印度刺猬蛋白相關(guān)信號通路在骨生長調(diào)控中的作用研究進展2026骨起源于中胚層組織，其生長發(fā)育依賴于兩種不同的骨化形式，分別是膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。膜內(nèi)成骨見于頭面骨、肩胛骨等，即間充質(zhì)干細胞直接增殖、分化為成骨細胞并沉積為骨組織；而軟骨內(nèi)成骨則見于四肢骨及軀干骨等，胎兒時期間充質(zhì)干細胞分化形成軟骨模板，后有骨滋養(yǎng)動脈長入以提供營養(yǎng)物質(zhì)。軟骨細胞首先分化為成骨細胞，與骨膜相連形成原始骨化中心并逐漸擴大，最終成骨細胞增殖分化形成骨骺。到兒童生長發(fā)育期，長骨的縱向生長主要依賴于骨骺和干骺端之間的生長板軟骨細胞柱的軟骨內(nèi)成骨的作用，與初期形成原始骨化中心的生理過程相似

［1］

。骨生長發(fā)育過程受多方面的調(diào)節(jié)。生長激素-胰島素樣生長因子-1軸（growthhormone-insulin-likegrowthfactor-1axis，GH-IGF-1）的中樞調(diào)節(jié)被認為是長骨縱向生長最重要的調(diào)節(jié)機制［2］。GH/IGF-1敲除小鼠骨骼的生長發(fā)育被嚴重抑制。有研究表明，旁分泌因子、轉(zhuǎn)錄因子、內(nèi)分泌激素、細胞外基質(zhì)等對生長板軟骨細胞的局部調(diào)控也不可忽視。局部性調(diào)控生長板的某種蛋白或者轉(zhuǎn)錄因子異常，可使其所關(guān)聯(lián)信號通路失調(diào)，可導(dǎo)致軟骨發(fā)育障礙而引起身材矮小、骨骼畸形等骨骼發(fā)育相關(guān)的疾病［3-4］。印度刺猬蛋白（Indianhedgehog，Ihh）在骨的生長發(fā)育過程中可通過多種途徑調(diào)節(jié)軟骨細胞的增殖、分化，維持骨的縱向生長和正常形態(tài)，并且近年來研究表明，Ihh不僅可以調(diào)控骨的軟骨內(nèi)成骨，對膜內(nèi)成骨也具有一定的影響，現(xiàn)就其對生長板軟骨細胞的作用機制及相關(guān)通路進行綜述。1

Ihh與骨的生長發(fā)育Ihh屬于刺猬蛋白家族的成員之一。刺猬蛋白相關(guān)信號通路對細胞生長、胚胎發(fā)育及多種組織形態(tài)穩(wěn)定起著重要作用。刺猬蛋白家族除了Ihh以外還有兩種同源編碼的基因即音猬蛋白（sonichedgehog，Shh）和沙漠刺猬蛋白（deserthedgehog，Dhh）。近年來研究表明Shh不僅參與哺乳動物脊柱和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，而且胎兒時期還參與調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和軟骨細胞的分化；Dhh與男性性腺發(fā)育和外周神經(jīng)的發(fā)育有關(guān)［5-6］。Ihh在生長發(fā)育的不同時期參與調(diào)控軟骨細胞的分化，維持骨的穩(wěn)定生長。骨骼的生長發(fā)育過程需要幾種不同類型的骨骼干細胞，如骨膜干細胞、生長板靜止帶干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞等，分別對骨的發(fā)育起不同的作用［7-8］。在骨的發(fā)育過程中，之前的觀點認為軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨二者獨立作用，互不干擾，然而近期研究表明骨膜干細胞不僅能介導(dǎo)膜內(nèi)成骨的過程，而且可維持生長板軟骨細胞的增殖分化和骨縱向生長［9］。研究表明缺乏骨膜干細胞的小鼠在膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨兩個方面都受到影響。進一步研究表明：一方面，肥大軟骨細胞可以通過分泌Ihh調(diào)控生長板靜止帶干細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞來介導(dǎo)骨生長；另一方面，膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨二者之間有相互串擾作用，借助于骨膜干細胞分泌的Ihh作用于生長板靜止帶干細胞維持其增殖分化。因此，骨膜干細胞缺乏也會影響軟骨內(nèi)成骨的過程，對骨骼的生長發(fā)育有重要的影響

