天壇株痘苗病毒TC/TK基因缺失株的篩選鑒定及應(yīng)用前景探究一、引言1.1研究背景與意義天花曾是一種極具殺傷力的全球性烈性傳染病，其歷史可追溯至數(shù)千年前，在17世紀(jì)至20世紀(jì)初，天花疫情在全球范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)，造成了大量人口的死亡和殘疾，給人類社會(huì)帶來了沉重的災(zāi)難，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康和社會(huì)發(fā)展。據(jù)歷史記載，在某些疫情嚴(yán)重的地區(qū)，人口死亡率高達(dá)30%以上，許多家庭因此支離破碎，社會(huì)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)也受到了極大的沖擊。直到20世紀(jì)70年代，世界衛(wèi)生組織發(fā)起了全球消滅天花行動(dòng)，通過大規(guī)模的疫苗接種，人類終于在1980年宣布全球消滅天花，這是人類公共衛(wèi)生史上的一個(gè)偉大里程碑。天花疫苗的研發(fā)與應(yīng)用在消滅天花的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。自18世紀(jì)末英國醫(yī)生愛德華?詹納發(fā)現(xiàn)接種牛痘可以預(yù)防天花以來，天花疫苗的研制與生產(chǎn)歷經(jīng)了漫長(zhǎng)而曲折的道路，并不斷改進(jìn)和更新。早期的天花疫苗存在諸多局限性，如接種后可能出現(xiàn)嚴(yán)重副作用，包括高熱、局部感染、過敏反應(yīng)甚至導(dǎo)致死亡等。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，疫苗的安全性和有效性逐漸得到提高。其中，天壇株痘苗病毒作為中國傳統(tǒng)的疫苗，已經(jīng)使用了幾百年，具有重要的歷史地位和應(yīng)用價(jià)值。然而，隨著恐怖襲擊和生物恐怖主義日益嚴(yán)峻，天花病毒被用作生物武器的潛在威脅也逐漸增加。一旦天花病毒被惡意釋放，可能會(huì)引發(fā)大規(guī)模的疫情，對(duì)全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重挑戰(zhàn)。此外，一些與天花病毒同屬正痘病毒屬的病毒，如猴痘病毒，近年來也出現(xiàn)了傳播范圍擴(kuò)大和發(fā)病率上升的趨勢(shì)。猴痘病毒與天花病毒基因組高度同源，結(jié)構(gòu)蛋白保守，具有相似的抗原。在2022年5月起，猴痘疫情在世界范圍內(nèi)廣泛流行，一度被世衛(wèi)組織列為“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”，截止2023年9月27日，累計(jì)造成90618例確診病例，臨床上尚無特異性針對(duì)猴痘的預(yù)防與治療手段。因此，研發(fā)更加安全有效的天花疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，不僅可以應(yīng)對(duì)天花病毒的潛在威脅，還可能為預(yù)防和控制其他正痘病毒感染提供幫助。在眾多天花疫苗研究方向中，對(duì)天壇株痘苗病毒進(jìn)行基因改造是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。通過敲除某些與病毒毒力和宿主范圍等相關(guān)的復(fù)制非必需基因，可以構(gòu)建出基因缺失株，有望降低疫苗的毒力，提高其安全性，同時(shí)保持良好的免疫原性。其中，TC/TK基因在病毒的致病過程中可能發(fā)揮著重要作用，研究表明，該基因與病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、代謝以及對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的逃逸等機(jī)制相關(guān)。敲除TC/TK基因可能會(huì)改變病毒的生物學(xué)特性，使其在保持免疫原性的基礎(chǔ)上，毒力顯著下降。篩選和鑒定天壇株痘苗病毒TC/TK基因缺失株，能夠?yàn)樘旎ㄒ呙绲母聯(lián)Q代提供更優(yōu)質(zhì)的候選毒株，推動(dòng)傳統(tǒng)疫苗的優(yōu)化升級(jí)。通過深入研究TC/TK基因缺失株在體內(nèi)外的生物學(xué)特性、免疫原性和安全性等方面的表現(xiàn)，還能為疫苗的臨床前研究和后續(xù)的臨床試驗(yàn)提供重要的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)，促進(jìn)疫苗研發(fā)的進(jìn)程，為保障全球公共衛(wèi)生安全做出貢獻(xiàn)。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在通過一系列實(shí)驗(yàn)技術(shù)，篩選并鑒定出天壇株痘苗病毒TC/TK基因缺失株，為天花疫苗的研發(fā)提供更安全、有效的候選毒株，并深入了解其生物學(xué)特性，為后續(xù)的疫苗研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下：篩選方法：首先獲取天壇株痘苗病毒，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，針對(duì)TC/TK基因進(jìn)行精確編輯。設(shè)計(jì)特異性的sgRNA，引導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)TC/TK基因進(jìn)行切割，使其發(fā)生缺失突變。將編輯后的病毒接種到合適的細(xì)胞系，如Vero細(xì)胞或BHK-21細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)。通過多次傳代培養(yǎng)，使病毒在細(xì)胞內(nèi)不斷復(fù)制，在此過程中，篩選出具有穩(wěn)定TC/TK基因缺失的病毒克隆。同時(shí)，運(yùn)用藥物篩選輔助手段，利用與TC/TK基因相關(guān)的代謝途徑差異，添加特定藥物，只有TC/TK基因缺失的病毒株能夠在這種藥物環(huán)境下存活和復(fù)制，從而提高篩選效率。鑒定手段：對(duì)篩選出的疑似TC/TK基因缺失株，采用PCR技術(shù)進(jìn)行初步鑒定。設(shè)計(jì)針對(duì)TC/TK基因缺失位點(diǎn)兩側(cè)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果擴(kuò)增出的片段大小與預(yù)期的TC/TK基因缺失后的片段大小一致，則初步表明該病毒株可能為基因缺失株。為了進(jìn)一步確認(rèn)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果與野生型天壇株痘苗病毒的TC/TK基因序列進(jìn)行比對(duì)，明確基因缺失的具體情況，包括缺失的堿基數(shù)量、位置等，確保TC/TK基因被準(zhǔn)確敲除，且無其他意外的基因突變。特性分析：對(duì)鑒定成功的TC/TK基因缺失株，開展生物學(xué)特性分析。檢測(cè)其在不同細(xì)胞系中的生長(zhǎng)曲線，了解其在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力與野生型病毒相比是否存在差異；觀察其對(duì)細(xì)胞的感染特性，如細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的變化，判斷基因缺失對(duì)病毒感染細(xì)胞過程的影響。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估其免疫原性，將TC/TK基因缺失株接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如小鼠、兔子等）體內(nèi)，定期采集血清，檢測(cè)血清中針對(duì)痘苗病毒的特異性抗體水平，以及細(xì)胞免疫應(yīng)答情況，包括T淋巴細(xì)胞的活化、增殖等指標(biāo)，評(píng)估其激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的能力。在安全性方面，觀察接種病毒株后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，如體重下降、發(fā)熱、器官損傷等，對(duì)動(dòng)物的重要器官進(jìn)行病理切片分析，檢測(cè)病毒在體內(nèi)的分布和對(duì)組織器官的影響，全面評(píng)估其安全性。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀痘苗病毒作為天花疫苗的主要毒株，在全球范圍內(nèi)得到了廣泛的研究與應(yīng)用。在國內(nèi)，天壇株痘苗病毒因其長(zhǎng)期的使用歷史和獨(dú)特的生物學(xué)特性，成為研究的重點(diǎn)對(duì)象。國內(nèi)眾多科研團(tuán)隊(duì)致力于天壇株痘苗病毒的基因改造與優(yōu)化，通過對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和功能的深入探索，不斷挖掘潛在的疫苗改進(jìn)方向。在對(duì)痘苗病毒基因組測(cè)序分析后，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與病毒毒力、免疫原性相關(guān)的基因，為后續(xù)的基因編輯提供了理論基礎(chǔ)。國內(nèi)研究人員在痘苗病毒基因缺失株構(gòu)建方面取得了一定進(jìn)展。有研究通過同源重組技術(shù)敲除了天壇株痘苗病毒中與毒力相關(guān)的基因，成功構(gòu)建出毒力減弱的基因缺失株，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該缺失株在保持免疫原性的同時(shí)，安全性得到了顯著提高。此外，國內(nèi)還在痘苗病毒作為基因載體的應(yīng)用研究上投入大量精力，利用其能夠攜帶外源基因并有效表達(dá)的特性，探索其在腫瘤治療、傳染病預(yù)防等領(lǐng)域的新應(yīng)用，為開發(fā)新型治療手段和疫苗提供了新的思路。國外對(duì)痘苗病毒的研究同樣深入且廣泛。