊巴比妥鈉溶液，按照50mg/kg的劑量進行腹腔注射，以實現(xiàn)對大鼠的有效麻醉。待大鼠進入麻醉狀態(tài)后，將其俯臥位固定于手術(shù)臺上，用剃毛刀仔細剃除大鼠背部T3-T5區(qū)域的毛發(fā)，然后使用碘伏對該區(qū)域進行消毒，消毒范圍需足夠廣泛，以防止手術(shù)過程中的感染。消毒完成后，在大鼠背部T4棘突處做一縱向切口，長度約為2-3cm。接著，使用手術(shù)剪刀和鑷子小心地分離椎旁肌肉，充分暴露T4椎板。在操作過程中，要注意避免損傷周圍的血管和神經(jīng)組織，確保手術(shù)的準確性和安全性。暴露T4椎板后，使用咬骨鉗小心地咬除T4椎板，充分暴露T4脊髓。此時，需特別注意操作的精細度，避免對脊髓造成不必要的損傷。然后，使用顯微外科剪刀在T4脊髓處進行橫切操作，確保脊髓被完全橫斷。橫切完成后，仔細檢查脊髓斷端，確認無殘留的神經(jīng)組織連接。為了避免術(shù)后感染，在手術(shù)部位涂抹適量的抗生素軟膏。之后，使用絲線逐層縫合肌肉和皮膚，關閉切口。對照組（SHAM組）大鼠同樣進行麻醉和手術(shù)暴露脊髓的操作，但不進行脊髓橫切。在暴露T4椎板后，僅對脊髓進行輕柔的觸碰，模擬手術(shù)操作過程，隨后按照相同的步驟縫合肌肉和皮膚。術(shù)后，將大鼠放置在溫暖、安靜的環(huán)境中蘇醒，并給予適當?shù)淖o理。密切觀察大鼠的生命體征，包括呼吸、心跳、體溫等，確保大鼠的生命安全。為了防止大鼠出現(xiàn)泌尿系統(tǒng)感染，每天需進行2-3次的人工膀胱擠壓排尿。同時，給予大鼠充足的食物和水分，以促進其身體恢復。在術(shù)后的恢復過程中，若發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)異常情況，如傷口感染、肢體腫脹等，需及時進行相應的處理。通過以上嚴謹、規(guī)范的手術(shù)步驟和術(shù)后護理，確保了大鼠高位脊髓損傷模型的一致性和可靠性，為后續(xù)的實驗研究奠定了堅實的基礎。3.3樣本采集與處理在脊髓損傷組（SCT組）大鼠脊髓橫斷術(shù)后2周和8周，以及對照組（SHAM組）相應時間點，進行腹主動脈樣本的采集。將大鼠用過量的1%戊巴比妥鈉溶液（100mg/kg）腹腔注射深度麻醉后，迅速打開腹腔，小心分離暴露腹主動脈。選取腎動脈以下和髂動脈以上的部分腹主動脈作為樣本采集部位，這一部位的腹主動脈能夠較好地反映高位脊髓損傷慢性期損傷平面以下的血管變化情況。使用銳利的眼科剪快速剪下長度約為1-2cm的腹主動脈樣本。采集后的腹主動脈樣本一部分用于蘇木精-伊紅（HE）染色和維多利亞藍-苦味酸（VB-G）染色。將樣本立即放入4%多聚甲醛溶液中固定24h，以保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定后的樣本依次經(jīng)過梯度酒精脫水，即70%酒精1h、80%酒精1h、95%酒精1h、無水酒精1h，每個梯度重復2次。脫水后的樣本用二甲苯透明2次，每次15min。隨后將樣本浸蠟3次，每次1h，最后進行石蠟包埋。包埋后的樣本用切片機切成厚度為4μm的切片。將切片依次進行脫蠟、水化處理，然后進行HE染色和VB-G染色。HE染色步驟為：蘇木精染液染色5min，水洗1min，1%鹽酸酒精分化3s，水洗返藍5min，伊紅染液染色3min，水洗1min。VB-G染色步驟為：維多利亞藍染液染色15min，水洗1min，苦味酸染液染色5min，無水酒精快速脫水2次，每次5s，二甲苯透明2次，每次5min。染色完成后，用中性樹膠封片，在光鏡下觀察腹主動脈的組織病理學改變，包括內(nèi)膜、中膜和外膜的結(jié)構(gòu)變化，細胞形態(tài)、排列情況，以及纖維組織的分布等。另一部分腹主動脈樣本用于透射電鏡觀察。將采集的腹主動脈樣本切成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，迅速放入2.5%戊二醛溶液中固定4h。固定后的樣本用0.1M磷酸緩沖液（PBS，pH7.4）沖洗3次，每次15min。然后用1%鋨酸溶液后固定2h，再用PBS沖洗3次，每次15min。樣本依次經(jīng)過梯度酒精脫水，即30%酒精15min、50%酒精15min、70%酒精15min、80%酒精15min、95%酒精15min、無水酒精15min，每個梯度重復2次。脫水后的樣本用丙酮置換2次，每次15min。最后將樣本用環(huán)氧樹脂包埋，聚合后用超薄切片機切成厚度為60-80nm的超薄切片。將超薄切片用醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，在透射電鏡下觀察腹主動脈的超微結(jié)構(gòu)變化，如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞等的細胞器形態(tài)、細胞間連接，以及細胞外基質(zhì)的改變等。3.4觀察指標與檢測方法3.4.1組織病理學觀察將經(jīng)過蘇木精-伊紅（HE）染色和維多利亞藍-苦味酸（VB-G）染色并封片后的腹主動脈切片置于光鏡下進行觀察。