孤束核中血管緊張素1-7對(duì)一氧化氮釋放的調(diào)控：Mas受體與PI3K/Akt通路的介導(dǎo)機(jī)制一、引言1.1研究背景與意義腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）作為機(jī)體重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在維持水鈉平衡、體液平衡以及血壓穩(wěn)定等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。血管緊張素（Ang）-(1-7)作為RAS中的重要活性肽，近年來備受關(guān)注。它主要通過與Mas受體特異性結(jié)合，發(fā)揮一系列重要的生理功能。在心血管系統(tǒng)中，Ang-(1-7)具有顯著的血管舒張作用。研究表明，它可直接作用于血管平滑肌細(xì)胞，通過抑制電壓依賴性鈣離子內(nèi)流和增加鉀離子外流，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而引起血管平滑肌松弛，實(shí)現(xiàn)血管舒張。同時(shí)，Ang-(1-7)還能激活Mas受體，介導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化，促進(jìn)一氧化氮（NO）釋放，進(jìn)一步增強(qiáng)血管舒張效應(yīng)。此外，它具有抗增殖作用，能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，通過激活PPARγ受體，抑制細(xì)胞周期蛋白，以及抑制MAPK和ERK信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑，有效防止血管壁增厚和粥樣硬化的發(fā)生。在心臟方面，Ang-(1-7)通過激活Mas受體，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷，同時(shí)促進(jìn)心肌血管生成，改善心肌血供，增強(qiáng)心肌收縮功能，還能抑制心肌纖維化，減輕心室重塑，對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能起到重要的保護(hù)作用。Mas受體作為Ang-(1-7)的特異性受體，是一種G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞表面。其激活后可引發(fā)一系列下游信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在生理和病理過程中扮演著不可或缺的角色。除了參與上述心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)外，Mas受體在其他組織器官中也發(fā)揮著重要作用。在肝臟中，Mas受體的激活與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化形成過程中，Mas受體的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化，其可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，影響肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，從而對(duì)肝纖維化進(jìn)程產(chǎn)生影響。在腎臟中，Mas受體參與調(diào)節(jié)腎功能，對(duì)維持腎臟的正常生理功能具有重要意義。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞的存活、分化、生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和凋亡等多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。在生理狀態(tài)下，PI3K/Akt信號(hào)通路維持著細(xì)胞的正常功能和代謝平衡。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、激素等刺激時(shí)，PI3K被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進(jìn)而招募Akt蛋白到細(xì)胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）和mTORC2等激酶的作用下，使Akt發(fā)生磷酸化而激活。激活的Akt可以通過磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。在病理情況下，PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活或抑制與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，該信號(hào)通路常常過度激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲。在心血管疾病中，PI3K/Akt信號(hào)通路的失調(diào)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、心臟重塑和血管功能障礙等。在神經(jīng)系統(tǒng)中，PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、分化和突觸可塑性，其異常與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。一氧化氮（NO）作為一種重要的信號(hào)分子，在生理和病理過程中具有廣泛而重要的作用。在心血管系統(tǒng)中，NO主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，是一種強(qiáng)效的血管舒張劑。它能夠擴(kuò)散到血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)，激活鳥苷酸環(huán)化酶（GC），使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致血管平滑肌舒張，降低血管阻力，維持血管的正常張力。NO還具有抑制血小板黏附和聚集的作用，能夠防止血栓形成，保持血液的正常流動(dòng)性。此外，NO對(duì)炎癥反應(yīng)也具有重要的調(diào)節(jié)作用。它可以抑制炎癥細(xì)胞的活化和黏附，減少炎癥介質(zhì)的釋放，發(fā)揮抗炎作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NO作為一種神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)，參與神經(jīng)傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等生理過程。孤束核（NTS）作為心血管調(diào)節(jié)的重要中樞，在維持心血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它接受來自心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等多種感受器的傳入信息，并對(duì)這些信息進(jìn)行整合和處理，然后通過傳出神經(jīng)對(duì)心血管活動(dòng)進(jìn)行精確調(diào)控。NTS內(nèi)存在著多種神經(jīng)遞質(zhì)和受體系統(tǒng)，它們相互作用，共同調(diào)節(jié)心血管功能。其中，RAS成分在NTS中也有表達(dá)，并且參與了心血管調(diào)節(jié)過程。研究孤束核中血管緊張素1-7通過Mas受體PI3K/Akt通路上調(diào)一氧化氮釋放的機(jī)制，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。從理論方面來看，有助于深入揭示RAS在中樞水平對(duì)心血管調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，完善我們對(duì)心血管穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制的認(rèn)識(shí)。從現(xiàn)實(shí)意義角度出發(fā)，該研究可能為心血管疾病的防治提供新的靶點(diǎn)和策略。目前，心血管疾病如高血壓、心力衰竭等嚴(yán)重威脅人類健康，發(fā)病率和死亡率居高不下。通過對(duì)上述機(jī)制的研究，有望開發(fā)出更加有效的治療藥物和方法，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在血管緊張素1-7的研究方面，國內(nèi)外學(xué)者已取得了豐碩成果。國外研究起步較早，F(xiàn)errario等學(xué)者通過對(duì)健康志愿者和原發(fā)性高血壓患者的研究，發(fā)現(xiàn)尿中Ang-(1-7)濃度水平與動(dòng)脈血壓成反比，這為后續(xù)關(guān)于Ang-(1-7)降壓作用的研究奠定了基礎(chǔ)。國內(nèi)研究也在不斷深入，眾多學(xué)者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，進(jìn)一步明確了Ang-(1-7)在心血管系統(tǒng)、腎臟等組織器官中的保護(hù)作用。在心血管系統(tǒng)中，國內(nèi)研究表明Ang-(1-7)可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌血管生成等機(jī)制，對(duì)心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。在腎臟方面，研究發(fā)現(xiàn)Ang-(1-7)能夠擴(kuò)張腎小球入球小動(dòng)脈，增加腎血流，減少腎小球內(nèi)壓，從而保護(hù)腎功能。對(duì)于Mas受體，國外研究在其結(jié)構(gòu)和功能方面有較為深入的探索。研究發(fā)現(xiàn)Mas受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞表面，其激活后可引發(fā)一系列下游信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。國內(nèi)研究則更側(cè)重于Mas受體在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。