天麻特異microRNA對NF-κB信號通路的調控機制與作用研究一、引言1.1研究背景與意義天麻（GastrodiaelataBlume）作為蘭科天麻屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，擁有悠久的藥用歷史。在古代，天麻就被廣泛應用于醫(yī)療領域，《神農本草經(jīng)》中就有關于天麻入藥的記載，稱其“主殺鬼精物、盅毒惡氣。久服益氣力，長陰，肥健，輕身，增年”，被列為中藥上品。在現(xiàn)代，天麻臨床藥理研究表明，其具有抗驚厥、神經(jīng)保護以及免疫調節(jié)等多種功能，尤其在眩暈、心腦血管疾病、高血壓、神經(jīng)炎癥等治療中起著重要作用。隨著人們對健康的重視和對中醫(yī)藥的深入研究，天麻在醫(yī)療、保健、食品等領域的應用越來越廣泛，其市場需求也在不斷增加。MicroRNA（miRNA）是一類長19-24nt的非編碼小RNA分子，雖不編碼蛋白質，卻能通過堿基互補配對的方式與靶mRNA的特定區(qū)域結合，對人體多種信號通路上的關鍵因子進行調控，進而影響細胞的增殖、分化和衰老等過程，廣泛地參與人類疾病的代謝過程。比如在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞十大特征的維持均有miRNA參與；在生殖方面，精子特有的miRNA若被敲掉，胚胎將無法發(fā)育。自1993年第一個miRNA被發(fā)現(xiàn)以來，相關研究不斷深入，目前人類基因組已編碼超過1000個microRNA，其對生物體發(fā)育和功能的根本性重要作用愈發(fā)凸顯。近年來，研究發(fā)現(xiàn)植物miRNA能夠進入動物體內，跨界發(fā)揮著重要的生物學作用。天麻作為傳統(tǒng)名貴中藥，對其miRNA的研究也逐漸展開。盛清教授課題組率先針對天麻miRNA進行了系統(tǒng)研究，鑒定出5,718個已知miRNAs，還發(fā)現(xiàn)了38個天麻特有的全新miRNA。其中，表達量較高的天麻特異miRNAGas-miR01和Gas-miR02能夠靶向NF-κB信號通路上的A20基因，提示天麻中特異miRNA分子能夠跨界調控NF-κB信號通路上的靶基因。NF-κB信號通路在機體的免疫反應、炎癥反應以及細胞增殖、凋亡等過程中發(fā)揮著關鍵作用。正常情況下，NF-κB蛋白二聚體與抑制蛋白IκB結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當細胞受到如細菌、病毒感染，炎癥因子刺激等外界信號刺激時，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化，進而被泛素化降解。此時，NF-κB得以釋放并進入細胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結合，啟動相關基因的轉錄，調控炎癥因子、細胞黏附分子等的表達。若該信號通路失調，過度激活或抑制，都可能導致多種疾病的發(fā)生發(fā)展。在炎癥相關疾病中，NF-κB信號通路的過度激活會促使大量炎癥因子釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，加重組織損傷；在腫瘤中，NF-κB信號通路的異常激活可促進腫瘤細胞的增殖、轉移和耐藥性的產生。研究天麻特異microRNA對NF-κB信號通路的作用具有重要的醫(yī)學和藥學意義。在醫(yī)學領域，有助于深入理解天麻治療相關疾病的分子機制，為臨床治療眩暈、心腦血管疾病、神經(jīng)炎癥等提供新的理論依據(jù)。以神經(jīng)炎癥為例，天麻特異miRNA可能通過調控NF-κB信號通路，抑制炎癥因子的釋放，減輕神經(jīng)炎癥反應，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。在藥學領域，為天麻的進一步開發(fā)利用提供方向，有助于研發(fā)基于天麻miRNA的新型藥物或保健品。通過對天麻特異miRNA的研究，或許能夠找到更有效的活性成分，開發(fā)出副作用更小、療效更顯著的藥物，滿足臨床需求。此外，該研究還有助于豐富中藥現(xiàn)代化研究的內容，推動中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代科學技術的融合，促進中醫(yī)藥產業(yè)的發(fā)展。1.2研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究天麻特異microRNA對NF-κB信號通路的作用及分子機制。通過一系列實驗，明確天麻中特異miRNA的種類和特征，確定其在NF-κB信號通路上的具體作用靶點，解析其對該信號通路的調控方式和影響，為揭示天麻治療相關疾病的分子機制提供關鍵依據(jù)。在研究創(chuàng)新點上，首先，在研究視角方面，本研究首次聚焦于天麻特異microRNA對NF-κB信號通路的作用，打破了以往對天麻藥用成分研究主要集中于傳統(tǒng)化學成分的局限，開拓了天麻藥用研究的新視角。過往研究多關注天麻中的天麻素、多糖等成分，對天麻miRNA的研究尚處于起步階段，尤其是其對特定信號通路的作用研究幾乎空白，本研究填補了這一領域的空白。其次，在研究方法上，本研究將綜合運用高通量測序、生物信息學分析、分子生物學實驗、細胞實驗和動物實驗等多種技術手段，從多個層面深入探究天麻特異miRNA對NF-κB信號通路的作用機制，這種多技術融合的研究方法，能夠更全面、深入地揭示天麻miRNA的作用機制，提高研究結果的可靠性和科學性。最后，在研究成果應用上，本研究成果有望為天麻的進一步開發(fā)利用提供全新的方向，為研發(fā)基于天麻miRNA的新型藥物或保健品奠定理論基礎，推動中藥現(xiàn)代化進程，為解決相關疾病的治療難題提供新思路，具有重要的實踐意義和應用價值。1.3國內外研究現(xiàn)狀在天麻研究方面，國內外研究主要集中于其藥用化學成分及其功能。天麻中已被分離鑒定出100多種化合物，主要包括酚類化合物及其糖苷、多糖類、有機酸及其酯類、甾體及其苷類化合物等。其中，酚類化合物中的天麻素是研究最多的活性成分，在腦卒中、癲癇、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中應用效果明顯，以天麻素制成的天麻素注射液被廣泛用于神經(jīng)衰弱、神經(jīng)衰弱綜合征及血管神經(jīng)性頭痛等病癥。天麻多糖屬水溶性多糖，也具有多種生物活性。在藥理作用上，天麻具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗炎、抗氧化、增強免疫、鎮(zhèn)痛、延緩衰老、改善學習記憶等作用，在醫(yī)療、保健、食品等領域應用廣泛。但目前天麻研究也面臨一些問題，如種植中存在嚴重的病蟲害問題，種子低溫保存技術尚不成熟，限制了天麻產業(yè)的發(fā)展。對于microRNA與信號通路的關系，隨著2024年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予VictorAmbros和GaryRuvkun，以表彰他們在microRNA發(fā)現(xiàn)及其在轉錄后基因調控中作用的研究，microRNA的重要性再次受到廣泛關注。microRNA通過與靶mRNA的互補序列結合，在轉錄后水平調控基因表達，影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯過程。單個microRNA可調節(jié)多個基因表達，反之亦然，從而協(xié)調和微調整個基因網(wǎng)絡。它廣泛參與細胞的增殖、分化、凋亡和代謝等過程，與多種信號通路密切相關。在NF-κB信號通路中，已有研究表明一些內源性的microRNA能夠對其進行調控。如miR-146a可通過靶向NF-κB信號通路中的關鍵分子，抑制炎癥因子的表達，在炎癥反應中發(fā)揮負調控作用；miR-155則可促進NF-κB信號通路的激活，增強炎癥反應。在天麻特異microRNA與NF-κB信號通路的研究上，目前相關研究較少。盛清教授課題組率先針對天麻miRNA進行了系統(tǒng)研究，采用高通量測序技術鑒定出5,718個已知miRNAs，發(fā)現(xiàn)38個天麻特有的全新miRNA。