酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)酵母雙雜交系統(tǒng)作為解析蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術(shù)，憑借其在活細(xì)胞內(nèi)模擬天然互作環(huán)境、無(wú)需純化蛋白的優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于信號(hào)通路解析、藥物靶點(diǎn)篩選等領(lǐng)域。精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)操作與對(duì)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的把控，是獲得可靠互作數(shù)據(jù)的核心。本文將從載體構(gòu)建、酵母轉(zhuǎn)化到結(jié)果驗(yàn)證，系統(tǒng)闡述實(shí)驗(yàn)流程，并針對(duì)常見(jiàn)問(wèn)題提供實(shí)操建議。一、實(shí)驗(yàn)前的關(guān)鍵準(zhǔn)備（一）載體與菌株選擇根據(jù)研究目標(biāo)選擇適配的載體系統(tǒng)：誘餌載體（如pGBKT7）需攜帶DNA結(jié)合域（BD，如Gal4-BD）與營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記（如Trp?）；獵物載體（如pGADT7）則融合轉(zhuǎn)錄激活域（AD，如Gal4-AD）與另一篩選標(biāo)記（如Leu?）。菌株選擇需匹配報(bào)告基因類(lèi)型，如AH109含His3、Ade2、LacZ三重報(bào)告基因，適合高嚴(yán)謹(jǐn)性篩選；Y187則更適配LacZ單報(bào)告系統(tǒng)。（二）試劑與耗材質(zhì)控培養(yǎng)基：YPD（酵母完全培養(yǎng)基）、SD系列缺陷培養(yǎng)基（-Trp、-Leu、-His、-Ade等）需新鮮配制，葡萄糖作為碳源時(shí)需單獨(dú)滅菌后添加，避免高溫分解。轉(zhuǎn)化輔助試劑：PEG4000（分子量需精準(zhǔn)，避免雜質(zhì)影響）、醋酸鋰（LiAc）需用超純水配制，鮭魚(yú)精DNA（載體DNA）需經(jīng)煮-凍-煮法處理以去除蛋白，-20℃分裝保存。二、實(shí)驗(yàn)核心步驟（一）誘餌與獵物載體構(gòu)建1.目的基因擴(kuò)增以cDNA為模板（避免基因組DNA的內(nèi)含子干擾），設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)（如EcoRI/BamHI）的引物，確保目的基因與載體讀碼框完全匹配（可通過(guò)SnapGene等軟件模擬翻譯后序列）。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，與經(jīng)相同酶切的載體進(jìn)行T4連接（16℃過(guò)夜或快速連接酶處理）。2.重組質(zhì)粒驗(yàn)證連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布含抗生素的LB平板（如Amp?）。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR或酶切驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送測(cè)序（需覆蓋連接區(qū)域，確認(rèn)無(wú)移碼或突變）。提取質(zhì)粒時(shí)，優(yōu)先選擇無(wú)內(nèi)毒素的試劑盒（如EndoFreePlasmidKit），保證DNA純度（OD???/???≈1.8~2.0）。（二）酵母感受態(tài)制備與轉(zhuǎn)化1.菌株活化從-80℃甘油菌中取50μL接種至5mLYPD液體培養(yǎng)基，30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12~16h至對(duì)數(shù)期（OD???≈0.6~0.8，菌液呈輕微渾濁）。取1mL活化菌液轉(zhuǎn)接至50mLYPD，繼續(xù)培養(yǎng)3~4h至OD???≈0.4~0.6（確保細(xì)胞活力）。2.醋酸鋰法轉(zhuǎn)化離心收集酵母（5000rpm，5min），用10mL無(wú)菌水重懸洗滌，再用1mLLiAc/TE（0.1MLiAc，10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH7.5）重懸，制成感受態(tài)細(xì)胞。取100μL感受態(tài)細(xì)胞，加入誘餌質(zhì)粒（1~5μg）、獵物質(zhì)粒（1~5μg）、鮭魚(yú)精DNA（50μg，變性后）、500μLPEG/LiAc（40%PEG4000，0.1MLiAc，10mMTris-HCl，1mMEDTA），渦旋混勻后30℃靜置30min。42℃熱激25~30min（溫度需精準(zhǔn)，避免熱死細(xì)胞），冰浴2min終止反應(yīng)。離心（5000rpm，5min）棄上清，用1mLYPD重懸，30℃靜置復(fù)蘇2h（讓細(xì)胞修復(fù)轉(zhuǎn)化損傷）。（三）篩選與互作驗(yàn)證1.初篩共轉(zhuǎn)化子將復(fù)蘇后的菌液涂布于SD/-Trp/-Leu雙缺培養(yǎng)基（篩選同時(shí)含BD和AD質(zhì)粒的酵母），30℃倒置培養(yǎng)2~3天。若菌落生長(zhǎng)過(guò)密，可梯度稀釋后涂布，確保單菌落清晰。2.互作依賴(lài)性篩選用滅菌牙簽挑取雙缺平板上的單菌落，點(diǎn)種（或影?。