。2

Ihh介導(dǎo)骨生長的相關(guān)信號通路的研究2.1

Ihh初級纖毛傳導(dǎo)通路Ihh基因最早于1980年從果蠅體內(nèi)分離出，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該基因?qū)τ诩怪鶆游锏墓切螒B(tài)學(xué)發(fā)展至關(guān)重要［10］。經(jīng)典的Ihh信號通路中，Ihh在軟骨細胞膜上通過兩種受體發(fā)揮作用：十二次跨膜蛋白Ptch和七次跨膜的G蛋白耦聯(lián)受體Smo。其下游信號涉及三種轉(zhuǎn)錄激活因子Gli1、Gli2和Gli3以及Gli蛋白抑制因子SuFu。在生理狀態(tài)下，Ptch最初位于纖毛的基底部，可以與Ihh結(jié)合激活Smo沉積募集到纖毛上。激活狀態(tài)的Smo可以解除SuFu對Gli蛋白的抑制，傳遞Ihh的信號激活下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli，進而調(diào)控Ihh通路相關(guān)的靶基因的表達。Ihh的負性調(diào)控通路分別是SuFu-Gli復(fù)合物抑制通路和PKA通路，當無Ihh作用于細胞受體時，Ptch與Smo緊密結(jié)合，抑制Smo的活性，則不能傳導(dǎo)至SuFu-Gli復(fù)合物使其解離。PKA除了有抑制SuFu-Gli復(fù)合物解離的作用以外，還可以磷酸化Gli蛋白，并將其分解為抑制性的大分子蛋白Glir，抑制Ihh相關(guān)靶基因在細胞核的轉(zhuǎn)錄［11-12］。2.2

甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（parathyroidhormonerelatedprotein，PTHrP）-Ihh負反饋調(diào)節(jié)通路PTHrP最初由于與甲狀旁腺激素（parathyroidhormone，PTH）具有相似的生理功能而被發(fā)現(xiàn)，二者在不同類型的細胞中，介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)及參與的傳導(dǎo)信號因子不同，目前機制尚不明確。PTH一般通過內(nèi)分泌的方式間接調(diào)控骨和腎臟來調(diào)節(jié)體內(nèi)血鈣血磷比例，以及體內(nèi)礦物質(zhì)的沉積；也可通過與PTH1R結(jié)合調(diào)控骨間充質(zhì)細胞增殖和成骨細胞的分化。而PTHrP在體內(nèi)表達于多種組織，除了可以調(diào)節(jié)鈣磷離子濃度外，同時參與各個器官的生長發(fā)育，并且PTHrP是調(diào)節(jié)骨生長的主要調(diào)節(jié)因子，促進軟骨細胞的分裂增殖，對軟細胞的成熟分化起負性調(diào)節(jié)作用［13］。研究表明PTHrP（-/-）突變小鼠的軟骨細胞增殖減少并加速分化，并且該軟骨細胞在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)出對Ihh蛋白的抵抗性［14］。正常生理狀態(tài)下，生長發(fā)育后期Ihh主要表達在生長板的前肥大帶和肥大帶，可直接作用于靜止帶、脛骨骨膜的軟骨細胞，調(diào)控PTHrP的分泌。PTHrP通過旁分泌的方式作用于脛骨生長板上帶有PTHrP受體的軟骨細胞，干預(yù)肥大軟骨細胞的成熟分化，促進其增殖，并負反饋作用于未分化的軟骨細胞抑制Ihh的表達。Ihh與PTHrP的動態(tài)平衡維持軟骨細胞的增殖和分化［15］。軟骨骨折數(shù)字模型研究表明PTHrP-Ihh負反饋通路可以通過調(diào)控軟骨內(nèi)成骨的骨化過程促進骨折愈合［16］。另一方面，當抑制Ihh作用于軟骨細胞受體調(diào)控的PTHrP通路時，過表達Ihh或者敲除Ihh仍可調(diào)控軟骨細胞的肥大與分化，說明除了PTHrP-Ihh通路之外仍有不同的作用機制通過Ihh來調(diào)控生長板軟骨細胞的增殖、分化、成熟。PTHrP-Ihh通路不僅受時空因素的調(diào)節(jié)，也受到生長板軟骨細胞分泌的蛋白因子Cbfβ、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）、SOX9、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-relatedtranscriptionfactor2，Runx2）、機械力學(xué)信號等多方面的影響來調(diào)控生長板軟骨細胞［17］。2.3