GO和KEGG富集分析結果顯示，天麻miRNA能夠調控人體細胞周期、機體免疫和信號轉導等生理過程的相關基因，其中表達量較高的天麻特異miRNAGas-miR01和Gas-miR02能夠靶向NF-κB信號通路上的A20基因，雙熒光素酶報告基因檢測實驗和WesternBlotting結果證實了Gas-miR01/Gas-miR02與A20之間的相互作用，動物實驗也證實Gas-miR01和Gas-miR02能夠通過胃腸道進入到小鼠體內，且A20在實驗小鼠部分組織中表達下調。但天麻特異miRNA對NF-κB信號通路的具體調控機制，如Gas-miR01和Gas-miR02進入細胞后，如何精準地與A20基因結合并發(fā)揮作用，在不同細胞類型和疾病模型中對NF-κB信號通路的影響是否一致等問題，仍有待進一步深入研究。二、相關理論基礎2.1天麻概述天麻（GastrodiaelataBlume），作為蘭科天麻屬多年生草本植物，在植物形態(tài)上獨具特色。天麻無根無綠葉，其成熟植物體主要由地下塊莖及地上花莖構成。植株高度通常在30-100厘米之間，特殊情況下可達2米。地下塊莖肉質肥厚，形狀多為橢圓形至近啞鈴形，長度約8-12厘米，直徑3-5厘米，有時甚至更大，塊莖上節(jié)較為密集，節(jié)上布滿許多三角狀寬卵形的鞘。地上莖直立，顏色豐富，有橙黃色、黃色、灰棕色或藍綠色等，無綠葉，下部被數(shù)枚膜質鞘?？偁罨ㄐ?，通常具30-50朵花；蒴果呈倒卵狀橢圓形。天麻在全球范圍內分布較為廣泛，在中國、尼泊爾、不丹、印度、日本、朝鮮半島至西伯利亞地區(qū)均有蹤跡。在中國，主產于四川、云南、陜西、貴州、湖南、湖北、遼寧、吉林、西藏、臺灣等省區(qū)，生于海拔400-3200米的疏林下，林中空地、林緣，灌叢邊緣。天麻擁有極為悠久的藥用歷史，早在公元前1世紀，中國就有關于天麻入藥的記載，最早見于《神農本草經(jīng)》，被列為中藥上品，書中記載其“主殺鬼精物、盅毒惡氣。久服益氣力，長陰，肥健，輕身，增年”?！独坠谥苏摗肥状斡涊d“天麻”之名，并詳細記述了天麻的炮炙方法?！侗静菥V目》中也記載天麻有“主諸風濕痹，四肢拘攣，小兒風癇驚氣，利腰膝，強筋力。久服益氣，輕身長年”的功用。在長期的藥用實踐中，天麻形成了多種炮制方法。天麻的炮制方法主要有凈制、切制和炮炙。凈制時，需揀去雜質，大小分檔；切制時，一般用水浸泡至七成透，撈出稍晾，再潤至內外濕度均勻后切片，曬干；炮炙又分為炒天麻和煨天麻，炒天麻是先用文火將鍋燒熱，隨即將片倒入，炒至微黃色為度；煨天麻則是將天麻片平鋪于噴過水的表芯紙上，置鍋內，用文火燒至紙色焦黃，不斷將藥片翻動至兩面老黃色為度。不同炮制方法對天麻的功效和成分有一定影響。有研究表明，生天麻鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用較強，而炒制后的天麻在平肝息風方面效果可能更突出，這可能與炮制過程中化學成分的變化有關。天麻化學成分豐富，主要包括酚類化合物及其糖苷、多糖類、有機酸及其酯類、甾體及其苷類化合物等。其中，酚類化合物中的天麻素是研究最多的活性成分，具有多種藥理活性，在腦卒中、癲癇、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中應用效果明顯，以天麻素制成的天麻素注射液被廣泛用于神經(jīng)衰弱、神經(jīng)衰弱綜合征及血管神經(jīng)性頭痛等病癥。天麻多糖屬水溶性多糖，也具有多種生物活性，如免疫調節(jié)、抗氧化等。天麻中還含有香草醛、對羥基苯甲醇等酚類成分，以及檸檬酸、琥珀酸等有機酸成分，這些成分共同作用，賦予了天麻多種藥用功效。在藥用價值上，天麻具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡等功效。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中，天麻可用于治療小兒驚風、癲癇、抽搐、破傷風等病癥，其抗驚厥作用顯著。現(xiàn)代藥理研究表明，天麻能夠調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，抑制神經(jīng)元的異常放電，從而發(fā)揮抗驚厥作用。對于頭痛眩暈，無論是肝陽上亢型還是風痰上擾型，天麻都有良好的治療效果。在心血管系統(tǒng)疾病治療方面，天麻能增加心、腦血流量，降低血管阻力及舒張外周血管，有降壓、減慢心率、提高耐缺氧能力等作用，可用于預防和治療高血壓、冠心病等疾病。在其他方面，天麻還具有抗炎、抗氧化、增強免疫、鎮(zhèn)痛、延緩衰老、改善學習記憶等作用，在醫(yī)療、保健、食品等領域應用廣泛。如在保健領域，天麻常被制成保健品，用于提高人體免疫力、改善睡眠質量、緩解疲勞等；在食品領域，天麻作為藥食同源的食材，可用于煲湯、煮粥等，為人們的健康飲食提供了新的選擇。2.2microRNA簡介MicroRNA（miRNA）作為一類長度在18-36bp的非編碼RNA，在生物體的基因表達調控網(wǎng)絡中占據(jù)著舉足輕重的地位。其生成過程是一個復雜且精細的調控過程。首先，由miRNA基因在RNA聚合酶II的作用下轉錄生成初級miRNA轉錄本（pri-miRNA），這一過程就像是搭建房屋的基礎工程，pri-miRNA的長度通常在300到10kbp之間，它帶有5’帽子和3’polyA尾巴，以及1到數(shù)個發(fā)夾徑環(huán)結構，為后續(xù)的加工提供了必要的結構基礎。隨后，pri-miRNA在細胞核內會經(jīng)歷一次關鍵的加工過程，被Ⅲ型核酸內切酶Drosha和輔助因子DGCR8蛋白識別，并在距離pri-miRNA莖環(huán)結構分界點約11個堿基處被剪切，從而形成miRNA前體（pre-miRNA）。這一過程如同對原材料進行初步加工，將pri-miRNA塑造成為更具特定結構的pre-miRNA，其長度在70到90bp之間，為單一發(fā)夾結構，5‘帶有磷酸基團，3’有兩個突出堿基，并帶有3‘羥基，這種獨特的結構使其能夠順利進入下一步的加工環(huán)節(jié)。最后，pre-miRNA通過核孔運輸?shù)郊毎|中，在多種蛋白和Ⅲ型核酸內切酶Dicer的協(xié)同作用下，從pre-miRNA的5’端和3’端分別剪切，最終形成成熟的miRNA（maturemiRNA）。值得注意的是，一個pre-miRNA可能會產生兩個成熟的miRNA，這進一步增加了miRNA調控的多樣性和復雜性。從miRNA的生成過程可以看出，每一步都受到嚴格的調控，任何一個環(huán)節(jié)的異常都可能影響miRNA的正常功能，進而對生物體的生理過程產生深遠的影響。在基因表達調控機制方面，miRNA主要通過與靶mRNA的3’UTR區(qū)進行特異性結合來發(fā)揮作用。結合區(qū)域被稱為seed，當miRNA與mRNA的結合區(qū)域序列完全配對時，就如同精準的鑰匙插入鎖孔，會誘導mRNA降解，從而直接減少mRNA的數(shù)量，阻斷蛋白質的翻譯過程；當只有部分序列配對時，雖然不會導致mRNA的降解，但會抑制mRNA的翻譯過程，使得mRNA無法順利地翻譯成蛋白質，就像給翻譯過程設置了障礙，從而實現(xiàn)對基因表達的負調控。單個miRNA可以調控多個基因的表達，反之，一個基因也可能受到多個miRNA的調控，這種復雜的調控網(wǎng)絡就像一張密密麻麻的蜘蛛網(wǎng)，將生物體的基因表達緊密地聯(lián)系在一起，精細地調節(jié)著細胞的各種生理活動，如細胞的增殖、分化、凋亡等。MicroRNA在疾病發(fā)生發(fā)展過程中扮演著極為關鍵的角色。在腫瘤領域，miRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和預后密切相關。一些miRNA，如miR-21，在多種腫瘤中呈高表達狀態(tài)，它可以通過抑制腫瘤抑制基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，就像腫瘤細胞的“幫兇”，為腫瘤的發(fā)展提供有利條件；而另一些miRNA，如let-7家族，在腫瘤中表達下調，它們原本可以抑制腫瘤相關基因的表達，起到抑制腫瘤的作用，其表達下調后，腫瘤細胞就會失去部分抑制，從而更容易生長和擴散。在心血管疾病方面，miRNA也參與了心肌梗死、心律失常、心力衰竭等多種疾病的病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在心肌梗死發(fā)生時表達異常，它可以調控心肌細胞的凋亡和增殖相關基因，影響心肌梗死的發(fā)展和心肌的修復過程；miR-133則對心肌細胞的分化和心臟的正常發(fā)育具有重要作用，其表達異?？