高效液相色譜（HPLC）培訓(xùn)課件第一章液相色譜基礎(chǔ)概述液相色譜的起源與發(fā)展歷史里程碑1906年，俄國植物學(xué)家米哈伊爾·茨維特在研究植物色素時(shí)首次提出色譜法概念。他用碳酸鈣作為吸附劑，成功分離了葉綠素，開創(chuàng)了色譜分析的先河。這一革命性發(fā)現(xiàn)為后續(xù)分離技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。液相色譜的分離原理吸附作用組分分子與固定相表面發(fā)生物理或化學(xué)吸附，極性差異導(dǎo)致保留時(shí)間不同分配作用組分在固定相和流動相之間按一定比例分配，疏水性強(qiáng)的組分在非極性固定相中保留更久離子交換帶電離子與固定相上的反離子發(fā)生可逆交換，實(shí)現(xiàn)離子性物質(zhì)的高效分離排阻效應(yīng)根據(jù)分子大小進(jìn)行分離，大分子無法進(jìn)入孔隙快速洗脫，小分子深入孔隙保留時(shí)間長HPLC的特點(diǎn)與優(yōu)勢1高壓高效輸液泵產(chǎn)生150~300kg/cm2的高壓，推動流動相快速通過填料緊密的色譜柱，大幅提升分離效率和柱效2快速分析樣品分離通常在15~30分鐘內(nèi)完成，相比傳統(tǒng)液相色譜數(shù)小時(shí)的分析時(shí)間，效率提升顯著，適合批量檢測3超高靈敏度紫外檢測器的檢測限可達(dá)0.01ng級別，熒光檢測器靈敏度更高，能夠檢測痕量物質(zhì)，滿足藥物、環(huán)境樣品等嚴(yán)格要求4卓越柱效第二章HPLC系統(tǒng)組成與功能HPLC系統(tǒng)的主要組成部分輸液泵提供穩(wěn)定高壓流動相輸送進(jìn)樣器精確定量樣品引入色譜柱組分分離的核心單元檢測器捕獲并轉(zhuǎn)化分離信號數(shù)據(jù)系統(tǒng)采集分析色譜數(shù)據(jù)輸液泵詳解柱塞往復(fù)泵的技術(shù)優(yōu)勢柱塞往復(fù)泵是HPLC系統(tǒng)中最常用的輸液裝置，通過精密柱塞的往復(fù)運(yùn)動產(chǎn)生脈動流。其核心優(yōu)勢在于流量穩(wěn)定性極高，能夠承受高達(dá)400kg/cm2的系統(tǒng)壓力，滿足高效分離的苛刻要求。雙泵系統(tǒng)的創(chuàng)新雙泵系統(tǒng)通過兩個泵頭交替工作，有效減少流量脈沖，將流量重現(xiàn)性提升至RSD<0.5%的卓越水平。這種設(shè)計(jì)不僅提高了分析精度，還增強(qiáng)了梯度洗脫的穩(wěn)定性。維護(hù)要點(diǎn)使用0.2μm濾膜過濾所有流動相，防止固體顆粒損壞單向閥和柱塞密封圈避免使用含鹽緩沖液長時(shí)間停泵,防止泵內(nèi)鹽結(jié)晶造成堵塞進(jìn)樣器類型與應(yīng)用隔膜進(jìn)樣器通過注射器穿透硅橡膠隔膜進(jìn)樣，操作簡便靈活。但耐壓能力有限（通常<50kg/cm2），且隔膜易磨損影響密封性，主要用于低壓或制備色譜系統(tǒng)。停流進(jìn)樣器暫停泵的運(yùn)行,在常壓下注入樣品,然后恢復(fù)流動相輸送。避免了高壓下進(jìn)樣的操作難度,適合制備色譜或大體積樣品引入,但會中斷分離過程,影響分析速度。