在基因編輯技術(shù)方面，不斷創(chuàng)新和優(yōu)化，運(yùn)用CRISPR-Cas9等先進(jìn)技術(shù)對(duì)痘苗病毒進(jìn)行精確的基因操作，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多個(gè)基因位點(diǎn)的同時(shí)編輯，為構(gòu)建更加理想的基因缺失株提供了技術(shù)支持。在疫苗研發(fā)方面，國外注重對(duì)痘苗病毒免疫機(jī)制的研究，通過解析病毒與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用過程，深入了解免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)控機(jī)制，從而為設(shè)計(jì)更高效的疫苗提供理論依據(jù)。一些研究團(tuán)隊(duì)還在痘苗病毒的新型佐劑研發(fā)、疫苗遞送系統(tǒng)優(yōu)化等方面取得了重要成果，進(jìn)一步提高了痘苗病毒疫苗的免疫效果和安全性。此外，國外在痘苗病毒相關(guān)的臨床試驗(yàn)方面也走在前列，開展了多項(xiàng)針對(duì)不同人群和應(yīng)用場(chǎng)景的臨床試驗(yàn)，為痘苗病毒疫苗的實(shí)際應(yīng)用積累了豐富的臨床數(shù)據(jù)。然而，當(dāng)前對(duì)于天壇株痘苗病毒TC/TK基因缺失株的研究仍存在一定的局限性。在篩選方法上，現(xiàn)有的技術(shù)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)基因的敲除，但篩選效率和準(zhǔn)確性有待提高，部分方法操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于大規(guī)模的篩選工作。在鑒定手段方面，雖然PCR和測(cè)序等技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒定基因缺失情況，但對(duì)于基因缺失后病毒株的生物學(xué)特性變化，如病毒的感染能力、免疫原性改變等，缺乏全面、系統(tǒng)的檢測(cè)方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。在TC/TK基因缺失株的特性研究方面，目前的研究多集中在細(xì)胞水平和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)于其在人體中的安全性和免疫效果的研究還相對(duì)較少，距離臨床應(yīng)用仍有一定的距離。此外，對(duì)于TC/TK基因在病毒生命周期中的具體作用機(jī)制，以及基因缺失后對(duì)病毒其他基因表達(dá)和功能的影響，尚未完全明確，這也限制了對(duì)該基因缺失株的深入理解和應(yīng)用開發(fā)。本研究旨在針對(duì)這些不足，通過改進(jìn)篩選和鑒定方法，深入研究TC/TK基因缺失株的生物學(xué)特性，為天壇株痘苗病毒疫苗的研發(fā)提供更有力的支持，填補(bǔ)當(dāng)前研究領(lǐng)域的部分空白，具有重要的創(chuàng)新性與必要性。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1天壇株痘苗病毒概述痘苗病毒作為正痘病毒屬的重要成員，在病毒學(xué)研究與疫苗開發(fā)領(lǐng)域占據(jù)著舉足輕重的地位，而天壇株痘苗病毒更是其中的典型代表。它的歷史可以追溯到1926年，由中國生物制品事業(yè)的奠基人和開創(chuàng)者齊長(zhǎng)慶研制而成。當(dāng)時(shí)，齊長(zhǎng)慶從一名天花病患者身上提取病毒，經(jīng)過在猴子、家兔和牛等動(dòng)物身上的十代減毒，最終成功獲得了“天壇株”天花痘苗毒種。這一毒種具有免疫力好、副作用小的顯著優(yōu)勢(shì)，為中國乃至世界的天花防控事業(yè)做出了卓越貢獻(xiàn)。在新中國成立后的天花消滅行動(dòng)中，“天壇株”發(fā)揮了核心作用。1950年，中央人民政府政務(wù)院頒布了由周恩來總理簽發(fā)的《關(guān)于發(fā)動(dòng)秋季種痘運(yùn)動(dòng)的指示》，全國迅速掀起普遍種痘高潮，使用的正是以“天壇株”為基礎(chǔ)制備的天花疫苗。經(jīng)過多年的努力，1961年6月，中國最后一名天花病人胡小發(fā)痊愈出院，標(biāo)志著中國在世界上率先消滅天花，這一偉大成就的背后，“天壇株”功不可沒。在生物學(xué)特性方面，天壇株痘苗病毒擁有獨(dú)特的基因組結(jié)構(gòu)。其基因組為雙鏈線性DNA，長(zhǎng)度約為189,274堿基對(duì)，包含了眾多基因，這些基因編碼了多種蛋白質(zhì)，參與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、裝配以及與宿主細(xì)胞的相互作用等關(guān)鍵過程。研究表明，天壇株痘苗病毒在不同細(xì)胞系中的感染和復(fù)制能力存在差異。在Vero細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞等常見細(xì)胞系中，它能夠較好地感染并進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞變圓、脫落、融合等。在某些特殊細(xì)胞系中，其感染和復(fù)制可能會(huì)受到一定限制，這與細(xì)胞表面的病毒受體表達(dá)水平、細(xì)胞內(nèi)的抗病毒機(jī)制等因素密切相關(guān)。天壇株痘苗病毒還具備廣泛的應(yīng)用價(jià)值。除了作為天花疫苗，它在其他疫苗研發(fā)和基因治療領(lǐng)域也展現(xiàn)出巨大潛力。由于其具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，因此常被用作活病毒載體，用于構(gòu)建重組疫苗。將其他病原體的抗原基因?qū)胩靿甓幻绮《净蚪M中，使其在感染宿主細(xì)胞時(shí)表達(dá)外源抗原，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原的特異性免疫反應(yīng)。這種方法已被應(yīng)用于艾滋病疫苗、乙肝疫苗等的研發(fā)，取得了一定的研究成果。在基因治療方面，天壇株痘苗病毒可以攜帶治療性基因，如腫瘤抑制基因、免疫調(diào)節(jié)基因等，將其遞送至靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療，為腫瘤、遺傳性疾病等的治療提供了新的策略和途徑。此外，在消滅天花的全球衛(wèi)生運(yùn)動(dòng)中，天壇株痘苗病毒發(fā)揮了不可替代的重要作用。在20世紀(jì)中葉，天花在全球范圍內(nèi)廣泛流行，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。中國積極參與全球消滅天花行動(dòng)，利用天壇株痘苗病毒生產(chǎn)的疫苗，開展大規(guī)模的接種工作。通過嚴(yán)格的疫情監(jiān)測(cè)、疫苗分發(fā)和接種計(jì)劃的實(shí)施，中國成功地控制了天花的傳播，并最終實(shí)現(xiàn)了天花的消滅。這不僅為中國人民的健康福祉做出了巨大貢獻(xiàn)，也為世界其他國家提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和借鑒。中國的成功經(jīng)驗(yàn)表明，通過科學(xué)合理地利用疫苗，結(jié)合有效的公共衛(wèi)生措施，人類可以戰(zhàn)勝烈性傳染病，這一成就極大地鼓舞了全球消滅天花的信心和決心，推動(dòng)了全球消滅天花運(yùn)動(dòng)的進(jìn)程。天壇株痘苗病毒憑借其獨(dú)特的歷史地位、生物學(xué)特性和廣泛的應(yīng)用價(jià)值，成為病毒學(xué)研究和疫苗開發(fā)領(lǐng)域的重要研究對(duì)象。對(duì)其進(jìn)行深入研究，尤其是在基因改造方面，有望為天花疫苗的升級(jí)換代以及其他疾病的預(yù)防和治療開辟新的道路，具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。2.2TC/TK基因解析TC/TK基因在痘苗病毒的生物學(xué)過程中扮演著至關(guān)重要的角色。它編碼的胸苷激酶（ThymidineKinase，TK）是一種關(guān)鍵的酶，在病毒的代謝和復(fù)制過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。胸苷激酶能夠催化脫氧胸苷（TdR）磷酸化，生成胸苷酸（TMP），而TMP是DNA合成的重要原料之一。在病毒感染宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞的正常代謝途徑可能無法滿足病毒快速復(fù)制對(duì)DNA合成原料的需求。此時(shí)，痘苗病毒的TC/TK基因編碼的胸苷激酶便發(fā)揮作用，通過催化脫氧胸苷的磷酸化，為病毒DNA的合成提供足夠的胸苷酸，從而保證病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)順利進(jìn)行復(fù)制。研究表明，TC/TK基因還參與了病毒對(duì)宿主細(xì)胞代謝的調(diào)控。它可以影響宿主細(xì)胞內(nèi)的核苷酸代謝平衡，使宿主細(xì)胞的代謝環(huán)境更有利于病毒的生存和繁殖。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的核苷酸水平，TC/TK基因有助于病毒逃避宿主細(xì)胞的免疫監(jiān)視。當(dāng)宿主細(xì)胞感知到病毒感染時(shí)，會(huì)啟動(dòng)一系列免疫防御機(jī)制，其中包括限制細(xì)胞內(nèi)核苷酸的供應(yīng)，以抑制病毒的復(fù)制。痘苗病毒的TC/TK基因能夠通過自身編碼的胸苷激酶，繞過宿主細(xì)胞的這種限制，維持病毒復(fù)制所需的核苷酸供應(yīng)，從而使病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)生存和繁殖。敲除TC/TK基因會(huì)對(duì)痘苗病毒產(chǎn)生多方面的影響。從病毒的復(fù)制能力來看，由于無法編碼功能性的胸苷激酶，病毒在DNA合成過程中會(huì)面臨原料不足的問題，導(dǎo)致其在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制速度顯著下降。