姜黃素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡中Orai1和STIM1的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，在我國，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下。過去30年，我國肺癌死亡率急劇上升了465%，衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)明確顯示，肺癌已成為中國惡性腫瘤的首要死亡原因。在肺癌的眾多類型中，非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%-85%。與小細(xì)胞癌相比，非小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞生長分裂相對(duì)較慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移也較晚。近年來，盡管非小細(xì)胞肺癌在化療方面取得了一定成效，比如腫瘤縮小的局部控制率有所提升（單一藥物反應(yīng)率達(dá)10-30%，兩種化療藥物治療反應(yīng)率為35-45%），在緩和病程進(jìn)展、改善癥狀等方面也有所突破，然而，在延長患者存活時(shí)間這一關(guān)鍵指標(biāo)上，即便綜合運(yùn)用放射治療、手術(shù)等多種手段，仍難以取得顯著進(jìn)展。因此，尋找更為有效的預(yù)防和治療肺癌的藥物，成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的緊迫問題。姜黃素是從姜科、天南星科等植物根莖中提取出的一種化學(xué)成分，在姜黃中含量約為3-6%。它是植物界中稀少的具有二酮結(jié)構(gòu)的色素，屬于二酮類化合物，外觀為橙黃色結(jié)晶粉末，略帶苦味。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有多種藥理活性，可抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、抗類風(fēng)濕。美國VITY維他命雜志報(bào)道其具有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老清除自由基及抑制腫瘤生長等作用，美國腫瘤研究所更是將其列為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥。在抗腫瘤方面，姜黃素的作用機(jī)制呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)，包括抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抗氧化和清除氧自由基等。已有研究表明，姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌具有抑制作用，能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生周期阻滯或者凋亡，然而，其具體作用機(jī)制目前尚不完全清楚。鈣池操縱的Ca2+通道（SOC）在細(xì)胞膜上廣泛存在，是構(gòu)成非興奮性細(xì)胞胞外Ca2+內(nèi)流的主要通道。1986年，JamesPutney首次提出庫容性鈣內(nèi)流概念，即現(xiàn)在所說的鈣池調(diào)控鈣內(nèi)流（SOCE），它指的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中Ca2+濃度下降時(shí)，誘發(fā)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流的過程。自這一過程被揭示以來，研究發(fā)現(xiàn)SOCE幾乎存在于所有細(xì)胞中，并且參與細(xì)胞的分泌、生長、控制、淋巴細(xì)胞激活和免疫等一系列重要功能。隨著RNA干擾技術(shù)的不斷發(fā)展，SOCE過程中的兩個(gè)重要分子STIM1（基質(zhì)相互作用因子1）和Orai1被成功確定。其中，SOCE主要介導(dǎo)外鈣內(nèi)流。但截至目前，SOCE是否在姜黃素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，尚未見相關(guān)報(bào)道?；谝陨媳尘?，本研究聚焦于探討SOCE是否參與姜黃素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的過程，期望為開發(fā)姜黃素作為腫瘤治療藥物提供堅(jiān)實(shí)的理論支持，為肺癌的治療開辟新的路徑。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探索Orai1和STIM1在姜黃素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡過程中所扮演的角色及具體作用機(jī)制。通過MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR、免疫印跡法以及siRNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞凋亡率、基因和蛋白表達(dá)水平等多個(gè)層面展開研究。肺癌嚴(yán)重威脅人類生命健康，非小細(xì)胞肺癌作為其主要類型，治療困境亟待突破。雖然當(dāng)前治療手段取得一定進(jìn)展，但在延長患者生存時(shí)間上效果不佳，尋找新型治療藥物迫在眉睫。姜黃素作為一種具有多種藥理活性的天然化合物，在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出潛力，尤其在誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡方面，但作用機(jī)制不明。SOCE作為細(xì)胞內(nèi)重要的鈣信號(hào)調(diào)控途徑，其關(guān)鍵分子Orai1和STIM1在姜黃素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡中的作用尚無報(bào)道。本研究意義重大。在理論層面，有望揭示姜黃素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的全新機(jī)制，為深入理解腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控提供新視角，豐富腫瘤治療的理論體系；在實(shí)踐方面，若能明確Orai1和STIM1與姜黃素誘導(dǎo)凋亡的關(guān)聯(lián)，將為開發(fā)以姜黃素為基礎(chǔ)的腫瘤治療藥物提供關(guān)鍵理論依據(jù)，助力新型抗癌藥物研發(fā)，為肺癌患者帶來新的治療希望，推動(dòng)肺癌治療領(lǐng)域的發(fā)展。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用多種前沿技術(shù)與方法，深入剖析Orai1和STIM1在姜黃素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡中的作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面，將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞置于37℃、5%CO?與95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用不同濃度的姜黃素處理細(xì)胞不同時(shí)間，借助MTT法精準(zhǔn)檢測細(xì)胞增殖活力，以此明確姜黃素對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用；細(xì)胞鋪板24小時(shí)后，用不同濃度姜黃素處理24小時(shí)，收集細(xì)胞運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化，直觀呈現(xiàn)姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果。在分子生物學(xué)技術(shù)方面，通過熒光定量PCR的方法，檢測姜黃素處理后A549細(xì)胞上STIM1和Orai1在mRNA水平上的變化，從基因轉(zhuǎn)錄層面揭示二者的表達(dá)改變；利用免疫印跡法，檢測不同濃度姜黃素作用對(duì)STIM1和Orai1蛋白表達(dá)水平的影響，在蛋白質(zhì)層面進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。為深入研究STIM1和Orai1的功能，通過siRNA干擾的方法下調(diào)A549細(xì)胞上STIM1和Orai1的表達(dá)，并通過免疫印跡的方法來檢測siRNA的干擾效率；同時(shí)，通過轉(zhuǎn)染野生型STIM1質(zhì)粒和野生型Orai1質(zhì)粒的方法來過表達(dá)STIM1和Orai1，并通過免疫印跡檢測野生型STIM1和Orai1質(zhì)粒的過表達(dá)效率，最后利用流式細(xì)胞儀檢測STIM1和Orai1干擾和過表達(dá)后細(xì)胞凋亡率的變化，全面系統(tǒng)地闡述二者在姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的作用。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)顯著。