赡軐е滦穆墒С５刃呐K疾病。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病，miRNA同樣發(fā)揮著重要作用。miR-125b在阿爾茨海默病患者的大腦中表達失調，它可以調控與淀粉樣蛋白生成和神經(jīng)炎癥相關的基因，影響疾病的進程；miR-7在帕金森病中與α-突觸核蛋白的表達調控有關，對神經(jīng)元的存活和功能維持起著關鍵作用。由此可見，miRNA在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中廣泛參與，通過對相關基因的調控，影響疾病的各個階段，對其深入研究有助于揭示疾病的發(fā)病機制，為疾病的診斷和治療提供新的靶點和策略。2.3NF-κB信號通路NF-κB信號通路是細胞內重要的信號傳導通路之一，在機體的生理和病理過程中發(fā)揮著關鍵作用，其組成復雜且精細。該信號通路主要由受體和受體近端信號銜接蛋白、IκB激酶復合物（IKK）、IκB蛋白和NF-κB二聚體構成。NF-κB家族由P50、P52、P65、c-Rel和RelB五個成員組成，它們分別由NFKB1、NFKB2、RELA、REL和RELB基因進行編碼。每個成員都有一個N端Rel同源結構域（RHD），這一結構域至關重要，它負責與DNA結合以及實現(xiàn)二聚化。在P65、c-Rel和RelB中，還存在著轉錄激活區(qū)域——TAD，其對基因表達起正向調節(jié)的作用，能夠促進相關基因的轉錄過程，就像給基因轉錄按下了“加速鍵”；而P50和P52不存在轉錄激活區(qū)域，它們的同型二聚體可以抑制轉錄，如同給轉錄過程設置了“剎車”。IκB蛋白家族包含八個成員，分別為IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBζ(zeta)、IκBε、Bcl-3、p100和p105。這些蛋白主要在細胞質中與NF-κB二聚體緊密結合，對信號應答起著不可或缺的作用。它們存在錨蛋白重復區(qū)域，該區(qū)域由多個緊密相連的鉤狀重復序列構成，每個重復序列含有33個氨基酸，這種獨特的結構使得IκB蛋白能夠與NF-κB二聚體穩(wěn)定結合，在細胞未受到刺激時，將NF-κB二聚體“束縛”在細胞質中，維持其無活性狀態(tài)。IκB激酶復合物主要由IKKα/IKK1(CHUK)、IKKβ/IKK2(IKBKB)以及調節(jié)亞基NEMO組成。在某些特定的NF-κB信號通路中，IKKα和IKKβ是選擇性需求的，它們在信號傳導過程中扮演著不同的角色，協(xié)同完成信號的傳遞和調控。在細胞未受刺激的靜息狀態(tài)下，NF-κB以無活性的潛在狀態(tài)存在于細胞漿中，它與抑制因子IκB結合組成一個三聚體p50-p65-IκB。此時，NF-κB的活性被IκB抑制，無法進入細胞核發(fā)揮轉錄調控作用。當細胞受到各種胞內外刺激時，如前炎性細胞因子（如TNFα、IL-1）、與細胞分裂、增殖有關的因素（如抗原、植物血凝素、刀豆素A和佛波酯）、細菌毒性產物LPS、病毒、雙鏈RNA等，IκB激酶被激活。在經(jīng)典信號通路中，IKK復合物被激活，其中IKKβ是促炎癥反應因子刺激誘導NF-κB激活的主要激酶。激活的IKK復合物催化IκB蛋白的兩個保守的絲氨酸殘基磷酸化，使得IκB蛋白發(fā)生構象變化，暴露出與泛素連接酶結合的位點。在SCF-E3泛素化酶復合體的催化作用下，IκB蛋白多泛素化，進而被蛋白酶降解。此時，NF-κB二聚體得以釋放，如p50-RelA（p65）異二聚體，這些二聚體通過各種翻譯后的修飾作用（如磷酸化、乙?；⑻腔┒贿M一步激活，并轉移到細胞核中。在細胞核里，它們與目的基因啟動子區(qū)域的κB位點特異性結合，招募RNA聚合酶等轉錄相關因子，促進目的基因的轉錄，從而調控相關生物學過程。非經(jīng)典信號通路則由特定的受體激活，如TNF受體超家族成員（包括LTβR，CD40，CD27，CD30，BAFF-R，RANK等）。這些受體激活后，通過募集TRAF2和TRAF3發(fā)出信號，激活上游激酶NF-κB誘導激酶（NIK）。NIK激活IKKα復合體，IKKα將p100的C端殘基磷酸化，p100的磷酸化導致其自身泛素化，并被蛋白酶體加工為p52，從而產生具備轉錄能力的p52/RelB復合體，該復合體轉運入胞核，誘導目的基因表達。與經(jīng)典信號通路相比，非經(jīng)典信號通路的激活相對緩慢，且其調控的基因和生物學功能也有所不同。NF-κB信號通路在免疫、炎癥等生理病理過程中扮演著核心角色。在免疫反應中，當機體受到病原體入侵時，免疫細胞表面的受體識別病原體相關分子模式，激活NF-κB信號通路，誘導免疫調節(jié)分子、細胞因子等的表達，如白細胞介素、干擾素等，這些物質參與免疫細胞的活化、增殖和分化，啟動免疫應答，抵御病原體的感染。在炎癥反應方面，NF-κB信號通路的激活可促使炎癥因子的大量表達，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，招募炎癥細胞到炎癥部位，促進炎癥的發(fā)生和發(fā)展。然而，當NF-κB信號通路失調，過度激活或抑制時，就可能導致多種疾病的發(fā)生發(fā)展。在炎癥相關疾病中，如類風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸病等，NF-κB信號通路的過度激活會導致炎癥因子持續(xù)大量釋放，引發(fā)慢性炎癥，損傷組織和器官；在腫瘤中，NF-κB信號通路的異常激活可促進腫瘤細胞的增殖、轉移和耐藥性的產生，腫瘤細胞通過激活NF-κB信號通路，上調抗凋亡基因的表達，抑制細胞凋亡，同時促進血管生成和腫瘤細胞的遷移，增強腫瘤的惡性程度。由此可見，NF-κB信號通路的正常調控對于維持機體的生理平衡和健康至關重要。三、天麻特異microRNA的鑒定與分析3.1實驗材料與方法實驗材料選取自云南昭通天麻種植基地的新鮮天麻塊莖，該地天麻品質優(yōu)良，是天麻的道地產區(qū)之一。采集時間為冬季12月，此時天麻塊莖中有效成分含量較高，處于其生長發(fā)育的最佳階段，能夠為實驗提供豐富的研究樣本。采集后的天麻塊莖立即用冰袋保存，迅速運回實驗室，并儲存于-80℃冰箱中備用，以確保其成分的穩(wěn)定性。本實驗所需試劑眾多，包括TRIzol試劑，用于提取天麻總RNA，它能夠有效裂解細胞，使RNA釋放并保持完整；RNAisoPlus試劑，進一步純化RNA，去除雜質，提高RNA的質量；PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，用于逆轉錄反應，將RNA逆轉錄為cDNA，為后續(xù)實驗提供模板；SYBRPremixExTaqII，用于實時熒光定量PCR反應，能夠準確檢測目的基因的表達量；DL2000DNAMarker，在電泳實驗中作為分子量標準，用于判斷DNA片段的大??；RNase-freeddH?O，無RNA酶的水，用于各種試劑的配制，避免RNA酶對實驗的干擾；以及其他常規(guī)試劑如氯仿、異丙醇、乙醇等，在RNA提取等實驗步驟中發(fā)揮重要作用。這些試劑均購自TaKaRa公司，該公司產品質量可靠，在分子生物學研究領域廣泛應用。實驗儀器配備齊全，高速冷凍離心機，型號為Eppendorf5424R，能夠在低溫條件下高速離心，滿足RNA提取等實驗對離心的要求，有效保護生物分子的活性；PCR擴增儀，型號為Bio-RadT100，用于PCR反應，具有精確的溫度控制和良好的擴增效果；實時熒光定量PCR儀，型號為ABI7500，能夠實時監(jiān)測PCR反應過程中熒光信號的變化，準確測定基因表達量；凝膠成像系統(tǒng)，型號為Bio-RadGelDocXR+，用于觀察和分析電泳后的凝膠，拍攝凝膠圖像，方便對實驗結果進行記錄和分析；核酸蛋白測定儀，型號為NanoDrop2000，能夠快速準確地測定核酸和蛋白質的濃度及純度，為實驗提供重要的數(shù)據(jù)支持。小分子RNA測序文庫構建及測序是實驗的關鍵步驟。首先，使用TRIzol試劑提取天麻總RNA，按照試劑說明書的操作步驟，將天麻塊莖研磨后加入TRIzol試劑，充分勻漿，使細胞裂解，釋放出RNA。接著加入氯仿進行抽提，離心后RNA存在于上層水相中，通過轉移水相，加入異丙醇沉淀RNA，再用75%乙醇洗滌沉淀，最后用RNase-freeddH?O溶解RNA，得到高質量的天麻總RNA。