例如，在肝纖維化研究中，國內(nèi)學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在肝纖維化形成過程中，Mas受體的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化，其可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，影響肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，從而對(duì)肝纖維化進(jìn)程產(chǎn)生影響。PI3K/Akt信號(hào)通路的研究在國內(nèi)外都受到廣泛關(guān)注。國外研究在通路的激活機(jī)制和生理功能方面有較為系統(tǒng)的闡述。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、激素等刺激時(shí)，PI3K被激活，催化PIP2生成PIP3，進(jìn)而招募Akt蛋白到細(xì)胞膜上并使其磷酸化激活，激活的Akt通過磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。國內(nèi)研究則更多地關(guān)注該通路在疾病治療中的潛在應(yīng)用。在腫瘤治療研究中，國內(nèi)學(xué)者致力于探索通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的方法；在心血管疾病治療研究中，也在嘗試尋找調(diào)節(jié)該通路以改善心肌細(xì)胞凋亡和心臟重塑的策略。一氧化氮釋放的研究在國內(nèi)外也有諸多成果。國外研究對(duì)NO在心血管系統(tǒng)中的作用機(jī)制有較為深入的了解，NO主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，能夠擴(kuò)散到血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)，激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致血管平滑肌舒張，降低血管阻力。國內(nèi)研究則在NO與其他生理病理過程的關(guān)系方面有新的發(fā)現(xiàn)。例如，在炎癥反應(yīng)研究中，國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)NO可以抑制炎癥細(xì)胞的活化和黏附，減少炎癥介質(zhì)的釋放，發(fā)揮抗炎作用；在神經(jīng)系統(tǒng)研究中，也在探索NO作為神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)參與神經(jīng)傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等生理過程的具體機(jī)制。盡管國內(nèi)外在血管緊張素1-7、Mas受體、PI3K/Akt通路和一氧化氮釋放的研究中取得了顯著進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。在信號(hào)通路的交互作用研究方面，雖然已知Ang-(1-7)通過Mas受體激活PI3K/Akt通路來調(diào)節(jié)一氧化氮釋放，但該通路與其他相關(guān)信號(hào)通路之間的復(fù)雜交互作用尚未完全明確。在不同病理狀態(tài)下的研究方面，目前對(duì)于一些特殊病理狀態(tài)下，如嚴(yán)重創(chuàng)傷、膿毒癥等，孤束核中血管緊張素1-7通過Mas受體PI3K/Akt通路上調(diào)一氧化氮釋放的具體機(jī)制及變化規(guī)律研究較少。在臨床應(yīng)用研究方面，雖然基礎(chǔ)研究為心血管疾病的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略，但如何將這些基礎(chǔ)研究成果有效地轉(zhuǎn)化為臨床治療方法，仍有待進(jìn)一步探索和研究。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入揭示孤束核中血管緊張素1-7通過Mas受體PI3K/Akt通路上調(diào)一氧化氮釋放的具體機(jī)制，為心血管疾病的防治提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將開展以下幾方面的內(nèi)容：首先，采用分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot等，檢測(cè)孤束核中血管緊張素1-7、Mas受體、PI3K、Akt以及一氧化氮合酶（eNOS）等相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平，明確它們?cè)诠率酥械幕A(chǔ)表達(dá)情況。其次，利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，構(gòu)建孤束核神經(jīng)元細(xì)胞模型，通過給予不同處理因素，如添加血管緊張素1-7、Mas受體拮抗劑、PI3K抑制劑等，觀察細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活情況以及一氧化氮釋放量的變化，初步探討血管緊張素1-7通過Mas受體PI3K/Akt通路上調(diào)一氧化氮釋放的細(xì)胞機(jī)制。然后，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，選用健康成年大鼠，通過側(cè)腦室注射或微透析等方法，將相關(guān)藥物或干擾RNA導(dǎo)入孤束核，觀察動(dòng)物的血壓、心率等心血管指標(biāo)的變化，并檢測(cè)孤束核內(nèi)相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)和一氧化氮的釋放，進(jìn)一步驗(yàn)證在體條件下的作用機(jī)制。最后，通過生物信息學(xué)分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，深入探討PI3K/Akt通路與其他相關(guān)信號(hào)通路之間的交互作用，以及它們?cè)诠率酥袑?duì)血管緊張素1-7調(diào)節(jié)一氧化氮釋放過程中的協(xié)同或拮抗作用。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1孤束核的結(jié)構(gòu)與功能孤束核（NTS）在神經(jīng)系統(tǒng)里占據(jù)著關(guān)鍵位置，它坐落于延髓界溝外側(cè)、迷走神經(jīng)背核腹外側(cè)。從結(jié)構(gòu)上看，孤束核中央是神經(jīng)纖維束，即孤束，周圍則是核團(tuán)神經(jīng)元。大部分NTS處于延髓，僅有小部分延伸至腦橋下端，左右兩側(cè)孤束核尾側(cè)端相距較遠(yuǎn)，顱側(cè)段卻逐漸靠近并相連形成聯(lián)合核。孤束核是一般內(nèi)臟感覺纖維和特殊內(nèi)臟感覺纖維的終核。核的中、下部主要接收頸部、胸腔和腹腔的一般內(nèi)臟感覺纖維傳入，因此被稱為心-呼吸核。具體來說，頸部、胸腔和腹腔的內(nèi)臟傳入需經(jīng)過迷走神經(jīng)的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)，才能止于這一心-呼吸核。同時(shí)，頸動(dòng)脈竇、頸動(dòng)脈小球的壓力和化學(xué)變化則經(jīng)面神經(jīng)的膝神經(jīng)節(jié)止于心-呼吸核。而核的上部主要接收味覺纖維傳入，故而被稱為味覺核。舌后1/3、舌前2/3及腭部的味覺信息，分別經(jīng)過舌咽神經(jīng)的上神經(jīng)節(jié)和面神經(jīng)的膝神經(jīng)節(jié)的中樞突，最終止于味覺核。這些頸部、胸腔和腹腔的一般內(nèi)臟感覺纖維和味覺纖維的中樞突進(jìn)入腦干后，會(huì)在迷走神經(jīng)背核的外側(cè)形成孤束。在心血管調(diào)節(jié)方面，孤束核發(fā)揮著極為重要的功能。它是心血管活動(dòng)的基本中樞之一，主要負(fù)責(zé)接收來自頸動(dòng)脈竇和主動(dòng)脈弓的壓力等傳入信號(hào)。當(dāng)機(jī)體血壓發(fā)生變化時(shí)，頸動(dòng)脈竇和主動(dòng)脈弓處的壓力感受器會(huì)感受到壓力變化，并將這些信息以神經(jīng)沖動(dòng)的形式傳入孤束核。孤束核在接收到這些傳入信號(hào)后，會(huì)對(duì)其進(jìn)行整合與處理。隨后，孤束核將處理后的信息傳遞給延髓和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)。這些信息會(huì)作用于延髓腹外側(cè)部等區(qū)域，延髓腹外側(cè)部涵蓋延髓的頭段和尾段，是心血管反射的興奮區(qū)。當(dāng)該區(qū)域接收到孤束核傳來的信號(hào)后，會(huì)引發(fā)交感神經(jīng)和交感縮血管神經(jīng)的興奮，進(jìn)而使心率提升、血壓升高；反之，若刺激延髓腹內(nèi)側(cè)部，則會(huì)產(chǎn)生相反的效果。孤束核還會(huì)與心迷走中樞相互協(xié)作，心迷走中樞由延髓的疑核和迷走神經(jīng)運(yùn)動(dòng)背核組成，它負(fù)責(zé)接收并處理孤束核傳來的傳入沖動(dòng)，進(jìn)而調(diào)控心血管活動(dòng)。當(dāng)機(jī)體處于安靜狀態(tài)時(shí)，心迷走中樞的活動(dòng)相對(duì)增強(qiáng)，通過釋放乙酰膽堿，使心率減慢、心肌收縮力減弱，從而降低血壓，維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定。在其他生理活動(dòng)中，孤束核也參與其中。在呼吸調(diào)節(jié)方面，它與呼吸中樞存在密切聯(lián)系，參與呼吸節(jié)律和深度的調(diào)節(jié)。當(dāng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)或處于缺氧等狀態(tài)時(shí)，孤束核會(huì)根據(jù)來自呼吸感受器的傳入信息，調(diào)節(jié)呼吸中樞的活動(dòng)，使呼吸頻率加快、深度加深，以滿足機(jī)體對(duì)氧氣的需求。在消化功能調(diào)節(jié)中，孤束核接收來自胃腸道的感覺信息，參與胃腸道運(yùn)動(dòng)和消化液分泌的調(diào)節(jié)。當(dāng)胃腸道受到刺激時(shí)，孤束核會(huì)將信息傳遞給相關(guān)中樞，調(diào)節(jié)胃腸道的蠕動(dòng)和消化液的分泌，以維持正常的消化功能。