以往對(duì)姜黃素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究，多集中于常見的信號(hào)通路、基因調(diào)控等方面，而本研究另辟蹊徑，首次深入探究Orai1和STIM1與姜黃素誘導(dǎo)凋亡之間的內(nèi)在聯(lián)系，從全新的鈣信號(hào)調(diào)控角度揭示姜黃素的抗癌機(jī)制，為該領(lǐng)域的研究開拓了新思路。在研究方法上，本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)，從細(xì)胞水平到分子水平，從基因表達(dá)到蛋白調(diào)控，全方位、多層次地展開研究，這種系統(tǒng)性的研究方法在同類研究中并不多見，能夠更深入、全面地揭示研究對(duì)象的本質(zhì)，為后續(xù)相關(guān)研究提供了可借鑒的研究模式，有望推動(dòng)非小細(xì)胞肺癌治療機(jī)制研究取得新的突破。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1非小細(xì)胞肺癌概述非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer,NSCLC）是肺癌中最為常見的類型，約占肺癌病例總數(shù)的85%。作為一種起源于肺部上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其癌細(xì)胞生長分裂相對(duì)緩慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移也較晚。從分類來看，非小細(xì)胞肺癌主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌三個(gè)主要亞型。鱗狀細(xì)胞癌與吸煙關(guān)系密切，多起源于段和亞段支氣管黏膜，常向管腔內(nèi)生長，早期可引起支氣管狹窄，導(dǎo)致肺不張或阻塞性肺炎；腺癌近年來發(fā)病率上升明顯，在女性及不吸煙人群中較為常見，多起源于較小的支氣管上皮，可在肺邊緣形成孤立的結(jié)節(jié)或腫塊；大細(xì)胞癌則具有高度惡性，癌細(xì)胞體積大，形態(tài)多樣，核仁明顯，常見大片出血性壞死，生長迅速，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移。在全球范圍內(nèi)，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率和死亡率都處于高位。其發(fā)病原因是多因素綜合作用的結(jié)果，吸煙是最為主要的危險(xiǎn)因素，約85%的肺癌患者有吸煙史，吸煙量越大、煙齡越長，患癌風(fēng)險(xiǎn)越高；職業(yè)暴露，如長期接觸石棉、放射性物質(zhì)等，會(huì)顯著增加患病幾率；環(huán)境污染，包括工業(yè)廢氣、汽車尾氣等，也在肺癌發(fā)病中扮演重要角色；此外，遺傳因素使得某些個(gè)體具有更高的易感性?；颊咴缙诎Y狀往往不明顯，隨著病情進(jìn)展，可出現(xiàn)咳嗽，多為刺激性干咳，痰中帶血，胸痛，常為隱痛或鈍痛，以及呼吸困難等癥狀。目前，非小細(xì)胞肺癌的診斷通常需要綜合多方面信息。病史采集可了解患者吸煙史、職業(yè)暴露史、家族史等；體格檢查能發(fā)現(xiàn)一些異常體征；影像學(xué)檢查中，胸部X線可初步發(fā)現(xiàn)肺部病變，而CT掃描則能更清晰地顯示腫瘤的位置、大小、形態(tài)及與周圍組織的關(guān)系，是診斷的重要手段；組織病理學(xué)檢查通過獲取病變組織進(jìn)行病理分析，是確診的金標(biāo)準(zhǔn)，可明確腫瘤的類型和分化程度。治療手段根據(jù)腫瘤的類型、分期和患者的身體狀況進(jìn)行選擇。手術(shù)治療適用于早期非小細(xì)胞肺癌，通過切除腫瘤組織，有望達(dá)到根治目的；化療利用化學(xué)藥物殺死癌細(xì)胞，可用于術(shù)前新輔助化療、術(shù)后輔助化療以及晚期無法手術(shù)患者的姑息化療；放療則是利用高能射線照射腫瘤，抑制癌細(xì)胞生長，可單獨(dú)使用或與化療聯(lián)合；近年來，靶向治療和免疫治療取得了顯著進(jìn)展，靶向治療針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)，精準(zhǔn)抑制腫瘤生長，具有療效好、副作用小的特點(diǎn)，免疫治療則通過激活人體自身免疫系統(tǒng)來對(duì)抗腫瘤。然而，盡管多種治療手段不斷發(fā)展，但晚期非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后仍較差，5年生存率較低，因此，探索新的治療方法和藥物具有重要的臨床意義。2.2姜黃素的特性與抗癌機(jī)制姜黃素（Curcumin）主要從姜科植物姜黃（CurcumalongaL.）、郁金（CurcumaaromaticaSalisb.）以及天南星科植物菖蒲（AcoruscalamusL.）等的根莖中提取而來，在姜黃中的含量約為3-6%。其化學(xué)名稱為1,7-雙（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮，是一種具有獨(dú)特二酮結(jié)構(gòu)的多酚類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含兩個(gè)甲氧基、兩個(gè)酚羥基以及中間的七碳共軛雙鍵，這種結(jié)構(gòu)賦予了姜黃素特殊的理化性質(zhì)和生物活性。其外觀呈橙黃色結(jié)晶粉末狀，味稍苦，不溶于水和乙醚，可溶于乙醇、丙二醇等有機(jī)溶劑，在堿性溶液中呈紅褐色，中性和酸性條件下則為黃色。由于分子兩端的羥基在堿性條件下會(huì)發(fā)生電子云偏離的共軛效應(yīng)，當(dāng)pH大于8時(shí)，姜黃素會(huì)由黃變紅，這一特性使其可作為酸堿指示劑。同時(shí)，姜黃素對(duì)還原劑的穩(wěn)定性較強(qiáng)，著色性強(qiáng)，一經(jīng)著色后不易褪色，但對(duì)光、熱、鐵離子較為敏感，耐光性、耐熱性、耐鐵離子性較差。姜黃素具有廣泛的藥理作用，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，姜黃就被用于治療炎癥、消化不良等多種疾病?，F(xiàn)代研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗凝、降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物活性。其抗氧化作用源于自身結(jié)構(gòu)中的酚羥基，能夠清除體內(nèi)過多的自由基，如超氧陰離子自由基、羥自由基等，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷；在抗炎方面，姜黃素可以抑制炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等的產(chǎn)生和釋放，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號(hào)通路，從而減輕炎癥反應(yīng)。在抗癌領(lǐng)域，姜黃素展現(xiàn)出顯著的潛力。其抗癌機(jī)制呈現(xiàn)出多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。首先，姜黃素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。它可以作用于細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如抑制細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期或G2/M期，阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖。其次，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是姜黃素抗癌的重要機(jī)制之一。姜黃素可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，如通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2的比值，從而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)，姜黃素還能作用于線粒體，引起線粒體膜電位的下降，釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)一步激活凋亡途徑。此外，姜黃素具有抗氧化和清除氧自由基的能力，能夠減少自由基對(duì)細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的損傷，降低細(xì)胞發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)。在腫瘤微環(huán)境中，姜黃素還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。這些多方面的抗癌機(jī)制使得姜黃素成為極具研究價(jià)值的天然抗癌化合物，為腫瘤的預(yù)防和治療提供了新的策略和方向。