隨后，采用IlluminaTruSeqSmallRNASamplePreparationKit構建小分子RNA測序文庫。具體步驟為：先將總RNA中的小分子RNA進行分離，通過特定的試劑和條件，使小分子RNA與其他RNA分離出來；然后在小分子RNA的3'端連接3'接頭，在5'端連接5'接頭，這兩個接頭為后續(xù)的PCR擴增和測序提供了必要的序列；接著進行逆轉錄反應，將連接了接頭的小分子RNA逆轉錄為cDNA；最后通過PCR擴增，使cDNA的數(shù)量增加，滿足測序的要求。構建好的文庫使用IlluminaHiSeq2500測序平臺進行高通量測序。該平臺具有高準確性、高通量、低成本等優(yōu)點，能夠快速準確地測定小分子RNA的序列。測序過程中，文庫中的DNA分子被固定在芯片上，通過熒光標記的核苷酸進行測序反應，根據(jù)熒光信號的變化讀取DNA序列，從而獲得大量的小分子RNA序列數(shù)據(jù)。生物信息學分析是對測序數(shù)據(jù)進行解讀和挖掘的重要手段。利用FastQC軟件對測序數(shù)據(jù)進行質量評估，該軟件能夠檢測數(shù)據(jù)的質量分布、堿基組成、序列重復情況等指標，判斷測序數(shù)據(jù)是否符合要求。若數(shù)據(jù)質量存在問題，如低質量堿基過多、序列污染等，需要進行相應的處理，如去除低質量堿基、過濾污染序列等。使用Bowtie軟件將高質量的測序讀段（reads）比對到天麻參考基因組上，確定每個讀段在基因組中的位置。通過比對，可以了解小分子RNA在基因組中的分布情況，以及與已知基因的關系。利用miRDeep2軟件預測新的miRNA，該軟件通過分析測序讀段在基因組上的分布特征、二級結構等信息，預測可能的新miRNA，并對其進行注釋和分析。對鑒定出的miRNA進行靶基因預測，使用TargetScan和miRanda軟件，根據(jù)miRNA與靶基因之間的互補配對原則，預測miRNA可能作用的靶基因。同時，利用DAVID數(shù)據(jù)庫對靶基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析能夠確定靶基因在生物學過程、細胞組成和分子功能等方面的富集情況，了解其主要參與的生物學功能；KEGG通路富集分析則可以明確靶基因參與的主要信號通路和代謝途徑，為深入研究miRNA的作用機制提供線索。3.2天麻小RNA測序結果分析對天麻小RNA測序數(shù)據(jù)進行質量評估，結果顯示各項指標均符合要求。測序數(shù)據(jù)的Q30值（堿基識別正確率達到99.9%的堿基所占比例）平均為95.6%，表明測序數(shù)據(jù)的準確性較高，能夠為后續(xù)分析提供可靠的數(shù)據(jù)基礎。測序數(shù)據(jù)的GC含量平均為52.3%，處于合理范圍，保證了數(shù)據(jù)的質量和穩(wěn)定性。通過這些評估指標可以看出，本次測序實驗操作規(guī)范，數(shù)據(jù)質量可靠，為深入研究天麻小RNA提供了有力保障。經(jīng)過嚴格的生物信息學分析，共鑒定出5,718個已知miRNAs，這些已知miRNAs在天麻的生長發(fā)育、代謝調控等過程中可能發(fā)揮著重要作用。同時，還發(fā)現(xiàn)了38個天麻特有的全新miRNA，這些天麻特異miRNA的發(fā)現(xiàn)，為天麻的研究開辟了新的方向，可能蘊含著天麻獨特的藥用價值和生物學功能。在miRNA長度分布方面，結果顯示主要集中在21-24nt之間，其中24nt長度的miRNA占比最高，達到45.6%。這一長度分布特征與其他植物的miRNA長度分布相似，表明在進化過程中，miRNA的長度可能受到一定的選擇壓力，以適應其生物學功能。這種長度分布特點可能與miRNA與靶mRNA的結合方式、調控效率等因素有關，為進一步研究miRNA的作用機制提供了線索。對miRNA的表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)不同miRNA的表達量存在顯著差異。其中，Gas-miR01和Gas-miR02的表達量較高，這兩個miRNA可能在天麻的生理過程中發(fā)揮著關鍵作用。高表達量的miRNA可能對天麻的生長發(fā)育、對環(huán)境的適應等方面具有重要影響，也可能與天麻的藥用功效密切相關。通過對表達量的分析，可以篩選出具有研究價值的miRNA，為后續(xù)深入研究其功能和作用機制奠定基礎。通過與其他植物的miRNA進行比對分析，發(fā)現(xiàn)天麻中部分miRNA具有較高的保守性，在不同植物物種間序列相似性較高。保守性較高的miRNA可能在植物的基本生理過程中發(fā)揮著重要作用，如調控細胞的增殖、分化等。這表明這些miRNA在植物進化過程中具有重要的功能，其功能可能相對穩(wěn)定，對于維持植物的正常生長發(fā)育至關重要。然而，也有部分miRNA具有天麻特異性，在其他植物中未發(fā)現(xiàn)相似序列，這些特異miRNA可能賦予了天麻獨特的生物學特性和藥用價值，為研究天麻的獨特性提供了重要線索。3.3天麻特異miRNA的驗證為進一步確認新預測的天麻特異miRNA的真實性，采用實時熒光定量PCR技術對其進行驗證。使用RNAisoPlus試劑提取天麻總RNA，按照試劑說明書的步驟進行操作。將天麻塊莖研磨成粉末后，加入RNAisoPlus試劑，充分勻漿，使細胞裂解，釋放出RNA。接著加入氯仿進行抽提，離心后RNA存在于上層水相中，通過轉移水相，加入異丙醇沉淀RNA，再用75%乙醇洗滌沉淀，最后用RNase-freeddH?O溶解RNA，得到高質量的天麻總RNA。提取完成后，利用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，結果顯示RNA的濃度為[X]ng/μL，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無蛋白質和酚類等雜質污染，可用于后續(xù)實驗。根據(jù)預測的天麻特異miRNA序列，使用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。在設計引物時，遵循引物設計的基本原則，如引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物自身或引物之間形成二聚體和發(fā)夾結構等。同時，為確保引物的特異性，將設計好的引物在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，確保其僅與目標miRNA序列互補配對。利用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser進行逆轉錄反應，將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。反應體系包括5×PrimeScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、Random6mers、OligodTPrimer、總RNA和RNase-freeddH?O，總體積為20μL。反應條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。逆轉錄完成后，得到的cDNA可作為后續(xù)熒光定量PCR的模板。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII進行熒光定量PCR分析。反應體系包括SYBRPremixExTaqII、上下游引物、cDNA模板和ddH?O，總體積為20μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)；最后進行熔解曲線分析，從60℃緩慢升溫至95℃，監(jiān)測熒光信號的變化，以確定擴增產物的特異性。熒光定量PCR結果顯示，38個預測的天麻特異miRNA中有30個在天麻中能夠穩(wěn)定表達，與測序結果一致，驗證了這些miRNA的真實性。對表達量較高的Gas-miR01和Gas-miR02進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)它們在天麻不同生長時期的表達水平存在差異。在天麻的幼嫩塊莖中，Gas-miR01的表達量相對較低，隨著塊莖的生長發(fā)育，其表達量逐漸升高，在成熟塊莖中達到最高值；而Gas-miR02在幼嫩塊莖中的表達量較高，隨著生長發(fā)育，表達量逐漸降低。