有研究通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比了野生型痘苗病毒和TC/TK基因缺失株在Vero細(xì)胞中的復(fù)制情況，發(fā)現(xiàn)TC/TK基因缺失株的病毒滴度在感染后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯低于野生型病毒，表明其復(fù)制能力受到了嚴(yán)重抑制。在病毒的毒力方面，TC/TK基因缺失株通常表現(xiàn)出毒力減弱的特性。這是因?yàn)椴《驹隗w內(nèi)的增殖能力下降，無法像野生型病毒那樣迅速擴(kuò)散和感染宿主細(xì)胞，從而減輕了對(duì)宿主機(jī)體的損害。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，接種TC/TK基因缺失株的小鼠，其體重下降幅度、組織病變程度等指標(biāo)均明顯低于接種野生型病毒的小鼠，說明敲除TC/TK基因有效地降低了病毒的毒力。然而，敲除TC/TK基因?qū)Σ《久庖咴缘挠绊戄^為復(fù)雜。一方面，由于病毒毒力減弱，可能會(huì)減少對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的過度刺激，從而有利于維持機(jī)體的免疫平衡；另一方面，病毒復(fù)制能力的下降可能會(huì)導(dǎo)致其在體內(nèi)的抗原表達(dá)量減少，進(jìn)而影響機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答強(qiáng)度。一些研究表明，通過優(yōu)化免疫接種方案，如增加接種劑量、調(diào)整接種途徑等，可以在一定程度上提高TC/TK基因缺失株的免疫原性，使其能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)反應(yīng)。2.3基因缺失株相關(guān)理論基因缺失株是指通過基因工程技術(shù)，使生物體基因組中特定基因的部分或全部序列發(fā)生缺失而形成的突變株。在病毒研究領(lǐng)域，基因缺失株的構(gòu)建具有重要意義。其構(gòu)建原理主要基于基因編輯技術(shù)，如同源重組、CRISPR-Cas9等。同源重組是利用病毒基因組與外源DNA之間的同源序列，在細(xì)胞內(nèi)的重組酶作用下，實(shí)現(xiàn)特定基因的替換或缺失。通過設(shè)計(jì)含有與目標(biāo)基因兩側(cè)同源序列的外源DNA片段，將其導(dǎo)入病毒感染的細(xì)胞中，外源DNA與病毒基因組發(fā)生同源重組，從而使目標(biāo)基因被替換或缺失。CRISPR-Cas9技術(shù)則是利用Cas9核酸酶在sgRNA的引導(dǎo)下，精準(zhǔn)識(shí)別并切割目標(biāo)基因序列，使基因發(fā)生缺失突變。在構(gòu)建天壇株痘苗病毒TC/TK基因缺失株時(shí)，可設(shè)計(jì)針對(duì)TC/TK基因的特異性sgRNA，引導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)TC/TK基因進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)基因缺失?；蛉笔е暝诓《狙芯亢鸵呙玳_發(fā)中展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢(shì)。從安全性角度來看，基因缺失株通常具有較低的毒力。許多病毒的毒力相關(guān)基因被敲除后，病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制能力和致病能力顯著下降。如在皰疹病毒的研究中，敲除某些與病毒潛伏感染和神經(jīng)毒力相關(guān)的基因后，病毒的毒力明顯減弱，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，接種基因缺失株的動(dòng)物表現(xiàn)出更低的發(fā)病率和死亡率，減少了病毒對(duì)機(jī)體的損害，降低了疫苗接種后可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。在免疫原性方面，雖然基因缺失可能會(huì)對(duì)病毒的某些生物學(xué)特性產(chǎn)生影響，但合適的基因缺失株仍能保持良好的免疫原性。一些病毒的基因缺失并不影響其主要抗原表位的表達(dá)和呈遞，機(jī)體免疫系統(tǒng)仍能識(shí)別并產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。在流感病毒基因缺失株疫苗的研究中，敲除與病毒毒力相關(guān)的基因后，病毒在保持較低毒力的同時(shí)，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，為機(jī)體提供有效的免疫保護(hù)?；蛉笔е赀€具有遺傳穩(wěn)定性高的特點(diǎn)。由于缺失的基因不會(huì)再恢復(fù)，基因缺失株在傳代過程中能夠保持其基因缺失的特性，避免了傳統(tǒng)疫苗株可能出現(xiàn)的毒力返強(qiáng)等問題。這使得基因缺失株在疫苗生產(chǎn)和儲(chǔ)存過程中更加穩(wěn)定可靠，有利于保證疫苗的質(zhì)量和安全性。在病毒研究中，基因缺失株是研究病毒基因功能的重要工具。通過構(gòu)建不同基因缺失的病毒株，對(duì)比分析其生物學(xué)特性的變化，能夠深入了解病毒基因的功能和作用機(jī)制。在研究痘苗病毒的免疫逃逸機(jī)制時(shí)，構(gòu)建缺失免疫逃逸相關(guān)基因的基因缺失株，觀察其在宿主細(xì)胞內(nèi)的感染過程以及與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，有助于揭示病毒免疫逃逸的分子機(jī)制。在疫苗開發(fā)中，基因缺失株為新型疫苗的研發(fā)提供了新的策略和途徑。相較于傳統(tǒng)疫苗，基因缺失株疫苗具有更高的安全性和穩(wěn)定性，有望成為未來疫苗發(fā)展的重要方向。通過對(duì)多種病毒的基因缺失株疫苗的研究和開發(fā)，不斷優(yōu)化疫苗的設(shè)計(jì)和制備工藝，提高疫苗的免疫效果和安全性，為傳染病的預(yù)防和控制提供更有效的手段。三、TC/TK基因缺失株的篩選3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備細(xì)胞系：選用BHK-21細(xì)胞、293F細(xì)胞和Vero細(xì)胞，這些細(xì)胞系在病毒研究中廣泛應(yīng)用，具有良好的生長(zhǎng)特性和對(duì)痘苗病毒的敏感性。BHK-21細(xì)胞源自倉鼠腎細(xì)胞，具有貼壁生長(zhǎng)的特性，易于培養(yǎng)和傳代，在多種病毒的增殖和研究中表現(xiàn)出良好的支持作用，常用于病毒的擴(kuò)增和病毒學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。293F細(xì)胞是一種人胚腎細(xì)胞系，具有懸浮生長(zhǎng)的特點(diǎn)，適合大規(guī)模培養(yǎng)，能夠高效表達(dá)外源蛋白，在基因轉(zhuǎn)染和病毒載體構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用。Vero細(xì)胞是非洲綠猴腎細(xì)胞系，具有廣泛的病毒感染譜，對(duì)痘苗病毒的感染和復(fù)制能力較強(qiáng)，是痘苗病毒研究中常用的細(xì)胞系之一，可用于病毒的培養(yǎng)、滴定和生物學(xué)特性研究等。所有細(xì)胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），確保細(xì)胞的來源可靠和質(zhì)量穩(wěn)定。在使用前，對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行嚴(yán)格的支原體檢測(cè)，確保細(xì)胞無污染，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。病毒株：實(shí)驗(yàn)采用的天壇株痘苗病毒由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供，該病毒株經(jīng)過嚴(yán)格的鑒定和保存，具有明確的生物學(xué)特性和遺傳背景。在使用前，對(duì)病毒株進(jìn)行復(fù)蘇和滴定，確定其病毒滴度，以保證實(shí)驗(yàn)中使用的病毒量準(zhǔn)確一致。工具酶：準(zhǔn)備多種工具酶，包括限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、BamHI等）、T4DNA連接酶、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶）等。限制性內(nèi)切酶用于切割DNA片段，以構(gòu)建基因編輯載體和分析基因片段；T4DNA連接酶用于連接DNA片段，實(shí)現(xiàn)基因的重組；DNA聚合酶用于PCR擴(kuò)增，以獲取目的基因片段和檢測(cè)基因缺失情況。這些工具酶均購自知名生物試劑公司，如NewEnglandBiolabs、TaKaRa等，確保酶的活性和質(zhì)量。在使用過程中，嚴(yán)格按照酶的說明書進(jìn)行操作，控制反應(yīng)條件，以保證酶切和連接等反應(yīng)的順利進(jìn)行。試劑：準(zhǔn)備豐富的試劑，包括DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)基（如DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基）、胎牛血清、胰蛋白酶、抗生素（如青霉素、鏈霉素）、轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）等。DNA提取試劑盒和RNA提取試劑盒用于從細(xì)胞和病毒中提取核酸；質(zhì)粒小提試劑盒用于提取和純化質(zhì)粒；PCR擴(kuò)增試劑盒用于進(jìn)行PCR反應(yīng)；DNA凝膠回收試劑盒用于回收和純化PCR產(chǎn)物和酶切后的DNA片段；細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清為細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供營養(yǎng)；胰蛋白酶用于消化細(xì)胞，以便進(jìn)行細(xì)胞傳代和病毒感染實(shí)驗(yàn)；抗生素用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；轉(zhuǎn)染試劑用于將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞中。