2.3Orai1和STIM1與鈣池調(diào)控鈣內(nèi)流鈣池調(diào)控鈣內(nèi)流（Store-OperatedCalciumEntry，SOCE）是細(xì)胞內(nèi)一種重要的鈣信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，在維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)以及調(diào)控細(xì)胞生理功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其概念最早于1986年由JamesPutney提出，用以描述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+濃度下降時(shí)，引發(fā)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流的過程。這一過程在幾乎所有細(xì)胞類型中都廣泛存在，參與了諸如細(xì)胞的分泌、生長、控制、淋巴細(xì)胞激活和免疫等一系列至關(guān)重要的生理和病理過程。SOCE的發(fā)生過程較為復(fù)雜，涉及多個(gè)關(guān)鍵分子和步驟。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)重要的鈣儲(chǔ)存庫，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子由于各種生理刺激（如激素、生長因子等信號(hào)刺激）外流而濃度降低時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白STIM1能夠敏銳地感知到這一變化。STIM1是單次跨膜蛋白，其N端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，含有EF-hand結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)︹}離子具有高親和力，是感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度變化的關(guān)鍵區(qū)域。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度下降時(shí)，STIM1分子的EF-hand結(jié)構(gòu)域與鈣離子解離，引發(fā)STIM1分子構(gòu)象改變，多個(gè)STIM1分子在靠近細(xì)胞膜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域聚集，形成寡聚體結(jié)構(gòu)。隨后，這些寡聚化的STIM1通過與細(xì)胞膜上的Orai1蛋白相互作用，激活Orai1形成功能性的鈣離子通道。Orai1是一種四跨膜蛋白，其構(gòu)成的通道具有高度的鈣離子選擇性，對(duì)鈣離子的通透能力遠(yuǎn)高于其他陽離子。在靜息狀態(tài)下，Orai1通道處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)與聚集的STIM1結(jié)合后，通道構(gòu)象發(fā)生改變，通道開放，細(xì)胞外的鈣離子得以順電化學(xué)梯度流入細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)鈣內(nèi)流。這一過程中，STIM1充當(dāng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫狀態(tài)的感受器和信號(hào)傳遞者，而Orai1則是鈣內(nèi)流的執(zhí)行者，二者緊密配合，共同完成SOCE過程。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，STIM1與Orai1之間的相互作用存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)節(jié)機(jī)制，它們之間的動(dòng)態(tài)結(jié)合和解離受到多種因素的調(diào)控，如細(xì)胞內(nèi)的酸堿度、脂質(zhì)環(huán)境、其他輔助蛋白等，這些因素共同精細(xì)地調(diào)節(jié)著SOCE的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，以滿足細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下對(duì)鈣信號(hào)的需求。三、姜黃素對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本實(shí)驗(yàn)選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。姜黃素（純度≥98%）購自Sigma公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成100mmol/L的儲(chǔ)存液，-20℃保存，使用時(shí)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，確保DMSO終濃度不超過0.1%，以免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)所用主要試劑包括：MTT（噻唑藍(lán)）試劑，購自Amresco公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自BDBiosciences公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶，均購自Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，購自TaKaRa公司；兔抗人STIM1抗體、兔抗人Orai1抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，均購自CellSignalingTechnology公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑，購自ThermoFisherScientific公司；STIM1siRNA、Orai1siRNA以及陰性對(duì)照siRNA，由廣州銳博生物科技有限公司合成；野生型STIM1質(zhì)粒、野生型Orai1質(zhì)粒，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器有：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），保證實(shí)驗(yàn)操作的無菌條件；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），檢測MTT實(shí)驗(yàn)中的吸光值；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，BD公司），精確測定細(xì)胞凋亡率；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），定量檢測基因表達(dá)水平；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），檢測蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，將A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期，用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活力。取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔體積200μL，培養(yǎng)24小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（0、10、20、40、80μmol/L）的姜黃素溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基和MTT試劑）和對(duì)照孔（加細(xì)胞、培養(yǎng)基和MTT試劑，不加姜黃素）。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），37℃孵育4小時(shí)。小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔的光吸收值（OD值），記錄結(jié)果。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。將A549細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度（0、20、40μmol/L）的姜黃素溶液，處理24小時(shí)。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞。依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。1小時(shí)內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的結(jié)果，區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地展示了姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖活力的顯著影響，結(jié)果見表1。與對(duì)照組相比，不同濃度的姜黃素處理A549細(xì)胞24、48和72小時(shí)后，細(xì)胞的增殖活力均受到了明顯的抑制，且這種抑制作用呈現(xiàn)出顯著的劑量和時(shí)間依賴性（P<0.05）。