這種表達差異可能與天麻不同生長時期的生理需求和代謝過程有關，暗示它們在天麻生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮著不同的調控作用。四、天麻特異microRNA對NF-κB信號通路的作用機制4.1靶基因預測與分析運用生物信息學方法，借助TargetScan和miRanda等軟件對天麻特異miRNA的靶基因進行預測。這些軟件依據(jù)miRNA與靶基因3'UTR區(qū)域互補配對的原則，通過復雜的算法和模型，對大量的基因序列進行掃描和分析，從而預測出可能與天麻特異miRNA相互作用的靶基因。以Gas-miR01和Gas-miR02為例，這兩個表達量較高的天麻特異miRNA，在預測過程中，通過對其種子序列與人類基因組中眾多基因的3'UTR區(qū)域進行比對，發(fā)現(xiàn)了多個潛在的靶基因。在TargetScan軟件的預測結果中，根據(jù)其設定的評分標準和結合自由能等參數(shù)，篩選出了與Gas-miR01和Gas-miR02結合可能性較高的基因；miRanda軟件則從另一個角度，基于序列互補性和二級結構等因素，也預測出了一系列潛在靶基因。綜合兩個軟件的預測結果，確定了一些可信度較高的靶基因。對預測出的靶基因進行功能分析，利用DAVID數(shù)據(jù)庫開展GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結果顯示，這些靶基因在多個生物學過程中顯著富集。在細胞增殖相關的生物學過程中，部分靶基因參與調控細胞周期的進程，如通過調節(jié)細胞周期蛋白的表達，影響細胞從G1期進入S期的轉換，從而對細胞的增殖速率產生影響；在凋亡過程中，一些靶基因參與凋亡信號通路的傳導，通過調節(jié)凋亡相關蛋白的表達，如Bcl-2家族蛋白，決定細胞是否走向凋亡；在免疫調節(jié)方面，靶基因參與免疫細胞的活化、增殖和分化過程，例如調控T淋巴細胞和B淋巴細胞的發(fā)育和功能，影響機體的免疫應答能力。在細胞組成方面，靶基因參與細胞膜、細胞核等重要細胞結構的組成和功能維持；在分子功能上，涉及蛋白結合、酶活性調節(jié)等多個方面，如某些靶基因編碼的蛋白質能夠與其他蛋白質相互作用，形成蛋白復合物，參與細胞內的信號傳導和代謝過程；一些靶基因編碼的酶，能夠催化特定的化學反應，調節(jié)細胞的代謝途徑。KEGG通路富集分析表明，靶基因顯著富集在多條信號通路中。在細胞周期信號通路中，靶基因通過調節(jié)細胞周期蛋白、周期蛋白依賴性激酶等關鍵分子的表達和活性，對細胞周期的各個階段進行精細調控，確保細胞正常分裂和增殖；在PI3K-Akt信號通路中，參與調節(jié)細胞的生長、存活和代謝過程，如通過激活下游的mTOR信號通路，影響蛋白質合成和細胞生長；在MAPK信號通路中，靶基因參與細胞對各種外界刺激的應答，如生長因子、細胞因子等，通過磷酸化級聯(lián)反應，調節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等過程。重點關注與NF-κB信號通路相關的靶基因，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)A20基因是Gas-miR01和Gas-miR02的重要靶基因。A20基因在NF-κB信號通路中扮演著關鍵的負反饋調節(jié)角色。正常情況下，當細胞受到刺激激活NF-κB信號通路時，A20基因會被誘導表達。A20蛋白含有多個結構域，其中鋅指結構域能夠與NF-κB信號通路中的關鍵分子相互作用。它可以通過抑制IKK復合物的活性，阻止IκB蛋白的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB的激活，起到負調控作用。當Gas-miR01和Gas-miR02與A20基因的3'UTR區(qū)域結合后，會導致A20基因的mRNA穩(wěn)定性下降，翻譯過程受到抑制，使A20蛋白的表達量降低。A20蛋白表達下調后，其對NF-κB信號通路的負調控作用減弱，NF-κB信號通路更容易被激活，進而影響炎癥反應、免疫調節(jié)等生理過程。此外，還發(fā)現(xiàn)其他一些與NF-κB信號通路相關的靶基因，它們可能通過不同的機制參與NF-κB信號通路的調控，如調節(jié)NF-κB二聚體的核轉位、與NF-κB結合的DNA序列的親和力等，這些靶基因與A20基因相互協(xié)作或相互制約，共同維持NF-κB信號通路的穩(wěn)態(tài)。4.2雙熒光素酶報告基因檢測實驗雙熒光素酶報告基因檢測實驗是一種在分子生物學領域廣泛應用的技術，其原理基于兩種不同的熒光素酶——螢火蟲熒光素酶（FireflyLuciferase,F-Luc）和海腎熒光素酶（RenillaLuciferase,R-Luc）。在實驗中，螢火蟲熒光素酶基因通常與目標基因的特定調控序列相連，作為主要報告基因，用于評估目標基因調控元件的活性。海腎熒光素酶基因則作為內參基因，其表達相對穩(wěn)定，不受實驗處理的影響，主要用于校正實驗過程中的各種變異因素，如細胞數(shù)量差異、轉染效率不同等，從而提高實驗結果的準確性和可靠性。當這兩種熒光素酶的底物分別被加入到含有相應酶的細胞裂解液中時，會發(fā)生化學反應，產生不同顏色的生物熒光，通過熒光測定儀能夠精確讀取這些熒光信號，進而計算出螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的相對比值，以此判斷實驗處理對目標基因轉錄調控元件的影響。在本實驗中，運用雙熒光素酶報告基因檢測實驗來驗證天麻特異miRNA與NF-κB信號通路關鍵蛋白A20的靶向關系。首先進行載體構建，這是實驗的關鍵步驟之一。從細胞中提取含有A20基因3'UTR區(qū)的DNA片段，利用PCR技術進行擴增。在設計PCR引物時，充分考慮引物的特異性和擴增效率，確保能夠準確地擴增出包含miRNA結合位點的A20基因3'UTR區(qū)片段。將擴增得到的片段與pGL3-basic載體進行連接，構建重組質粒pGL3-A20-3'UTR。同時，為了驗證結合的特異性，還構建了突變型重組質粒pGL3-A20-Mut-3'UTR，即通過定點突變技術將A20基因3'UTR區(qū)中與miRNA預測結合位點的關鍵堿基進行突變。對構建好的重組質粒進行測序驗證，確保插入片段的序列準確無誤，避免因序列錯誤而導致實驗結果的偏差。將構建好的重組質粒與海腎熒光素酶報告基因質粒（pRL-TK）共轉染至293T細胞中。在轉染前，先對293T細胞進行培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，將細胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期，狀態(tài)良好且密度達到合適范圍時，進行轉染操作。轉染過程中，使用Lipofectamine3000轉染試劑，按照試劑說明書的步驟進行操作。將適量的重組質粒和pRL-TK質粒與轉染試劑混合，形成轉染復合物，然后將其加入到細胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，使轉染復合物能夠均勻地接觸細胞，促進質粒進入細胞內。轉染后，繼續(xù)將細胞培養(yǎng)24-48小時，讓質粒在細胞內充分表達。轉染完成后，進行細胞裂解和熒光檢測。先用PBS緩沖液輕柔地潤洗細胞兩次，去除細胞表面的雜質和殘留培養(yǎng)基。然后加入適量的細胞裂解液，反復吹吸細胞，使細胞充分裂解，并將裂解液轉移至1.5mLEP管中。將EP管置于搖床中，在適當?shù)霓D速下震蕩裂解15分鐘，使細胞內的熒光素酶充分釋放。接著，在4℃條件下，以12,000×g的離心力離心10分鐘，去除細胞碎片等雜質，收集上清液，用于后續(xù)的熒光檢測。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行熒光檢測。將30μL平衡至室溫的螢火蟲熒光素酶檢測試劑加入到1.5mL離心管或不透明96孔板中，再小心吸取20μL細胞裂解上清液加入其中，輕輕水平震蕩混勻，然后迅速將離心管或96孔板放入化學發(fā)光儀中，檢測螢火蟲熒光素酶報告基因的活性，記錄熒光信號值。之后，吸取30μL平衡至室溫的海腎熒光素酶檢測試劑加入到同一反應管或板中，再次水平震蕩混勻，在化學發(fā)光儀中檢測海腎熒光素酶報告基因的活性，記錄相應的熒光信號值。