BMP-Smad-Runx2-Ihh通路轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）細胞因子家族，包括TGF-β、活化素、抑制素、BMP等30多種因子，對胚胎發(fā)育和組織形態(tài)學(xué)的穩(wěn)定、骨的形成和發(fā)育方面有重要的作用［18-19］。典型TGF-β/BMP信號傳導(dǎo)通路是一個高度保守的級聯(lián)激活通路，其下游的Smad蛋白結(jié)構(gòu)域松散且易于結(jié)合多種不同蛋白激酶，一般通過蛋白Smads進行信號傳導(dǎo)。TGF-β與受體結(jié)合后磷酸化Smad2/3，BMP與受體結(jié)合后可磷酸化Smad1/5/8，激活后的R-Smads可以通過Smad/Smad4相互作用，調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、分化、細胞外基質(zhì)的重塑等。蛋白Smad是TGF-β/BMP與多個信號傳導(dǎo)通路連接的橋梁，在機體發(fā)揮著重要作用，并始終受多種信號通路、蛋白激酶、內(nèi)分泌因子等的影響，借以維持生物體組織形態(tài)的穩(wěn)定和功能、正常的生長發(fā)育過程。Smad/Smad4也可直接與Runx2啟動子的調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)軟骨細胞的肥大和成骨細胞的分化［20］。而BMP-2作為TGF-β家族的一員，已被證實可以介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞的分化成熟，介導(dǎo)成骨分化和軟骨內(nèi)成骨。BMP有多種受體及配體，分別在骨的不同生長發(fā)育階段表達，調(diào)控骨的生長。既往有大量研究表明BMP-2敲除或突變，或BMP-2/4雙敲除，可引起小鼠發(fā)生明顯的軟骨發(fā)育不良、四肢短縮。而Wang等［21］進一步的體外實驗表明，經(jīng)過rhBMP處理的缺乏Ihh基因的成骨細胞，表現(xiàn)出BMP-2/Smad/Runx2-Ihh通路重新激活，可恢復(fù)部分增殖分化功能。Runx2屬于Runx蛋白家族，由Runx1、Runx2和Runx3組成，是一種誘導(dǎo)軟骨成熟和成骨細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子。Runx2在生長板軟骨細胞上主要表達在生長板軟骨細胞核，參與調(diào)控軟骨細胞的成熟分化；在間充質(zhì)干細胞和未成熟的成骨細胞中也高表達，并參與成骨細胞的分化。在Ihh的DNA序列的啟動子區(qū)域有Runx2的結(jié)合序列。Ihh（-/-）敲除小鼠在軟骨與骨中缺乏成骨細胞，并且在軟骨膜中不存在Runx2表達；這表明Ihh為軟骨內(nèi)骨祖細胞中Runx2表達所必需。并且有研究表明，Runx2突變（+/-）小鼠會導(dǎo)致鎖骨發(fā)育不良、顱骨囟門閉合不全、身材矮小等。而Runx（-/-）小鼠除了四肢變短外，脛骨生長板軟骨細胞增殖減少，在肥大前軟骨細胞中Ihh的表達也明顯減少。Runx（-/-）小鼠的大部分骨骼均可觀察到未成熟的骨細胞，僅有軟骨細胞構(gòu)成，顱骨僅有一層薄間充質(zhì)細胞構(gòu)成，成骨細胞完全缺失［22-23］。除了調(diào)控軟骨細胞間充質(zhì)干細胞成熟分化之外，Runx2還可以通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）的分泌來調(diào)控生長板的血管生長，通過血液運輸為生長板中心提供生長板軟骨細胞分裂增殖分化所需要的物質(zhì)［24］。綜上所述，BMP-Smad-Runx2-Ihh通路是骨骼發(fā)育中經(jīng)典通路，對軟骨細胞的增殖及分化成熟、間充質(zhì)干細胞的增殖及分化成熟、細胞外基質(zhì)的調(diào)控均有十分重要的作用。2.4