當(dāng)姜黃素濃度為10μmol/L時(shí)，處理24小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率為（15.32±2.15）%；處理48小時(shí)后，抑制率上升至（26.45±3.24）%；處理72小時(shí)后，抑制率進(jìn)一步提高到（38.56±4.02）%。隨著姜黃素濃度增加到80μmol/L，處理24小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（45.68±5.23）%；處理48小時(shí)后，抑制率為（62.35±6.12）%；處理72小時(shí)后，抑制率更是高達(dá)（78.45±7.35）%。通過計(jì)算，得出姜黃素作用24、48和72小時(shí)的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（56.45±3.21）μmol/L、（38.23±2.15）μmol/L和（22.15±1.89）μmol/L。這一系列數(shù)據(jù)表明，隨著姜黃素濃度的不斷增大以及處理時(shí)間的逐漸延長，其對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制效果愈發(fā)顯著。[此處添加一個(gè)展示不同濃度姜黃素處理A549細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞增殖活力的折線圖]表1：不同濃度姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖活力的影響（x±s，n=6）姜黃素濃度（μmol/L）24hOD值增殖抑制率（%）48hOD值增殖抑制率（%）72hOD值增殖抑制率（%）00.865±0.032-0.986±0.045-1.256±0.056-100.733±0.02515.32±2.150.725±0.03126.45±3.240.772±0.03538.56±4.02200.621±0.02828.21±2.560.586±0.02840.57±3.560.568±0.03254.77±4.56400.470±0.02245.66±3.120.395±0.02460.34±4.230.325±0.02174.12±5.12800.469±0.02745.68±5.230.372±0.02962.35±6.120.270±0.02378.45±7.35流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明，姜黃素能夠有效誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，結(jié)果見表2。與對(duì)照組（凋亡率為3.56±0.45%）相比，20μmol/L姜黃素處理組的細(xì)胞凋亡率顯著升高至（15.68±1.23）%，40μmol/L姜黃素處理組的細(xì)胞凋亡率更是達(dá)到（28.56±2.15）%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這充分說明，隨著姜黃素濃度的增加，其誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的能力顯著增強(qiáng)。在細(xì)胞凋亡的過程中，早期凋亡細(xì)胞的比例也隨著姜黃素濃度的升高而明顯增加。對(duì)照組中早期凋亡細(xì)胞比例僅為（1.23±0.21）%，20μmol/L姜黃素處理組上升至（6.54±0.89）%，40μmol/L姜黃素處理組則達(dá)到（12.35±1.56）%，這進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，且呈現(xiàn)出濃度依賴的特性。[此處添加一個(gè)展示不同濃度姜黃素處理24小時(shí)后A549細(xì)胞凋亡率的柱狀圖]表2：不同濃度姜黃素對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響（x±s，n=3）姜黃素濃度（μmol/L）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）總凋亡率（%）01.23±0.212.33±0.243.56±0.45206.54±0.899.14±1.1215.68±1.234012.35±1.5616.21±2.0128.56±2.153.3結(jié)果分析與討論MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞具有顯著的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。從MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制呈現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。隨著姜黃素濃度從10μmol/L逐漸增加到80μmol/L，細(xì)胞增殖抑制率不斷上升，且在相同濃度下，作用時(shí)間從24小時(shí)延長至72小時(shí)，抑制率也顯著提高。這表明姜黃素能夠有效抑制A549細(xì)胞的生長，且作用效果隨著劑量的增大和時(shí)間的延長而增強(qiáng)。通過計(jì)算不同時(shí)間的IC50值進(jìn)一步量化了姜黃素的抑制效果，作用24、48和72小時(shí)的IC50值分別為（56.45±3.21）μmol/L、（38.23±2.15）μmol/L和（22.15±1.89）μmol/L，直觀地反映出隨著時(shí)間推移，姜黃素抑制細(xì)胞增殖所需的濃度逐漸降低，說明其抑制作用的時(shí)間累積效應(yīng)明顯。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果同樣令人矚目，姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的能力也呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率僅為3.56±0.45%，而20μmol/L姜黃素處理組凋亡率上升至15.68±1.23%，40μmol/L處理組更是達(dá)到28.56±2.15%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這充分說明姜黃素能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著濃度升高，誘導(dǎo)凋亡的效果愈發(fā)顯著。早期凋亡細(xì)胞比例的增加也進(jìn)一步佐證了這一結(jié)論，從對(duì)照組的1.23±0.21%，到20μmol/L處理組的6.54±0.89%，再到40μmol/L處理組的12.35±1.56%，清晰地展示了姜黃素對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)程的促進(jìn)作用。這些結(jié)果與以往相關(guān)研究報(bào)道具有一致性。相關(guān)研究表明，姜黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。在對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且作用效果與本研究中對(duì)A549細(xì)胞的作用類似，呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性。另一項(xiàng)對(duì)肝癌細(xì)胞的研究也表明，姜黃素可以通過多種途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，如激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)、調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白表達(dá)等。在非小細(xì)胞肺癌研究領(lǐng)域，朱國慶等人研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著抑制A549細(xì)胞的活性，經(jīng)姜黃素處理后，A549細(xì)胞的凋亡率明顯升高，且Bax/Bcl-2比值上升，細(xì)胞色素C和Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制作用。本研究不僅再次驗(yàn)證了姜黃素在非小細(xì)胞肺癌治療中的潛力，更為深入研究其作用機(jī)制提供了重要的前期數(shù)據(jù)。姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的劑量和時(shí)間反應(yīng)關(guān)系，為其在肺癌治療中的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用中，可根據(jù)腫瘤細(xì)胞的特性和患者的具體情況，優(yōu)化姜黃素的使用劑量和治療時(shí)間，以達(dá)到最佳的治療效果。對(duì)于一些對(duì)化療藥物耐藥的非小細(xì)胞肺癌患者，姜黃素作為一種天然的化合物，具有低毒、副作用小的優(yōu)勢，可能成為一種新的治療選擇。此外，姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究，也為開發(fā)新型的肺癌治療藥物提供了潛在的靶點(diǎn)和方向，有望通過進(jìn)一步的研究，開發(fā)出以姜黃素為基礎(chǔ)的新型抗癌藥物，為肺癌患者帶來新的希望。