┲罶D/-Trp/-Leu/-His/-Ade四缺培養(yǎng)基（或添加AbA、X-α-Gal的選擇性平板）。若蛋白存在互作，報(bào)告基因（His3、Ade2、LacZ）會(huì)被激活：生長(zhǎng)驗(yàn)證：四缺平板上菌落生長(zhǎng)（陰性對(duì)照，如空載體組合應(yīng)無(wú)菌落）；顯色驗(yàn)證：X-α-Gal平板上菌落呈藍(lán)色（LacZ酶解底物顯色）；抗性驗(yàn)證：AbA（AureobasidinA）平板上菌落生長(zhǎng)（Ade2激活后酵母對(duì)AbA耐受）。3.假陽(yáng)性排除對(duì)疑似陽(yáng)性克隆進(jìn)行反向驗(yàn)證：將誘餌質(zhì)粒與空AD載體共轉(zhuǎn)化，或獵物質(zhì)粒與空BD載體共轉(zhuǎn)化，若仍在四缺平板生長(zhǎng)，則為假陽(yáng)性（可能因誘餌自激活或獵物非特異性結(jié)合）。此外，可通過(guò)β-半乳糖苷酶活性定量（如ONPG法）比較互作強(qiáng)度，活性值需顯著高于陰性對(duì)照（至少3倍以上）。三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與問(wèn)題解決（一）讀碼框與自激活控制讀碼框驗(yàn)證：載體多克隆位點(diǎn)的讀碼框需與目的基因嚴(yán)格匹配（如pGBKT7的NdeI位點(diǎn)為ATG起始，需確保目的基因第一個(gè)密碼子與ATG后序列連續(xù)）?？赏ㄟ^(guò)“載體-基因”融合序列的翻譯預(yù)測(cè)，避免移碼導(dǎo)致的無(wú)義蛋白。自激活檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)前需將誘餌質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)化酵母，涂布四缺或AbA平板。若菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明誘餌蛋白自身可激活報(bào)告基因，需通過(guò)截短功能域（如刪除轉(zhuǎn)錄激活域同源序列）、點(diǎn)突變（破壞潛在的轉(zhuǎn)錄激活基序）或換用弱啟動(dòng)子載體（如pBridge的MET25啟動(dòng)子）解決。（二）酵母狀態(tài)與轉(zhuǎn)化效率菌株活力：僅對(duì)數(shù)期酵母（OD???0.4~0.8）可高效轉(zhuǎn)化，若菌液過(guò)濃（OD???>1.0），需稀釋后重新培養(yǎng)。培養(yǎng)基需無(wú)雜菌污染（可通過(guò)“空白培養(yǎng)基培養(yǎng)”驗(yàn)證，若有菌落則需重新滅菌）。轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化：PEG濃度（40%最佳）、熱激時(shí)間（25~30min）、載體DNA用量（50μg鮭魚(yú)精DNA可提高轉(zhuǎn)化效率2~3倍）需嚴(yán)格控制。若轉(zhuǎn)化效率低，可嘗試“分步轉(zhuǎn)化”：先轉(zhuǎn)誘餌質(zhì)粒，篩選后再轉(zhuǎn)獵物質(zhì)粒（適用于毒性蛋白或高拷貝載體）。（三）假陽(yáng)性與假陰性應(yīng)對(duì)假陽(yáng)性：多由非特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子泄漏導(dǎo)致?？赏ㄟ^(guò)多報(bào)告基因篩選（如同時(shí)依賴(lài)His、Ade、LacZ）、回復(fù)突變驗(yàn)證（突變互作關(guān)鍵位點(diǎn)后互作消失）、生理相關(guān)性驗(yàn)證（如已知互作的陽(yáng)性對(duì)照需同時(shí)陽(yáng)性）降低假陽(yáng)性率。假陰性：可能因蛋白表達(dá)量低、翻譯后修飾缺失（如哺乳動(dòng)物蛋白的磷酸化修飾在酵母中無(wú)法完成）?？蓢L試共表達(dá)分子伴侶（如Hsp70/Hsp90）促進(jìn)蛋白折疊，或換用哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)（如基于LexA的系統(tǒng)）。（四）試劑與操作細(xì)節(jié)質(zhì)粒純度：內(nèi)毒素會(huì)抑制酵母轉(zhuǎn)化，需用無(wú)內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒，或通過(guò)“酚-氯仿抽提”進(jìn)一步純化。培養(yǎng)基保存：SD培養(yǎng)基需避光保存（避免色氨酸降解），且需現(xiàn)配現(xiàn)用（放置超過(guò)1周的培養(yǎng)基可能因營(yíng)養(yǎng)耗盡影響生長(zhǎng)）。無(wú)菌操作：所有操作需在超凈臺(tái)內(nèi)完成，接種針/牙簽需灼燒滅菌，避免細(xì)菌或真菌污染（污染菌在SD缺陷培養(yǎng)基上一般不生長(zhǎng)，可通過(guò)“形態(tài)觀(guān)察”區(qū)分：酵母菌落圓潤(rùn)、乳白；細(xì)菌菌落扁平、透明）。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解讀與拓展陽(yáng)性克隆需結(jié)合生物信息學(xué)分析（如蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，確認(rèn)互作區(qū)域合理性）、體外驗(yàn)證（如Pull-down、Co-IP）等技術(shù)交叉驗(yàn)證，避免“酵母內(nèi)互作”與“生理環(huán)境互作”的偏差。若需研究弱互作或瞬時(shí)互作，可通過(guò)酵母單雜交（研究蛋白與DNA互作）、三雜交