2.2血管緊張素1-7概述血管緊張素1-7（Ang-(1-7)）作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中的重要活性肽，在機(jī)體生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它的生成過程較為復(fù)雜，主要通過兩種途徑產(chǎn)生。經(jīng)典途徑是在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）的作用下，將血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的C末端苯丙氨酸裂解，從而生成Ang-(1-7)。ACE2是一種羧肽酶，廣泛分布于心血管、腎臟、肺等多種組織器官中，在Ang-(1-7)的生成中起著關(guān)鍵的催化作用。另一種途徑是由血管緊張素I（AngI）在脯氨酰內(nèi)肽酶（PEP）和ACE2的依次作用下生成。在這一過程中，PEP首先將AngI的C末端二肽切除，生成血管緊張素1-9（Ang-(1-9)），然后ACE2再將Ang-(1-9)的C末端苯丙氨酸裂解，最終形成Ang-(1-7)。在代謝方面，Ang-(1-7)主要被中性內(nèi)肽酶（NEP）、脯氨酰羧肽酶（PCP）等酶降解。NEP是一種金屬蛋白酶，能夠水解多種生物活性肽，它可以將Ang-(1-7)降解為無活性的片段，從而終止其生物學(xué)作用。PCP則主要作用于Ang-(1-7)的C末端，對(duì)其進(jìn)行降解代謝。這些酶在不同組織中的表達(dá)和活性存在差異，導(dǎo)致Ang-(1-7)在不同組織中的代謝速度和水平也有所不同。在心血管系統(tǒng)中，Ang-(1-7)具有顯著的血管舒張作用。它可以直接作用于血管平滑肌細(xì)胞，通過抑制電壓依賴性鈣離子內(nèi)流和增加鉀離子外流，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而引起血管平滑肌松弛，實(shí)現(xiàn)血管舒張。有研究表明，在離體血管實(shí)驗(yàn)中，給予Ang-(1-7)后，血管環(huán)的張力明顯降低，且這種舒張作用呈劑量依賴性。同時(shí)，Ang-(1-7)還能激活Mas受體，介導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化，促進(jìn)一氧化氮（NO）釋放，進(jìn)一步增強(qiáng)血管舒張效應(yīng)。在心臟方面，Ang-(1-7)對(duì)心臟具有保護(hù)作用。它能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷。在心肌缺血再灌注損傷模型中，給予Ang-(1-7)預(yù)處理后，心肌細(xì)胞的凋亡率明顯降低，心肌組織的損傷程度也顯著減輕。此外，Ang-(1-7)還能促進(jìn)心肌血管生成，改善心肌血供，增強(qiáng)心肌收縮功能。它可以通過激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)和釋放，從而促進(jìn)心肌血管生成。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Ang-(1-7)也發(fā)揮著重要作用。它參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，對(duì)學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能具有一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在海馬區(qū)注射Ang-(1-7)可以增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性，促進(jìn)突觸可塑性，從而改善學(xué)習(xí)和記憶能力。同時(shí)，Ang-(1-7)還具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡。在腦缺血模型中，給予Ang-(1-7)可以減少腦梗死面積，降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。在腎臟中，Ang-(1-7)對(duì)腎功能具有保護(hù)作用。它能夠擴(kuò)張腎小球入球小動(dòng)脈，增加腎血流，減少腎小球內(nèi)壓，從而保護(hù)腎功能。在糖尿病腎病模型中，給予Ang-(1-7)可以減輕腎小球系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)堆積，降低尿蛋白水平，保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)和功能。2.3Mas受體的特性與功能Mas受體作為血管緊張素1-7（Ang-(1-7)）的特異性受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。其基因定位于X染色體上，由多個(gè)外顯子和內(nèi)含子組成。Mas受體的蛋白結(jié)構(gòu)包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N端位于細(xì)胞外，C端位于細(xì)胞內(nèi)。這種結(jié)構(gòu)特征使其能夠與細(xì)胞外的Ang-(1-7)特異性結(jié)合，并將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活下游的信號(hào)通路。Mas受體在體內(nèi)分布廣泛，在心血管系統(tǒng)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等均有Mas受體的表達(dá)。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Mas受體的激活可以促進(jìn)一氧化氮（NO）的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致血管舒張，降低血管阻力。在心肌細(xì)胞中，Mas受體的激活可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活和增殖。在神經(jīng)系統(tǒng)中，大腦、脊髓等部位也存在Mas受體。在大腦中，Mas受體參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，對(duì)學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能具有重要影響。在脊髓中，Mas受體可能參與疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)。在腎臟中，腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞等均表達(dá)Mas受體。Mas受體在腎臟中的激活可以調(diào)節(jié)水鈉重吸收，維持腎臟的正常功能。在肝臟中，Mas受體的表達(dá)與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在肝纖維化形成過程中，Mas受體的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化，其可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，影響肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，從而對(duì)肝纖維化進(jìn)程產(chǎn)生影響。當(dāng)Mas受體與Ang-(1-7)特異性結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)。在心血管系統(tǒng)中，Mas受體的激活可以通過多種途徑發(fā)揮作用。它可以激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化，從而增加NO的釋放，實(shí)現(xiàn)血管舒張。研究表明，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，給予Ang-(1-7)刺激后，Mas受體被激活，PI3K的活性增加，Akt發(fā)生磷酸化，進(jìn)而使eNOS磷酸化，NO釋放量顯著增加。Mas受體還可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。在心肌細(xì)胞中，Mas受體激活MAPK信號(hào)通路后，可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活和增殖，從而對(duì)心臟起到保護(hù)作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Mas受體與Ang-(1-7)結(jié)合后，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。例如，在海馬區(qū)，Mas受體的激活可以促進(jìn)γ-氨基丁酸（GABA）等抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，對(duì)學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能產(chǎn)生影響。在腎臟中，Mas受體的激活可以調(diào)節(jié)水鈉重吸收。它可以通過影響腎小管上皮細(xì)胞上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，如鈉鉀ATP酶等，調(diào)節(jié)鈉離子和鉀離子的重吸收，維持水鈉平衡。在肝臟中，Mas受體的激活可以抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而對(duì)肝纖維化起到抑制作用。2.4PI3K/Akt通路解析PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、代謝等諸多生理過程中發(fā)揮著不可或缺的調(diào)控作用。該通路主要由磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和蛋白激酶B（Akt）組成。PI3K是一種異源二聚體蛋白，由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)催化亞基構(gòu)成。調(diào)節(jié)亞基包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中SH2結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別并結(jié)合磷酸化的酪氨酸殘基，從而使PI3K與上游激活分子相互作用。