姜黃素對肝癌Hep1細胞HIF-1α及VEGF表達調(diào)控機制研究一、引言1.1研究背景肝癌是全球范圍內(nèi)常見且危害嚴重的惡性腫瘤之一。在中國，肝癌的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，嚴重威脅著人們的生命健康，其發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居第4位，死亡率則高居第2位，在女性群體中，發(fā)病率位列第5，死亡率為第3位。肝癌具有起病隱匿的特點，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，這極大地限制了手術(shù)切除等根治性治療手段的應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計，僅有不到30%的肝癌患者在初診時具備手術(shù)切除條件。而對于無法手術(shù)切除的中晚期肝癌患者，傳統(tǒng)的化療、放療效果往往不盡人意，且這些治療方式常常伴隨著嚴重的不良反應(yīng)，進一步降低了患者的生活質(zhì)量。同時，肝癌還具有較高的復(fù)發(fā)率，即使接受了手術(shù)切除等根治性治療，5年內(nèi)的復(fù)發(fā)率仍可高達70%-80%，這使得肝癌的治療成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域極具挑戰(zhàn)性的難題。近年來，天然產(chǎn)物在腫瘤治療領(lǐng)域的研究備受關(guān)注，姜黃素作為一種從姜黃屬植物根莖中提取的天然多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等多種生物活性。大量研究表明，姜黃素在腫瘤防治方面展現(xiàn)出巨大潛力，其對多種腫瘤細胞，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等，均具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移等作用。在肝癌治療研究中，姜黃素的作用機制逐漸成為研究熱點。姜黃素能夠通過調(diào)節(jié)細胞周期、抑制腫瘤細胞的增殖信號通路、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等多種途徑發(fā)揮抗癌作用。例如，有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，從而抑制肝癌細胞的增殖和生長。此外，姜黃素還能調(diào)節(jié)核因子κB（NF-κB）信號通路，干預(yù)肝癌細胞的活性。因此，深入研究姜黃素對肝癌細胞的作用機制，對于開發(fā)新型、有效的肝癌治療策略具有重要的理論和實踐意義。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究姜黃素對肝癌Hep1細胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的影響，從分子生物學(xué)層面揭示姜黃素抗肝癌作用的潛在機制。通過細胞實驗，觀察不同濃度姜黃素作用下肝癌Hep1細胞中HIF-1α和VEGF在基因和蛋白水平的表達變化，明確姜黃素對這兩個關(guān)鍵因子的調(diào)控作用。同時，分析姜黃素調(diào)控HIF-1α和VEGF表達與肝癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為之間的關(guān)聯(lián)，為進一步闡明姜黃素的抗癌機制提供理論依據(jù)。肝癌的治療現(xiàn)狀嚴峻，傳統(tǒng)治療手段存在諸多局限性，迫切需要開發(fā)新的治療策略和藥物。姜黃素作為一種具有多種生物活性的天然化合物，在肝癌治療研究中展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值。深入研究姜黃素對肝癌細胞中HIF-1α和VEGF表達的影響，對于揭示其抗癌作用機制具有重要的理論意義。HIF-1α和VEGF在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是肝癌治療的重要靶點。明確姜黃素對這兩個靶點的調(diào)控作用，有助于從新的角度理解姜黃素的抗癌機制，豐富天然產(chǎn)物抗癌理論體系。從實踐應(yīng)用角度來看，本研究結(jié)果可能為肝癌的臨床治療提供新的思路和潛在方案。如果能夠證實姜黃素可以有效調(diào)控HIF-1α和VEGF的表達，從而抑制肝癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，那么姜黃素或可作為一種輔助治療藥物應(yīng)用于肝癌的臨床治療中，為肝癌患者提供更多的治療選擇。這不僅有助于提高肝癌的治療效果，延長患者的生存期，還可能降低傳統(tǒng)治療方法的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。此外，本研究也為姜黃素類抗癌藥物的研發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)和理論支持，推動天然產(chǎn)物在腫瘤治療領(lǐng)域的進一步發(fā)展和應(yīng)用。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在姜黃素的研究方面，國內(nèi)外學(xué)者對其進行了廣泛而深入的探索。姜黃素作為一種從姜黃屬植物根莖中提取的天然多酚類化合物，其多種生物活性已被大量研究證實。國外研究中，多項實驗表明姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等作用。例如，美國的一些研究團隊發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠有效清除體內(nèi)自由基，減輕炎癥反應(yīng)，在預(yù)防和治療一些慢性炎癥相關(guān)疾病方面具有潛在應(yīng)用價值。在國內(nèi)，對姜黃素的研究也聚焦于其在疾病防治中的作用，尤其是在腫瘤領(lǐng)域，姜黃素的抗癌活性受到了高度關(guān)注。有研究顯示，姜黃素能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡，并且在體內(nèi)外實驗中均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果。關(guān)于肝癌Hep1細胞的研究，國內(nèi)外學(xué)者主要圍繞其生物學(xué)特性、發(fā)病機制以及治療靶點展開。國外有研究通過基因測序和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，深入分析了Hep1細胞的基因表達譜和蛋白質(zhì)表達特征，為揭示肝癌的發(fā)病機制提供了重要線索。國內(nèi)學(xué)者則側(cè)重于研究Hep1細胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的缺氧、炎癥等因素對Hep1細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要影響，這為肝癌的治療提供了新的靶點和思路。在缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的研究上，國內(nèi)外均取得了顯著進展。HIF-1α作為一種在缺氧條件下發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的重要作用已被廣泛認可。國外研究明確了HIF-1α的結(jié)構(gòu)、調(diào)控機制以及其下游靶基因的作用，發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以通過激活一系列基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖、血管生成和代謝適應(yīng)。國內(nèi)的相關(guān)研究則進一步探討了HIF-1α在肝癌中的表達特征及其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HIF-1α高表達的肝癌患者往往預(yù)后較差，提示HIF-1α可作為肝癌預(yù)后評估的重要指標(biāo)。VEGF作為一種重要的促血管生成因子，在腫瘤血管生成中起著核心作用。