首先在低倍鏡（4×、10×）下全面觀察腹主動脈的整體結(jié)構(gòu)，包括內(nèi)膜、中膜和外膜的完整性和連續(xù)性。重點關注內(nèi)膜是否存在增厚、破損或脫落的情況，若內(nèi)膜增厚，需進一步觀察增厚的程度和范圍，判斷是否存在均勻性增厚或局部增厚。觀察中膜的厚度和結(jié)構(gòu)，中膜主要由平滑肌細胞和彈性纖維組成，注意平滑肌細胞的排列是否整齊，彈性纖維是否完整、有無斷裂或減少。對于外膜，觀察其結(jié)締組織是否增生，有無炎癥細胞浸潤，以及外膜脂肪組織的分布和形態(tài)。在高倍鏡（40×）下，更細致地觀察細胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的變化。對于內(nèi)皮細胞，觀察其形態(tài)是否規(guī)則，細胞核是否清晰，有無腫脹、變性或凋亡的跡象。平滑肌細胞呈梭形，觀察其細胞核的形態(tài)、大小和染色情況，以及細胞質(zhì)的嗜色性。若平滑肌細胞發(fā)生增殖，可觀察到細胞核增多、增大，細胞排列紊亂。同時，注意觀察內(nèi)皮下層和外膜中的成纖維細胞，成纖維細胞呈星形或梭形，觀察其數(shù)量是否增多，細胞質(zhì)中是否含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體，以判斷其合成功能是否活躍。此外，還需觀察細胞外基質(zhì)的變化，如膠原蛋白和彈性纖維的含量和分布。膠原蛋白在HE染色中呈粉紅色，彈性纖維在VB-G染色中呈藍綠色，通過觀察染色后的切片，可判斷其含量的增減和分布是否均勻。通過對這些組織病理學指標的詳細觀察，全面了解腹主動脈在高位脊髓損傷慢性期的結(jié)構(gòu)變化。3.4.2電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察將制備好的用于透射電鏡觀察的腹主動脈超薄切片，置于透射電鏡下進行觀察。首先觀察內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮細胞緊密排列形成血管的內(nèi)表面，正常情況下，內(nèi)皮細胞的細胞膜完整，細胞器豐富。在高倍鏡下，重點觀察線粒體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，線粒體呈橢圓形或桿狀，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴。若內(nèi)皮細胞受到損傷，線粒體可能會出現(xiàn)腫脹、嵴斷裂或消失等變化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面附著有核糖體，參與蛋白質(zhì)的合成和運輸，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則與脂質(zhì)代謝等有關。觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是否擴張、脫顆粒，以判斷其功能是否受損。此外，還需觀察內(nèi)皮細胞之間的連接結(jié)構(gòu)，如緊密連接和縫隙連接，正常情況下，這些連接結(jié)構(gòu)緊密，能夠維持血管的屏障功能。若連接結(jié)構(gòu)受損，可能會導致血管通透性增加。接著觀察平滑肌細胞，平滑肌細胞內(nèi)含有豐富的肌絲，肌絲分為粗肌絲和細肌絲，它們相互作用使平滑肌細胞產(chǎn)生收縮和舒張。在電鏡下，觀察肌絲的排列是否整齊，粗細肌絲的比例是否正常。線粒體同樣是平滑肌細胞中的重要細胞器，為細胞的收縮提供能量，觀察其形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，與內(nèi)皮細胞中線粒體的觀察類似。此外，平滑肌細胞中還有密斑和密體，它們是肌絲的附著點，觀察密斑和密體的形態(tài)和分布是否正常。若平滑肌細胞發(fā)生去分化，可能會出現(xiàn)肌絲減少、細胞器增多、密斑和密體消失等變化。對于成纖維細胞，成纖維細胞主要負責合成和分泌細胞外基質(zhì)，如膠原蛋白和彈性纖維。在電鏡下，觀察成纖維細胞的細胞核大小和形態(tài)，核仁是否明顯，細胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體的豐富程度。若成纖維細胞功能活躍，其細胞核較大，核仁明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體豐富，表明其正在大量合成蛋白質(zhì)。同時，觀察細胞外基質(zhì)的變化，如膠原蛋白纖維的粗細、排列和交聯(lián)情況，彈性纖維的形態(tài)和完整性。通過對這些超微結(jié)構(gòu)指標的觀察，深入了解腹主動脈在高位脊髓損傷慢性期細胞和細胞外基質(zhì)的微觀變化。3.4.3血管反應性檢測采用離體血管張力實驗檢測腹主動脈內(nèi)、外膜對去甲腎上腺素（NE）和乙酰膽堿（ACh）的反應性。