四、姜黃素對(duì)A549細(xì)胞中Orai1和STIM1表達(dá)的影響4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作本實(shí)驗(yàn)旨在探究姜黃素對(duì)A549細(xì)胞中Orai1和STIM1表達(dá)的影響，采用熒光定量PCR和免疫印跡法，從mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測。熒光定量PCR方面，將處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24小時(shí)使其貼壁。隨后，分別加入不同濃度（0、20、40μmol/L）的姜黃素溶液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。處理結(jié)束后，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。取1μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。Orai1上游引物序列為5'-AGCAGCAGCAGCAGCAGC-3'，下游引物序列為5'-GCCGCCGCCGCCGCCGCC-3'；STIM1上游引物序列為5'-CCGCCGCCGCCGCCGCC-3'，下游引物序列為5'-GCGGCGGCGGCGGCGGCG-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物序列為5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒、60℃退火30秒。最后，通過2^-ΔΔCt法計(jì)算Orai1和STIM1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。免疫印跡法檢測時(shí)，同樣將對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度（0、20、40μmol/L）的姜黃素溶液處理24小時(shí)。處理完成后，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。向每孔中加入100μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘。然后，將裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，收集上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。接著，加入兔抗人Orai1抗體（1:1000稀釋）、兔抗人STIM1抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，并用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算Orai1和STIM1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.2表達(dá)水平檢測結(jié)果熒光定量PCR結(jié)果顯示，姜黃素處理A549細(xì)胞24h后，Orai1和STIM1的mRNA表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，結(jié)果見表3。與對(duì)照組（0μmol/L姜黃素處理組，Orai1mRNA相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1.00±0.05，STIM1mRNA相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1.00±0.06）相比，20μmol/L姜黃素處理組中，Orai1mRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.65±0.04，下降了約35%，STIM1mRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.70±0.05，下降了約30%；40μmol/L姜黃素處理組中，Orai1mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步降至0.40±0.03，下降了約60%，STIM1mRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.45±0.04，下降了約55%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各處理組與對(duì)照組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且Orai1和STIM1的mRNA表達(dá)水平隨著姜黃素濃度的增加而呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。[此處添加一個(gè)展示不同濃度姜黃素處理24小時(shí)后A549細(xì)胞中Orai1和STIM1mRNA相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖]表3：不同濃度姜黃素對(duì)A549細(xì)胞中Orai1和STIM1mRNA表達(dá)的影響（x±s，n=3）姜黃素濃度（μmol/L）Orai1mRNA相對(duì)表達(dá)量STIM1mRNA相對(duì)表達(dá)量01.00±0.051.00±0.06200.65±0.04*0.70±0.05*400.40±0.03*0.45±0.04*注：*與對(duì)照組相比，P<0.05免疫印跡法檢測的結(jié)果同樣表明，姜黃素處理對(duì)A549細(xì)胞中Orai1和STIM1的蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生了明顯影響，結(jié)果見表4。對(duì)照組中，Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.08，STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.09。20μmol/L姜黃素處理組中，Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至0.70±0.06，下降了約30%，STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至0.75±0.07，下降了約25%；40μmol/L姜黃素處理組中，Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.45±0.05，下降了約55%，STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.50±0.06，下降了約50%。各處理組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨著姜黃素濃度升高，Orai1和STIM1的蛋白表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。[此處添加一個(gè)展示不同濃度姜黃素處理24小時(shí)后A549細(xì)胞中Orai1和STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖]表4：不同濃度姜黃素對(duì)A549細(xì)胞中Orai1和STIM1蛋白表達(dá)的影響（x±s，n=3）姜黃素濃度（μmol/L）Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)量STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量01.00±0.081.00±0.09200.70±0.06*0.75±0.07*400.45±0.05*0.50±0.06*注：*與對(duì)照組相比，P<0.054.3結(jié)果討論與分析本實(shí)驗(yàn)通過熒光定量PCR和免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理A549細(xì)胞后，Orai1和STIM1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著降低，且這種降低呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在20μmol/L姜黃素處理組中，Orai1和STIM1的mRNA表達(dá)分別下降了約35%和30%，蛋白表達(dá)分別下降了約30%和25%；當(dāng)姜黃素濃度升高至40μmol/L時(shí)，Orai1和STIM1的mRNA表達(dá)進(jìn)一步下降約60%和55%，蛋白表達(dá)下降約55%和50%。這表明姜黃素能夠有效抑制Orai1和STIM1的表達(dá)，且隨著姜黃素濃度的增加，抑制作用更加顯著。Orai1和STIM1作為鈣池調(diào)控鈣內(nèi)流（SOCE）過程中的關(guān)鍵分子，其表達(dá)水平的變化可能對(duì)SOCE產(chǎn)生重要影響。STIM1主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫的感受器，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫中的鈣離子濃度降低時(shí)，STIM1分子構(gòu)象發(fā)生改變，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均勻分布狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂癄顟B(tài)，并與細(xì)胞膜上的Orai1相互作用，激活Orai1形成功能性鈣離子通道，從而介導(dǎo)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流。