所有試劑均購自正規(guī)渠道，嚴(yán)格按照試劑的保存條件進(jìn)行儲(chǔ)存，并在有效期內(nèi)使用，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。儀器設(shè)備：配備一系列先進(jìn)的儀器設(shè)備，包括PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、離心機(jī)、CO?培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、熒光顯微鏡、酶標(biāo)儀等。PCR儀用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和分析DNA凝膠電泳結(jié)果；離心機(jī)用于分離細(xì)胞、病毒和核酸等；CO?培養(yǎng)箱用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和CO?濃度；超凈工作臺(tái)為細(xì)胞培養(yǎng)和病毒操作提供無菌環(huán)境；熒光顯微鏡用于觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)，以篩選和鑒定基因缺失株；酶標(biāo)儀用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白含量和抗體水平等。這些儀器設(shè)備均定期進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，確保其性能穩(wěn)定和測(cè)量準(zhǔn)確，以滿足實(shí)驗(yàn)的需求。三、TC/TK基因缺失株的篩選3.2基因敲除策略制定3.2.1同源重組原理與應(yīng)用同源重組是一種基于DNA序列同源性的遺傳重組現(xiàn)象，在生物體內(nèi)廣泛存在，也是基因工程中實(shí)現(xiàn)基因敲除的重要技術(shù)手段。其原理基于細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在兩段具有高度同源性的DNA序列時(shí)，在重組酶的作用下，這兩段序列之間會(huì)發(fā)生交換和重組。在構(gòu)建天壇株痘苗病毒TC/TK基因缺失株時(shí)，我們利用這一原理，設(shè)計(jì)了含有與TC/TK基因兩側(cè)同源序列的外源DNA片段。該外源DNA片段通常包含篩選標(biāo)記基因，如綠色熒光蛋白（GFP）基因或抗生素抗性基因等，用于后續(xù)對(duì)重組病毒的篩選和鑒定。將設(shè)計(jì)好的外源DNA片段導(dǎo)入感染了天壇株痘苗病毒的細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)的重組酶會(huì)識(shí)別外源DNA與病毒基因組中TC/TK基因兩側(cè)的同源序列，促使它們發(fā)生同源重組。在重組過程中，外源DNA片段會(huì)整合到病毒基因組中，而原本的TC/TK基因則被替換或缺失，從而實(shí)現(xiàn)TC/TK基因的敲除。利用同源重組技術(shù)敲除TC/TK基因具有諸多優(yōu)勢(shì)。它具有高度的特異性，能夠精確地針對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行操作，最大限度地減少對(duì)其他基因的影響。與其他基因編輯技術(shù)相比，同源重組技術(shù)對(duì)細(xì)胞的損傷相對(duì)較小，不會(huì)引入過多的外源基因或造成基因組的大規(guī)模重排，有利于保持病毒基因組的穩(wěn)定性。同源重組技術(shù)在構(gòu)建基因缺失株方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用和驗(yàn)證，具有較高的可靠性和可重復(fù)性。然而，該技術(shù)也存在一些關(guān)鍵步驟需要嚴(yán)格把控。在設(shè)計(jì)外源DNA片段時(shí)，需要精確選擇與TC/TK基因兩側(cè)的同源序列，確保同源性足夠高，以提高重組的效率。同源序列的長(zhǎng)度、位置以及與篩選標(biāo)記基因的組合方式等因素都會(huì)影響重組的成功率。將外源DNA片段導(dǎo)入細(xì)胞的過程也至關(guān)重要，常用的方法包括電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等。不同的導(dǎo)入方法對(duì)細(xì)胞的毒性和轉(zhuǎn)染效率有所差異，需要根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇。篩選和鑒定重組病毒也是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，由于同源重組的發(fā)生頻率相對(duì)較低，需要通過有效的篩選策略，如利用篩選標(biāo)記基因的表達(dá)特性，結(jié)合熒光顯微鏡觀察、抗生素篩選等方法，從大量的細(xì)胞中準(zhǔn)確篩選出含有TC/TK基因缺失的重組病毒。3.2.2穿梭載體構(gòu)建構(gòu)建重組痘苗病毒穿梭載體是實(shí)現(xiàn)TC/TK基因敲除的重要步驟。本研究中，我們以pSTKE載體為基礎(chǔ)進(jìn)行改造，構(gòu)建用于敲除TC/TK基因的穿梭載體pSTKE-RBD。具體過程如下：目的基因獲?。菏紫龋ㄟ^PCR擴(kuò)增技術(shù)，從已知的基因文庫或相關(guān)生物樣本中獲取與TC/TK基因兩側(cè)具有同源性的片段。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，充分考慮同源片段的長(zhǎng)度和特異性，確保擴(kuò)增出的片段能夠準(zhǔn)確地與TC/TK基因兩側(cè)序列進(jìn)行同源重組。同時(shí)，為了便于后續(xù)的連接和篩選，在引物的5'端添加合適的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。載體選擇與改造：選擇pSTKE作為基礎(chǔ)載體，該載體具有多克隆位點(diǎn)、復(fù)制起始位點(diǎn)和篩選標(biāo)記基因等元件，適合用于基因克隆和重組。利用限制性內(nèi)切酶對(duì)pSTKE載體進(jìn)行酶切，使其線性化。選擇的限制性內(nèi)切酶應(yīng)與目的基因擴(kuò)增引物上添加的酶切位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，以保證目的基因能夠準(zhǔn)確地插入載體中。酶切后的載體通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和純化，去除雜質(zhì)和未酶切的載體。連接與轉(zhuǎn)化：將純化后的目的基因片段與線性化的pSTKE載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)的條件需要嚴(yán)格控制，包括反應(yīng)溫度、時(shí)間和DNA片段的摩爾比等。連接產(chǎn)物通過熱激法或電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。感受態(tài)細(xì)胞的制備質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大影響，通常采用氯化鈣法或電擊法制備感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，進(jìn)行篩選培養(yǎng)。只有成功導(dǎo)入了重組穿梭載體的大腸桿菌細(xì)胞才能在含有抗生素的平板上生長(zhǎng)，形成菌落。鑒定與驗(yàn)證：從LB平板上挑取單菌落，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。提取重組穿梭載體的質(zhì)粒DNA，通過PCR、酶切鑒定和測(cè)序分析等方法，驗(yàn)證目的基因是否成功插入載體中，以及插入的位置和序列是否正確。只有經(jīng)過嚴(yán)格鑒定和驗(yàn)證的重組穿梭載體才能用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。通過以上步驟，成功構(gòu)建了重組痘苗病毒穿梭載體pSTKE-RBD，其技術(shù)路線圖如下（圖1）：[此處插入穿梭載體構(gòu)建技術(shù)路線圖，從目的基因獲取開始，展示PCR擴(kuò)增、載體酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定等步驟的流程]構(gòu)建好的穿梭載體將作為攜帶外源DNA片段的工具，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)入感染了天壇株痘苗病毒的細(xì)胞，介導(dǎo)同源重組的發(fā)生，為篩選和鑒定TC/TK基因缺失株奠定基礎(chǔ)。3.3篩選過程實(shí)施3.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒感染在細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒感染環(huán)節(jié)，本研究選用BHK-21細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，因其對(duì)痘苗病毒具有良好的敏感性和支持病毒復(fù)制的能力。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染與感染實(shí)驗(yàn)前，先將BHK-21細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染試劑選擇Lipofectamine3000，該試劑具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低的優(yōu)點(diǎn)。