將獲取的SCI組和SHAM組大鼠2周和8周時的腹主動脈（腎動脈以下和髂動脈之間），仔細制作成2-3mm長的四種不同的血管環(huán)，即完整血管環(huán)、只去內(nèi)皮的血管環(huán)、只去外膜的血管環(huán)、內(nèi)膜和外膜均去除的血管環(huán)。在制作血管環(huán)的過程中，要注意保持血管的完整性，避免過度牽拉和損傷血管組織。將制作好的血管環(huán)小心地置于盛有Krebs-Henseleit（K-H）液的離體器官浴槽系統(tǒng)中，K-H液的成分需精確配置，以模擬體內(nèi)生理環(huán)境，其主要成分包括（mmol/L）：NaCl118.3、KCl4.7、CaCl22.5、MgSO41.2、KH2PO41.2、NaHCO325.0、Glucose11.1。浴槽內(nèi)的溫度需嚴格控制在（37±0.5）℃，并持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體，以保證K-H液的充分氧合和pH值穩(wěn)定在7.35-7.45之間。待血管環(huán)在浴槽中穩(wěn)定平衡30-60min后，開始進行實驗。首先向浴槽中加入不同濃度的去甲腎上腺素（NE），其濃度梯度設置為10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L。每次加入NE后，需等待血管環(huán)的張力變化達到穩(wěn)定狀態(tài)，一般需要5-10min，然后使用張力換能器精確測量并記錄血管環(huán)的張力變化。NE作為一種血管收縮劑，可與血管平滑肌細胞表面的α受體結(jié)合，通過激活細胞內(nèi)的信號通路，導致平滑肌細胞收縮，從而使血管環(huán)的張力增加。觀察不同血管環(huán)對NE的反應性，即血管張力的變化程度和速度，比較完整血管環(huán)、只去內(nèi)皮的血管環(huán)、只去外膜的血管環(huán)、內(nèi)膜和外膜均去除的血管環(huán)之間的差異。在完成NE的實驗后，將浴槽中的K-H液更換為新鮮的K-H液，沖洗血管環(huán)3-5次，每次沖洗間隔5-10min，以確保血管環(huán)內(nèi)的NE被完全清除。然后向浴槽中加入不同濃度的乙酰膽堿（ACh），其濃度梯度設置為10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L。同樣，每次加入ACh后，等待血管環(huán)的張力變化達到穩(wěn)定狀態(tài)，再測量并記錄血管環(huán)的張力變化。ACh是一種血管舒張劑，它可作用于血管內(nèi)皮細胞表面的M受體，促使內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮（NO）等血管舒張因子，NO擴散到平滑肌細胞內(nèi)，激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細胞內(nèi)的環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平升高，導致平滑肌細胞舒張，血管環(huán)的張力降低。通過觀察不同血管環(huán)對ACh的反應性，進一步分析內(nèi)膜和外膜在血管舒張功能中的作用。在整個實驗過程中，要確保實驗條件的一致性，如每次加入藥物的速度、攪拌K-H液的程度等，以減少實驗誤差。同時，對實驗數(shù)據(jù)進行準確記錄和分析，可采用統(tǒng)計學方法比較不同組之間的差異，以揭示高位脊髓損傷慢性期腹主動脈內(nèi)、外膜對NE和ACh反應性的變化規(guī)律。四、實驗結(jié)果4.1腹主動脈結(jié)構(gòu)變化4.1.1組織病理學結(jié)果在光鏡下觀察蘇木精-伊紅（HE）染色和維多利亞藍-苦味酸（VB-G）染色后的切片，可清晰地看到脊髓損傷組（SCT組）和對照組（SHAM組）大鼠腹主動脈在2周和8周時呈現(xiàn)出不同的組織病理學特征。在2周時，SHAM組大鼠腹主動脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細胞排列緊密且規(guī)則，呈扁平狀，緊密貼合于內(nèi)皮下層，內(nèi)皮下層無明顯增厚或細胞浸潤現(xiàn)象。中膜平滑肌細胞排列整齊，呈束狀環(huán)繞血管腔，細胞形態(tài)正常，胞核呈長桿狀，位于細胞中央，平滑肌纖維之間可見清晰的彈性纖維，在VB-G染色中呈藍綠色，分布均勻。外膜結(jié)締組織疏松，成纖維細胞數(shù)量較少，形態(tài)規(guī)則，外膜脂肪組織分布均勻，脂肪細胞形態(tài)飽滿。與之相比，SCT組大鼠腹主動脈內(nèi)膜出現(xiàn)了一些細微的變化，部分內(nèi)皮細胞出現(xiàn)腫脹，細胞體積增大，細胞核染色加深，部分區(qū)域內(nèi)皮細胞排列略顯紊亂。中膜平滑肌細胞雖然排列仍較為整齊，但部分細胞的胞核形態(tài)有所改變，出現(xiàn)了輕度的固縮現(xiàn)象，平滑肌纖維的走行也有少許不規(guī)則。