六通閥進(jìn)樣器色譜柱結(jié)構(gòu)與填料色譜柱結(jié)構(gòu)柱管材料：316不銹鋼,耐腐蝕、耐高壓柱長：10~30cm,長柱提供更高分離度內(nèi)徑：2.1~4.6mm,窄徑柱節(jié)省溶劑,寬徑柱適合制備柱溫控制：通常25~60°C,提高分離重復(fù)性填料類型硅膠基鍵合相：C18（ODS）、C8、C4、苯基柱等極性鍵合相：氨基柱、氰基柱、二醇基柱離子交換填料：強(qiáng)/弱陽離子交換、強(qiáng)/弱陰離子交換手性填料：分離對映異構(gòu)體檢測器類型與原理紫外-可見檢測器（UV-VIS）原理：基于Lambert-Beer定律,測量樣品對特定波長光的吸收特點(diǎn)：應(yīng)用最廣,靈敏度高（ng級）,線性范圍寬適用：具有紫外吸收的有機(jī)化合物（芳香族、共軛體系等）二極管陣列檢測器（DAD）原理：同時(shí)檢測多個波長,獲取三維色譜圖（時(shí)間-波長-吸光度）特點(diǎn)：可進(jìn)行光譜掃描和峰純度分析,鑒別共洗脫組分適用：復(fù)雜樣品分析、未知物鑒定、方法開發(fā)熒光檢測器（FLD）原理：激發(fā)光照射樣品,測量發(fā)射熒光強(qiáng)度特點(diǎn)：靈敏度極高（pg級）,選擇性強(qiáng)適用：生物樣品（蛋白質(zhì)、核酸）、衍生化分析蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）原理：流動相蒸發(fā)后,非揮發(fā)性組分顆粒散射光特點(diǎn)：通用型檢測器,不依賴發(fā)色團(tuán)適用：糖類、脂質(zhì)、聚合物等無紫外吸收物質(zhì)電導(dǎo)檢測器（CD）原理：測量溶液電導(dǎo)率變化特點(diǎn)：對離子靈敏度高,背景干擾低第三章色譜分離模式與應(yīng)用反相液相色譜（RPC）分離機(jī)制固定相為非極性鍵合硅膠（C18、C8最常用）,流動相為極性高的水-有機(jī)溶劑混合物（甲醇、乙腈）。非極性或弱極性化合物在非極性固定相上保留時(shí)間長,極性化合物快速洗脫。應(yīng)用范圍反相色譜是HPLC中應(yīng)用最廣泛的模式,占所有應(yīng)用的70%以上。適合藥物分析、天然產(chǎn)物研究、環(huán)境監(jiān)測、食品檢測等眾多領(lǐng)域。正相液相色譜（NPC）分離原理固定相極性高（硅膠、氰基、氨基、二醇基鍵合相）,流動相為非極性有機(jī)溶劑（正己烷、庚烷等）。極性化合物在極性固定相上保留強(qiáng),非極性化合物快速洗脫。適用范圍主要用于強(qiáng)極性化合物分離：酚類、醇類、胺類、氨基酸、糖類、水溶性維生素等。對于這些在反相色譜中保留弱或不保留的物質(zhì),正相色譜提供了有效的分離手段?；パa(bǔ)性正相與反相色譜的選擇性完全不同,形成互補(bǔ)關(guān)系。當(dāng)一種模式無法獲得滿意分離時(shí),切換到另一種模式往往能解決問題。這種互補(bǔ)性在方法開發(fā)中非常重要。離子交換色譜（IEC）陽離子交換色譜固定相帶負(fù)電荷（如磺酸基-SO??）,與溶液中的陽離子發(fā)生可逆交換。適合分離堿性化合物、氨基酸、多肽等正電荷物質(zhì)。陰離子交換色譜固定相帶正電荷（如季銨基-N?(CH?)?）,與溶液中的陰離子交換。適合分離酸性化合物、核苷酸、有機(jī)酸等負(fù)電荷物質(zhì)。分離條件優(yōu)化pH調(diào)節(jié)：控制化合物離子化程度,影響交換平衡鹽濃度：增加流動相中的鹽濃度可縮短保留時(shí)間,實(shí)現(xiàn)梯度洗脫離子強(qiáng)度：高離子強(qiáng)度促進(jìn)樣品離子從固定相上洗脫離子交換色譜特別適合生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸）的純化與分析,在生物制藥領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。離子對色譜法（IPC）離子對色譜是反相色譜的一種特殊形式,通過在流動相中添加離子對試劑,使強(qiáng)極性或離子性物質(zhì)形成中性離子對,從而在反相色譜柱上獲得適當(dāng)保留。