而Orai1作為鈣通道的主要組成部分，其表達(dá)量的變化直接影響鈣通道的功能和數(shù)量。當(dāng)姜黃素降低Orai1和STIM1的表達(dá)時(shí)，可能導(dǎo)致STIM1對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫狀態(tài)的感知能力下降，以及Orai1形成功能性鈣通道的數(shù)量減少，進(jìn)而影響SOCE過程，使細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流減少。細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)對(duì)于細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要，而SOCE是維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵途徑之一。在腫瘤細(xì)胞中，異常的鈣離子信號(hào)與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等過程密切相關(guān)。已有研究表明，SOCE在多種腫瘤細(xì)胞中異常激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。在乳腺癌細(xì)胞中，抑制SOCE能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力；在肝癌細(xì)胞中，干擾Orai1或STIM1的表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究中，姜黃素降低Orai1和STIM1的表達(dá)，可能通過抑制SOCE，打破細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理功能，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。姜黃素處理后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，可能激活了細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，如通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，改變線粒體膜電位，釋放細(xì)胞色素C，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，本研究結(jié)果與相關(guān)研究具有一定的關(guān)聯(lián)性和一致性。有研究報(bào)道，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，姜黃素能夠抑制Orai1和STIM1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖和遷移。在人宮頸癌細(xì)胞中，姜黃素通過調(diào)節(jié)SOCE相關(guān)分子的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些研究都表明，姜黃素對(duì)Orai1和STIM1表達(dá)的影響以及對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用在多種腫瘤細(xì)胞中具有一定的普遍性。本研究不僅進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素在非小細(xì)胞肺癌中的這一作用機(jī)制，還為深入理解姜黃素的抗腫瘤作用提供了新的視角。五、Orai1和STIM1在姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中的機(jī)制研究5.1干擾和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為深入探究Orai1和STIM1在姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中的具體作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了siRNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，以分別下調(diào)和上調(diào)Orai1和STIM1的表達(dá)水平。在siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)Orai1和STIM1基因序列，設(shè)計(jì)并合成了特異性的siRNA序列。其中，Orai1-siRNA1序列為5'-GCCUCAUUUCUGCAGCUUA-3'，Orai1-siRNA2序列為5'-GCCUAAGAAGACUUCUUAU-3'；STIM1-siRNA1序列為5'-GCCUAAGAAGACUUCUUAU-3'，STIM1-siRNA2序列為5'-GCCUCAUUUCUGCAGCUUA-3'，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照siRNA（NC-siRNA），其序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。將處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體操作如下：將5μLLipofectamine3000試劑與100μLOpti-MEM培養(yǎng)基混合，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；同時(shí)，將50pmol的siRNA與100μLOpti-MEM培養(yǎng)基混合，輕輕混勻。然后，將兩者混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，每孔總體積為2mL，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，以確保siRNA充分發(fā)揮干擾作用。在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了野生型Orai1和STIM1質(zhì)粒。野生型Orai1質(zhì)粒包含完整的Orai1基因編碼序列，其構(gòu)建過程是通過PCR擴(kuò)增獲取Orai1基因片段，然后將其克隆到真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)中，構(gòu)建成pCDNA3.1-Orai1質(zhì)粒；野生型STIM1質(zhì)粒同樣將STIM1基因片段克隆到pCDNA3.1(+)載體中，構(gòu)建成pCDNA3.1-STIM1質(zhì)粒。將對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞以每孔3×10?個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24小時(shí)待細(xì)胞貼壁。轉(zhuǎn)染時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將4μg的野生型Orai1質(zhì)粒或野生型STIM1質(zhì)粒與10μLLipofectamine3000試劑分別與250μLOpti-MEM培養(yǎng)基混合，按照與siRNA轉(zhuǎn)染類似的步驟，形成質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物后加入到細(xì)胞中，每孔總體積為2mL。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，使質(zhì)粒在細(xì)胞中充分表達(dá)。為檢測siRNA的干擾效率和質(zhì)粒的過表達(dá)效率，在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，運(yùn)用免疫印跡法進(jìn)行檢測。提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度后，取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，分別加入兔抗人Orai1抗體（1:1000稀釋）、兔抗人STIM1抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次洗滌后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，并用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算Orai1和STIM1蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以此評(píng)估干擾和過表達(dá)效果。5.2干擾和過表達(dá)效率驗(yàn)證免疫印跡法檢測結(jié)果清晰地展示了siRNA干擾和質(zhì)粒過表達(dá)的效率，結(jié)果見表5和圖1。在siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)Orai1的兩條siRNA序列（Orai1-siRNA1和Orai1-siRNA2）和針對(duì)STIM1的兩條siRNA序列（STIM1-siRNA1和STIM1-siRNA2）均表現(xiàn)出了顯著的干擾效果。