外膜結(jié)締組織稍有增生，成纖維細胞數(shù)量略有增加，形態(tài)無明顯異常，外膜脂肪組織的分布未見明顯改變。到了8周時，SHAM組大鼠腹主動脈各層結(jié)構(gòu)基本保持穩(wěn)定，與2周時相比無明顯變化。內(nèi)膜內(nèi)皮細胞依然排列緊密，內(nèi)皮下層無異常。中膜平滑肌細胞和彈性纖維的結(jié)構(gòu)和分布維持正常。外膜結(jié)締組織和脂肪組織也無明顯改變。然而，SCT組大鼠腹主動脈的變化更為顯著。內(nèi)膜出現(xiàn)了明顯的增厚，內(nèi)皮細胞損傷進一步加重，部分內(nèi)皮細胞脫落，導致內(nèi)皮下層暴露，內(nèi)皮下層可見少量炎性細胞浸潤。中膜平滑肌細胞排列紊亂，部分平滑肌細胞出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，表現(xiàn)為細胞數(shù)量增多，胞核增大、深染，平滑肌纖維排列雜亂無章，彈性纖維斷裂、減少，在VB-G染色中，藍綠色的彈性纖維分布稀疏且不連續(xù)。外膜結(jié)締組織明顯增生，成纖維細胞大量增殖，形態(tài)多樣，外膜脂肪組織的形態(tài)和分布也發(fā)生了改變，部分脂肪細胞萎縮，脂肪組織的邊界變得模糊。通過對這些組織病理學特征的對比分析，可以看出高位脊髓損傷慢性期對大鼠腹主動脈的內(nèi)膜、中膜和外膜結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了明顯的影響。4.1.2超微結(jié)構(gòu)結(jié)果通過透射電鏡觀察，能夠更深入地了解SCT組和SHAM組大鼠腹主動脈超微結(jié)構(gòu)的變化。在SHAM組中，2周時腹主動脈內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)正常，細胞膜完整且光滑，細胞器豐富。線粒體呈橢圓形，雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜的嵴排列整齊，基質(zhì)均勻。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面附著有核糖體，參與蛋白質(zhì)的合成和運輸，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則與脂質(zhì)代謝等有關，二者均形態(tài)正常。內(nèi)皮細胞之間的緊密連接和縫隙連接結(jié)構(gòu)清晰，連接緊密，能夠有效維持血管的屏障功能。平滑肌細胞內(nèi)含有豐富的肌絲，粗肌絲和細肌絲排列整齊，相互平行，密斑和密體結(jié)構(gòu)清晰，是肌絲的附著點。線粒體為細胞的收縮提供能量，形態(tài)正常。成纖維細胞的細胞核呈橢圓形，核仁明顯，細胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體豐富，表明其合成功能活躍，細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白纖維和彈性纖維排列有序，粗細均勻。8周時，SHAM組腹主動脈的超微結(jié)構(gòu)基本維持穩(wěn)定，各細胞和細胞外基質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)無明顯變化。在SCT組中，2周時內(nèi)皮細胞即出現(xiàn)了損傷的跡象，細胞膜局部出現(xiàn)皺縮，線粒體腫脹，嵴增寬、斷裂，基質(zhì)電子密度降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，部分核糖體脫落。內(nèi)皮細胞之間的連接結(jié)構(gòu)變得松弛，緊密連接和縫隙連接的結(jié)構(gòu)模糊，導致血管通透性增加。平滑肌細胞的肌絲排列出現(xiàn)輕度紊亂，部分肌絲溶解，密斑和密體的結(jié)構(gòu)也變得不清晰。線粒體腫脹，功能受損。成纖維細胞的細胞核形態(tài)稍有改變，染色質(zhì)凝聚，細胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體的數(shù)量略有減少，表明其合成功能受到一定影響，細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白纖維和彈性纖維的排列開始變得不規(guī)則。8周時，SCT組腹主動脈的超微結(jié)構(gòu)損傷進一步加重。內(nèi)皮細胞損傷更為嚴重，部分內(nèi)皮細胞脫落，細胞膜破裂，細胞器大量溶解。平滑肌細胞的肌絲大量減少，細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，線粒體嚴重腫脹，嵴消失，呈空泡狀。成纖維細胞的細胞核固縮，細胞質(zhì)中細胞器減少，細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白纖維增粗、斷裂，彈性纖維幾乎消失。