離子對試劑陰離子試劑：烷基磺酸鹽（如十二烷基硫酸鈉SDS、庚烷磺酸鈉）陽離子試劑：四丁基銨鹽、四甲基銨鹽典型應(yīng)用強(qiáng)酸性物質(zhì)（磺酸類藥物、核苷酸）強(qiáng)堿性物質(zhì)（季銨化合物、生物堿）兩性離子（氨基酸、多肽）使用注意：離子對試劑會強(qiáng)烈吸附在色譜柱上,切換到其他方法前需要充分沖洗色譜柱。建議使用專用色譜柱進(jìn)行離子對色譜分析,避免交叉污染。排阻色譜法（SEC）分離原理排阻色譜（也稱凝膠色譜、體積排阻色譜）根據(jù)分子大小進(jìn)行分離,不依賴化學(xué)相互作用。固定相為具有確定孔徑分布的多孔填料（如多孔硅膠、交聯(lián)聚苯乙烯）。洗脫規(guī)律大分子：無法進(jìn)入孔隙,只能在顆粒間隙流動,最先洗脫中等分子：部分進(jìn)入孔隙,保留時(shí)間適中小分子：充分進(jìn)入孔隙,保留時(shí)間最長分子量越大,洗脫時(shí)間越短,與常規(guī)色譜相反。主要應(yīng)用蛋白質(zhì)分子量測定、聚合物相對分子質(zhì)量分布分析、生物大分子純化、脫鹽與緩沖液交換等。在生物制藥、高分子材料研究中不可或缺。第四章流動相與梯度洗脫技術(shù)流動相的選擇與洗脫程序設(shè)計(jì)直接影響分離效果。掌握等度與梯度洗脫的原理和技巧,是HPLC方法開發(fā)的核心能力。流動相選擇原則01極性匹配流動相極性應(yīng)與樣品性質(zhì)相適應(yīng)。反相色譜使用極性流動相（水-有機(jī)溶劑）,正相色譜使用非極性流動相（烷烴類）。選擇合適的有機(jī)溶劑比例是關(guān)鍵。02檢測器兼容性流動相不能干擾檢測器信號。紫外檢測要選擇紫外截止波長低的溶劑,蒸發(fā)光散射檢測器要求流動相易揮發(fā)。避免使用吸收強(qiáng)的溶劑影響基線穩(wěn)定性。03溶劑性質(zhì)考慮溶劑的洗脫強(qiáng)度、粘度、毒性和成本。甲醇粘度低、價(jià)格便宜,但洗脫能力弱于乙腈。乙腈毒性較大但分離效果通常更好。根據(jù)具體需求權(quán)衡選擇。04樣品溶解度流動相應(yīng)能充分溶解樣品,避免沉淀堵塞色譜柱或進(jìn)樣器。對于溶解度差的樣品,可在流動相中加入少量溶解促進(jìn)劑（如表面活性劑）。常用溶劑體系水相：超純水、磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、三氟乙酸水溶液有機(jī)相：甲醇、乙腈、四氫呋喃（THF）、異丙醇添加劑：三氟乙酸（TFA,改善峰形）、甲酸（質(zhì)譜兼容）、三乙胺（抑制拖尾）梯度洗脫技術(shù)梯度洗脫指在分析過程中系統(tǒng)地改變流動相組成,通常是逐步增加有機(jī)溶劑比例。這種技術(shù)能顯著提高復(fù)雜樣品的分離效果,是現(xiàn)代HPLC的標(biāo)準(zhǔn)配置。1初始條件低有機(jī)相比例,強(qiáng)極性組分開始洗脫2梯度上升有機(jī)相比例逐漸增加,中等極性組分依次分離3高有機(jī)相有機(jī)相達(dá)到最高比例,弱極性組分快速洗脫4柱再生恢復(fù)初始條件,沖洗色譜柱為下次分析做準(zhǔn)備梯度類型線性梯度：有機(jī)相比例線性增加,最常用,適合大多數(shù)反相分離階躍梯度：有機(jī)相比例分段跳躍,適合極性差異大的樣品凹形/凸形梯度：改變斜率,優(yōu)化特定區(qū)域的分離梯度洗脫的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)核心優(yōu)勢縮短分析時(shí)間弱保留組分快速洗脫,強(qiáng)保留組分在高有機(jī)相中加速洗脫,整體分析時(shí)間顯著縮短改善峰形后洗脫的峰不會因長時(shí)間停留而展寬,峰形尖銳對稱,提高檢測靈敏度擴(kuò)大分離范圍能夠在一次分析中分離極性跨度大的混合物,等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)提升靈敏度峰濃縮效應(yīng)使檢測限降低,適合痕量分析主要挑戰(zhàn)基線漂移流動相組成變化導(dǎo)致檢測器響應(yīng)改變,特別是紫外檢測器。