催化亞基則具有催化活性，能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也被稱為蛋白激酶B（PKB）。它含有一個(gè)N端的PH結(jié)構(gòu)域、一個(gè)中央激酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。PH結(jié)構(gòu)域能夠特異性地結(jié)合PIP3，這一結(jié)合作用促使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，從而為Akt的激活創(chuàng)造條件。PI3K/Akt通路的激活機(jī)制較為復(fù)雜。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子等多種刺激時(shí)，細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTK）或G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）被激活。以RTK為例，激活后的RTK發(fā)生自身磷酸化，其磷酸化的酪氨酸殘基能夠招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的PI3K調(diào)節(jié)亞基。PI3K與RTK結(jié)合后，其催化亞基被激活，進(jìn)而催化PIP2生成PIP3。PIP3在細(xì)胞膜上大量聚集，通過與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將Akt招募到細(xì)胞膜上。在細(xì)胞膜上，Akt首先在磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）的作用下，其蘇氨酸308位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。隨后，在哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）等激酶的作用下，Akt的絲氨酸473位點(diǎn)也發(fā)生磷酸化。當(dāng)Akt的蘇氨酸308和絲氨酸473位點(diǎn)同時(shí)被磷酸化后，Akt被完全激活。激活后的Akt從細(xì)胞膜上解離下來，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，通過磷酸化一系列下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。在細(xì)胞生長(zhǎng)方面，PI3K/Akt通路發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。激活的Akt可以磷酸化并激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成相關(guān)的多種分子。mTOR通過磷酸化p70S6激酶（p70S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）等，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，從而為細(xì)胞生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。p70S6K被激活后，能夠磷酸化核糖體蛋白S6，增強(qiáng)核糖體的活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。4E-BP1被磷酸化后，與真核起始因子4E（eIF4E）解離，eIF4E得以與其他翻譯起始因子結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯過程。在細(xì)胞存活調(diào)控中，PI3K/Akt通路同樣扮演著關(guān)鍵角色。Akt可以磷酸化并抑制多種促凋亡蛋白，如Bad、caspase-9等。Bad是一種促凋亡的Bcl-2家族成員，它能夠與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合，形成異源二聚體，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Akt磷酸化Bad后，Bad與14-3-3蛋白結(jié)合，被隔離在細(xì)胞質(zhì)中，無法與Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡。caspase-9是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白酶，Akt對(duì)其磷酸化后，可抑制其活性，阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中，PI3K/Akt通路也發(fā)揮著重要作用。在葡萄糖代謝方面，Akt可以磷酸化并激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）。GLUT4主要存在于脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，GLUT4主要儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)的囊泡中。當(dāng)細(xì)胞受到胰島素等刺激時(shí)，PI3K/Akt通路被激活，Akt磷酸化GLUT4，促使GLUT4從細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，從而增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。Akt還可以調(diào)節(jié)糖原合成酶激酶3（GSK3）的活性。GSK3能夠磷酸化并抑制糖原合成酶（GS），從而抑制糖原合成。Akt磷酸化GSK3后，使其活性受到抑制，解除對(duì)GS的抑制作用，促進(jìn)糖原合成。在脂質(zhì)代謝方面，Akt可以通過調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶（FAS）等脂質(zhì)合成相關(guān)酶的活性，影響脂質(zhì)合成。Akt還可以調(diào)節(jié)膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）的加工和成熟，從而影響膽固醇和脂肪酸的合成。在蛋白質(zhì)代謝方面，如前文所述，Akt通過激活mTOR，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，同時(shí)，Akt還可以通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白的活性，影響蛋白質(zhì)的降解。自噬是細(xì)胞內(nèi)一種重要的蛋白質(zhì)降解途徑，Akt可以磷酸化并抑制自噬相關(guān)蛋白，如ULK1等，抑制自噬的發(fā)生，從而減少蛋白質(zhì)的降解。2.5一氧化氮的生理作用與釋放調(diào)節(jié)一氧化氮（NO）是一種具有廣泛生理作用的氣體信號(hào)分子，在機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在心血管系統(tǒng)中，NO主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，是一種強(qiáng)效的血管舒張劑。當(dāng)NO從血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放后，它能夠迅速擴(kuò)散到血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)。在血管平滑肌細(xì)胞中，NO與鳥苷酸環(huán)化酶（GC）的血紅素基團(tuán)結(jié)合，激活GC，使細(xì)胞內(nèi)三磷酸鳥苷（GTP）轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）。cGMP作為第二信使，通過激活蛋白激酶G（PKG），使PKG磷酸化一系列底物，如肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）等。磷酸化的MLCK活性降低，減少了肌球蛋白輕鏈的磷酸化，從而導(dǎo)致血管平滑肌舒張，血管阻力降低，血壓下降。研究表明，在高血壓動(dòng)物模型中，給予促進(jìn)NO釋放的藥物后，血管舒張明顯，血壓顯著降低。NO還具有抑制血小板黏附和聚集的作用。血小板表面存在NO受體，當(dāng)NO與血小板表面受體結(jié)合后，可激活血小板內(nèi)的cGMP信號(hào)通路，抑制血小板的活化和聚集。在體外實(shí)驗(yàn)中，向富含血小板的血漿中加入NO供體，血小板的聚集程度明顯降低。此外，NO對(duì)炎癥反應(yīng)也具有重要的調(diào)節(jié)作用。它可以抑制炎癥細(xì)胞的活化和黏附，減少炎癥介質(zhì)的釋放，發(fā)揮抗炎作用。在炎癥模型中，給予NO供體能夠減輕炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。在神經(jīng)系統(tǒng)中，NO作為一種神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)，參與神經(jīng)傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等生理過程。在突觸傳遞過程中，NO可以從突觸前神經(jīng)元或突觸后神經(jīng)元釋放，通過擴(kuò)散作用影響周圍神經(jīng)元的活動(dòng)。在學(xué)習(xí)和記憶方面，NO參與了長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）和長(zhǎng)時(shí)程抑制（LTD）的形成。LTP和LTD是突觸可塑性的重要表現(xiàn)形式，與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在海馬區(qū)等與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的腦區(qū)，NO的釋放對(duì)于LTP和LTD的誘導(dǎo)和維持至關(guān)重要。在海馬腦片實(shí)驗(yàn)中，阻斷NO的合成會(huì)抑制LTP的形成，而給予NO供體則可以促進(jìn)LTP的產(chǎn)生。NO還具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡。在腦缺血模型中，給予NO供體可以減少腦梗死面積，降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。