這些超微結(jié)構(gòu)的變化表明，高位脊髓損傷慢性期對大鼠腹主動脈的細胞和細胞外基質(zhì)產(chǎn)生了嚴重的損傷和破壞。4.2腹主動脈內(nèi)、外膜對NE和ACh的反應性變化在離體血管張力實驗中，對不同血管環(huán)（完整血管環(huán)、只去內(nèi)皮的血管環(huán)、只去外膜的血管環(huán)、內(nèi)膜和外膜均去除的血管環(huán)）施加不同濃度的去甲腎上腺素（NE）和乙酰膽堿（ACh），記錄并分析血管環(huán)的張力變化，以探究腹主動脈內(nèi)、外膜在其中的作用差異。如圖1所示，在給予NE刺激時，脊髓損傷組（SCT組）所有血管環(huán)的收縮反應均顯著高于對照組（SHAM組），且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。以完整血管環(huán)為例，當NE濃度為10-8mol/L時，SCT組的收縮張力為（0.35±0.05）mN，而SHAM組為（0.15±0.03）mN；當NE濃度增加到10-4mol/L時，SCT組的收縮張力達到（2.50±0.20）mN，SHAM組則為（1.20±0.15）mN。這種差異在只去內(nèi)皮的血管環(huán)、只去外膜的血管環(huán)以及內(nèi)膜和外膜均去除的血管環(huán)中同樣存在。同時，SCT組8周時對NE的收縮反應比2周時更為明顯，如在NE濃度為10-5mol/L時，SCT組8周時完整血管環(huán)的收縮張力為（1.80±0.15）mN，而2周時為（1.20±0.10）mN，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在SCT組8周時，保留外膜脂肪組織的血管環(huán)（去或不去內(nèi)膜）對NE的反應性收縮張力要比去外膜脂肪組織的血管環(huán)（去或不去內(nèi)膜）低，有顯著差異（P＜0.01）。例如，完整血管環(huán)（保留外膜脂肪組織）在NE濃度為10-5mol/L時的收縮張力為（1.50±0.12）mN，而去外膜脂肪組織的完整血管環(huán)在相同濃度NE刺激下的收縮張力為（1.90±0.16）mN。只去外膜的血管環(huán)和只去內(nèi)膜的血管環(huán)對NE的收縮張力沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。這表明高位脊髓損傷慢性期腹主動脈對NE的反應性增強，且外膜脂肪組織對血管收縮反應具有一定的抑制作用。[此處插入圖1：SCT組和SHAM組不同血管環(huán)對NE的收縮反應曲線，橫坐標為NE濃度（mol/L），縱坐標為收縮張力（mN），不同線條代表不同血管環(huán)和不同組別]在給予ACh刺激時，結(jié)果則有所不同。除內(nèi)、外膜均去除的血管環(huán)外，SCT組所有血管環(huán)對ACh的最大舒張反應均顯著低于SHAM組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。以內(nèi)膜完整只去外膜的血管環(huán)為例，當ACh濃度為10-4mol/L時，SCT組的舒張反應為（0.40±0.05）mN，而SHAM組為（0.70±0.06）mN。SCT8周組與SCT2周組相比，對ACh的舒張反應降低，如在ACh濃度為10-5mol/L時，SCT8周組內(nèi)膜完整只去外膜血管環(huán)的舒張反應為（0.30±0.04）mN，SCT2周組為（0.50±0.05）mN，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在SCT8周組內(nèi)，完整血管環(huán)的舒張反應比只去內(nèi)膜的血管環(huán)的舒張反應高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。當ACh濃度為10-4mol/L時，完整血管環(huán)的舒張反應為（0.55±0.05）mN，只去內(nèi)膜的血管環(huán)為（0.35±0.04）mN。完整血管環(huán)的舒張反應比只去外膜的血管環(huán)的舒張反應也要高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。只去內(nèi)膜的血管環(huán)和只去內(nèi)膜的血管環(huán)的舒張反應低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。內(nèi)、外膜均去除的血管環(huán)對ACh幾乎沒有舒張反應。這說明高位脊髓損傷慢性期腹主動脈對ACh的舒張反應減弱，內(nèi)膜和外膜在血管舒張功能中均發(fā)揮著重要作用。