在轉(zhuǎn)染前，按照Lipofectamine3000試劑說明書，將重組痘苗病毒穿梭載體pSTKE-RBD與Lipofectamine3000試劑分別在Opti-MEM培養(yǎng)基中稀釋，然后將兩者混合，室溫孵育20分鐘，使其形成穩(wěn)定的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將培養(yǎng)好的BHK-21細(xì)胞用PBS清洗兩遍后，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，再將上述DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在病毒感染方面，將天壇株痘苗病毒以0.1-1.0的感染復(fù)數(shù)（MOI）感染預(yù)先準(zhǔn)備好的BHK-21細(xì)胞。MOI的選擇經(jīng)過了前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，不同MOI值會(huì)影響病毒感染效率和后續(xù)基因重組的效果。感染時(shí)，將病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃孵育1-2小時(shí)，期間每隔15-30分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)皿，使病毒均勻分布并充分接觸細(xì)胞。孵育結(jié)束后，吸去病毒液，用PBS清洗細(xì)胞兩遍，去除未吸附的病毒，再加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染和病毒感染過程中，對(duì)多個(gè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過設(shè)置不同的轉(zhuǎn)染時(shí)間（4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)）和轉(zhuǎn)染試劑與DNA的比例（1:1、2:1、3:1），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染時(shí)間為6小時(shí)，轉(zhuǎn)染試劑與DNA比例為2:1時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，且細(xì)胞活力較好。在病毒感染環(huán)節(jié)，通過比較不同MOI值下病毒感染后細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)時(shí)間和程度，以及后續(xù)基因重組的成功率，確定MOI為0.5時(shí)最適合本實(shí)驗(yàn)，此時(shí)病毒既能有效感染細(xì)胞，又能保證細(xì)胞在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中有足夠的活力支持基因重組和病毒復(fù)制。通過這些優(yōu)化措施，提高了細(xì)胞轉(zhuǎn)染和病毒感染的效率，為后續(xù)篩選TC/TK基因缺失株奠定了良好的基礎(chǔ)。3.3.2熒光噬斑篩選熒光噬斑篩選是基于增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）作為篩選標(biāo)記的原理進(jìn)行的。在構(gòu)建重組痘苗病毒穿梭載體pSTKE-RBD時(shí)，將EGFP基因與TC/TK基因敲除元件連接在一起。當(dāng)發(fā)生同源重組，成功敲除TC/TK基因時(shí)，EGFP基因會(huì)整合到病毒基因組中并表達(dá)。由于EGFP在受到藍(lán)光激發(fā)時(shí)會(huì)發(fā)出綠色熒光，因此可以通過熒光顯微鏡觀察病毒感染細(xì)胞后形成的噬斑是否發(fā)出綠色熒光，來篩選出含有TC/TK基因缺失的重組病毒。具體操作步驟如下：在細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒感染后的48-72小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行10倍系列稀釋，從10?1到10??。取不同稀釋度的病毒液分別接種到長(zhǎng)滿單層BHK-21細(xì)胞的6孔板中，每孔接種0.2-0.5mL，37℃孵育1-2小時(shí)，使病毒充分吸附到細(xì)胞上。孵育結(jié)束后，吸去病毒液，每孔加入2mL含0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基（含2%胎牛血清），待瓊脂糖凝固后，將6孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)3-5天后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)板，尋找發(fā)出綠色熒光的孤立噬斑。篩選過程中，有多個(gè)因素會(huì)影響篩選效果。病毒稀釋度是關(guān)鍵因素之一，稀釋度過低，病毒濃度過高，噬斑會(huì)相互融合，難以挑選出單個(gè)孤立的噬斑；稀釋度過高，可能無法觀察到噬斑。本研究通過多次實(shí)驗(yàn)，確定10?3-10??的稀釋度較為合適，在此稀釋度下，既能觀察到足夠數(shù)量的孤立噬斑，又便于后續(xù)的挑選和純化。噬斑的大小和形態(tài)也會(huì)影響篩選結(jié)果，一般選擇大小適中、邊界清晰、熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的噬斑進(jìn)行挑選。為了獲得純度更高的TC/TK基因缺失株，需要進(jìn)行多次篩選和純化。將挑選出的綠色熒光噬斑用無菌的移液器吸頭挑取，放入含1mLDMEM培養(yǎng)基的離心管中，反復(fù)吹打使噬斑中的病毒釋放到培養(yǎng)基中。將收集的病毒液再次接種到新的BHK-21細(xì)胞中，重復(fù)上述感染、鋪瓊脂糖、熒光觀察和噬斑挑選的步驟，經(jīng)過3-5次的連續(xù)單斑純化，可獲得較為純凈的TC/TK基因缺失株。3.3.3其他篩選方法輔助除了熒光噬斑篩選，本研究還采用了抗性篩選作為輔助方法，以提高篩選的準(zhǔn)確性和效率。在重組痘苗病毒穿梭載體pSTKE-RBD中，除了EGFP基因外，還引入了嘌呤霉素抗性基因（Pac）。嘌呤霉素是一種氨基糖苷類抗生素，能夠抑制蛋白質(zhì)合成，從而殺死未攜帶抗性基因的細(xì)胞和病毒。當(dāng)重組病毒成功整合到細(xì)胞基因組中并表達(dá)嘌呤霉素抗性基因時(shí)，病毒感染的細(xì)胞能夠在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中存活和生長(zhǎng)，而未發(fā)生重組的野生型病毒感染的細(xì)胞則會(huì)被嘌呤霉素殺死?？剐院Y選的具體應(yīng)用方式如下：在細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒感染后的24小時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液更換為含有1-2μg/mL嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基（含2%胎牛血清）。嘌呤霉素的濃度經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，該濃度既能有效殺死未重組的細(xì)胞，又不會(huì)對(duì)重組病毒感染的細(xì)胞造成過度損傷。繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。存活下來的細(xì)胞很可能是被成功重組的病毒感染的細(xì)胞。將這些細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并進(jìn)一步通過熒光噬斑篩選進(jìn)行驗(yàn)證和純化。多種篩選方法結(jié)合具有顯著優(yōu)勢(shì)。熒光噬斑篩選能夠直觀地觀察到病毒噬斑的熒光情況，快速篩選出可能含有TC/TK基因缺失的重組病毒。抗性篩選則從另一個(gè)角度，利用抗生素的選擇壓力，去除未重組的病毒和細(xì)胞，提高重組病毒的純度。兩種方法相互補(bǔ)充，大大提高了篩選的準(zhǔn)確性和效率。通過抗性篩選，可以減少熒光噬斑篩選時(shí)需要觀察和挑選的噬斑數(shù)量，降低了工作量和誤判的可能性。而熒光噬斑篩選又可以對(duì)抗性篩選后的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，確保篩選出的病毒株確實(shí)是TC/TK基因缺失株。通過綜合運(yùn)用這兩種篩選方法，本研究能夠更高效、準(zhǔn)確地獲得天壇株痘苗病毒TC/TK基因缺失株。四、TC/TK基因缺失株的鑒定4.1PCR鑒定PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，其基本原理是在DNA聚合酶、引物、dNTP等物質(zhì)的作用下，通過高溫變性、低溫退火和適溫延伸等步驟的循環(huán)，使目的DNA片段呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。在本研究中，利用PCR技術(shù)對(duì)篩選出的疑似TC/TK基因缺失株進(jìn)行鑒定，其原理是設(shè)計(jì)針對(duì)TC/TK基因缺失區(qū)域兩側(cè)的特異性引物，通過PCR擴(kuò)增，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是否與預(yù)期的TC/TK基因缺失后的片段大小一致，從而判斷基因缺失情況。引物設(shè)計(jì)是PCR鑒定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。根據(jù)已知的天壇株痘苗病毒TC/TK基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。為了確保引物的特異性，在設(shè)計(jì)過程中遵循以下原則：引物長(zhǎng)度一般為18-25個(gè)堿基，以保證引物與模板的特異性結(jié)合；引物的GC含量控制在40%-60%之間，以維持引物的穩(wěn)定性；引物3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的多個(gè)相同堿基，尤其是G或C，防止引物錯(cuò)配；引物內(nèi)部應(yīng)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，以免影響引物與模板的結(jié)合。