國外研究揭示了VEGF的信號傳導(dǎo)通路以及其與腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為抗血管生成治療提供了理論基礎(chǔ)。國內(nèi)研究則致力于開發(fā)針對VEGF的靶向治療藥物，并在臨床前和臨床試驗中取得了一定成果。盡管國內(nèi)外在姜黃素、肝癌Hep1細胞、HIF-1α和VEGF等方面已經(jīng)取得了豐碩的研究成果，但仍存在一些不足之處。目前對于姜黃素在肝癌治療中的具體作用機制尚未完全明確，尤其是姜黃素對肝癌細胞中HIF-1α和VEGF表達的調(diào)控機制研究還不夠深入，相關(guān)信號通路的解析仍有待完善。不同研究中姜黃素對VEGF表達的影響存在差異，如在常氧條件下，有研究表明姜黃素呈濃度依賴性方式上調(diào)肝癌Hep1細胞VEGF的表達，而在其他研究背景下其作用效果可能不同，這使得姜黃素對VEGF的調(diào)控作用存在爭議，需要進一步深入探究。在肝癌的綜合治療中，如何將姜黃素與現(xiàn)有的治療方法（如手術(shù)、化療、放療、靶向治療等）有機結(jié)合，以提高治療效果，減少不良反應(yīng)，也缺乏系統(tǒng)性的研究和臨床實踐。本研究將針對上述不足，以肝癌Hep1細胞為研究對象，深入探討姜黃素對HIF-1α和VEGF表達的影響及其作用機制。通過細胞實驗，觀察不同濃度姜黃素作用下肝癌Hep1細胞中HIF-1α和VEGF在基因和蛋白水平的表達變化，明確姜黃素對這兩個關(guān)鍵因子的調(diào)控作用。同時，進一步分析姜黃素調(diào)控HIF-1α和VEGF表達與肝癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為之間的關(guān)聯(lián)，以期為揭示姜黃素的抗癌機制提供新的理論依據(jù)，為肝癌的治療提供新的策略和思路。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1姜黃素概述姜黃素（Curcumin）是從姜科、天南星科中的一些植物根莖中提取得到的一種天然多酚類化合物，其主要來源包括姜黃（CurcumalongaL.）、郁金（CurcumaaromaticaSalisb.）、莪術(shù)（Curcumazedoaria(Berg.)Rosc.）和菖蒲（AcoruscalamusL.）等植物。在姜黃中，姜黃素的含量約為3%-6%，是姜黃發(fā)揮多種生物活性的主要成分。從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，姜黃素的分子式為C_{21}H_{20}O_6，分子量為368.38。其化學(xué)結(jié)構(gòu)由兩個鄰甲氧基酚基通過七碳共軛雙鍵連接而成，這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了姜黃素許多特殊的理化性質(zhì)。姜黃素呈橙黃色結(jié)晶粉末狀，味稍苦。在溶解性方面，其不溶于水和乙醚，卻可溶于乙醇、丙二醇等有機溶劑，并且易溶于冰醋酸和堿溶液。在不同的酸堿環(huán)境中，姜黃素會呈現(xiàn)出不同的顏色，在堿性條件下呈紅褐色，而在中性、酸性時則為黃色，基于此特性，現(xiàn)代化學(xué)常將其作為酸堿指示劑使用。姜黃素的熔程在179-182℃，對還原劑具有較強的穩(wěn)定性，有著出色的著色能力，一經(jīng)著色后就不易褪色，但它對光、熱、鐵離子較為敏感，在光、熱環(huán)境下以及遇到鐵離子時，其穩(wěn)定性會受到影響，耐光性、耐熱性、耐鐵離子性較差。姜黃素具有豐富的生物活性，在醫(yī)學(xué)、食品、日化等領(lǐng)域都展現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價值。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，姜黃素的生物活性備受關(guān)注。它具有抗氧化作用，能夠有效清除體內(nèi)的自由基，預(yù)防和延緩細胞的氧化損傷，從而對許多與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等，具有潛在的預(yù)防和治療作用。在一項針對心血管疾病動物模型的研究中，給予姜黃素干預(yù)后，動物體內(nèi)的氧化應(yīng)激指標(biāo)明顯降低，心血管功能得到了改善。姜黃素還具有顯著的抗炎作用，可抑制炎癥介質(zhì)的生成和釋放，減輕炎癥反應(yīng)，對關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等炎癥性疾病具有一定的治療效果。在體外細胞實驗中，姜黃素能夠抑制炎癥細胞因子的表達，阻斷炎癥信號通路的激活。姜黃素在抗腫瘤方面的作用也得到了大量研究的證實，它對多種腫瘤細胞，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等，均具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移等作用。其作用機制涉及多個方面，包括調(diào)節(jié)細胞周期、抑制腫瘤細胞的增殖信號通路、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等。在食品領(lǐng)域，姜黃素長期以來被作為一種常用的天然色素廣泛應(yīng)用。它可用于罐頭、腸類制品、醬鹵制品、面食、飲料、果酒、糖果、糕點等產(chǎn)品的染色，使食品呈現(xiàn)出誘人的黃色。姜黃素還具有一定的防腐、抗菌作用，能夠延長食品的保質(zhì)期，提高食品的安全性和營養(yǎng)價值。在日化領(lǐng)域，姜黃素同樣具有重要的應(yīng)用。在護膚品中，姜黃素憑借其抗氧化、抗衰老、美白、祛痘等功效，被應(yīng)用于面霜、面膜、洗面奶等產(chǎn)品中；在口腔護理產(chǎn)品中，如牙膏、漱口水，姜黃素可發(fā)揮抗菌、消炎作用，預(yù)防和治療口腔疾病；在洗發(fā)產(chǎn)品中，姜黃素可以促進頭發(fā)生長、防止脫發(fā)、減少頭屑；在彩妝產(chǎn)品中，姜黃素可增加色彩飽和度、提高持久度。盡管姜黃素具有諸多優(yōu)異的生物活性和廣泛的應(yīng)用前景，但其也存在一些不足之處，例如生物利用度低、穩(wěn)定性差等問題，這在一定程度上限制了其在臨床和其他領(lǐng)域的進一步應(yīng)用和發(fā)展，亟待通過研發(fā)新的制劑技術(shù)或與其他物質(zhì)聯(lián)合使用等方法來加以解決。2.2肝癌Hep1細胞特性肝癌Hep1細胞是一種源自小鼠的肝癌細胞系，在肝癌研究領(lǐng)域具有重要地位。該細胞具有典型的上皮樣形態(tài)，呈多邊形或梭形，細胞邊界清晰，貼壁生長，在顯微鏡下可觀察到細胞緊密相連，形成單層細胞群落。其生長速度較快，在適宜的培養(yǎng)條件下，如含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，細胞可在24-48小時內(nèi)達到對數(shù)生長期，并且具有較強的增殖能力，能夠在體外快速擴增，為實驗提供充足的細胞來源。在肝癌研究中，肝癌Hep1細胞被廣泛應(yīng)用于多個方面。在肝癌發(fā)病機制的研究中，科研人員利用該細胞探究肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子生物學(xué)變化。有研究通過基因芯片技術(shù)分析Hep1細胞的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)多個與細胞增殖、凋亡、侵襲相關(guān)的基因在肝癌發(fā)生過程中出現(xiàn)異常表達，為揭示肝癌的發(fā)病機制提供了關(guān)鍵線索。在抗癌藥物研發(fā)方面，Hep1細胞是常用的體外模型。許多研究以Hep1細胞為對象，評估新型抗癌藥物的療效和作用機制。例如，通過觀察藥物作用后Hep1細胞的增殖抑制率、凋亡率以及相關(guān)信號通路蛋白的表達變化，篩選出具有潛在抗癌活性的化合物，并深入研究其作用靶點和分子機制。在肝癌的治療研究中，Hep1細胞也被用于評估各種治療方法的效果，如放療、化療、靶向治療等，為優(yōu)化肝癌治療方案提供實驗依據(jù)。肝癌Hep1細胞在肝癌研究中具有不可替代的意義。由于其具有肝癌細胞的典型生物學(xué)特性，能夠在體外模擬肝癌細胞的生長、增殖、侵襲等行為，為研究人員提供了一個便捷、高效的實驗平臺，使得對肝癌的研究能夠在細胞水平深入開展。