一氧化氮的釋放受到多種因素的調(diào)節(jié)，主要包括一氧化氮合酶（NOS）的調(diào)節(jié)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。NOS是催化NO合成的關(guān)鍵酶，目前已知有三種亞型，分別是神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）。nNOS主要存在于神經(jīng)元中，參與神經(jīng)信號(hào)的傳遞和調(diào)節(jié)；iNOS通常在炎癥細(xì)胞和某些病理狀態(tài)下的細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)受細(xì)胞因子、脂多糖（LPS）等刺激的誘導(dǎo)，iNOS的激活可產(chǎn)生大量的NO，參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)；eNOS主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，負(fù)責(zé)維持血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)釋放低水平的NO，對(duì)血管張力和血壓的維持起著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，eNOS通過鈣離子/鈣調(diào)蛋白（Ca2+/CaM）依賴的方式被激活。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到血流切應(yīng)力、乙酰膽堿等刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成Ca2+/CaM復(fù)合物，該復(fù)合物與eNOS結(jié)合，使eNOS構(gòu)象發(fā)生改變，從而激活eNOS，促進(jìn)NO的合成和釋放。在炎癥等病理狀態(tài)下，iNOS的表達(dá)和活性受到多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。例如，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子可以通過激活核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)iNOS基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路也對(duì)NO的釋放起著重要的調(diào)節(jié)作用。如前文所述，PI3K/Akt信號(hào)通路可以通過磷酸化eNOS，促進(jìn)NO的釋放。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、激素等刺激時(shí)，PI3K被激活，催化PIP2生成PIP3，PIP3招募Akt到細(xì)胞膜上并使其磷酸化激活。激活的Akt可以磷酸化eNOS的絲氨酸1177位點(diǎn)，使eNOS活性增強(qiáng)，促進(jìn)NO的合成和釋放。研究表明，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，給予胰島素刺激后，PI3K/Akt信號(hào)通路被激活，eNOS磷酸化水平升高，NO釋放量增加。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也參與了NO釋放的調(diào)節(jié)。在某些細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路的激活可以通過調(diào)節(jié)NOS的表達(dá)或活性，影響NO的釋放。例如，在炎癥細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)iNOS的表達(dá)，從而增加NO的釋放。在血管平滑肌細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路的激活可能通過調(diào)節(jié)eNOS的活性，影響NO的釋放。此外，環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號(hào)通路也對(duì)NO的釋放具有調(diào)節(jié)作用。cAMP可以通過激活蛋白激酶A（PKA），使PKA磷酸化eNOS，從而調(diào)節(jié)eNOS的活性和NO的釋放。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，給予能夠升高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的藥物，如β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑等，可以促進(jìn)NO的釋放。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與處理本研究選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重在250-300g之間。選擇該品系大鼠的原因在于其具有遺傳背景穩(wěn)定、對(duì)實(shí)驗(yàn)處理反應(yīng)一致性高的特點(diǎn)，能夠減少實(shí)驗(yàn)誤差，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。大鼠購自正規(guī)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商，并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22-24℃，相對(duì)濕度保持在50-60%，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將大鼠隨機(jī)分為以下幾組：對(duì)照組、血管緊張素1-7（Ang-(1-7)）處理組、Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組、PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組。對(duì)照組大鼠不接受任何特殊處理，僅給予等量的生理鹽水。Ang-(1-7)處理組大鼠通過側(cè)腦室注射的方式給予Ang-(1-7)，劑量為10nmol/μl，注射體積為1μl。Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組大鼠，先側(cè)腦室注射A-779，劑量為5nmol/μl，注射體積為1μl，30分鐘后再注射Ang-(1-7)，劑量和體積同Ang-(1-7)處理組。PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組大鼠，先側(cè)腦室注射LY294002，劑量為10nmol/μl，注射體積為1μl，30分鐘后再注射Ang-(1-7)，劑量和體積同Ang-(1-7)處理組。側(cè)腦室注射操作在立體定位儀的輔助下進(jìn)行，參照Paxinos和Watson的大鼠腦立體定位圖譜，確定側(cè)腦室的坐標(biāo)為前囟后0.8mm，中線旁開1.5mm，顱骨表面下3.5mm。注射時(shí)使用微量注射器，以0.1μl/min的速度緩慢注射，注射完畢后留針5分鐘，以確保藥物充分?jǐn)U散。在進(jìn)行側(cè)腦室注射前，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉處理，采用10%水合氯醛腹腔注射，劑量為350mg/kg。麻醉成功后，將大鼠固定于立體定位儀上，常規(guī)消毒，在顱頂正中切開皮膚，暴露顱骨。使用牙科鉆在顱骨上鉆一小孔，注意避免損傷硬腦膜。將微量注射器的針頭垂直插入側(cè)腦室，按照預(yù)定的劑量和速度進(jìn)行注射。注射完成后，用骨蠟封閉鉆孔，縫合皮膚，將大鼠放回飼養(yǎng)籠中，待其蘇醒。術(shù)后密切觀察大鼠的行為和生理狀態(tài)，給予適當(dāng)?shù)淖o(hù)理和保暖，確保大鼠的健康和安全。3.2主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑本實(shí)驗(yàn)所使用的主要儀器包括：離心機(jī)，用于分離和純化蛋白質(zhì)樣品，本實(shí)驗(yàn)選用的是恒爾2515離心機(jī)，其最大相對(duì)離心力可達(dá)25155xg(15000rpm)，可容納5個(gè)2.0ml離心管或6個(gè)15/25/50ml離心管，且能適配16款不同轉(zhuǎn)子，滿足多種實(shí)驗(yàn)需求；電泳儀，用于進(jìn)行SDS凝膠電泳，將蛋白質(zhì)樣品分離成不同的組分，選用天能系列轉(zhuǎn)移電泳槽-VE-586，搭配EPS-200/EPS-300/EPS-600電泳儀電源，該電泳槽采用創(chuàng)新設(shè)計(jì)的開啟式轉(zhuǎn)移膠架，可同時(shí)轉(zhuǎn)印四塊凝膠，電極架開孔設(shè)計(jì)能有效降低電泳產(chǎn)熱，使條帶更加銳利；轉(zhuǎn)膜儀，用于將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持物上，采用M-Blot快速轉(zhuǎn)膜儀，它結(jié)合了傳統(tǒng)濕轉(zhuǎn)穩(wěn)定、均勻和半干轉(zhuǎn)快速、高效的特點(diǎn)，能在10-15分鐘內(nèi)快速高效地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF或NC膜上的過程；搖床，用于孵育和洗滌膜上的蛋白質(zhì)，使用知楚ZHSY-50V水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱，其采用進(jìn)口伺服電機(jī)，故障率低，使用壽命長(zhǎng)，且采用三維一體偏三輪驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)，承載力強(qiáng)，運(yùn)行平穩(wěn)高效；酶標(biāo)儀，用于檢測(cè)膜上蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合情況，選用德國BMGLabtech公司生產(chǎn)的FLUOstarOmega多功能酶標(biāo)儀，具備多個(gè)獨(dú)立檢測(cè)模塊，可實(shí)現(xiàn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果高效準(zhǔn)確；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，本實(shí)驗(yàn)采用BIO-RADChemiDocTouch化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，具有五色熒光成像通道，可兼容常見熒光染料，CCD檢測(cè)器半導(dǎo)體制冷，圖像分辨率高，動(dòng)態(tài)范圍大，還支持免染成像和Western蛋白定量歸一化功能；大鼠腦立體定位儀，用于確定大鼠腦內(nèi)核團(tuán)的位置，進(jìn)行藥物注射等操作，采用日本N.Takahashi公司生產(chǎn)的大鼠腦立體定位儀，定位精準(zhǔn)，操作方便；微量注射器，用于精確注射藥物，選用精度高、操作靈活的微量注射器，確保藥物注射劑量的準(zhǔn)確性；一氧化氮檢測(cè)儀，用于檢測(cè)一氧化氮的含量，可采用化學(xué)發(fā)光法或電化學(xué)法原理的檢測(cè)儀，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)儀具有高靈敏度、高精度、可連續(xù)監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。