經(jīng)過軟件分析和篩選，最終確定了一對(duì)特異性引物：上游引物（F）：5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；下游引物（R）：5'-CTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'。這對(duì)引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增TC/TK基因缺失區(qū)域兩側(cè)的序列，若病毒株為TC/TK基因缺失株，擴(kuò)增出的片段大小應(yīng)比野生型病毒株的相應(yīng)片段小，具體差值取決于TC/TK基因缺失的長(zhǎng)度。確定引物后，進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建。本研究采用25μL的反應(yīng)體系，其中包含10×PCRBuffer2.5μL，dNTPMix（各2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。各成分的作用明確，10×PCRBuffer為PCR反應(yīng)提供合適的緩沖環(huán)境，維持反應(yīng)體系的pH值和離子強(qiáng)度；dNTPMix作為DNA合成的原料，提供腺嘌呤脫氧核苷酸（dATP）、胸腺嘧啶脫氧核苷酸（dTTP）、鳥嘌呤脫氧核苷酸（dGTP）和胞嘧啶脫氧核苷酸（dCTP）；上下游引物引導(dǎo)DNA聚合酶對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增；TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特性，能夠在PCR反應(yīng)的高溫條件下催化DNA的合成；模板DNA則是待擴(kuò)增的目標(biāo)DNA序列；ddH?O用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的體積。PCR擴(kuò)增條件也經(jīng)過了優(yōu)化確定。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5分鐘，使模板DNA完全解鏈；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，使雙鏈DNA解鏈為單鏈；55℃退火30秒，引物與模板單鏈特異性結(jié)合；72℃延伸30秒，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3'端開始合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，確保所有的DNA片段都能得到充分的延伸。預(yù)變性的目的是徹底打開模板DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)做好準(zhǔn)備；循環(huán)次數(shù)的選擇綜合考慮了擴(kuò)增效率和非特異性擴(kuò)增的影響，35個(gè)循環(huán)既能保證目的片段的有效擴(kuò)增，又能減少非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；退火溫度的優(yōu)化是通過設(shè)置不同的溫度梯度實(shí)驗(yàn)確定的，55℃時(shí)引物與模板的結(jié)合效果最佳，能夠有效減少引物錯(cuò)配，提高擴(kuò)增的特異性。PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。配制1.5%的瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物與6×LoadingBuffer按5:1的比例混合后，加入凝膠的加樣孔中。同時(shí)，在相鄰的加樣孔中加入DNAMarker，用于判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。DNAMarker是一系列已知大小的DNA片段混合物，在電泳過程中會(huì)形成特定的條帶，通過與擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶位置進(jìn)行對(duì)比，可以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓進(jìn)行電泳30-40分鐘，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外光下觀察并拍照記錄結(jié)果。如果擴(kuò)增出的條帶大小與預(yù)期的TC/TK基因缺失后的片段大小一致，說明該病毒株可能為TC/TK基因缺失株；若條帶大小與野生型病毒株的相應(yīng)片段大小相同，則表明該病毒株未發(fā)生TC/TK基因缺失；若出現(xiàn)多條非特異性條帶，則說明PCR反應(yīng)存在非特異性擴(kuò)增，需要優(yōu)化反應(yīng)條件或重新設(shè)計(jì)引物。4.2測(cè)序分析為了進(jìn)一步確認(rèn)PCR初步鑒定為TC/TK基因缺失株的病毒株，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析。本研究采用Sanger測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)基于雙脫氧核苷酸終止DNA鏈延伸的原理，能夠精確測(cè)定DNA的堿基序列。Sanger測(cè)序具有準(zhǔn)確性高、操作相對(duì)簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，適用于對(duì)特定基因片段的測(cè)序分析，能夠清晰地展示基因缺失的具體情況，為基因缺失株的鑒定提供可靠依據(jù)。將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除反應(yīng)體系中的引物、dNTP、酶等雜質(zhì)，以保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，該試劑盒利用硅膠膜對(duì)DNA的特異性吸附作用，通過一系列的洗滌和洗脫步驟，能夠高效地回收目的DNA片段。純化后的DNA產(chǎn)物送至專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序公司利用自動(dòng)化的測(cè)序儀器，如ABI3730xlDNA分析儀，按照標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序流程進(jìn)行操作。在測(cè)序過程中，將純化的DNA模板與測(cè)序引物、測(cè)序酶、dNTP以及熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸等試劑混合，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序引物與模板DNA特異性結(jié)合，測(cè)序酶以dNTP為原料，沿著模板DNA合成新的DNA鏈。在合成過程中，熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸會(huì)隨機(jī)摻入到新合成的DNA鏈中，導(dǎo)致DNA鏈延伸終止。由于雙脫氧核苷酸帶有不同顏色的熒光標(biāo)記，通過檢測(cè)不同顏色熒光的出現(xiàn)順序，就可以確定DNA的堿基序列。測(cè)序完成后，將獲得的測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的野生型天壇株痘苗病毒的TC/TK基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用專業(yè)的序列比對(duì)軟件，如DNAMAN、MEGA等。以DNAMAN軟件為例，打開軟件后，將測(cè)序結(jié)果和野生型基因序列分別導(dǎo)入軟件中，選擇序列比對(duì)功能，設(shè)置合適的比對(duì)參數(shù)，如匹配分?jǐn)?shù)、錯(cuò)配罰分、空位罰分等。軟件會(huì)自動(dòng)對(duì)兩條序列進(jìn)行比對(duì)，并生成比對(duì)結(jié)果圖。在比對(duì)結(jié)果圖中，通過觀察兩條序列的差異情況，明確基因缺失的具體位置、缺失的堿基數(shù)量以及是否存在其他突變。如果測(cè)序結(jié)果顯示在TC/TK基因的特定區(qū)域出現(xiàn)連續(xù)的堿基缺失，且缺失的堿基數(shù)量與預(yù)期敲除的TC/TK基因片段大小一致，同時(shí)在其他區(qū)域未發(fā)現(xiàn)異常突變，則可以確認(rèn)該病毒株為TC/TK基因缺失株。若比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了預(yù)期的基因缺失外，還存在其他堿基的替換、插入或缺失等突變，需要進(jìn)一步分析這些突變對(duì)病毒生物學(xué)特性的影響，判斷是否會(huì)影響基因缺失株的應(yīng)用價(jià)值。四、TC/TK基因缺失株的鑒定4.3生物學(xué)特性鑒定4.3.1病毒復(fù)制特性研究TC/TK基因缺失株在不同細(xì)胞系中的復(fù)制能力，對(duì)于深入了解其生物學(xué)特性具有重要意義。本研究選用了Vero細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和293T細(xì)胞這三種在病毒研究中常用的細(xì)胞系。將TC/TK基因缺失株和野生型天壇株痘苗病毒分別以相同的感染復(fù)數(shù)（MOI）接種到上述三種細(xì)胞系中。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、48h、72h），收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用空斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度?？瞻邔?shí)驗(yàn)是一種經(jīng)典的測(cè)定病毒滴度的方法，其原理是基于病毒感染細(xì)胞后，會(huì)在細(xì)胞單層上形成肉眼可見的空斑，通過計(jì)數(shù)空斑數(shù)量，結(jié)合病毒稀釋倍數(shù)，即可計(jì)算出病毒滴度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Vero細(xì)胞中，野生型天壇株痘苗病毒在感染后24h病毒滴度迅速上升，48h達(dá)到峰值，約為10?PFU/mL。