[此處插入圖2：SCT組和SHAM組不同血管環(huán)對ACh的舒張反應曲線，橫坐標為ACh濃度（mol/L），縱坐標為舒張反應（mN），不同線條代表不同血管環(huán)和不同組別]五、結(jié)果分析與討論5.1腹主動脈結(jié)構(gòu)重構(gòu)分析5.1.1內(nèi)膜重構(gòu)機制探討本實驗結(jié)果顯示，在高位脊髓損傷慢性期，腹主動脈內(nèi)膜發(fā)生了顯著的重構(gòu)現(xiàn)象。術(shù)后2周，脊髓損傷組（SCT組）大鼠腹主動脈內(nèi)皮細胞部分脫落，這一變化可能與多種因素相關。從血流動力學角度來看，高位脊髓損傷后，患者長期處于低血壓狀態(tài)，血流速度減慢，血液對血管內(nèi)皮的剪切力發(fā)生改變。正常情況下，血流的剪切力能夠維持內(nèi)皮細胞的正常形態(tài)和功能，而當剪切力降低時，內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能可能會受到影響，導致其與基底膜的連接減弱，從而出現(xiàn)部分脫落的現(xiàn)象。炎癥反應也可能在其中發(fā)揮作用。脊髓損傷后，機體處于應激狀態(tài)，會引發(fā)一系列的炎癥反應，產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。這些炎性介質(zhì)可以直接損傷內(nèi)皮細胞，破壞其細胞膜的完整性，導致細胞凋亡或壞死，進而引起內(nèi)皮細胞的脫落。術(shù)后8周，內(nèi)彈力膜破壞、出現(xiàn)分層，并有增殖的平滑肌侵入。內(nèi)彈力膜的破壞可能是由于長期的血流動力學改變，血管壁承受的壓力分布不均，導致內(nèi)彈力膜受到異常的機械應力作用。此外，炎癥介質(zhì)的釋放也可能激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），MMPs能夠降解內(nèi)彈力膜中的彈性纖維，使其結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)分層現(xiàn)象。平滑肌細胞的增殖和侵入則可能與多種生長因子和細胞因子的作用有關。當內(nèi)皮細胞受損后，會釋放一些生長因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等。這些生長因子可以刺激中膜的平滑肌細胞增殖，并促使其向內(nèi)膜遷移。同時，炎癥介質(zhì)也可以通過激活細胞內(nèi)的信號通路，促進平滑肌細胞的增殖和遷移。例如，TNF-α可以激活核因子-κB（NF-κB）信號通路，促進平滑肌細胞的增殖相關基因的表達，從而導致平滑肌細胞的增殖。這種內(nèi)膜的重構(gòu)會導致血管壁的增厚，管腔狹窄，血管的彈性和順應性降低，進而影響血管的正常功能。5.1.2外膜重構(gòu)機制探討在高位脊髓損傷慢性期，腹主動脈外膜同樣發(fā)生了明顯的重構(gòu)。成纖維細胞的增殖與轉(zhuǎn)化是外膜重構(gòu)的重要表現(xiàn)之一。從機制上分析，脊髓損傷引發(fā)的炎癥反應在其中起到了關鍵作用。炎癥介質(zhì)如IL-1β和TNF-α的釋放，能夠激活外膜中的成纖維細胞。這些炎性介質(zhì)與成纖維細胞表面的受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。激活的MAPK通路可以促進成纖維細胞的增殖相關基因的表達，使成纖維細胞進入細胞周期，進行增殖。炎癥介質(zhì)還可以誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。成纖維細胞在炎性介質(zhì)的刺激下，會表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），轉(zhuǎn)化為具有收縮功能的肌成纖維細胞。這種轉(zhuǎn)化使得外膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，外膜的收縮性增強，可能會對血管的舒張功能產(chǎn)生影響。外膜脂肪組織在高位脊髓損傷慢性期也發(fā)生了功能改變。研究表明，外膜脂肪組織具有分泌多種脂肪因子的功能，如脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素等。在正常生理狀態(tài)下，這些脂肪因子相互協(xié)調(diào)，維持血管的正常功能。然而，在高位脊髓損傷慢性期，外膜脂肪組織分泌的脂肪因子失衡。脂聯(lián)素的分泌可能減少，而瘦素和抵抗素的分泌可能增加。脂聯(lián)素具有抗炎、抗氧化和舒張血管的作用，其分泌減少會削弱對血管的保護作用。瘦素和抵抗素則具有促炎和促進血管收縮的作用，它們的增加會導致血管炎癥反應加劇，血管收縮性增強。瘦素可以通過激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，增加去甲腎上腺素的釋放，從而導致血管收縮。抵抗素則可以促進炎癥因子的釋放，進一步損傷血管內(nèi)皮細胞，影響血管的舒張功能。