選擇紫外截止波長低的溶劑可減少漂移重現(xiàn)性降低梯度程序的微小偏差可能影響保留時(shí)間,需要精確控制泵流量和混合比例溶劑要求高流動相純度、脫氣效果、互溶性都直接影響結(jié)果。使用HPLC級溶劑,充分脫氣柱平衡時(shí)間每次分析后需足夠時(shí)間將色譜柱恢復(fù)到初始條件,通常5~10個柱體積第五章樣品制備與進(jìn)樣技巧樣品前處理質(zhì)量直接決定分析結(jié)果的準(zhǔn)確性與儀器使用壽命。掌握科學(xué)的樣品制備方法和進(jìn)樣技巧,是獲得可靠數(shù)據(jù)的前提。樣品預(yù)處理方法過濾除雜使用0.22μm或0.45μm孔徑的濾膜去除顆粒雜質(zhì),防止堵塞色譜柱和進(jìn)樣器。水系樣品用水相濾膜,有機(jī)溶劑樣品用有機(jī)相濾膜。離心過濾器操作便捷,適合小體積樣品。稀釋與濃縮高濃度樣品需稀釋至檢測器線性范圍內(nèi),避免柱過載和檢測器飽和。低濃度樣品可通過固相萃取（SPE）、液液萃取或氮吹濃縮提高檢測靈敏度。選擇與流動相兼容的溶劑進(jìn)行稀釋。衍生化處理無發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的化合物需要衍生化才能被檢測。柱前衍生提高穩(wěn)定性,柱后衍生避免干擾峰。常用衍生試劑：OPA（氨基酸）、FMOC（胺類）、苯甲酰氯（羥基化合物）。樣品穩(wěn)定性避免樣品降解、吸附和揮發(fā)。光敏感化合物使用棕色瓶,易氧化物質(zhì)加入抗氧化劑,揮發(fā)性物質(zhì)密封保存。制備后盡快分析,或在-20°C冷凍保存。進(jìn)樣溶劑選擇：進(jìn)樣溶劑應(yīng)與流動相初始組成相近。如使用強(qiáng)溶劑（如純有機(jī)相）溶解樣品注入極性流動相,可能導(dǎo)致峰分裂或峰形異常。必要時(shí)將樣品轉(zhuǎn)溶至合適溶劑。進(jìn)樣注意事項(xiàng)進(jìn)樣量控制進(jìn)樣量過大會導(dǎo)致柱過載,峰形變寬、拖尾,分離度下降。分析柱典型進(jìn)樣量1~20μL,制備柱可達(dá)數(shù)mL。根據(jù)樣品濃度和檢測器靈敏度優(yōu)化進(jìn)樣體積,在保證信號強(qiáng)度的前提下盡量減少進(jìn)樣量。溶劑匹配進(jìn)樣溶劑與流動相不匹配是峰形異常的常見原因。理想情況下,進(jìn)樣溶劑應(yīng)與流動相初始組成相同。若必須使用強(qiáng)溶劑,應(yīng)減少進(jìn)樣體積（<5μL）,或在進(jìn)樣前將樣品稀釋在弱溶劑中。自動進(jìn)樣器維護(hù)定期清洗進(jìn)樣針和樣品環(huán),避免交叉污染和殘留。檢查進(jìn)樣針密封圈磨損情況,及時(shí)更換。樣品瓶位置擺放準(zhǔn)確,防止進(jìn)樣針偏位。使用后用強(qiáng)溶劑（如50%甲醇-水）沖洗進(jìn)樣系統(tǒng)。重復(fù)性校準(zhǔn)定期用標(biāo)準(zhǔn)品評估進(jìn)樣精密度,峰面積RSD應(yīng)<2%。如重復(fù)性變差,檢查進(jìn)樣閥泄漏、樣品環(huán)體積偏差、進(jìn)樣針堵塞等問題。自動進(jìn)樣器需按照廠家要求進(jìn)行定期校準(zhǔn)和保養(yǎng)。第六章HPLC方法開發(fā)與優(yōu)化方法開發(fā)是將分析需求轉(zhuǎn)化為可靠HPLC方法的系統(tǒng)過程?？