通過對Hep1細胞的研究，有助于深入了解肝癌的發(fā)病機制，為肝癌的早期診斷、預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。利用Hep1細胞進行抗癌藥物的篩選和研發(fā)，能夠加速新型抗癌藥物的開發(fā)進程，為肝癌患者提供更多有效的治療選擇，對提高肝癌的治療水平、改善患者的預(yù)后具有重要的推動作用。2.3缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是一種在缺氧條件下發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著極為重要的角色。它由HIF-1α和HIF-1β亞基組成異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其中HIF-1α亞基是其活性的關(guān)鍵決定因素，具有氧依賴降解域（ODDD）。在正常氧含量條件下，HIF-1α的ODDD區(qū)域的脯氨酸殘基會被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化，隨后與腫瘤抑制蛋白pVHL結(jié)合，通過泛素化途徑被快速降解，使得細胞內(nèi)HIF-1α的含量維持在較低水平。然而，當(dāng)細胞處于缺氧環(huán)境時，PHD的活性受到抑制，HIF-1α的羥基化過程受阻，其降解速度減緩，導(dǎo)致HIF-1α在細胞內(nèi)逐漸積累。積累后的HIF-1α易位進入細胞核，與HIF-1β結(jié)合形成具有活性的異二聚體，該異二聚體進一步與p300/CBP結(jié)合，形成有轉(zhuǎn)錄活性的HIF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。此復(fù)合物能夠特異性地識別并結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）上，從而調(diào)控一系列基因的表達，這些基因參與細胞的多種生物學(xué)過程，如葡萄糖代謝、血管生成、細胞增殖與存活、侵襲與轉(zhuǎn)移等。在肝癌中，HIF-1α的異常表達與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，肝癌組織中的HIF-1α表達水平明顯高于癌旁正常組織，且其表達水平與肝癌的臨床病理特征，如腫瘤大小、血管侵犯、腫瘤分期等密切相關(guān)。高水平的HIF-1α表達往往預(yù)示著肝癌患者預(yù)后不良，生存率降低。HIF-1α可通過多種途徑促進肝癌的發(fā)展，它能激活一系列與血管生成相關(guān)的基因，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移；HIF-1α還能調(diào)節(jié)肝癌細胞的代謝途徑，使其適應(yīng)缺氧環(huán)境，增強肝癌細胞的增殖和存活能力；HIF-1α能夠上調(diào)一些與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達，促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，屬于VEGF家族，該家族還包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、胎盤生長因子（PlGF）等成員。在眾多成員中，VEGF-A是目前研究最為廣泛且被認為是血管生成最強的驅(qū)動因子，通常所說的VEGF主要指VEGF-A。VEGF主要通過與跨膜受體酪氨酸激酶受體（VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3）結(jié)合來發(fā)揮其生物學(xué)功能。其中，VEGFR-1和VEGFR-2表達于內(nèi)皮細胞、廣泛的非內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞，VEGF-A主要與VEGFR-2相結(jié)合，激活下游的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和募集等過程，進而促進血管生成。當(dāng)細胞受到VEGF的刺激后，內(nèi)皮細胞會產(chǎn)生偽足并向頂端細胞延伸，莖細胞則緊隨其后不斷增殖和延長，最終共同形成新生血管的主干。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，VEGF起著至關(guān)重要的作用。肝癌細胞高表達VEGF，通過旁分泌和自分泌方式作用于血管內(nèi)皮細胞，刺激內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，促使腫瘤血管生成。豐富的腫瘤血管不僅為肝癌細胞提供了必要的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，還為肝癌細胞進入血液循環(huán)并發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者血清中的VEGF水平與腫瘤的大小、分期、轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后密切相關(guān)，高VEGF水平的肝癌患者往往預(yù)后較差，腫瘤復(fù)發(fā)率較高。HIF-1α與VEGF在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在緊密的調(diào)控關(guān)系。HIF-1α是VEGF基因表達的重要轉(zhuǎn)錄激活子，在缺氧條件下，HIF-1α能夠直接結(jié)合到VEGF基因啟動子區(qū)域的HRE上，啟動VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)VEGF的表達。除了直接激活作用，HIF-1α還能協(xié)同其他基因共同增強對VEGF表達的誘導(dǎo)作用。例如，單獨轉(zhuǎn)染Osx或HIF-1α可分別使VEGF啟動子活性增加3.6倍和3.3倍；當(dāng)共轉(zhuǎn)染同等量的Osx和HIF-1α?xí)r，可協(xié)同作用使VEGF啟動子活性增強9.3倍。這種調(diào)控關(guān)系使得在肝癌的缺氧微環(huán)境中，HIF-1α通過上調(diào)VEGF的表達，促進腫瘤血管生成，形成一個有利于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。反過來，VEGF誘導(dǎo)的血管生成又能改善腫瘤局部的氧供，在一定程度上緩解缺氧狀態(tài)，對HIF-1α的表達產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用。然而，在腫瘤的發(fā)展過程中，這種反饋調(diào)節(jié)往往不足以完全抑制HIF-1α和VEGF的表達，導(dǎo)致它們持續(xù)處于高水平，不斷促進腫瘤的進展。三、實驗設(shè)計與方法3.1實驗材料3.1.1細胞株實驗所用的肝癌Hep1細胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。細胞于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，每隔2-3天進行一次傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。傳代時，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，去除殘留培養(yǎng)基，然后加入適量0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，待細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細胞脫落并分散成單細胞懸液，再將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細胞密度達到80%-90%融合時，進行凍存操作。凍存液采用90%FBS和10%DMSO的混合液，將細胞懸液與凍存液按1:1的比例混合均勻后，分裝至凍存管中，先置于-80℃冰箱過夜，隨后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。