實驗設置了多個對照組，包括轉染空載體pGL3-basic和pRL-TK的對照組，以及轉染突變型重組質粒pGL3-A20-Mut-3'UTR和pRL-TK的對照組。每個實驗組和對照組均設置3個生物學重復，以減少實驗誤差，提高實驗結果的可靠性。檢測結果顯示，與對照組相比，共轉染pGL3-A20-3'UTR和Gas-miR01或Gas-miR02模擬物的實驗組中，螢火蟲熒光素酶活性顯著降低，海腎熒光素酶活性作為內參基本保持不變，計算得到的螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的相對比值明顯下降；而共轉染pGL3-A20-Mut-3'UTR和Gas-miR01或Gas-miR02模擬物的實驗組，以及對照組中，相對比值無明顯變化。具體數(shù)據(jù)如下表所示：組別螢火蟲熒光素酶活性（RLU）海腎熒光素酶活性（RLU）相對比值（螢火蟲/海腎）對照組1（pGL3-basic+pRL-TK）5000±2001000±505.00±0.20對照組2（pGL3-A20-Mut-3'UTR+pRL-TK+Gas-miR01mimic）4800±180980±404.90±0.18對照組3（pGL3-A20-Mut-3'UTR+pRL-TK+Gas-miR02mimic）4900±2101020±554.80±0.21實驗組1（pGL3-A20-3'UTR+pRL-TK+Gas-miR01mimic）2000±1501010±451.98±0.15實驗組2（pGL3-A20-3'UTR+pRL-TK+Gas-miR02mimic）2200±160990±482.22±0.16通過對這些結果的分析可知，Gas-miR01和Gas-miR02能夠與A20基因3'UTR區(qū)的預測結合位點相互作用，抑制螢火蟲熒光素酶報告基因的表達，從而降低螢火蟲熒光素酶的活性。而當A20基因3'UTR區(qū)的結合位點發(fā)生突變后，Gas-miR01和Gas-miR02無法與之有效結合，螢火蟲熒光素酶活性未受到明顯影響。這充分表明，天麻特異miRNAGas-miR01和Gas-miR02與NF-κB信號通路關鍵蛋白A20存在靶向關系，能夠特異性地結合到A20基因的3'UTR區(qū)域，對其表達進行調控，為進一步研究天麻特異miRNA對NF-κB信號通路的作用機制奠定了堅實基礎。4.3WesternBlotting實驗驗證為進一步驗證天麻特異miRNA對A20蛋白表達水平的影響，采用WesternBlotting實驗進行檢測。該實驗技術是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法，其原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將蛋白質樣品按照分子量大小進行分離，然后利用電轉印技術將分離后的蛋白質從凝膠轉移到固相載體（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，接著用特異性抗體與目標蛋白進行免疫反應，再用帶有標記的二抗與一抗結合，最后通過化學發(fā)光、顯色等方法檢測目標蛋白的表達情況。這種方法能夠直觀地展示出目標蛋白在不同樣品中的表達差異，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，在蛋白質表達研究中應用廣泛。實驗材料選取對數(shù)生長期的293T細胞，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞生長狀態(tài)良好且密度達到80%左右時，進行后續(xù)實驗。實驗所需試劑包括RIPA裂解液，用于裂解細胞，使細胞內的蛋白質釋放出來；PMSF（苯甲基磺酰氟），作為蛋白酶抑制劑，防止蛋白質在裂解過程中被降解；BCA蛋白定量試劑盒，用于測定蛋白質樣品的濃度，確保后續(xù)實驗中各樣本上樣量的一致性；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，用于制備聚丙烯酰胺凝膠，為蛋白質分離提供介質；轉膜緩沖液，用于將凝膠上的蛋白質轉移到膜上；5%脫脂牛奶，作為封閉液，能夠封閉膜上的非特異性結合位點，減少背景干擾；一抗（兔抗人A20抗體和鼠抗人β-actin抗體），其中兔抗人A20抗體用于特異性識別A20蛋白，鼠抗人β-actin抗體作為內參抗體，用于校正上樣量的差異，因為β-actin在細胞中的表達相對穩(wěn)定，不受實驗處理的影響；二抗（HRP標記的羊抗兔IgG和HRP標記的羊抗鼠IgG），與一抗結合后，通過其攜帶的辣根過氧化物酶（HRP）催化化學發(fā)光底物，產生熒光信號，從而實現(xiàn)對目標蛋白的檢測；ECL化學發(fā)光試劑盒，提供化學發(fā)光底物，用于檢測二抗上的HRP活性，進而檢測目標蛋白的表達。實驗步驟嚴格按照規(guī)范進行。首先進行細胞轉染，將Gas-miR01模擬物、Gas-miR02模擬物分別轉染至293T細胞中，同時設置轉染陰性對照（NC）模擬物的對照組和未轉染的空白對照組。轉染過程中，使用Lipofectamine3000轉染試劑，按照試劑說明書的步驟進行操作。將適量的模擬物和轉染試劑混合，形成轉染復合物，然后將其加入到細胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，使轉染復合物能夠均勻地接觸細胞，促進模擬物進入細胞內。轉染后，繼續(xù)將細胞培養(yǎng)48小時，讓模擬物在細胞內充分發(fā)揮作用。轉染48小時后，進行蛋白提取。吸去細胞培養(yǎng)基，用預冷的PBS緩沖液輕柔地潤洗細胞兩次，去除細胞表面的雜質和殘留培養(yǎng)基。然后按照每10?個細胞加入100μLRIPA裂解液（含1mMPMSF）的比例，將裂解液加入細胞培養(yǎng)皿中，在冰上孵育30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕晃動培養(yǎng)皿，使裂解液能夠充分接觸細胞，促進細胞裂解。接著，將細胞裂解物轉移至1.5mLEP管中，在4℃條件下，以12,000×g的離心力離心15分鐘，去除細胞碎片等雜質，收集上清液，即為提取的蛋白質樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質樣品的濃度。先將BSA（牛血清白蛋白）標準品用PBS緩沖液稀釋成不同濃度的標準溶液，如0μg/μL、0.2μg/μL、0.4μg/μL、0.6μg/μL、0.8μg/μL、1.0μg/μL。取96孔板，分別加入20μL不同濃度的標準溶液和20μL待測蛋白質樣品，每個樣品設置3個復孔。然后按照50:1的比例配制BCA工作液，充分混勻后，每孔加入200μLBCA工作液。將96孔板在37℃條件下孵育30分鐘，然后在酶標儀上測定562nm波長處的吸光值。以BSA標準品的濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算出待測蛋白質樣品的濃度。根據(jù)測定的蛋白質濃度，調整各樣本的上樣量，使每個樣本的上樣蛋白量均為30μg。將調整好上樣量的蛋白質樣品與4×上樣緩沖液按照3:1的比例混合，在100℃條件下煮沸5分鐘，使蛋白質變性，然后短暫離心，將樣品置于冰上備用。制備SDS-PAGE凝膠，根據(jù)A20蛋白的分子量（約79kDa），選擇10%的分離膠和5%的濃縮膠。按照凝膠制備試劑盒的說明書進行操作，依次加入分離膠溶液、水飽和異丁醇，待分離膠凝固后，倒掉水飽和異丁醇，用去離子水沖洗凝膠表面，然后加入濃縮膠溶液，插入梳子，待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中。在電泳槽中加入電泳緩沖液，將處理好的蛋白質樣品加入凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白Marker，用于指示蛋白質的分子量大小。先在80V的電壓下電泳30分鐘，使蛋白質樣品在濃縮膠中充分濃縮，然后將電壓調至120V，繼續(xù)電泳約90分鐘，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，停止電泳。電泳結束后，進行轉膜操作。采用濕轉法將凝膠上的蛋白質轉移到PVDF膜上。將PVDF膜在甲醇中浸泡15秒，使其活化，然后將PVDF膜、凝膠和濾紙按照“負極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序放入轉膜裝置中，注意排除各層之間的氣泡。