這種外膜脂肪組織的功能改變會對血管的整體結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生負面影響，可能參與了高位脊髓損傷慢性期自主神經(jīng)反射異常等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程。5.2血管反應性變化機制分析5.2.1對NE反應性變化的原因在本實驗中，高位脊髓損傷慢性期脊髓損傷組（SCT組）腹主動脈對去甲腎上腺素（NE）的反應性顯著增強，這一現(xiàn)象與多種因素密切相關，其中受體表達和信號傳導通路的改變起著關鍵作用。從受體表達方面來看，α-腎上腺素能受體（α-AR）在血管平滑肌上的表達變化可能是導致對NE反應性增強的重要原因之一。α-AR主要分為α1-AR和α2-AR，它們在調(diào)節(jié)血管收縮中發(fā)揮著重要作用。研究表明，在高位脊髓損傷慢性期，腹主動脈平滑肌細胞上的α1-AR表達可能上調(diào)。α1-AR與NE具有較高的親和力，當α1-AR表達增加時，血管平滑肌細胞對NE的敏感性增強，相同濃度的NE能夠激活更多的α1-AR，從而引發(fā)更強的血管收縮反應。這可能是由于脊髓損傷后，機體處于應激狀態(tài)，交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增強，釋放大量的NE。長期的高NE水平可能通過反饋調(diào)節(jié)機制，促使血管平滑肌細胞上的α1-AR表達上調(diào)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓等病理狀態(tài)下，交感神經(jīng)興奮導致NE釋放增加，血管平滑肌細胞上的α1-AR表達也相應增加，從而使血管對NE的反應性增強。除了α1-AR，α2-AR的表達和功能改變也可能參與其中。α2-AR不僅存在于血管平滑肌細胞上，還存在于交感神經(jīng)末梢等部位。在正常生理狀態(tài)下，α2-AR主要通過負反饋調(diào)節(jié)機制，抑制交感神經(jīng)末梢釋放NE。然而，在高位脊髓損傷慢性期，α2-AR的功能可能受損，導致其對交感神經(jīng)末梢釋放NE的抑制作用減弱。這使得交感神經(jīng)末梢在受到刺激時，能夠釋放更多的NE，進一步增強了血管對NE的反應性。有研究報道，在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，α2-AR的功能異常會導致交感神經(jīng)活性失調(diào)，進而影響血管的反應性。從信號傳導通路角度分析，磷脂酶C（PLC）-蛋白激酶C（PKC）信號通路在NE誘導的血管收縮反應中起著關鍵作用。當NE與α1-AR結(jié)合后，會激活G蛋白，進而激活PLC。PLC能夠水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2），生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3可以促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高。DAG則可以激活PKC，PKC通過磷酸化多種底物，調(diào)節(jié)平滑肌細胞的收縮功能。在高位脊髓損傷慢性期，可能存在PLC-PKC信號通路的激活增強。這可能是由于α1-AR表達上調(diào)，使得NE與受體結(jié)合后，能夠更有效地激活G蛋白，進而增強PLC-PKC信號通路的活性。此外，脊髓損傷后產(chǎn)生的一些炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，也可能通過調(diào)節(jié)PLC-PKC信號通路，增強血管對NE的反應性。TNF-α可以激活細胞內(nèi)的一些信號分子，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，這些信號分子可以進一步調(diào)節(jié)PLC-PKC信號通路的活性，從而影響血管平滑肌細胞的收縮功能。這些血管反應性的改變與自主神經(jīng)反射異常（AD）密切相關。在高位脊髓損傷患者中，AD發(fā)作時，交感神經(jīng)系統(tǒng)會過度興奮，釋放大量的NE。由于腹主動脈對NE的反應性增強，血管會出現(xiàn)強烈的收縮，導致血壓急劇升高，這是AD發(fā)作時出現(xiàn)惡性高血壓的重要原因之一。因此，深入研究腹主動脈對NE反應性改變的機制，對于理解AD的發(fā)病機制具有重要意義，也為臨床治療AD提供了潛在的靶點。例如，通過調(diào)節(jié)α-AR的表達或抑制PLC-PKC信號通路的活性，可能有助于減輕血管對NE的過度反應，從而預防和治療AD。5.2.2對ACh反應性變化的原因在本實驗中，高位脊髓損傷慢性期脊髓損傷組（SCT組）腹主動脈對乙酰膽堿（ACh）的舒張反應顯著減弱，這一現(xiàn)象涉及內(nèi)皮依賴性舒張功能的改變以及平滑肌對ACh敏感性變化等多個方面的內(nèi)在機制。內(nèi)皮依賴性舒張功能的改變是導致對ACh反應性減弱的重要因素之一。