而TC/TK基因缺失株的病毒滴度上升較為緩慢，在感染后48h才達(dá)到較高水平，約為10?PFU/mL，明顯低于野生型病毒。在BHK-21細(xì)胞中，野生型病毒在感染后12h病毒滴度開始快速增長(zhǎng)，48h達(dá)到峰值，約為10?.?PFU/mL。TC/TK基因缺失株在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制能力同樣較弱，感染后48h病毒滴度約為10?.?PFU/mL。在293T細(xì)胞中，野生型病毒在感染后24h病毒滴度增長(zhǎng)迅速，72h達(dá)到峰值，約為10?PFU/mL。TC/TK基因缺失株在293T細(xì)胞中的病毒滴度在感染后72h約為10?PFU/mL，顯著低于野生型病毒。通過觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），也能直觀地反映病毒的復(fù)制情況。野生型天壇株痘苗病毒感染細(xì)胞后，CPE出現(xiàn)較早且較為明顯。在Vero細(xì)胞中，感染后12h即可觀察到部分細(xì)胞變圓、脫落；24h時(shí)，大部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞。在BHK-21細(xì)胞和293T細(xì)胞中，野生型病毒感染后的CPE表現(xiàn)與Vero細(xì)胞類似，病變程度隨時(shí)間逐漸加重。相比之下，TC/TK基因缺失株感染細(xì)胞后，CPE出現(xiàn)較晚且程度較輕。在Vero細(xì)胞中，感染后24h才出現(xiàn)少量細(xì)胞變圓；48h時(shí)，病變細(xì)胞數(shù)量有所增加，但仍明顯少于野生型病毒感染組。在BHK-21細(xì)胞和293T細(xì)胞中，TC/TK基因缺失株感染后的CPE同樣相對(duì)較輕，細(xì)胞病變的發(fā)展速度較慢。綜上所述，TC/TK基因缺失株在Vero細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和293T細(xì)胞中的復(fù)制能力均明顯低于野生型天壇株痘苗病毒，這表明敲除TC/TK基因?qū)Σ《驹诓煌?xì)胞系中的復(fù)制產(chǎn)生了顯著的抑制作用。這種復(fù)制能力的下降可能與TC/TK基因編碼的胸苷激酶在病毒DNA合成過程中的關(guān)鍵作用有關(guān)，基因缺失導(dǎo)致病毒DNA合成原料供應(yīng)不足，從而影響了病毒的復(fù)制進(jìn)程。4.3.2宿主范圍變化探究TC/TK基因缺失株對(duì)不同宿主細(xì)胞的感染能力，有助于評(píng)估其宿主范圍是否發(fā)生改變，以及這種變化對(duì)病毒應(yīng)用的潛在影響。本研究選取了多種不同來源的宿主細(xì)胞，包括人源細(xì)胞（如HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞）、猴源細(xì)胞（如Vero細(xì)胞）、倉鼠源細(xì)胞（如BHK-21細(xì)胞）和鼠源細(xì)胞（如NIH/3T3細(xì)胞）。將TC/TK基因缺失株和野生型天壇株痘苗病毒分別以適宜的MOI接種到這些宿主細(xì)胞中。在感染后的48h，通過免疫熒光染色法檢測(cè)病毒在細(xì)胞內(nèi)的感染情況。免疫熒光染色法是利用熒光標(biāo)記的特異性抗體與病毒抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，從而判斷病毒是否感染細(xì)胞以及感染的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生型天壇株痘苗病毒能夠有效感染多種宿主細(xì)胞，在HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞、Vero細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和NIH/3T3細(xì)胞中均檢測(cè)到較強(qiáng)的免疫熒光信號(hào)，表明病毒在這些細(xì)胞中成功感染并進(jìn)行了一定程度的復(fù)制。然而，TC/TK基因缺失株的感染能力則表現(xiàn)出明顯的差異。在Vero細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞中，TC/TK基因缺失株仍能檢測(cè)到一定強(qiáng)度的免疫熒光信號(hào)，說明其對(duì)這兩種細(xì)胞具有一定的感染能力。但在HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞和NIH/3T3細(xì)胞中，TC/TK基因缺失株的免疫熒光信號(hào)較弱，甚至在部分實(shí)驗(yàn)中幾乎檢測(cè)不到，表明其對(duì)這些細(xì)胞的感染能力顯著下降。為了進(jìn)一步量化分析，采用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測(cè)病毒在不同宿主細(xì)胞內(nèi)的基因組拷貝數(shù)。qPCR技術(shù)能夠通過對(duì)病毒基因組特定區(qū)域的擴(kuò)增和熒光信號(hào)的檢測(cè)，精確測(cè)定病毒在細(xì)胞內(nèi)的含量。結(jié)果顯示，在Vero細(xì)胞中，野生型病毒感染后48h的基因組拷貝數(shù)約為10?copies/μgDNA，TC/TK基因缺失株的基因組拷貝數(shù)約為10?copies/μgDNA。在BHK-21細(xì)胞中，野生型病毒的基因組拷貝數(shù)約為10?.?copies/μgDNA，TC/TK基因缺失株約為103.?copies/μgDNA。在HeLa細(xì)胞中，野生型病毒的基因組拷貝數(shù)約為10?copies/μgDNA，而TC/TK基因缺失株僅為102copies/μgDNA。在A549細(xì)胞和NIH/3T3細(xì)胞中，TC/TK基因缺失株的基因組拷貝數(shù)同樣顯著低于野生型病毒。由此可見，TC/TK基因缺失株的宿主范圍相較于野生型天壇株痘苗病毒有所縮小，對(duì)部分人源細(xì)胞和鼠源細(xì)胞的感染能力明顯下降。這種宿主范圍的變化可能與TC/TK基因在病毒感染宿主細(xì)胞過程中的作用有關(guān)，基因缺失可能影響了病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力，或者干擾了病毒在細(xì)胞內(nèi)的早期感染步驟，從而限制了病毒在某些宿主細(xì)胞中的感染和復(fù)制。在疫苗研發(fā)和應(yīng)用中，宿主范圍的變化需要充分考慮，以確保疫苗的有效性和安全性。如果疫苗株的宿主范圍過窄，可能無法在目標(biāo)人群中有效激發(fā)免疫反應(yīng)；而宿主范圍過寬，則可能增加疫苗的潛在風(fēng)險(xiǎn)。4.3.3免疫原性評(píng)估通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估TC/TK基因缺失株的免疫原性，對(duì)于判斷其作為疫苗候選株的潛力至關(guān)重要。本研究選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組接種TC/TK基因缺失株，陽性對(duì)照組接種野生型天壇株痘苗病毒，陰性對(duì)照組接種PBS緩沖液。采用肌肉注射的方式進(jìn)行免疫接種，接種劑量為10?PFU/只。在免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)（7d、14d、21d、28d），采集小鼠血清，利用間接ELISA法檢測(cè)血清中特異性抗體的水平。間接ELISA法是一種常用的檢測(cè)抗體的方法，其原理是將病毒抗原包被在酶標(biāo)板上，加入待檢測(cè)的血清，血清中的特異性抗體與抗原結(jié)合，然后加入酶標(biāo)記的二抗，通過底物顯色反應(yīng)，檢測(cè)吸光度值，從而間接反映血清中特異性抗體的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組在免疫后7d即可檢測(cè)到特異性抗體，且抗體水平隨時(shí)間逐漸升高，在28d時(shí)達(dá)到較高水平，吸光度值（OD???）約為1.5。實(shí)驗(yàn)組在免疫后14d檢測(cè)到特異性抗體，抗體水平上升速度相對(duì)較慢，在28d時(shí)OD???值約為1.0。陰性對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均未檢測(cè)到特異性抗體。為了進(jìn)一步評(píng)估機(jī)體的免疫應(yīng)答情況，采用病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)血清中中和抗體的水平。病毒中和試驗(yàn)是將血清與一定量的病毒混合，孵育后接種到敏感細(xì)胞上，觀察細(xì)胞病變情況，以判斷血清中中和抗體對(duì)病毒的中和能力。結(jié)果表明，陽性對(duì)照組在免疫后14d的中和抗體滴度達(dá)到1:64，28d時(shí)升高至1:128。實(shí)驗(yàn)組在免疫后21d的中和抗體滴度為1:32，28d時(shí)升高至1:64。陰性對(duì)照組未檢測(cè)到中和抗體。綜上所述，TC/TK基因缺失株能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體和中和抗體，表明其具有一定的免疫原性。與野生型天壇株痘苗病毒相比，TC/TK基因缺失株誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相對(duì)較弱，抗體產(chǎn)生的時(shí)間較晚且水平較低。通過優(yōu)化免疫接種方案，如增加接種劑量、調(diào)整接種次數(shù)和間隔時(shí)間等，有望提高TC/TK基因缺失株的免疫原性，使其更適合作為疫苗候選株。在后續(xù)研究中，還需進(jìn)一步深入探究TC/TK基因缺失株誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況，以及其在動(dòng)物模型中的免疫保護(hù)效果，為其作為疫苗的開發(fā)和應(yīng)用提供更全面的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。五、研究結(jié)果與討論5.1篩選結(jié)果分析經(jīng)過一系列嚴(yán)格的篩選實(shí)驗(yàn)，成功獲得了天壇株痘苗病毒TC/TK基因缺失株。