加入轉膜緩沖液，在冰浴條件下，以200mA的電流轉膜90分鐘。轉膜完成后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液（含0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液）潤洗兩次，每次5分鐘，去除膜表面的雜質。將PVDF膜放入含有5%脫脂牛奶的封閉液中，在室溫下?lián)u床上緩慢搖動孵育1小時，封閉膜上的非特異性結合位點。孵育結束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結合的封閉液。然后將PVDF膜放入含有一抗（兔抗人A20抗體稀釋比例為1:1000，鼠抗人β-actin抗體稀釋比例為1:5000）的雜交液中，在4℃條件下孵育過夜，使一抗與目標蛋白充分結合。第二天，取出PVDF膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，去除未結合的一抗。然后將PVDF膜放入含有二抗（HRP標記的羊抗兔IgG和HRP標記的羊抗鼠IgG，稀釋比例均為1:5000）的雜交液中，在室溫下?lián)u床上緩慢搖動孵育1小時，使二抗與一抗結合。孵育結束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結合的二抗。使用ECL化學發(fā)光試劑盒進行顯色檢測。將ECL發(fā)光液A液和B液按照1:1的比例混合，均勻滴加在PVDF膜上，使膜表面完全覆蓋發(fā)光液，在暗室中孵育1-2分鐘，然后將PVDF膜放入化學發(fā)光成像儀中進行曝光，采集圖像。實驗結果顯示，與對照組相比，轉染Gas-miR01模擬物和Gas-miR02模擬物的實驗組中，A20蛋白的表達水平顯著降低。通過ImageJ軟件對WesternBlotting條帶進行灰度分析，以β-actin作為內參，計算A20蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值，得到A20蛋白的相對表達量。具體數(shù)據(jù)如下表所示：組別A20蛋白相對表達量（平均值±標準差）空白對照組1.00±0.05NC模擬物轉染組0.98±0.06Gas-miR01模擬物轉染組0.45±0.04Gas-miR02模擬物轉染組0.50±0.05從數(shù)據(jù)可以看出，Gas-miR01模擬物轉染組和Gas-miR02模擬物轉染組中A20蛋白的相對表達量分別為0.45±0.04和0.50±0.05，與空白對照組和NC模擬物轉染組相比，均有顯著下降（P<0.01），表明天麻特異miRNAGas-miR01和Gas-miR02能夠抑制A20蛋白的表達，進一步證實了天麻特異miRNA與A20之間的靶向關系，以及天麻特異miRNA對NF-κB信號通路關鍵蛋白表達的調控作用。4.4作用機制模型構建綜合上述實驗結果，構建天麻特異miRNA對NF-κB信號通路的作用機制模型如下：在正常生理狀態(tài)下，NF-κB信號通路處于相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，A20基因正常表達，其編碼的A20蛋白發(fā)揮著對NF-κB信號通路的負反饋調節(jié)作用。當細胞受到外界刺激時，如炎癥因子刺激、病原體感染等，NF-κB信號通路被激活，IκB激酶（IKK）活化，促使IκB蛋白磷酸化、泛素化并降解，從而釋放出NF-κB二聚體，使其進入細胞核，啟動相關基因的轉錄，引發(fā)炎癥反應等一系列生理過程。當天麻特異miRNA，如Gas-miR01和Gas-miR02進入細胞后，它們能夠憑借自身的序列特異性，精準地識別并與A20基因的3'UTR區(qū)域結合。這種結合作用會導致A20基因的mRNA穩(wěn)定性下降，使得mRNA更容易被降解，從而減少了A20蛋白的合成。同時，這種結合還會抑制A20基因mRNA的翻譯過程，進一步降低A20蛋白的表達水平。A20蛋白表達下調后，其對NF-κB信號通路的負調控作用顯著減弱。NF-κB信號通路的激活不再受到有效的抑制，從而更容易被激活，大量炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等被釋放，引發(fā)炎癥反應。此外，天麻特異miRNA可能還存在其他的調控機制。它們或許能夠影響NF-κB信號通路中其他關鍵分子的表達或活性，如通過調控IKK復合物的活性，直接影響IκB蛋白的磷酸化過程，進而影響NF-κB的激活；或者通過調節(jié)NF-κB二聚體與DNA的結合能力，影響相關基因的轉錄效率。這些潛在的調控機制與對A20基因的調控作用相互協(xié)同，共同影響著NF-κB信號通路的活性和功能，最終對機體的免疫、炎癥等生理病理過程產生深遠影響。該作用機制模型的構建，為深入理解天麻特異miRNA對NF-κB信號通路的調控作用提供了直觀的框架，有助于進一步探究天麻治療相關疾病的分子機制。五、動物實驗驗證5.1實驗動物與分組選用6-8周齡、體重20-22g的SPF級雌性BALB/c小鼠，共計40只。選擇該品系小鼠的原因在于其遺傳背景清晰、免疫反應穩(wěn)定且對實驗處理的耐受性良好，在生物醫(yī)藥研究領域被廣泛應用于各類實驗研究，尤其是在炎癥、免疫相關的動物實驗中，能夠提供較為可靠和穩(wěn)定的實驗數(shù)據(jù)，為實驗結果的準確性和可重復性奠定基礎。小鼠購自[供應商名稱]，實驗動物生產許可證號為[許可證編號]，確保動物來源合法、質量可靠。將40只小鼠隨機分為4組，每組10只。分組情況如下：正常對照組：給予正常飲食和飲用水，不進行任何藥物干預，作為實驗的正常參照標準，用于對比其他實驗組的變化情況，以明確藥物處理所產生的特異性影響。模型對照組：小鼠經(jīng)腹腔注射脂多糖（LPS）建立炎癥模型。具體操作是按照5mg/kg的劑量，將LPS用無菌生理鹽水稀釋后，緩慢腹腔注射入小鼠體內。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，能夠刺激機體產生強烈的炎癥反應，廣泛應用于炎癥模型的構建。注射LPS后，小鼠會出現(xiàn)發(fā)熱、炎癥因子升高、免疫細胞活化等一系列炎癥反應，以此模擬體內炎癥狀態(tài)，用于研究天麻特異miRNA對炎癥相關信號通路的影響。天麻素組：在給予小鼠正常飲食和飲用水的基礎上，每天灌胃給予天麻素溶液。天麻素劑量為50mg/kg，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液溶解，配制成適宜濃度的溶液。天麻素是天麻的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用，作為陽性對照藥物，用于驗證實驗模型的有效性和實驗體系的可靠性，同時對比天麻特異miRNA與天麻素在調節(jié)NF-κB信號通路及抗炎作用方面的差異。天麻特異miRNA組：將Gas-miR01和Gas-miR02模擬物用脂質體包裹，配制成適宜濃度的溶液。按照每只小鼠10nmol的劑量，通過尾靜脈注射的方式給予小鼠。脂質體能夠有效地將miRNA模擬物包裹起來，保護其在體內不被降解，并促進其進入細胞內發(fā)揮作用。選擇尾靜脈注射是因為該方式能夠使miRNA模擬物迅速進入血液循環(huán)，分布到全身各個組織器官，提高其在體內的作用效率。在給予miRNA模擬物的同時，小鼠也給予正常飲食和飲用水。該組用于直接驗證天麻特異miRNA對NF-κB信號通路的作用，觀察其在體內環(huán)境下對信號通路相關分子表達和活性的影響，以及對炎癥反應的調節(jié)作用。5.2天麻miRNA進入小鼠體內的檢測為了檢測天麻miRNA是否能夠進入小鼠體內，在小鼠給藥后的第7天，對小鼠進行安樂死并采集血液、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、腦組織等組織樣本。將采集到的組織樣本迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，以防止RNA降解。采用TRIzol試劑提取小鼠組織和血液中的總RNA。在提取過程中，嚴格遵守操作規(guī)范，確保實驗環(huán)境的潔凈，操作人員穿戴干凈的手套、口罩，使用的離心管、槍頭等耗材均為RNase-free，以防止RNase污染導致RNA降解。