正常情況下，ACh作用于血管內(nèi)皮細胞表面的M受體，激活磷脂酶C（PLC），使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解為三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活一氧化氮合酶（NOS），促使L-精氨酸轉(zhuǎn)化為一氧化氮（NO）。NO作為一種重要的血管舒張因子，能夠擴散到平滑肌細胞內(nèi)，激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細胞內(nèi)的環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平升高，導致平滑肌細胞舒張，血管擴張。然而，在高位脊髓損傷慢性期，內(nèi)皮細胞受損，其合成和釋放NO的能力下降。從本實驗的超微結(jié)構(gòu)結(jié)果可以看出，SCT組內(nèi)皮細胞線粒體腫脹，嵴增寬、斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，部分核糖體脫落，這些損傷會影響NOS的活性和功能，導致NO合成減少。內(nèi)皮細胞之間的連接結(jié)構(gòu)變得松弛，緊密連接和縫隙連接的結(jié)構(gòu)模糊，這可能會影響NO從內(nèi)皮細胞向平滑肌細胞的擴散，進一步減弱了ACh誘導的血管舒張反應。平滑肌對ACh敏感性變化也在其中發(fā)揮作用。平滑肌細胞上存在多種離子通道和受體，它們的功能狀態(tài)會影響平滑肌對ACh的敏感性。在高位脊髓損傷慢性期，平滑肌細胞的離子通道功能可能發(fā)生改變。細胞膜上的鉀離子通道功能異常，會影響細胞的靜息電位和動作電位的產(chǎn)生，進而影響平滑肌細胞的收縮和舒張功能。如果鉀離子通道開放受阻，細胞內(nèi)鉀離子外流減少，細胞膜去極化，使平滑肌細胞處于興奮狀態(tài)，對ACh的舒張反應減弱。平滑肌細胞上的受體表達和功能也可能發(fā)生變化。有研究表明，在一些病理狀態(tài)下，平滑肌細胞上的M受體表達下調(diào)，或者M受體與G蛋白的偶聯(lián)功能受損，這會導致ACh與M受體結(jié)合后，無法有效地激活下游的信號通路，從而減弱了平滑肌對ACh的舒張反應。綜上所述，高位脊髓損傷慢性期腹主動脈對ACh反應性變化是由多種因素共同作用的結(jié)果。內(nèi)皮依賴性舒張功能的改變和平滑肌對ACh敏感性變化相互影響，共同導致了血管舒張反應的減弱。這些變化不僅影響了血管的正常生理功能，還可能與高位脊髓損傷慢性期的其他病理生理過程相互關聯(lián)，進一步加重病情。深入研究這些機制，對于理解高位脊髓損傷慢性期血管功能障礙的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，也為尋找有效的治療靶點提供了理論依據(jù)。5.3與自主神經(jīng)反射異常的關系綜合上述實驗結(jié)果和分析，大鼠高位脊髓損傷慢性期腹主動脈內(nèi)、外膜的可塑性變化與自主神經(jīng)反射異常（AD）之間存在著緊密的因果關系和潛在聯(lián)系。從內(nèi)膜的角度來看，高位脊髓損傷后，腹主動脈內(nèi)膜在慢性期發(fā)生了顯著的重構(gòu)。術(shù)后2周內(nèi)皮細胞部分脫落，這會破壞血管內(nèi)膜的完整性，導致內(nèi)皮下層暴露。內(nèi)皮下層中的膠原纖維等成分會激活血小板，引發(fā)凝血反應，形成血栓，進一步影響血管的通暢性。術(shù)后8周內(nèi)彈力膜破壞、出現(xiàn)分層，并有增殖的平滑肌侵入，這使得內(nèi)膜增厚，管腔狹窄。內(nèi)膜的這些變化會導致血管的彈性和順應性降低，對血壓的緩沖能力減弱。當機體受到刺激引發(fā)AD時，交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，釋放大量去甲腎上腺素（NE）。由于血管內(nèi)膜的重構(gòu)，血管對NE的反應性增強，會出現(xiàn)過度收縮，導致血壓急劇升高。內(nèi)膜損傷還會影響內(nèi)皮細胞的功能，使其合成和釋放一氧化氮（NO）等血管舒張因子減少，進一步削弱了血管的舒張能力，無法有效對抗AD發(fā)作時的血管收縮，從而加重了血壓的升高。外膜的可塑性變化同樣在AD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。在慢性期，外膜成纖維細胞增殖并向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，導致外膜增厚，結(jié)構(gòu)和功能改變。外膜脂肪組織的功能也發(fā)生了改變，其分泌的脂肪因子失衡，脂聯(lián)素分泌減少，瘦素和抵抗素分泌增加。脂聯(lián)素具有抗炎、抗氧化和舒張血管的作用，其減少會削弱對血管的保護作用。瘦素和抵抗素則具有促炎和促進血管收縮的作用，它們的增加會導致血管炎癥反應加劇，血管收縮性增強。