微

量

熱

泳

動

分

子

互

作儀MicroscaleThermophoresis,

MST目

錄0 微量熱泳動技術原理02 實驗流程及軟件應用實驗問題和優(yōu)化方案應用案例分享01PART微量熱泳動技術原理

微量熱泳動技術原理 HUMANMST術語TARGET

→

熒光分子LIGAND

→

不激發(fā)熒光分子，配體

微量熱泳動技術原理 HUMAN工作原理紅外激光熒光激發(fā)毛細管檢測器逐個掃描熒光分子結合初始熒光 紅外激光開啟紅外激光關閉MST

trace

微量熱泳動技術原理 HUMANMST

信號變化來源于熱泳動和溫度依賴的熒光強度變化熱泳動（Thermophoresis）分子在溫度梯度內的定向運動會改變熒光分子的濃度；熒光濃度變化的程度取決于分子的整體性質，例如大小，水化層和電荷溫度依賴的熒光強度變化（TRIC）熒光強度與溫度有關熒光強度與熒光團的化學環(huán)境密切相關TemperatureTemperature

微量熱泳動技術原理 HUMANunboundbound由MST結合曲線得出平衡解離常數KdF0 F1FitKdRelative

fluorescenceKd越小，親和力越強02PART實驗流程及軟件應用

實驗流程及軟件使用 HUMANMST實驗流程1.

蛋白質控 2.

Target制備3.

Pretest4.

親和力檢測5.

數據分析

實驗流程及軟件使用 HUMANMST實驗流程

實驗流程及軟件使用 HUMAN樣品生物活性

實驗流程及軟件使用 HUMAN1.

蛋白質控2.

Target制備3.

Pretest4.

親和力檢測5.

數據分析HUMANNHS

kit:

通過賴氨酸側鏈氨基偶聯Maleimide

kit:

通過半胱氨酸偶聯tris-NTAkit:

His-tag特異性標記表達融合蛋白(i.e.

GFP)

實驗流程及軟件使用 Target制備——選擇標記方式SNAP-tagkit:SNAP

tag特異性標記NanoTemper蛋白標記試劑盒專為MST實驗優(yōu)化直接合成熒光樣品(核酸、多肽…)Cy5

實驗流程及軟件使用 HUMAN選擇合適的通道 推薦使用紅色通道

實驗流程及軟件使用 HUMAN1.

蛋白質控2.

Target制備3.

Pretest4.

親和力檢測5.

數據分析

實驗流程及軟件使用 HUMAN確定產生足夠熒光強度的Target濃度（應低于預估的Kd值）檢查Target是否與毛細管吸附檢測Target是否聚集Aggregated

sampleHomogeneous

sampleAdsorptionNo

adsorptionPretest檢測器熒光強度Nano200~2000Pico

RED3000-20000

實驗流程及軟件使用 HUMAN1.

蛋白質控2.

Target制備3.

Pretest4.

親和力檢測5.

數據分析

實驗流程及軟件使用 HUMANBinding

Check（定性）Targetonly

3根毛細管+Target

&

高濃度ligand分子3根毛細管判斷是否有結合結合buffer篩選

實驗流程及軟件使用 HUMAN1.

Ligand稀釋Binding

Affinity（定量）準備20μl

Ligand（濃度為Kd的20~50倍）向其他15個PCR管中各加入10μl

Buffer依次完成梯度稀釋，最后一管棄去10μl

實驗流程及軟件使用 HUMAN2.

加入Target準備200μl

Target（濃度<Kd，通常20~100nM）向所有PCR管中各加入10μl

Target并混勻使用毛細管吸取樣品，上機檢測Binding

Affinity廠0 云 M

尸云Bindine:

affinity樣品配

實驗流程及軟件使用 HUMAN1.

蛋白質控2.

Target制備3.

Pretest4.

親和力檢測5.