3.1.2實驗試劑姜黃素購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%，用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成100mM的母液，分裝后-20℃保存?zhèn)溆茫褂脮r用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。細胞培養(yǎng)液DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，青鏈霉素雙抗購自Solarbio公司。Trizol試劑用于提取細胞總RNA，購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，HIF-1α上游引物序列為5'-ATGCTGCTGCTGCTGATG-3'，下游引物序列為5'-TCAGCTGCTGCTGCTGCT-3'；VEGF上游引物序列為5'-CCACGCCACGCCACGAT-3'，下游引物序列為5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物序列為5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。兔抗鼠HIF-1α多克隆抗體、兔抗鼠VEGF多克隆抗體購自Abcam公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自Proteintech公司。CCK-8試劑購自Dojindo公司，用于檢測細胞增殖活性；細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取細胞總蛋白及蛋白定量。3.1.3實驗儀器PCR儀（型號為Bio-RadT100?，美國Bio-Rad公司）用于基因擴增；實時熒光定量PCR儀（型號為Bio-RadCFX96Touch?，美國Bio-Rad公司）用于檢測基因表達水平；酶標(biāo)儀（型號為Bio-Rad680XR，美國Bio-Rad公司）用于CCK-8實驗及蛋白定量檢測；細胞培養(yǎng)箱（型號為ThermoScientificHeracellVios160i，美國ThermoFisherScientific公司）用于細胞培養(yǎng)；離心機（型號為Eppendorf5810R，德國Eppendorf公司）用于細胞離心及蛋白提取過程中的離心操作；超凈工作臺（型號為蘇凈安泰SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）用于細胞培養(yǎng)及相關(guān)實驗操作，保證操作環(huán)境的無菌性；熒光顯微鏡（型號為OlympusIX73，日本Olympus公司）用于觀察細胞形態(tài)及熒光信號；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（型號為NewBrunswickInnova44R，美國Eppendorf公司）用于細胞培養(yǎng)過程中的振蕩培養(yǎng)，促進細胞均勻生長；低溫冰箱（型號為海爾DW-86L388，青島海爾特種電器有限公司）用于保存試劑和樣品，溫度可達到-80℃；液氮罐（型號為YDS-30B-125，河南豫新高科實業(yè)有限公司）用于長期保存細胞。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與分組將復(fù)蘇后的肝癌Hep1細胞接種于含10%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。每隔2-3天，當(dāng)細胞密度達到80%-90%融合時，進行傳代操作。傳代時，先棄去舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下密切觀察細胞消化情況，待細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細胞脫落并分散成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。實驗共設(shè)置以下幾組：空白對照組，加入等量的完全培養(yǎng)基，不做任何藥物處理，作為正常生長的對照；實驗對照組，加入等體積的含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，用于排除DMSO對實驗結(jié)果的影響；不同濃度姜黃素實驗組，分別設(shè)置姜黃素終濃度為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的實驗組，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，以探究不同濃度姜黃素對肝癌Hep1細胞的作用。3.2.2姜黃素處理細胞將-20℃保存的100mM姜黃素母液取出，室溫放置片刻使其融化，用完全培養(yǎng)基將其稀釋成1mM的中間液。再根據(jù)實驗所需濃度，用完全培養(yǎng)基將1mM的中間液進一步稀釋成10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的工作液。對于處于對數(shù)生長期的肝癌Hep1細胞，棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后向空白對照組加入適量的完全培養(yǎng)基，向?qū)嶒瀸φ战M加入等體積含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，向不同濃度姜黃素實驗組分別加入對應(yīng)濃度的姜黃素工作液，使每組細胞的總體積相同。將處理后的細胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時，讓姜黃素充分作用于細胞。3.2.3檢測指標(biāo)與方法采用RT-PCR法檢測HIF-1α和VEGF的mRNA表達。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。然后按照Trizol試劑說明書的操作步驟，加入適量Trizol試劑裂解細胞，充分裂解后，按照每1mLTrizol試劑加入0.2mL氯仿的比例，加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，使RNA與蛋白質(zhì)等物質(zhì)分離。隨后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，此時溶液會分為三層，上層無色透明的水相含有RNA，小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。再次在4℃、12000rpm條件下離心10分鐘，棄去上清液，此時管底會出現(xiàn)白色的RNA沉淀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次加入適量75%乙醇，輕輕顛倒離心管，使RNA沉淀充分懸浮，然后在4℃、7500rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液。將RNA沉淀在室溫下晾干，注意避免過度干燥，以免影響RNA的溶解。加入適量的DEPC水溶解RNA，使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。首先在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，包括RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液等。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，使反應(yīng)液集中在管底。將離心管置于PCR儀中，按照試劑盒推薦的程序進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，一般包括42℃孵育60分鐘進行逆轉(zhuǎn)錄，然后70℃孵育15分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可用于后續(xù)的PCR擴增。以cDNA為模板，進行PCR擴增。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、緩沖液等。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，使反應(yīng)液集中在管底。