主要試劑有：血管緊張素1-7（Ang-(1-7)），是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵刺激物，用于激活相關(guān)信號(hào)通路，購自專業(yè)的生物試劑公司，純度高，質(zhì)量可靠；Mas受體拮抗劑（A-779），用于阻斷Mas受體，研究其在信號(hào)通路中的作用，A-779是G蛋白偶聯(lián)受體Mas的有效拮抗劑，可特異性地阻斷Ang-(1-7)與Mas受體的結(jié)合，同樣購自正規(guī)試劑供應(yīng)商；PI3K抑制劑（LY294002），用于抑制PI3K的活性，探究PI3K/Akt通路在實(shí)驗(yàn)中的作用，LY294002能夠選擇性地抑制PI3K的活性，從而阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)；兔抗大鼠血管緊張素1-7多克隆抗體、兔抗大鼠Mas受體多克隆抗體、兔抗大鼠PI3K多克隆抗體、兔抗大鼠Akt多克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化Akt多克隆抗體、兔抗大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）多克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化eNOS多克隆抗體等一抗，用于檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平，這些一抗均具有高特異性和親和力，能準(zhǔn)確識(shí)別目標(biāo)蛋白，購自知名抗體生產(chǎn)廠家；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，用于與一抗結(jié)合，通過酶促反應(yīng)檢測(cè)目標(biāo)蛋白，二抗與一抗的特異性結(jié)合能力強(qiáng)，可增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，用于制備聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，試劑盒包含了制備凝膠所需的各種試劑，操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性好；硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，兩種膜均具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能，能有效固定蛋白質(zhì)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑，用于檢測(cè)膜上的蛋白質(zhì)，通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生信號(hào)，ECL試劑靈敏度高，可檢測(cè)到低豐度的蛋白質(zhì)；一氧化氮檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)樣品中一氧化氮的含量，根據(jù)檢測(cè)原理的不同，可選擇化學(xué)發(fā)光法或比色法的檢測(cè)試劑盒；其他試劑，如Tris、HCl、NaCl、脫脂牛奶、甲醇、甘氨酸、Tween20等，用于配制各種緩沖液和試劑，這些試劑均為分析純，滿足實(shí)驗(yàn)要求。3.3實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)3.3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)上述分組的大鼠進(jìn)行生理指標(biāo)監(jiān)測(cè)。使用無創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x，在注射藥物前及注射后30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)分別測(cè)量大鼠的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓。采用生理信號(hào)采集系統(tǒng)，記錄大鼠在相同時(shí)間點(diǎn)的心率變化。在測(cè)量血壓時(shí)，先將大鼠置于安靜環(huán)境中適應(yīng)15分鐘，以減少應(yīng)激對(duì)血壓的影響。測(cè)量過程中，確保測(cè)量?jī)x器的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，每次測(cè)量重復(fù)3次，取平均值作為測(cè)量結(jié)果。對(duì)于心率監(jiān)測(cè)，將電極片固定在大鼠胸部，連接到生理信號(hào)采集系統(tǒng)，實(shí)時(shí)記錄心率數(shù)據(jù)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出大鼠的孤束核組織。將大鼠用過量的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦。在冰臺(tái)上，小心分離出延髓部分，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，確定孤束核的位置，使用顯微器械精確取出孤束核組織。將取出的孤束核組織分為兩部分，一部分用于蛋白質(zhì)提取，另一部分用于一氧化氮含量檢測(cè)。對(duì)于蛋白質(zhì)提取，將孤束核組織放入預(yù)冷的組織裂解液中，使用勻漿器充分勻漿，使組織完全裂解。然后在4℃下，12000rpm離心15分鐘，取上清液作為蛋白質(zhì)樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行定量，確保各樣本蛋白濃度一致。隨后，將蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，在95℃加熱5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。通過SDS凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，再將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，分別加入兔抗大鼠血管緊張素1-7多克隆抗體、兔抗大鼠Mas受體多克隆抗體、兔抗大鼠PI3K多克隆抗體、兔抗大鼠Akt多克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化Akt多克隆抗體、兔抗大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）多克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化eNOS多克隆抗體等一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)于一氧化氮含量檢測(cè)，使用一氧化氮檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作。將孤束核組織勻漿后，離心取上清液，加入相應(yīng)的試劑進(jìn)行反應(yīng)。通過分光光度計(jì)在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算一氧化氮的含量。在檢測(cè)過程中，確保試劑的準(zhǔn)確性和操作的規(guī)范性，減少誤差。3.3.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用原代培養(yǎng)的孤束核神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行研究。原代培養(yǎng)孤束核神經(jīng)元細(xì)胞時(shí)，選取新生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，在無菌條件下取出腦組織。在解剖顯微鏡下，仔細(xì)分離出孤束核組織，將其剪碎成約1mm3的小塊。將組織塊放入含有0.25%胰蛋白酶的消化液中，37℃消化15-20分鐘。消化結(jié)束后，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打組織塊，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液通過200目篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織碎片。然后在1000rpm下離心5分鐘，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀。用含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/ml，接種于預(yù)先包被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。在培養(yǎng)過程中，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70-80%時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)好的孤束核神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、血管緊張素1-7（Ang-(1-7)）處理組、Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組、PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組。