數據分析HUMAN軟件應用MO.Control自動生成實驗protocol及時反饋問題并給出優(yōu)化意見檢測完成后可立即查看Kd結果MO.Affinity

Analysis分析Kd數據合并/對比分析導出圖片/數據/報告

實驗流程及軟件使用 03PART實驗問題與優(yōu)化方案

實驗問題與優(yōu)化方案 HUMANPretest---Target濃度熒光值過低熒光值過高Target濃度：低于預估的Kd值+符合儀器熒光范圍HUMANPretest---吸附和聚集吸附更換毛細管(Standard→Premium)添加去垢劑(0.05%

Tween

20,

0.1%

PluronicF-127)調整緩沖液成分(pH,salt

concentration...)聚集離心

(10min >15,000

xg,

4℃)，添加去垢劑(0.05%Tween20,0.1%Pluronic

F-127)調整緩沖液成分(pH,

salt

concentration...)檢查有機溶劑濃度

(DMSO...)

實驗問題與優(yōu)化方案 HUMAN樣品制備中的注意事項Target濃度:

低于預估Kd值；符合儀器熒光要求Ligand最高濃度:

預估Kd值的20-50倍每個樣品最終體積:

~20

μL使用小體積離心管進行梯度稀釋:

如PCR管或8聯排梯度稀釋使用的緩沖液中DMSO等組分需保持不變精確移液為關鍵移液器吹打而非渦旋混勻不要觸碰毛細管中心區(qū)域

實驗問題與優(yōu)化方案 HUMAN托盤放置

實驗問題與優(yōu)化方案 04PART應用案例分享

應用案例分享 HUMAN蛋白抗體，膜蛋白，受體，酶，納米抗體小分子片段，離子，納米顆粒，多核酸DNA,

RNA

，適配體囊泡外泌體，脂質體血小板，細胞病毒顆粒肽，糖類

應用案例分享 HUMAN小分子腫瘤抑制劑開發(fā)

應用案例分享 HUMANPan-

RAS腫瘤抑制劑開發(fā)RAS家族蛋白與多種癌癥發(fā)生相關分析KRAS蛋白結構找到三個潛在位點結合計算機模擬分子對接能夠同時結合2個或3個位點的化合物得到候選化合物3144

應用案例分享 HUMANPan-

RAS腫瘤抑制劑開發(fā)MST和ITC、NMR等方法共同驗證了化合物3144和KRAS的結合活性MST技術樣品用量少，檢測速度快(0.4ug，10min一組Kd）使用MST完成了17對Kd檢測Kd=9μM

±1μM

應用案例分享 HUMAN神經退行性疾病的研究——靶向降解蛋白聚集體應用案例分享HUMAN自噬小體綁定化合物——治療亨廷頓舞蹈癥新思路亨廷頓舞蹈癥病因：突變型亨廷頓蛋白CAG三核苷酸重復擴增導致蛋白錯誤折疊而形成聚集物自噬過程中，LC3擴增形成膜結構，并將目標蛋白等降解目標包裹于其中，形成自噬小體，與溶酶體融合后，其中包裹的物質得以降解

應用案例分享 HUMANMST對小分子化合物的結合進行快速表征難點：mHTT（350KDa）與化合物（500Da） 分子量差700倍，SPR實驗檢測信噪比很低MST基于熒光值變化的互作檢測技術，不受分子量所限制，不挑緩沖液，檢測蛋白聚集體有顯著的優(yōu)勢

應用案例分享 HUMAN中藥活性成分驗證蛋白免純化檢測

應用案例分享 HUMAN應用案例分享HUMANTRAF2蛋白與LDA結合Pif1蛋白

為陰性對照確認LDA結合位點(免純化檢測)Ligand

[M]TRAF2蛋白不與LDA類似物結合中藥小分子抑制結腸癌Wnt/β-catenin通路1、MST實驗結果證明:

LDA可直接結合TRAF2,而不與Pif1蛋白

(陰性對照)

結合