Wnt/β-catenin通路與Ihh下游的串擾作用Wnt蛋白是分泌型、脂質(zhì)修飾的信號分子，在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移、存活等方面具有多種作用；其在代謝性疾病、腫瘤性疾病方面的作用研究也較為深入。其中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路中，β-catenin作為其關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子，與刺猬蛋白家族在調(diào)節(jié)軟骨細胞功能方面一致，在調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞與軟骨細胞的增殖分化、骨穩(wěn)態(tài)等方面有重要作用［25-26］。Ihh由細胞自分泌產(chǎn)生，并不直接受Wnt/β-catenin的信號誘導(dǎo)［27］。研究表明，Ptch1作為Ihh信號通路的關(guān)鍵受體，當其發(fā)生突變時，對Smo的抑制作用減弱，導(dǎo)致Smo異常激活，進而增強Ihh信號通路的活性［28］。這一變化促使PTHrP表達上調(diào)，延緩軟骨細胞的成熟分化，且軟骨膜中可觀察到異位骨形成。而β-catenin發(fā)生突變時，成骨標志物、骨橋蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶13表達量均減少，骨形成被抑制，同時可伴隨軟骨內(nèi)成骨發(fā)生異位。當β-catenin和Ptch1雙突變體中，骨形成同樣被抑制，這表明兩種信號通路在骨發(fā)育調(diào)控中可能存在協(xié)同作用。綜上所述，Wnt/β-catenin不直接介導(dǎo)Ihh的分泌，是通過調(diào)節(jié)Ihh下游的某些信號分子來介導(dǎo)骨形成。3

Ihh在生長板局部介導(dǎo)機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用目前有研究表明，外源性機械力信號可以介導(dǎo)軟骨內(nèi)成骨過程。機械力可以通過介導(dǎo)軟骨細胞的細胞外基質(zhì)、纖毛系統(tǒng)、細胞膜牽張壓力感受離子通道等將力學(xué)刺激信號轉(zhuǎn)化為生物體內(nèi)的化學(xué)信號；而Ihh則是該轉(zhuǎn)化通路的重要的媒介［29］。體外實驗研究表明，在外力持續(xù)刺激作用下，ATDC5細胞系的軟骨細胞增殖及分化較對照組增多，在一定范圍內(nèi)隨著外力的增加Ihh表達量增多。高于一定外力范圍后，Ihh表達量較前減少，但始終多于對照組，增殖的軟骨細胞數(shù)量遠多于對照組，并且其相關(guān)通路PTHrP-Ihh、BMP-Smad-Runx2-Ihh、Wnt/β-catenin信號分子表達量均有不同程度上調(diào)［30-31］。有研究表明，在Ihh-BMP的機械傳導(dǎo)通路中，當BMP拮抗劑noggin作用于BMP相關(guān)的機械信號通路時，可抑制由機械力介導(dǎo)下的Ihh下游的BMP2/4的表達，進而減少軟骨細胞的增殖。有研究建立了Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的動態(tài)模型，發(fā)現(xiàn)初級纖毛也可以作為機械感覺細胞器，Ihh的機械力的傳導(dǎo)作用可以通過軟骨細胞膜上的初級纖毛系統(tǒng)介導(dǎo)，Smo移動到纖毛頂部發(fā)揮作用，激活I(lǐng)hh信號通路［30，32］。以上研究表明Ihh在骨生長發(fā)育過程中除了可以通過內(nèi)分泌的方式與PTHrP、Wnt/β-catenin、Runx2等相互串擾，同樣可將力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號，并進一步調(diào)控下游相關(guān)信號通路。當在外力作用下長骨發(fā)生變形時，機械壓力會導(dǎo)致軟骨細胞膜上的牽張壓力感受通道打開，將力學(xué)刺激信號轉(zhuǎn)化為生物體內(nèi)的化學(xué)信號，使Ihh的轉(zhuǎn)錄翻譯達到正常的十幾倍，進一步通過調(diào)控纖毛通路、PTHrP、Wnt/β-catenin、BMP-Smad-Runx2-Ihh通路影響軟骨內(nèi)成骨的過程。4

展望Ihh可影響體內(nèi)的多個生長發(fā)育信號通路，也可介導(dǎo)軟骨細胞的增殖和分化，并且可成為膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨的二者之間串擾作用的媒介。目前通過Ihh抑制劑來抑制癌細胞增殖和侵襲的研究已有一定進展［33］。當Ihh基因突變或者在其他相關(guān)通路的介導(dǎo)下，Ihh的表達量降低時，可針對其下游級聯(lián)信號通路使用靶點藥物如Smo、PTHrP等間接激活放大Ihh的信