茖W(xué)的方法開發(fā)流程能夠提高效率,減少試錯時(shí)間,獲得穩(wěn)健耐用的分析方法。方法開發(fā)流程明確分析目標(biāo)確定目標(biāo)化合物、檢測限要求、分析時(shí)間限制、樣品基質(zhì)特點(diǎn)等關(guān)鍵參數(shù)。了解化合物的理化性質(zhì)（極性、pKa、穩(wěn)定性）為后續(xù)選擇提供依據(jù)。選擇色譜柱根據(jù)化合物極性選擇分離模式（反相/正相/離子交換等）。C18柱適合大多數(shù)非極性化合物,極性化合物考慮HILIC或離子交換。柱長、內(nèi)徑、粒徑根據(jù)分離度和分析速度要求選擇。優(yōu)化流動相初步篩選有機(jī)溶劑類型（甲醇vs乙腈）和比例。調(diào)節(jié)pH值改善峰形,控制化合物離子化狀態(tài)。必要時(shí)加入離子對試劑或添加劑。通過試驗(yàn)確定最佳組成。調(diào)整分離條件優(yōu)化流速（通常0.5~2.0mL/min）,平衡分析時(shí)間與柱壓。調(diào)節(jié)柱溫（25~60°C）改善分離度和峰形。設(shè)計(jì)梯度程序,縮短分析時(shí)間,改善后洗脫峰的峰形。驗(yàn)證方法性能評估分離度（R>1.5）、理論塔板數(shù)、峰不對稱因子（0.9~1.2）。測試重復(fù)性（RSD<2%）、線性范圍、檢測限、回收率等方法學(xué)參數(shù)。確保方法滿足分析要求。常見問題及解決方案峰拖尾與峰展寬原因分析柱效下降、死體積增大樣品與硅醇基相互作用柱過載、進(jìn)樣量過大流動相pH不合適解決方案更換新色譜柱或反沖色譜柱調(diào)節(jié)流動相pH,加入三乙胺減少進(jìn)樣量或稀釋樣品檢查管路連接,減少死體積基線噪聲與漂移原因分析流動相未充分脫氣檢測器燈能量不足柱溫波動或室溫變化梯度洗脫組成變化解決方案使用在線脫氣機(jī),超聲脫氣更換檢測器燈泡使用柱溫箱穩(wěn)定溫度選擇截止波長低的溶劑柱壓異常及維護(hù)柱壓升高：柱頭污染、顆粒堵塞。反沖色譜柱,更換篩板,使用保護(hù)柱柱壓下降：系統(tǒng)泄漏、柱床塌陷。檢查接頭密封,更換老化色譜柱預(yù)防措施：徹底過濾樣品,定期用強(qiáng)溶劑沖洗,避免緩沖鹽結(jié)晶第七章HPLC在實(shí)際中的應(yīng)用案例HPLC技術(shù)在藥物分析、食品安全、環(huán)境監(jiān)測、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。通過實(shí)際案例理解方法選擇和問題解決思路。應(yīng)用實(shí)例精選藥物成分分析抗生素定量檢測：使用反相C18柱,甲醇-磷酸鹽緩沖液梯度洗脫,UV254nm檢測。分析青霉素、頭孢菌素類藥物的含量和雜質(zhì),滿足藥典要求。方法快速準(zhǔn)確,15分鐘完成分析。維生素定量分析：水溶性維生素（B族、C）采用反相色譜,脂溶性維生素（A、D、E、K）使用正相或反相模式。熒光檢測器提高靈敏度,檢測限達(dá)pg級,適合營養(yǎng)補(bǔ)充劑和食品中維生素含量測定。食品安全檢測農(nóng)藥殘留分析：采用固相萃?。⊿PE）富集,C18柱分離,DAD多波長檢測或質(zhì)譜聯(lián)用確證?？赏瑫r(shí)檢測有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等多類農(nóng)藥,滿足GB2763食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。食品添加劑檢測：反相HPLC測定防腐劑（苯甲酸、山梨酸）、甜味劑（糖精、安賽蜜）、色素（檸檬黃