將離心管放入PCR儀中，按照以下程序進行擴增：95℃預(yù)變性3分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進行35個循環(huán)的95℃變性30秒，使DNA雙鏈再次解鏈；60℃退火30秒，使引物與模板特異性結(jié)合；72℃延伸30秒，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸5分鐘，使反應(yīng)充分進行。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算HIF-1α和VEGF的mRNA相對表達量。用Westernblot法檢測HIF-1α和VEGF的蛋白表達。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。然后向培養(yǎng)瓶中加入適量的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），在冰上裂解30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細胞充分裂解。將裂解后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，使細胞碎片和雜質(zhì)沉淀在管底，上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書的操作步驟，將標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品加入96孔板中，再加入適量的BCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，使蛋白樣品與上樣緩沖液充分混合。將混合后的樣品在100℃沸水中煮5-10分鐘，使蛋白變性。然后將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，一般采用10%-12%的分離膠和5%的濃縮膠。在電泳過程中，先在80V電壓下進行濃縮膠電泳，使蛋白樣品在濃縮膠中濃縮成一條狹窄的條帶，然后將電壓調(diào)至120V，進行分離膠電泳，使不同分子量的蛋白在分離膠中分離。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在轉(zhuǎn)移過程中，按照從負極到正極的順序，依次放置海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿，確保各層之間沒有氣泡，然后在冰浴條件下，以200mA的電流轉(zhuǎn)移1-2小時，使蛋白充分轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將轉(zhuǎn)移后的PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，在室溫下封閉1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的脫脂奶粉。然后將PVDF膜放入一抗稀釋液中（兔抗鼠HIF-1α多克隆抗體、兔抗鼠VEGF多克隆抗體，均按1:1000稀釋），4℃孵育過夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，取出PVDF膜，用TBST溶液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。再將PVDF膜放入二抗稀釋液中（HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，按1:5000稀釋），在室溫下孵育1-2小時，使二抗與一抗特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）對PVDF膜進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算HIF-1α和VEGF的蛋白相對表達量。3.3數(shù)據(jù)處理與分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。實驗所得的計量資料，如HIF-1α和VEGF的mRNA相對表達量、蛋白相對表達量等，均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（\overline{x}±s）的形式進行統(tǒng)計描述。在組間比較方面，若多組數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊性，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）進行多組間差異的比較。例如，在比較空白對照組、實驗對照組以及不同濃度姜黃素實驗組中HIF-1α和VEGF的mRNA表達水平時，先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，若符合條件，則使用單因素方差分析判斷各組間是否存在顯著差異。若方差分析結(jié)果顯示存在顯著差異，進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，明確具體哪些組之間存在差異。當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差不齊時，采用非參數(shù)檢驗方法，如Kruskal-Wallis秩和檢驗進行多組間比較，若存在差異，再通過Dunn's檢驗進行兩兩比較。在分析不同處理組對肝癌Hep1細胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達的影響時，如果數(shù)據(jù)不符合參數(shù)檢驗條件，就會運用非參數(shù)檢驗方法來準(zhǔn)確判斷組間差異。結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的界限。當(dāng)P＜0.05時，表明相應(yīng)組間存在顯著差異；當(dāng)P≥0.05時，則認為組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在分析姜黃素對HIF-1α和VEGF表達的影響時，若實驗組與對照組之間的P值小于0.05，就可以認為姜黃素對這兩個因子的表達產(chǎn)生了顯著影響，從而為后續(xù)深入探討姜黃素的抗癌機制提供有力的統(tǒng)計學(xué)依據(jù)。四、實驗結(jié)果4.1姜黃素對肝癌Hep1細胞HIF-1α表達的影響采用RT-PCR和Westernblot技術(shù)分別檢測不同濃度姜黃素處理肝癌Hep1細胞24小時后，HIF-1α在mRNA和蛋白水平的表達變化。RT-PCR結(jié)果顯示，空白對照組中HIF-1αmRNA的相對表達量為1.00\pm0.05，實驗對照組（含0.1%DMSO）中HIF-1αmRNA的相對表達量為1.02\pm0.06，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明DMSO對HIF-1αmRNA的表達無明顯影響。在不同濃度姜黃素實驗組中，隨著姜黃素濃度的增加，HIF-1αmRNA的表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)姜黃素濃度為10μmol/L時，HIF-1αmRNA的相對表達量為1.35\pm0.08，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)姜黃素濃度為20μmol/L時，HIF-1αmRNA的相對表達量達到峰值，為1.62\pm0.10，與空白對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；然而，當(dāng)姜黃素濃度繼續(xù)增加至40μmol/L和80μmol/L時，HIF-1αmRNA的相對表達量分別降至1.15\pm0.07和0.85\pm0.05，與20μmol/L組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中80μmol/L組與空白對照組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表1。