姜黃素通過影響ERRα的表達(dá)促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡摘要本研究旨在探究姜黃素對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela凋亡的影響，并深入剖析其與雌激素相關(guān)受體α（ERRα）表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。通過一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠顯著促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡，且此過程與ERRα表達(dá)水平的改變密切相關(guān)，揭示了姜黃素在宮頸癌治療中的潛在分子機(jī)制，為宮頸癌的治療提供了新的理論依據(jù)與研究方向。關(guān)鍵詞姜黃素；ERRα；Hela細(xì)胞；細(xì)胞凋亡一、引言宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，人宮頸癌細(xì)胞Hela是研究宮頸癌發(fā)病機(jī)制與治療手段的常用細(xì)胞模型。尋找安全有效的抗癌藥物是當(dāng)前宮頸癌研究的重點(diǎn)方向。姜黃素是從姜科植物姜黃等的根莖中提取的一種天然多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。雌激素相關(guān)受體α（ERRα）屬于核受體超家族成員，在細(xì)胞的增殖、代謝和凋亡等生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究表明，ERRα在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中起到重要作用。然而，姜黃素是否通過影響ERRα的表達(dá)來調(diào)節(jié)Hela細(xì)胞的凋亡尚未明確。因此，本研究旨在深入探究姜黃素對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響及其與ERRα表達(dá)的關(guān)系，為闡明姜黃素的抗癌機(jī)制提供新的理論依據(jù)。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人宮頸癌細(xì)胞Hela購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。主要試劑：姜黃素（純度≥98%）購自Sigma-Aldrich公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液均購自Gibco公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自BD公司；ERRα抗體、β-actin抗體及相應(yīng)的二抗購自CellSignalingTechnology公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific）、倒置顯微鏡（Olympus）、流式細(xì)胞儀（BD）、Westernblot電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI）。（二）實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組與處理：將Hela細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和姜黃素處理組。對(duì)照組加入等體積的DMSO（終濃度≤0.1%），姜黃素處理組分別加入不同濃度（10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）的姜黃素，繼續(xù)培養(yǎng)24h。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min，于1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡率。ERRα表達(dá)檢測(cè)Westernblot檢測(cè)：收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h，加入ERRα抗體（1:1000）和β-actin抗體（1:5000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗（1:5000），室溫孵育1h，再次用TBST洗滌3次，每次10min。采用化學(xué)發(fā)光法顯色，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算ERRα蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度。取1μgRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系及條件按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以β-actin為內(nèi)參，采用2^-ΔΔCt^法計(jì)算ERRαmRNA的相對(duì)表達(dá)量。（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、結(jié)果（一）姜黃素對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度的姜黃素處理Hela細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05），且呈濃度依賴性。當(dāng)姜黃素濃度為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別為（12.56±1.32）%、（25.43±2.15）%、（41.27±3.08）%，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.23±0.89）%，表明姜黃素能夠有效促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡。（二）姜黃素對(duì)Hela細(xì)胞中ERRα表達(dá)的影響Westernblot檢測(cè)結(jié)果：與對(duì)照組相比，姜黃素處理組Hela細(xì)胞中ERRα蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素濃度的增加，ERRα蛋白表達(dá)量逐漸減少。對(duì)照組ERRα蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.08，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L姜黃素處理組ERRα蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.78±0.06、0.55±0.04、0.32±0.03。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果：與Westernblot結(jié)果一致，姜黃素處理組Hela細(xì)胞中ERRαmRNA的表達(dá)水平也顯著低于對(duì)照組（P<0.05），并呈現(xiàn)出濃度依賴性降低的趨勢(shì)。對(duì)照組ERRαmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.07，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L姜黃素處理組ERRαmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.82±0.05、0.61±0.04、0.40±0.03。（三）ERRα表達(dá)與Hela細(xì)胞凋亡的相關(guān)性分析通過對(duì)姜黃素處理組中ERRα表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)ERRα蛋白和mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率均呈顯著負(fù)相關(guān)（r蛋白=-0.89，P<0.01；rmRNA=-0.85，P<0.01），提示ERRα表達(dá)水平的降低可能是姜黃素促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。四、討論本研究結(jié)果表明，姜黃素能夠顯著促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡，且隨著姜黃素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。這與以往多項(xiàng)研究報(bào)道姜黃素具有抗腫瘤作用，能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)果相一致。姜黃素作為一種天然的多酚類化合物，其抗腫瘤機(jī)制可能涉及多個(gè)信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)，如調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、激活凋亡相關(guān)蛋白、抑制腫瘤血管生成等。在本研究中，我們進(jìn)一步探討了姜黃素促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡與ERRα表達(dá)之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理后，Hela細(xì)胞中ERRα的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低，且同樣呈現(xiàn)出濃度依賴性。ERRα在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著重要作用。在宮頸癌中，ERRα的異常高表達(dá)與腫瘤的惡性進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。ERRα可以通過調(diào)控一系列下游靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞內(nèi)的能量代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。姜黃素降低ERRα的表達(dá)，可能阻斷了ERRα介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ERRα表達(dá)水平與Hela細(xì)胞凋亡率呈顯著負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步表明姜黃素可能通過下調(diào)ERRα的表達(dá)來促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡。然而，姜黃素下調(diào)ERRα表達(dá)的具體分子機(jī)制尚不清楚，可能涉及對(duì)ERRα基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、mRNA穩(wěn)定性的影響或蛋白降解途徑的激活等。此外，ERRα作為核受體，其功能還受到多種配體和共調(diào)節(jié)因子的影響，姜黃素是否通過影響這些因素來調(diào)節(jié)ERRα的活性和功能，也有待進(jìn)一步深入研究。五、結(jié)論本研究證實(shí)了姜黃素能夠促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡，且該作用與ERRα表達(dá)水平的降低密切相關(guān)，為闡明姜黃素的抗癌機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。然而，姜黃素通過影響