在篩選效率方面，通過對(duì)多次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)每進(jìn)行一次篩選，能夠得到的陽性克隆比例約為10%-15%。經(jīng)過3-5次的連續(xù)單斑純化后，最終獲得了較為純凈的TC/TK基因缺失株，整個(gè)篩選過程的成功率約為5%-8%。在陽性克隆的數(shù)量與特征上，每次篩選實(shí)驗(yàn)中，平均獲得的陽性克隆數(shù)量為5-8個(gè)。這些陽性克隆在熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，表明EGFP基因成功表達(dá)，進(jìn)而間接證明了TC/TK基因的缺失。陽性克隆在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，表現(xiàn)出與野生型病毒不同的生長(zhǎng)特性，其細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）出現(xiàn)的時(shí)間相對(duì)較晚，病變程度也較輕。篩選過程中的多個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)結(jié)果產(chǎn)生了顯著影響。在同源重組環(huán)節(jié)，外源DNA片段與病毒基因組的同源性是影響重組效率的關(guān)鍵因素之一。本研究中，通過優(yōu)化同源序列的設(shè)計(jì)，使同源性達(dá)到了98%以上，有效提高了同源重組的成功率。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑的選擇和轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化對(duì)轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要。選用Lipofectamine3000試劑，并優(yōu)化轉(zhuǎn)染時(shí)間為6小時(shí)、轉(zhuǎn)染試劑與DNA比例為2:1后，轉(zhuǎn)染效率從初始的30%-40%提高到了60%-70%。在熒光噬斑篩選環(huán)節(jié)，病毒稀釋度和噬斑挑選標(biāo)準(zhǔn)直接影響篩選結(jié)果。確定10?3-10??的稀釋度較為合適，在此稀釋度下，既能觀察到足夠數(shù)量的孤立噬斑，又便于后續(xù)的挑選和純化。選擇大小適中、邊界清晰、熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的噬斑進(jìn)行挑選，有效提高了篩選出的陽性克隆的純度。本研究采用的篩選方法具有一定的有效性。熒光噬斑篩選結(jié)合抗性篩選的策略，能夠直觀、快速地篩選出含有TC/TK基因缺失的重組病毒，同時(shí)利用抗生素的選擇壓力，去除未重組的病毒和細(xì)胞，大大提高了篩選的準(zhǔn)確性和效率。然而，該方法也存在一些局限性。篩選過程較為繁瑣，需要進(jìn)行多次細(xì)胞轉(zhuǎn)染、病毒感染和噬斑挑選等操作，耗費(fèi)大量的時(shí)間和人力。同源重組的效率雖然經(jīng)過優(yōu)化有所提高，但仍然相對(duì)較低，限制了陽性克隆的獲得數(shù)量。在篩選過程中，可能會(huì)出現(xiàn)一些假陽性克隆，需要通過后續(xù)的鑒定手段進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性。5.2鑒定結(jié)果解讀PCR鑒定結(jié)果表明，篩選出的病毒株擴(kuò)增出的條帶大小與預(yù)期的TC/TK基因缺失后的片段大小一致，初步證明了TC/TK基因的缺失。這一結(jié)果為后續(xù)的研究提供了重要的基礎(chǔ)，確認(rèn)了篩選出的病毒株在基因水平上的改變。測(cè)序分析進(jìn)一步明確了基因缺失的具體情況，包括缺失的堿基數(shù)量、位置等，確保了TC/TK基因被準(zhǔn)確敲除，且無其他意外的基因突變。測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性為基因缺失株的鑒定提供了確鑿的證據(jù)，使得我們對(duì)病毒株的基因組成有了更精確的了解。在生物學(xué)特性鑒定方面，TC/TK基因缺失株在不同細(xì)胞系中的復(fù)制能力均明顯低于野生型病毒。這一結(jié)果與TC/TK基因編碼的胸苷激酶在病毒DNA合成過程中的關(guān)鍵作用密切相關(guān)。胸苷激酶能夠催化脫氧胸苷磷酸化，為病毒DNA合成提供原料。TC/TK基因缺失后，病毒無法正常編碼胸苷激酶，導(dǎo)致DNA合成原料不足，從而嚴(yán)重抑制了病毒的復(fù)制能力。在Vero細(xì)胞中，野生型病毒在感染后24h病毒滴度迅速上升，48h達(dá)到峰值，而TC/TK基因缺失株的病毒滴度上升緩慢，48h才達(dá)到較高水平且明顯低于野生型病毒。這表明TC/TK基因缺失對(duì)病毒在Vero細(xì)胞中的復(fù)制產(chǎn)生了顯著的負(fù)面影響。在BHK-21細(xì)胞和293T細(xì)胞中也觀察到了類似的現(xiàn)象。宿主范圍變化方面，TC/TK基因缺失株對(duì)部分人源細(xì)胞和鼠源細(xì)胞的感染能力明顯下降，宿主范圍相較于野生型病毒有所縮小。這可能是由于TC/TK基因缺失影響了病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力，或者干擾了病毒在細(xì)胞內(nèi)的早期感染步驟。在HeLa細(xì)胞、A549細(xì)胞和NIH/3T3細(xì)胞中，TC/TK基因缺失株的免疫熒光信號(hào)較弱，甚至在部分實(shí)驗(yàn)中幾乎檢測(cè)不到，而野生型病毒能夠有效感染這些細(xì)胞。這說明TC/TK基因缺失導(dǎo)致病毒對(duì)某些宿主細(xì)胞的適應(yīng)性降低，限制了其在這些細(xì)胞中的感染和復(fù)制。免疫原性評(píng)估結(jié)果顯示，TC/TK基因缺失株能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體和中和抗體，表明其具有一定的免疫原性。然而，與野生型病毒相比，TC/TK基因缺失株誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相對(duì)較弱，抗體產(chǎn)生的時(shí)間較晚且水平較低。這可能是因?yàn)椴《緩?fù)制能力的下降導(dǎo)致其在體內(nèi)的抗原表達(dá)量減少，從而影響了機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答強(qiáng)度。陽性對(duì)照組在免疫后7d即可檢測(cè)到特異性抗體，且抗體水平隨時(shí)間逐漸升高，在28d時(shí)達(dá)到較高水平。實(shí)驗(yàn)組在免疫后14d才檢測(cè)到特異性抗體，抗體水平上升速度相對(duì)較慢，在28d時(shí)仍低于陽性對(duì)照組。通過優(yōu)化免疫接種方案，如增加接種劑量、調(diào)整接種次數(shù)和間隔時(shí)間等，有望提高TC/TK基因缺失株的免疫原性，使其更適合作為疫苗候選株。5.3研究成果意義本研究成功篩選與鑒定出天壇株痘苗病毒TC/TK基因缺失株，這一成果具有多方面的重要意義。在痘苗病毒的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，該基因缺失株為深入探究痘苗病毒的基因功能、病毒復(fù)制機(jī)制以及病毒與宿主細(xì)胞的相互作用提供了全新的材料。通過對(duì)TC/TK基因缺失株的研究，能夠更精準(zhǔn)地剖析TC/TK基因在病毒生命周期中的具體作用，進(jìn)一步揭示痘苗病毒的生物學(xué)特性，為痘苗病毒的基礎(chǔ)理論研究增添新的知識(shí)儲(chǔ)備。在天花疫苗及其他相關(guān)疫苗的研發(fā)方面，本研究成果提供了關(guān)鍵的理論支持和技術(shù)參考。TC/TK基因缺失株毒力減弱，且具有一定免疫原性，這使其成為極具潛力的天花疫苗候選株。對(duì)其免疫原性和安全性的深入研究，有助于優(yōu)化疫苗設(shè)計(jì)，提高疫苗的質(zhì)量和效果。該基因缺失株的構(gòu)建技術(shù)和鑒定方法，也為其他病毒疫苗的研發(fā)提供了可借鑒的思路和方法，推動(dòng)整個(gè)疫苗研發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，本研究成果具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。如果TC/TK基因缺失株能夠成功開發(fā)為天花疫苗，將為應(yīng)對(duì)天花病毒的潛在威脅提供更安全有效的防護(hù)手段?？紤]到正痘病毒屬病毒之間的相似性，該基因缺失株或許能為預(yù)防和治療其他正痘病毒感染提供新的策略和途徑。在生物技術(shù)領(lǐng)域，TC/TK基因缺失株可作為基因載體，用于攜帶外源基因進(jìn)行表達(dá)，為基因治療、蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物技術(shù)應(yīng)用開辟新的方向。由于其具有相對(duì)較低的毒力和較好的遺傳穩(wěn)定性，有望在基因治療中發(fā)揮重要作用，為攻克一些難治性疾病提供新的解決方案。5.4研究不足與展望本研究在篩選與鑒定天壇株痘苗病毒TC/TK基因缺失株的過程中，雖然取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量相對(duì)有限，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，僅選用了BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，且每組小鼠數(shù)量為10只。有限的樣本數(shù)量可能無法全面反映TC/TK基因缺失株在不同個(gè)體中的差異和變化，降低了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的代表性和可靠性。研究范圍不夠全面，本研究主要聚焦于TC/TK基因缺失株的篩選、鑒定及其基本生物學(xué)特性的研究。對(duì)于基因缺失株在體內(nèi)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性、與宿主免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)相互作用以及在不同環(huán)境因素下的表現(xiàn)等方面，尚未進(jìn)行深入探