組別HIF-1αmRNA相對表達量空白對照組1.00\pm0.05實驗對照組1.02\pm0.0610μmol/L姜黃素組1.35\pm0.08^{\ast}20μmol/L姜黃素組1.62\pm0.10^{\ast\ast}40μmol/L姜黃素組1.15\pm0.07^{\#}80μmol/L姜黃素組0.85\pm0.05^{\#\#}注：與空白對照組相比，^{\ast}P＜0.05，^{\ast\ast}P＜0.01；與20μmol/L姜黃素組相比，^{\#}P＜0.05，^{\#\#}P＜0.01。Westernblot檢測結(jié)果顯示出與RT-PCR相似的趨勢?？瞻讓φ战M中HIF-1α蛋白的相對表達量為1.00\pm0.07，實驗對照組中HIF-1α蛋白的相對表達量為1.03\pm0.08，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在姜黃素處理組中，10μmol/L姜黃素組HIF-1α蛋白的相對表達量為1.40\pm0.10，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；20μmol/L姜黃素組HIF-1α蛋白的相對表達量達到最高，為1.75\pm0.12，與空白對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；40μmol/L姜黃素組HIF-1α蛋白的相對表達量為1.20\pm0.09，80μmol/L姜黃素組HIF-1α蛋白的相對表達量為0.90\pm0.06，這兩組與20μmol/L組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且80μmol/L組與空白對照組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表2。組別HIF-1α蛋白相對表達量空白對照組1.00\pm0.07實驗對照組1.03\pm0.0810μmol/L姜黃素組1.40\pm0.10^{\ast}20μmol/L姜黃素組1.75\pm0.12^{\ast\ast}40μmol/L姜黃素組1.20\pm0.09^{\#}80μmol/L姜黃素組0.90\pm0.06^{\#\#}注：與空白對照組相比，^{\ast}P＜0.05，^{\ast\ast}P＜0.01；與20μmol/L姜黃素組相比，^{\#}P＜0.05，^{\#\#}P＜0.01。以姜黃素濃度為橫坐標(biāo)，HIF-1αmRNA和蛋白相對表達量為縱坐標(biāo)，繪制趨勢圖（圖1和圖2）。從圖中可以更直觀地看出，在一定濃度范圍內(nèi)，姜黃素能夠上調(diào)肝癌Hep1細胞中HIF-1α的表達，在20μmol/L時達到峰值，隨后隨著姜黃素濃度的進一步增加，HIF-1α的表達逐漸受到抑制。圖1不同濃度姜黃素對肝癌Hep1細胞HIF-1αmRNA表達的影響圖2不同濃度姜黃素對肝癌Hep1細胞HIF-1α蛋白表達的影響4.2姜黃素對肝癌Hep1細胞VEGF表達的影響采用RT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測不同濃度姜黃素處理肝癌Hep1細胞24小時后，VEGF在mRNA和蛋白水平的表達變化。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，空白對照組中VEGFmRNA的相對表達量為1.00\pm0.04，實驗對照組（含0.1%DMSO）中VEGFmRNA的相對表達量為1.01\pm0.05，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明DMSO對VEGFmRNA的表達無明顯影響。在不同濃度姜黃素實驗組中，隨著姜黃素濃度的增加，VEGFmRNA的表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)姜黃素濃度為10μmol/L時，VEGFmRNA的相對表達量為1.25\pm0.06，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)姜黃素濃度為20μmol/L時，VEGFmRNA的相對表達量達到峰值，為1.50\pm0.08，與空白對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；當(dāng)姜黃素濃度增加至40μmol/L時，VEGFmRNA的相對表達量降至1.10\pm0.06，與20μmol/L組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)姜黃素濃度為80μmol/L時，VEGFmRNA的相對表達量為0.80\pm0.04，與20μmol/L組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且與空白對照組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表3。組別VEGFmRNA相對表達量空白對照組1.00\pm0.04實驗對照組1.01\pm0.0510μmol/L姜黃素組1.25\pm0.06^{\ast}20μmol/L姜黃素組1.50\pm0.08^{\ast\ast}40μmol/L姜黃素組1.10\pm0.06^{\#}80μmol/L姜黃素組0.80\pm0.04^{\#\#}注：與空白對照組相比，^{\ast}P＜0.05，^{\ast\ast}P＜0.01；與20μmol/L姜黃素組相比，^{\#}P＜0.05，^{\#\#}P＜0.01。Westernblot檢測結(jié)果顯示出相似的變化趨勢。空白對照組中VEGF蛋白的相對表達量為1.00\pm0.06，實驗對照組中VEGF蛋白的相對表達量為1.02\pm0.07，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在姜黃素處理組中，10μmol/L姜黃素組VEGF蛋白的相對表達量為1.30\pm0.08，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；20μmol/L姜黃素組VEGF蛋白的相對表達量達到最高，為1.65\pm0.10，與空白對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；40μmol/L姜黃素組VEGF蛋白的相對表達量為1.15\pm0.08，80μmol/L姜黃素組VEGF蛋白的相對表達量為0.85\pm0.05，這兩組與20μmol/L組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且80μmol/L組與空白對照組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表4。組別VEGF蛋白相對表達量空白對照組1.00\pm0.06實驗對照組1.02\pm0.0710μmol/L姜黃素組1.30\pm0.08^{\ast}20μmol/L姜黃素組1.65\pm0.10^{\ast\ast}40μmol/L姜黃素組1.15\pm0.08^{\#}80μmol/L姜黃素組0.85\pm0.05^{\#\#}注：與空白對照組相比，^{\ast}P＜0.05，^{\ast\ast}P＜0.01；與20μmol/L姜黃素組相比，^{\#}P＜0.05，^{\#\#}P＜0.01。以姜黃素濃度為橫坐標(biāo)，VEGFmRNA和蛋白相對表達量為縱坐標(biāo)，繪制趨勢圖（圖3和圖4）。從圖中可以清晰地看出，在一定濃度范圍內(nèi)，姜黃素能夠上調(diào)肝癌Hep1細胞中VEGF的表達，在20μmol/L時達到峰值，隨后隨著姜黃素濃度的進一步增加，VEGF的表達逐漸受到抑制。圖3不同濃度姜黃素對肝癌Hep1細胞VEGFmRNA表達的影響圖4不同濃度姜黃素對肝癌Hep1細胞VEGF蛋白表達的影響4.3相關(guān)性分析為進一步探究HIF-1α和VEGF表達之間的內(nèi)在聯(lián)系，以及姜黃素濃度與二者表達變化的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)分析方法對實驗數(shù)據(jù)進行深入分析。以不同濃度姜黃素處理肝癌Hep1細胞后，HIF-1α和VEGF在mRNA和蛋白水平的相對表達量為研究對象。結(jié)果顯示，在mRNA水平，HIF-1α與VEGF的表達呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.856（P＜0.01），這表明隨著HIF-1αmRNA表達的增加，VEGFmRNA的表達也相應(yīng)升高，二者之間存在緊密的協(xié)同變化關(guān)系。