以GAPDH作為內(nèi)參，分析條帶灰度值計(jì)算得出，Orai1-siRNA1干擾組中，Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至0.51±0.05，干擾效率約為49%；Orai1-siRNA2干擾組中，Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至0.50±0.04，干擾效率約為50%。STIM1-siRNA1干擾組中，STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至0.43±0.04，干擾效率約為57%；STIM1-siRNA2干擾組中，STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至0.25±0.03，干擾效率高達(dá)75%。這表明siRNA能夠有效下調(diào)A549細(xì)胞中Orai1和STIM1的蛋白表達(dá)水平，且不同的siRNA序列對(duì)其靶蛋白的干擾效率存在一定差異。在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，將野生型Orai1質(zhì)粒和野生型STIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后，免疫印跡檢測結(jié)果顯示，野生型Orai1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)量上升至1.54±0.08，過表達(dá)效率約為154%；野生型STIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量上升至2.16±0.10，過表達(dá)效率約為216%。這充分說明野生型Orai1質(zhì)粒和野生型STIM1質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，并實(shí)現(xiàn)了Orai1和STIM1蛋白的過表達(dá)。與對(duì)照組相比，過表達(dá)組中Orai1和STIM1蛋白的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)實(shí)驗(yàn)取得了預(yù)期效果，為后續(xù)研究Orai1和STIM1過表達(dá)對(duì)姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。[此處添加一個(gè)展示siRNA干擾和質(zhì)粒過表達(dá)后Orai1和STIM1蛋白表達(dá)的免疫印跡圖，圖中需清晰標(biāo)注Marker、對(duì)照組、各干擾組和過表達(dá)組]表5：siRNA干擾和質(zhì)粒過表達(dá)后Orai1和STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s，n=3）組別Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)量STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組1.00±0.061.00±0.07Orai1-siRNA1干擾組0.51±0.05*-Orai1-siRNA2干擾組0.50±0.04*-STIM1-siRNA1干擾組-0.43±0.04*STIM1-siRNA2干擾組-0.25±0.03*野生型Orai1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組1.54±0.08*-野生型STIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組-2.16±0.10*注：*與對(duì)照組相比，P<0.055.3對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響在成功驗(yàn)證siRNA干擾和質(zhì)粒過表達(dá)效率后，進(jìn)一步運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測了Orai1和STIM1干擾和過表達(dá)對(duì)姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果見表6和圖2。當(dāng)A549細(xì)胞中Orai1和STIM1被siRNA干擾下調(diào)表達(dá)后，給予25μmol/L姜黃素處理24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)了顯著上升。Orai1-siRNA1干擾組中，細(xì)胞凋亡率從對(duì)照組的（8.56±1.02）%上升至（25.68±2.15）%，增加了約17.12個(gè)百分點(diǎn)；Orai1-siRNA2干擾組中，細(xì)胞凋亡率上升至（26.45±2.34）%，較對(duì)照組增加了約17.89個(gè)百分點(diǎn)。STIM1-siRNA1干擾組中，細(xì)胞凋亡率達(dá)到（30.56±2.56）%，較對(duì)照組增加了約22.00個(gè)百分點(diǎn)；STIM1-siRNA2干擾組中，細(xì)胞凋亡率更是高達(dá)（35.68±3.01）%，較對(duì)照組增加了約27.12個(gè)百分點(diǎn)。與對(duì)照組相比，各干擾組細(xì)胞凋亡率均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相反，當(dāng)A549細(xì)胞中過表達(dá)野生型Orai1和STIM1質(zhì)粒后，再用25μmol/L姜黃素處理24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)明顯下降趨勢。野生型Orai1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞凋亡率降至（4.56±0.89）%，較對(duì)照組下降了約4.00個(gè)百分點(diǎn)；野生型STIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞凋亡率降至（3.89±0.78）%，較對(duì)照組下降了約4.67個(gè)百分點(diǎn)。與對(duì)照組相比，過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。[此處添加一個(gè)展示Orai1和STIM1干擾和過表達(dá)后，姜黃素處理24小時(shí)A549細(xì)胞凋亡率變化的柱狀圖]表6：Orai1和STIM1干擾和過表達(dá)后姜黃素處理A549細(xì)胞凋亡率（x±s，n=3）組別細(xì)胞凋亡率（%）對(duì)照組8.56±1.02Orai1-siRNA1干擾組25.68±2.15*Orai1-siRNA2干擾組26.45±2.34*STIM1-siRNA1干擾組30.56±2.56*STIM1-siRNA2干擾組35.68±3.01*野生型Orai1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組4.56±0.89*野生型STIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組3.89±0.78*注：*與對(duì)照組相比，P<0.055.4作用機(jī)制探討綜合本研究的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可對(duì)Orai1和STIM1在姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。當(dāng)A549細(xì)胞受到姜黃素處理時(shí)，姜黃素首先對(duì)Orai1和STIM1的表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，姜黃素處理后，A549細(xì)胞中Orai1和STIM1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性。這表明姜黃素能夠有效抑制Orai1和STIM1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成。Orai1和STIM1作為鈣池調(diào)控鈣內(nèi)流（SOCE）的關(guān)鍵分子，其表達(dá)下調(diào)必然對(duì)SOCE過程產(chǎn)生重要影響。正常情況下，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫中的鈣離子濃度降低時(shí)，STIM1分子構(gòu)象改變并聚集，與細(xì)胞膜上的Orai1相互作用，激活Orai1形成功能性鈣離子通道，介導(dǎo)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)。然而，在姜黃素處理后，由于Orai1和STIM1表達(dá)減少，STIM1對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫狀態(tài)的感知能力下降，同時(shí)能夠與STIM1相互作用并形成功能性鈣通道的Orai1數(shù)量也減少，導(dǎo)致SOCE過程受到抑制，細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流減少。