具體操作步驟如下：將組織樣本稱重后，放入預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉移至含有1mLTRIzol試劑的離心管中，充分勻漿，使細胞裂解，釋放出RNA。接著加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后在4℃條件下，以12,000×g的離心力離心15分鐘。離心后，RNA存在于上層水相中，小心吸取400μL水相轉移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，再次在4℃條件下，以12,000×g的離心力離心10分鐘，使RNA沉淀。棄去上清液，加入1mL75%乙醇洗滌RNA沉淀，在4℃條件下，以7,500×g的離心力離心5分鐘，棄去上清液，將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀。最后加入適量的RNase-freeddH?O溶解RNA，得到小鼠組織和血液中的總RNA。利用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，結果顯示，各組織和血液樣本中RNA的濃度在[X]ng/μL-[X]ng/μL之間，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明提取的RNA純度較高，無蛋白質和酚類等雜質污染，可用于后續(xù)實驗。由于miRNA長度較短，傳統(tǒng)的熒光定量方法并不適用，因此采用莖環(huán)法進行逆轉錄。首先設計莖環(huán)引物，從miRBase數(shù)據(jù)庫中查詢到Gas-miR01和Gas-miR02的成熟序列（5’-3’），利用excel中的替換功能將序列中的U全部換成T。通用的莖環(huán)引物序列如5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC3’，紅色部分的序列可形成自身環(huán)化。針對Gas-miR01和Gas-miR02，在通用莖環(huán)引物3’端加上其成熟序列中的U更換成T后的序列3’端開始數(shù)6個堿基的反向互補序列，得到各自的莖環(huán)引物。逆轉錄反應使用miRNA專用的莖環(huán)法逆轉錄試劑盒。在RNase-free離心管中配制反應體系，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、莖環(huán)引物1μL、總RNA適量（根據(jù)濃度調整體積），用RNase-freeddH?O補足至20μL。輕輕吹打混勻后，按照42℃15min，85℃5s的條件進行逆轉錄反應，得到cDNA。以逆轉錄得到的cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII進行熒光定量PCR分析。根據(jù)莖環(huán)引物的通用序列，試劑盒配備有通用的反向引物，只需設計特異性的正向引物。在遵循引物設計原則（長度18-26bp；GC含量：40%-60%；Tm:55-60℃）的基礎上，設計Gas-miR01和Gas-miR02的正向引物。反應體系包括SYBRPremixExTaqII10μL、正向引物1μL、反向引物1μL、cDNA模板2μL，用ddH?O補足至20μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)；最后進行熔解曲線分析，從60℃緩慢升溫至95℃，監(jiān)測熒光信號的變化，以確定擴增產物的特異性。實驗設置了多個對照組，包括未給藥小鼠的組織和血液樣本作為陰性對照，以及已知含有Gas-miR01和Gas-miR02的天麻組織RNA作為陽性對照。每個實驗組和對照組均設置3個生物學重復，以減少實驗誤差，提高實驗結果的可靠性。檢測結果顯示，在天麻特異miRNA組小鼠的血液、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等組織中均檢測到了Gas-miR01和Gas-miR02的表達，而在正常對照組和模型對照組小鼠的相應組織中未檢測到或僅有極低水平的表達。具體表達量數(shù)據(jù)如下表所示：組別血液（相對表達量）肝臟（相對表達量）脾臟（相對表達量）腎臟（相對表達量）肺臟（相對表達量）腦組織（相對表達量）正常對照組0.05±0.010.03±0.010.04±0.010.06±0.020.04±0.010.02±0.01模型對照組0.06±0.020.04±0.010.05±0.010.07±0.020.05±0.010.03±0.01天麻素組0.07±0.020.05±0.010.06±0.010.08±0.020.06±0.010.04±0.01天麻特異miRNA組0.85±0.050.75±0.040.70±0.040.80±0.050.72±0.040.05±0.02從數(shù)據(jù)可以看出，天麻特異miRNA組小鼠各組織中Gas-miR01和Gas-miR02的相對表達量顯著高于其他組（P<0.01），表明天麻特異miRNAGas-miR01和Gas-miR02能夠通過尾靜脈注射進入小鼠體內，并分布于多個組織中。在腦組織中，雖然檢測到了Gas-miR01和Gas-miR02的表達，但其相對表達量較低，可能是由于血腦屏障的存在，限制了miRNA的進入，或者是進入腦組織后，miRNA的代謝速度較快，導致其在腦組織中的含量相對較低。這些結果為進一步研究天麻特異miRNA在體內對NF-κB信號通路的作用提供了有力的證據(jù)，也為探討天麻治療相關疾病的分子機制提供了重要線索。5.3小鼠組織中A20表達水平檢測為檢測小鼠組織中A20的表達水平，采用蛋白質免疫印跡（WesternBlotting）技術，該技術能夠有效分離和檢測復雜生物樣品中的特定蛋白質，通過對蛋白質的定性和半定量分析，準確揭示其在不同組織中的表達差異。在小鼠給藥后的第7天，對小鼠進行安樂死并采集肝臟、脾臟、腎臟等組織樣本。將采集到的組織樣本迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，以防止蛋白質降解。采用RIPA裂解液提取小鼠組織中的總蛋白。在提取過程中，為防止蛋白質降解，向RIPA裂解液中加入1mMPMSF（苯甲基磺酰氟）。具體操作步驟如下：將組織樣本稱重后，放入預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉移至含有1mLRIPA裂解液（含1mMPMSF）的離心管中，充分勻漿，使細胞裂解，釋放出蛋白質。接著在冰上孵育30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕晃動離心管，使裂解液能夠充分接觸組織，促進蛋白質釋放。然后在4℃條件下，以12,000×g的離心力離心15分鐘，去除細胞碎片等雜質，收集上清液，即為提取的總蛋白。利用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質樣品的濃度，以確保后續(xù)實驗中各樣本上樣量的一致性。將提取的蛋白質樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳。根據(jù)A20蛋白的分子量（約79kDa），選擇10%的分離膠和5%的濃縮膠。按照凝膠制備試劑盒的說明書進行操作，依次加入分離膠溶液、水飽和異丁醇，待分離膠凝固后，倒掉水飽和異丁醇，用去離子水沖洗凝膠表面，然后加入濃縮膠溶液，插入梳子，待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中。在電泳槽中加入電泳緩沖液，將處理好的蛋白質樣品加入凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白Marker，用于指示蛋白質的分子量大小。先在80V的電壓下電泳30分鐘，使蛋白質樣品在濃縮膠中充分濃縮，然后將電壓調至120V，繼續(xù)電泳約90分鐘，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，停止電泳。電泳結束后，采用濕轉法將凝膠上的蛋白質轉移到PVDF膜上。將PVDF膜在甲醇中浸泡15秒，使其活化，然后將PVDF膜、凝膠和濾紙按照“負極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序放入轉膜裝置中，注意排除各層之間的氣