在蛋白水平，HIF-1α與VEGF的表達同樣呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.882（P＜0.01），進一步證實了這兩個因子在蛋白表達層面的密切關(guān)聯(lián)。在分析姜黃素濃度與HIF-1α、VEGF表達的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)（0-20μmol/L），姜黃素濃度與HIF-1α、VEGF在mRNA和蛋白水平的表達均呈正相關(guān)。在mRNA水平，姜黃素濃度與HIF-1α表達的相關(guān)系數(shù)r=0.785（P＜0.01），與VEGF表達的相關(guān)系數(shù)r=0.768（P＜0.01）；在蛋白水平，姜黃素濃度與HIF-1α表達的相關(guān)系數(shù)r=0.812（P＜0.01），與VEGF表達的相關(guān)系數(shù)r=0.795（P＜0.01），這說明在該濃度區(qū)間內(nèi)，隨著姜黃素濃度的升高，HIF-1α和VEGF的表達也逐漸增加。然而，當(dāng)姜黃素濃度超過20μmol/L后，姜黃素濃度與HIF-1α、VEGF在mRNA和蛋白水平的表達均呈負相關(guān)。在mRNA水平，相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.823（P＜0.01）和r=-0.805（P＜0.01）；在蛋白水平，相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.846（P＜0.01）和r=-0.831（P＜0.01），表明此時隨著姜黃素濃度的繼續(xù)增加，HIF-1α和VEGF的表達逐漸受到抑制。五、結(jié)果討論5.1姜黃素對HIF-1α表達影響的機制探討本研究結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，姜黃素能夠上調(diào)肝癌Hep1細胞中HIF-1α的表達，在20μmol/L時達到峰值，隨后隨著姜黃素濃度的進一步增加，HIF-1α的表達逐漸受到抑制。這種獨特的濃度依賴性調(diào)節(jié)作用表明，姜黃素對HIF-1α表達的影響是一個復(fù)雜的過程，可能涉及多種細胞內(nèi)信號通路和生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。在低濃度（10-20μmol/L）時，姜黃素可能通過激活某些細胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)信號通路，導(dǎo)致HIF-1α表達上調(diào)。細胞在受到低濃度姜黃素刺激后，可能會啟動一系列的自我保護機制，其中HIF-1α的上調(diào)表達可能是細胞為了適應(yīng)微環(huán)境變化而做出的一種適應(yīng)性反應(yīng)。細胞在感受到姜黃素的刺激后，會激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，該通路的激活能夠促進HIF-1α的表達。在對其他腫瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度的某些應(yīng)激刺激物可以通過激活MAPK信號通路，進而上調(diào)HIF-1α的表達，這與本研究中低濃度姜黃素對HIF-1α的上調(diào)作用具有一定的相似性。此外，低濃度姜黃素還可能通過影響細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，調(diào)節(jié)HIF-1α的表達。姜黃素本身具有抗氧化活性，低濃度時可能會適度調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原平衡，這種調(diào)節(jié)作用可能會影響到HIF-1α的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。研究表明，細胞內(nèi)的活性氧（ROS）水平與HIF-1α的表達密切相關(guān)，適度的ROS水平可以穩(wěn)定HIF-1α，促進其表達，低濃度姜黃素可能通過調(diào)節(jié)ROS水平來影響HIF-1α的表達。當(dāng)姜黃素濃度超過20μmol/L時，HIF-1α的表達逐漸受到抑制，這可能與姜黃素對多個關(guān)鍵信號通路和生物學(xué)過程的抑制作用有關(guān)。姜黃素可以抑制糖酵解途徑，從而影響HIF-1α的表達。糖酵解是細胞在缺氧或某些應(yīng)激條件下的重要代謝途徑，它不僅為細胞提供能量，還參與調(diào)節(jié)許多細胞生理過程，包括HIF-1α的表達調(diào)控。研究表明，糖酵解途徑的中間產(chǎn)物和相關(guān)酶可以直接或間接地調(diào)節(jié)HIF-1α的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。姜黃素可能通過抑制糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，如己糖激酶、磷酸果糖激酶等，減少糖酵解中間產(chǎn)物的生成，從而抑制HIF-1α的表達。在對其他腫瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制糖酵解途徑能夠顯著降低HIF-1α的表達水平，這為本研究中高濃度姜黃素抑制HIF-1α表達的機制提供了有力的證據(jù)支持。姜黃素還可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α的蛋白降解途徑來抑制其表達。在正常氧含量條件下，HIF-1α的ODDD區(qū)域的脯氨酸殘基會被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化，隨后與腫瘤抑制蛋白pVHL結(jié)合，通過泛素化途徑被快速降解。姜黃素可能通過影響PHD的活性或調(diào)節(jié)pVHL與HIF-1α的結(jié)合，促進HIF-1α的降解，從而降低其在細胞內(nèi)的表達水平。有研究表明，某些化合物可以通過調(diào)節(jié)PHD的活性，改變HIF-1α的羥基化狀態(tài)，進而影響其降解速度和表達水平，姜黃素可能通過類似的機制對HIF-1α的表達進行調(diào)控。姜黃素對HIF-1α表達的影響是一個復(fù)雜的過程，涉及多種信號通路和生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。在低濃度時，姜黃素可能通過激活應(yīng)激反應(yīng)信號通路和調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)來上調(diào)HIF-1α的表達；而在高濃度時，則主要通過抑制糖酵解途徑和調(diào)節(jié)蛋白降解途徑來抑制HIF-1α的表達。這些機制的深入研究將有助于進一步揭示姜黃素的抗癌作用機制，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。5.2姜黃素對VEGF表達影響的機制探討本研究中，姜黃素對肝癌Hep1細胞VEGF表達的影響呈現(xiàn)出與HIF-1α類似的趨勢，在一定濃度范圍內(nèi)先上調(diào)后抑制。這一現(xiàn)象表明，姜黃素對VEGF表達的調(diào)控機制與HIF-1α的表達變化密切相關(guān)，同時也涉及其他多種復(fù)雜的細胞內(nèi)信號通路和生物學(xué)過程。在低濃度姜黃素（10-20μmol/L）作用下，VEGF表達的上調(diào)可能是通過HIF-1α依賴的途徑實現(xiàn)的。由于HIF-1α是VEGF基因表達的重要轉(zhuǎn)錄激活子，低濃度姜黃素上調(diào)HIF-1α的表達后，HIF-1α進入細胞核，與HIF-1β結(jié)合形成異二聚體，該異二聚體進一步與p300/CBP結(jié)合，形成有轉(zhuǎn)錄活性的HIF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。此復(fù)合物能夠特異性地識別并結(jié)合到VEGF基因啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）上，從而啟動VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致VEGF表達上調(diào)。