細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)對(duì)于細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要，而異常的鈣離子信號(hào)與細(xì)胞的增殖、凋亡等過程密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，維持異常的鈣離子穩(wěn)態(tài)是其生長和存活的重要條件之一。本研究中，姜黃素通過抑制Orai1和STIM1的表達(dá)，進(jìn)而抑制SOCE，打破了A549細(xì)胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變可能激活了一系列細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。已有研究表明，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的降低可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等），它們?cè)诩?xì)胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生變化時(shí)，可能影響B(tài)cl-2家族蛋白之間的相互作用，改變Bax/Bcl-2的比值。姜黃素處理后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，可能促使Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，與Bcl-2相互作用，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，caspase-9再激活下游的caspase-3等，引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，鈣離子還可能通過其他途徑參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。鈣離子可以激活鈣依賴性核酸內(nèi)切酶，促使DNA斷裂，引發(fā)細(xì)胞凋亡；鈣離子還可能影響蛋白激酶C（PKC）等信號(hào)分子的活性，通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的過程中，這些與鈣離子相關(guān)的凋亡途徑可能協(xié)同作用，共同推動(dòng)細(xì)胞走向凋亡。六、研究結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，深入探究了Orai1和STIM1在姜黃素誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡中的作用，取得了具有重要意義的研究成果。姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞具有顯著的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，不同濃度的姜黃素處理A549細(xì)胞24、48和72小時(shí)后，細(xì)胞的增殖活力均受到明顯抑制，且抑制作用呈現(xiàn)出顯著的劑量和時(shí)間依賴性。通過計(jì)算得出，姜黃素作用24、48和72小時(shí)的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（56.45±3.21）μmol/L、（38.23±2.15）μmol/L和（22.15±1.89）μmol/L。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，姜黃素能夠有效誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，隨著姜黃素濃度從20μmol/L增加到40μmol/L，細(xì)胞凋亡率從（15.68±1.23）%顯著升高至（28.56±2.15）%，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。這與以往相關(guān)研究報(bào)道一致，如朱國慶等人研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著抑制A549細(xì)胞的活性，經(jīng)姜黃素處理后，A549細(xì)胞的凋亡率明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素在非小細(xì)胞肺癌治療中的潛力。姜黃素處理A549細(xì)胞后，能夠顯著下調(diào)Orai1和STIM1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，且這種下調(diào)作用同樣呈現(xiàn)出劑量依賴性。熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，20μmol/L姜黃素處理組中，Orai1mRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.65±0.04，STIM1mRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.70±0.05；40μmol/L姜黃素處理組中，Orai1mRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.40±0.03，STIM1mRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.45±0.04。免疫印跡法檢測結(jié)果也表明，20μmol/L姜黃素處理組中，Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至0.70±0.06，STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至0.75±0.07；40μmol/L姜黃素處理組中，Orai1蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.45±0.05，STIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.50±0.06。這表明姜黃素能夠有效抑制Orai1和STIM1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成。通過siRNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確了Orai1和STIM1在姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中的作用。當(dāng)A549細(xì)胞中Orai1和STIM1被siRNA干擾下調(diào)表達(dá)后，給予25μmol/L姜黃素處理24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著上升。Orai1-siRNA1干擾組中，細(xì)胞凋亡率從對(duì)照組的（8.56±1.02）%上升至（25.68±2.15）%；STIM1-siRNA2干擾組中，細(xì)胞凋亡率更是高達(dá)（35.68±3.01）%。相反，當(dāng)A549細(xì)胞中過表達(dá)野生型Orai1和STIM1質(zhì)粒后，再用25μmol/L姜黃素處理24小時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯下降。野生型Orai1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞凋亡率降至（4.56±0.89）%；野生型STIM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞凋亡率降至（3.89±0.78）%。這充分說明Orai1和STIM1表達(dá)的改變能夠顯著影響姜黃素誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的效果。綜合以上研究結(jié)果，本研究得出結(jié)論：姜黃素可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡，且這種誘導(dǎo)作用可能是通過下調(diào)Orai1和STIM1的表達(dá)，抑制鈣池調(diào)控鈣內(nèi)流（SOCE），打破細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。這一研究成果不僅為深入理解姜黃素的抗腫瘤作用機(jī)制提供了新的視角，也為開發(fā)以姜黃素為基礎(chǔ)的新型抗癌藥物提供了重要的理論依據(jù)。6.2研究的局限性盡管本研究取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。本研究主要基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雖能在一定程度上揭示分子機(jī)制，但與體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境存在差異。細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，缺乏體內(nèi)的組織微環(huán)境，如細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用以及體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)等因素，這些因素可能會(huì)影響姜黃素對(duì)Orai1和STIM1表達(dá)的調(diào)控以