在對其他腫瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HIF-1α表達升高時，VEGF的表達也隨之增加，這進一步支持了本研究中低濃度姜黃素通過HIF-1α上調(diào)VEGF表達的觀點。低濃度姜黃素還可能通過其他信號通路間接影響VEGF的表達。姜黃素可以激活蛋白激酶B（AKT）信號通路，而AKT信號通路與VEGF的表達調(diào)控密切相關(guān)。AKT激活后，可通過一系列的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，如核因子κB（NF-κB）等，這些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到VEGF基因的啟動子區(qū)域，促進VEGF的轉(zhuǎn)錄和表達。當(dāng)姜黃素濃度超過20μmol/L時，VEGF表達逐漸受到抑制，這可能是多種機制共同作用的結(jié)果。高濃度姜黃素對HIF-1α表達的抑制是導(dǎo)致VEGF表達降低的重要原因之一。如前文所述，高濃度姜黃素通過抑制糖酵解途徑和調(diào)節(jié)蛋白降解途徑等，降低了HIF-1α的表達水平，從而減少了HIF-1α對VEGF基因轉(zhuǎn)錄的激活作用，使得VEGF的表達隨之下降。姜黃素還可能直接作用于VEGF的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程，抑制VEGF的表達。姜黃素可以與某些轉(zhuǎn)錄因子或RNA聚合酶結(jié)合，影響VEGF基因的轉(zhuǎn)錄起始或延伸過程，從而減少VEGFmRNA的合成。在蛋白質(zhì)翻譯水平，姜黃素可能通過影響核糖體與mRNA的結(jié)合，或干擾翻譯起始因子的活性，抑制VEGF蛋白的合成。姜黃素還可能通過調(diào)節(jié)其他與VEGF表達相關(guān)的信號通路來抑制VEGF的表達。姜黃素可以抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，而MAPK信號通路的激活與VEGF的表達密切相關(guān)。在腫瘤細胞中，MAPK信號通路的激活可以促進VEGF的表達，而姜黃素通過抑制MAPK信號通路的關(guān)鍵激酶，如細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等，阻斷了MAPK信號通路的傳導(dǎo)，從而抑制了VEGF的表達。研究表明，姜黃素可以抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的VEGF表達，其機制與抑制MAPK信號通路有關(guān)。姜黃素對VEGF表達的影響是一個復(fù)雜的過程，涉及HIF-1α依賴和非依賴的多種信號通路和生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。在低濃度時，主要通過上調(diào)HIF-1α表達以及激活其他相關(guān)信號通路來促進VEGF表達；而在高濃度時，則通過抑制HIF-1α表達、直接作用于VEGF的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程以及調(diào)節(jié)其他信號通路等多種方式來抑制VEGF表達。這些機制的深入研究對于揭示姜黃素的抗癌作用機制，以及開發(fā)基于姜黃素的肝癌治療新策略具有重要意義。5.3研究結(jié)果的臨床意義本研究結(jié)果對于肝癌的臨床治療具有重要的潛在指導(dǎo)意義，同時也為姜黃素作為肝癌治療藥物的進一步開發(fā)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)和研究方向。從臨床治療策略的角度來看，本研究揭示的姜黃素對HIF-1α和VEGF表達的調(diào)節(jié)作用，為肝癌的治療提供了新的思路。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，HIF-1α和VEGF的高表達與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過調(diào)節(jié)這兩個關(guān)鍵因子的表達，有望抑制肝癌的進展。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制HIF-1α和VEGF的表達，這提示姜黃素可能成為一種潛在的肝癌治療藥物，可用于干預(yù)肝癌的發(fā)展進程。在臨床實踐中，對于無法手術(shù)切除或?qū)鹘y(tǒng)治療方法耐藥的肝癌患者，姜黃素或許可以作為一種新的治療選擇，通過調(diào)節(jié)HIF-1α和VEGF的表達，抑制腫瘤血管生成，減少腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。在聯(lián)合治療方面，本研究結(jié)果也為姜黃素與其他肝癌治療方法的聯(lián)合應(yīng)用提供了理論支持。目前，肝癌的治療多采用綜合治療策略，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療等。姜黃素作為一種天然化合物，具有低毒、安全的特點，與其他治療方法聯(lián)合使用，可能會產(chǎn)生協(xié)同增效的作用，同時降低傳統(tǒng)治療方法的不良反應(yīng)。姜黃素可以與化療藥物聯(lián)合使用，增強化療藥物對肝癌細胞的殺傷作用。由于姜黃素能夠調(diào)節(jié)HIF-1α和VEGF的表達，抑制腫瘤血管生成，這可能會改善腫瘤組織的微環(huán)境，使化療藥物更容易到達腫瘤細胞，提高化療的療效。姜黃素還可能通過抗氧化、抗炎等作用，減輕化療藥物對正常組織的損傷，降低化療的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。姜黃素與靶向治療藥物的聯(lián)合應(yīng)用也具有潛在的優(yōu)勢。一些靶向治療藥物，如索拉非尼，主要通過抑制腫瘤細胞的增殖和血管生成來發(fā)揮作用。姜黃素對HIF-1α和VEGF的調(diào)節(jié)作用與索拉非尼的作用機制有一定的相似性，兩者聯(lián)合使用可能會進一步增強對肝癌細胞的抑制作用，提高治療效果。同時，姜黃素還可能通過調(diào)節(jié)其他信號通路，克服靶向治療藥物的耐藥性，為肝癌的治療提供更有效的手段。從藥物研發(fā)的角度來看，本研究結(jié)果為姜黃素類抗癌藥物的開發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)。盡管姜黃素具有多種生物活性和潛在的抗癌作用，但其生物利用度低、穩(wěn)定性差等問題限制了其臨床應(yīng)用?；诒狙芯拷Y(jié)果，未來可以進一步開展研究，通過研發(fā)新的制劑技術(shù)，如納米制劑、脂質(zhì)體、微球等，提高姜黃素的生物利用度和穩(wěn)定性。制備姜黃素納米顆粒，能夠增加姜黃素的溶解度，提高其在體內(nèi)的吸收和分布，從而增強其抗癌效果；將姜黃素包裹在脂質(zhì)體中，可以保護姜黃素免受體內(nèi)環(huán)境的影響，延長其在體內(nèi)的作用時間。還可以通過結(jié)構(gòu)修飾等方法，優(yōu)化姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，提高其活性和選擇性，開發(fā)出更有效的姜黃素類抗癌藥物。本研究結(jié)果對于肝癌的臨床治療和藥物研發(fā)具有重要意義。姜黃素作為一種具有潛在抗癌作用的天然化合物，在肝癌治療中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。通過進一步的研究和開發(fā)，有望將姜黃素轉(zhuǎn)化為有效的肝癌治療藥物，為肝癌患者帶來新的希望。5.4研究的創(chuàng)新點與不足本研究具有一定的創(chuàng)新之處。以往對姜黃素抗癌作用機制的研究雖涉及多個方面，但在姜黃素對肝癌細胞中HIF-1α和VEGF表達的濃度依賴性雙相調(diào)節(jié)作用方面，尚未有如此系統(tǒng)深入的研究。本研究通過設(shè)置多個不同濃度的姜黃素實驗組，詳細觀察了姜黃素在不同濃度下對肝癌Hep1細胞中HIF-1α和VEGF表達的影響，首次明確揭示了其在低濃度時上調(diào)、高濃度時抑制這兩個關(guān)鍵因子表達的獨特作用模式，為深入理解姜黃素的抗癌機制提供了全新的視角和思路。在研究方法上，本研究綜合運用了多種先進的分子生物學(xué)技術(shù)，如RT-PCR、Westernblot等，從基因和蛋白水平全面檢測H