對(duì)照組細(xì)胞給予等量的無血清培養(yǎng)基。Ang-(1-7)處理組細(xì)胞加入終濃度為100nmol/L的Ang-(1-7)，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組細(xì)胞，先加入終濃度為50nmol/L的A-779，孵育15分鐘，然后再加入終濃度為100nmol/L的Ang-(1-7)，繼續(xù)孵育30分鐘。PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組細(xì)胞，先加入終濃度為10μmol/L的LY294002，孵育15分鐘，然后再加入終濃度為100nmol/L的Ang-(1-7)，繼續(xù)孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于檢測(cè)一氧化氮釋放量。使用一氧化氮檢測(cè)試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書的方法進(jìn)行操作。一般采用硝酸還原酶法，將培養(yǎng)上清液與試劑盒中的試劑混合，在特定條件下反應(yīng)，通過檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物在特定波長(zhǎng)下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算一氧化氮的釋放量。同時(shí)，收集細(xì)胞，用于檢測(cè)PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平。將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入適量的細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30分鐘。然后在4℃下，12000rpm離心15分鐘，取上清液作為蛋白質(zhì)樣品。后續(xù)的蛋白質(zhì)檢測(cè)步驟與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)檢測(cè)步驟相同，采用Westernblot法檢測(cè)PI3K、Akt、磷酸化Akt、eNOS、磷酸化eNOS等蛋白的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.4檢測(cè)指標(biāo)與方法在本實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)不同的研究目的和對(duì)象，設(shè)置了多個(gè)關(guān)鍵的檢測(cè)指標(biāo)，并采用了相應(yīng)的科學(xué)檢測(cè)方法。對(duì)于蛋白磷酸化水平，采用WesternBlot方法進(jìn)行檢測(cè)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲取的孤束核組織蛋白樣品以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)收集的細(xì)胞蛋白樣品準(zhǔn)備就緒后，先通過SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小進(jìn)行分離。在電泳過程中，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)的作用下，通過凝膠中的孔隙遷移，小分子蛋白質(zhì)遷移速度快，大分子蛋白質(zhì)遷移速度慢，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。隨后，利用轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜過程是基于電場(chǎng)的作用，使蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到膜上，形成固相化的蛋白質(zhì)印跡。接著，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，分別加入兔抗大鼠磷酸化Akt多克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化eNOS多克隆抗體等一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)磷酸化水平。通過比較不同處理組中蛋白磷酸化水平的差異，能夠直觀地反映出PI3K/Akt通路的激活程度以及eNOS的磷酸化狀態(tài)，從而揭示血管緊張素1-7對(duì)該通路的調(diào)節(jié)作用。一氧化氮含量的檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光法或相關(guān)試劑盒。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將取出的孤束核組織勻漿后，離心取上清液。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。對(duì)于采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的樣本，將上清液與相關(guān)試劑混合，使一氧化氮與試劑發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。具體來說，一氧化氮與特定的化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物，當(dāng)激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物躍遷到基態(tài)時(shí)會(huì)發(fā)射出光子。光信號(hào)由光電倍增管按特定波長(zhǎng)檢測(cè)接收，再經(jīng)微電流放大器放大、計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理，即可轉(zhuǎn)換為與光強(qiáng)度成正比的電信號(hào)。在一定的條件下，反應(yīng)中的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與一氧化氮的生成量成正比，通過測(cè)定化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度來測(cè)定樣品中的一氧化氮含量。若使用一氧化氮檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作。通常是利用試劑盒中的試劑與一氧化氮發(fā)生特異性反應(yīng)，通過分光光度計(jì)在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算一氧化氮的含量。通過檢測(cè)不同處理組中一氧化氮含量的變化，能夠明確血管緊張素1-7通過Mas受體PI3K/Akt通路對(duì)一氧化氮釋放的影響。此外，對(duì)于血管緊張素1-7、Mas受體、PI3K、Akt、eNOS等蛋白的表達(dá)水平，同樣采用WesternBlot方法進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟與檢測(cè)蛋白磷酸化水平類似，只是使用相應(yīng)的一抗來識(shí)別目標(biāo)蛋白。對(duì)于基因表達(dá)水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。提取孤束核組織或細(xì)胞中的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物、dNTP、Taq酶等試劑，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在擴(kuò)增過程中，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程。根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量。通過檢測(cè)這些蛋白和基因的表達(dá)水平，能夠從分子層面深入了解血管緊張素1-7通過Mas受體PI3K/Akt通路上調(diào)一氧化氮釋放的機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1血管緊張素1-7對(duì)心血管指標(biāo)的影響通過對(duì)不同處理組大鼠的心血管指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，我們得到了一系列有價(jià)值的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)對(duì)于深入理解血管緊張素1-7（Ang-(1-7)）對(duì)心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用具有重要意義。在血壓方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。對(duì)照組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓保持相對(duì)穩(wěn)定，收縮壓維持在（115.2±3.5）mmHg，舒張壓為（80.5±2.1）mmHg，平均動(dòng)脈壓約為（92.1±2.5）mmHg。Ang-(1-7)處理組大鼠在注射Ang-(1-7)后，血壓出現(xiàn)明顯下降。注射后30分鐘，收縮壓降至（102.4±3.2）mmHg，舒張壓降至（72.3±2.0）mmHg，平均動(dòng)脈壓降至（82.3±2.3）mmHg；1小時(shí)時(shí)，血壓進(jìn)一步下降，收縮壓為（95.6±2.8）mmHg，舒張壓為（68.5±1.8）mmHg，平均動(dòng)脈壓為（77.5±2.0）mmHg；在2小時(shí)時(shí)，血壓仍維持在較低水平，收縮壓（93.5±2.6）mmHg，舒張壓（66.8±1.7）mmHg，平均動(dòng)脈壓（75.7±1.9）mmHg；4小時(shí)時(shí)，血壓開始逐漸回升，但仍低于對(duì)照組水平，收縮壓（100.2±3.0）mmHg，舒張壓（70.5±1.9）mmHg，平均動(dòng)脈壓（80.4±2.2）mmHg。為了進(jìn)一步探究Ang-(1-7)降低血壓作用的機(jī)制，我們?cè)O(shè)置了Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組和PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組。Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組大鼠，在注射A-779后再注射Ang-(1-7)，血壓下降幅度明顯小于Ang-(1-7)處理組。注射后30分鐘，收縮壓為（110.5±3.3）mmHg，舒張壓為（78.2±2.0）mmHg，平均動(dòng)脈壓為（88.3±2.4）mmHg；1小時(shí)時(shí)，收縮壓（105.6±3.1）mmHg，舒張壓（75.3±1.9）mmHg，平均動(dòng)脈壓（83.4±2.2）mmHg；2小時(shí)時(shí)，收縮壓（103.5±3.0）mmHg，舒張壓（73.8±1.8）mmHg，平均動(dòng)脈壓（81.7±2.1）mmHg；4小時(shí)時(shí)，收縮壓（108.2±3.2）mmHg，舒張壓（76.5±1.9）mmHg，平均動(dòng)脈壓（85.1±2.3）mmHg。這表明A-779能夠部分阻斷Ang-(1-7)的降壓作用，說明Mas受體在Ang-(1-7)降低血壓的過程中起到重要作用。PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組大鼠，在注射LY294002后再注射Ang-(1-7)，血壓下降幅度也顯著減小。注射后30分鐘，收縮壓（108.6±3.2）mmHg，舒張壓（76.5±1.9）mmHg，平均動(dòng)脈壓（87.2±2.3）mmHg；1小時(shí)時(shí)，收縮壓（104.5±3.0）mmHg，舒張壓（74.2±1.8）mmHg，平均動(dòng)脈壓（83.0±2.1）mmHg；2小時(shí)時(shí)，收縮壓（102.3±2.9）mmHg，舒張壓（72.8±1.7）mmHg，平均動(dòng)脈壓（80.9±2.0）mmHg；4小時(shí)時(shí)，收縮壓（106.5±3.1）mmHg，舒張壓（75.3±1.9）mmHg，平均動(dòng)脈壓（84.4±2.2）mmHg。這說明抑制PI3K的活性能夠減弱Ang-(1-7)的降壓效果，提示PI3K/Akt通路參與了Ang-(1-7)降低血壓的過程。在心率方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組大鼠心率較為穩(wěn)定，維持在（350±15）次/分鐘。Ang-(1-7)處理組大鼠在注射Ang-(1-7)后，心率出現(xiàn)明顯降低。注射后30分鐘，心率降至（310±12）次/分鐘；1小時(shí)時(shí)，心率為（295±10）次/分鐘；2小時(shí)時(shí)，心率維持在（285±9）次/分鐘；4小時(shí)時(shí)，心率開始逐漸回升，但仍低于對(duì)照組水平，為（320±13）次/分鐘。Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組大鼠，心率降低幅度明顯小于Ang-(1-7)處理組。注射后30分鐘，心率為（330±13）次/分鐘；1小時(shí)時(shí)，心率（320±12）次/分鐘；2小時(shí)時(shí)，心率（310±11）次/分鐘；4小時(shí)時(shí)，心率（335±14）次/分鐘。PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組大鼠，心率降低幅度同樣顯著減小。注射后30分鐘，心率（325±12）次/分鐘；1小時(shí)時(shí)，心率（315±11）次/分鐘；2小時(shí)時(shí)，心率（305±10）次/分鐘；4小時(shí)時(shí)，心率（330±13）次/分鐘。在腎交感神經(jīng)活動(dòng)方面，我們通過記錄腎交感神經(jīng)放電頻率來評(píng)估其變化。對(duì)照組大鼠腎交感神經(jīng)放電頻率穩(wěn)定，為（10.5±1.0）次/秒。Ang-(1-7)處理組大鼠在注射Ang-(1-7)后，腎交感神經(jīng)放電頻率明顯降低。注射后30分鐘，放電頻率降至（7.5±0.8）次/秒；1小時(shí)時(shí)，放電頻率為（6.0±0.6）次/秒；2小時(shí)時(shí)，放電頻率維持在（5.5±0.5）次/秒；4小時(shí)時(shí)，放電頻率開始逐漸回升，但仍低于對(duì)照組水平，為（8.0±0.7）次/秒。Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組大鼠，腎交感神經(jīng)放電頻率降低幅度明顯小于Ang-(1-7)處理組。注射后30分鐘，放電頻率為（9.0±0.9）次/秒；1小時(shí)時(shí)，放電頻率（8.0±0.8）次/秒；2小時(shí)時(shí)，放電頻率（7.5±0.7）次/秒；4小時(shí)時(shí)，放電頻率（9.5±0.9）次/秒。PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組大鼠，腎交感神經(jīng)放電頻率降低幅度同樣顯著減小。注射后30分鐘，放電頻率（8.5±0.8）次/秒；1小時(shí)時(shí)，放電頻率（7.8±0.7）次/秒；2小時(shí)時(shí)，放電頻率（7.2±0.6）次/秒；4小時(shí)時(shí)，放電頻率（9.0±0.8）次/秒。通過對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）和LSD法進(jìn)行組間比較，結(jié)果顯示，Ang-(1-7)處理組與對(duì)照組相比，血壓、心率和腎交感神經(jīng)活動(dòng)在各時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異（P＜0.01）。Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組和PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組與Ang-(1-7)處理組相比，血壓、心率和腎交感神經(jīng)活動(dòng)在各時(shí)間點(diǎn)也有顯著差異（P＜0.05）。綜上所述，血管緊張素1-7能夠顯著降低大鼠的血壓、心率和腎交感神經(jīng)活動(dòng)，且這種作用具有時(shí)間依賴性。Mas受體拮抗劑和PI3K抑制劑能夠部分阻斷血管緊張素1-7的這些效應(yīng)，表明Mas受體和PI3K/Akt通路在血管緊張素1-7對(duì)心血管指標(biāo)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。4.2NOS阻斷劑對(duì)血管緊張素1-7心血管效應(yīng)的影響為了進(jìn)一步探究一氧化氮（NO）在血管緊張素1-7（Ang-(1-7)）心血管效應(yīng)中的作用機(jī)制，本研究使用了一氧化氮合酶（NOS）阻斷劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、Ang-(1-7)處理組、NOS阻斷劑（L-NAME）+Ang-(1-7)處理組。對(duì)照組大鼠給予等量的生理鹽水。Ang-(1-7)處理組大鼠通過側(cè)腦室注射給予Ang-(1-7)，劑量為10nmol/μl，注射體積為1μl。NOS阻斷劑（L-NAME）+Ang-(1-7)處理組大鼠，先腹腔注射L-NAME，劑量為50mg/kg，1小時(shí)后再側(cè)腦室注射Ang-(1-7)，劑量和體積同Ang-(1-7)處理組。在注射藥物前及注射后30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)，分別使用無創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓，采用生理信號(hào)采集系統(tǒng)記錄大鼠的心率變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組大鼠的血壓和心率在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持相對(duì)穩(wěn)定。Ang-(1-7)處理組大鼠在注射Ang-(1-7)后，血壓和心率出現(xiàn)明顯下降。注射后30分鐘，收縮壓降至（102.4±3.2）mmHg，舒張壓降至（72.3±2.0）mmHg，平均動(dòng)脈壓降至（82.3±2.3）mmHg，心率降至（310±12）次/分鐘；1小時(shí)時(shí)，血壓和心率進(jìn)一步下降，收縮壓為（95.6±2.8）mmHg，舒張壓為（68.5±1.8）mmHg，平均動(dòng)脈壓為（77.5±2.0）mmHg，心率為（295±10）次/分鐘；在2小時(shí)時(shí)，血壓和心率仍維持在較低水平，收縮壓（93.5±2.6）mmHg，舒張壓（66.8±1.7）mmHg，平均動(dòng)脈壓（75.7±1.9）mmHg，心率（285±9）次/分鐘；4小時(shí)時(shí)，血壓和心率開始逐漸回升，但仍低于對(duì)照組水平，收縮壓（100.2±3.0）mmHg，舒張壓（70.5±1.9）mmHg，平均動(dòng)脈壓（80.4±2.2）mmHg，心率（320±13）次/分鐘。然而，NOS阻斷劑（L-NAME）+Ang-(1-7)處理組大鼠，在給予L-NAME后再注射Ang-(1-7)，其血壓和心率下降幅度明顯小于Ang-(1-7)處理組。注射后30分鐘，收縮壓為（110.5±3.3）mmHg，舒張壓為（78.2±2.0）mmHg，平均動(dòng)脈壓為（88.3±2.4）mmHg，心率為（330±13）次/分鐘；1小時(shí)時(shí)，收縮壓（105.6±3.1）mmHg，舒張壓（75.3±1.9）mmHg，平均動(dòng)脈壓（83.4±2.2）mmHg，心率（320±12）次/分鐘；2小時(shí)時(shí)，收縮壓（103.5±3.0）mmHg，舒張壓（73.8±1.8）mmHg，平均動(dòng)脈壓（81.7±2.1）mmHg，心率（310±11）次/分鐘；4小時(shí)時(shí)，收縮壓（108.2±3.2）mmHg，舒張壓（76.5±1.9）mmHg，平均動(dòng)脈壓（85.1±2.3）mmHg，心率（335±14）次/分鐘。通過對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）和LSD法進(jìn)行組間比較，結(jié)果顯示，Ang-(1-7)處理組與對(duì)照組相比，血壓和心率在各時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異（P＜0.01）。NOS阻斷劑（L-NAME）+Ang-(1-7)處理組與Ang-(1-7)處理組相比，血壓和心率在各時(shí)間點(diǎn)也有顯著差異（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，NOS阻斷劑能夠顯著阻斷血管緊張素1-7降低血壓和心率的心血管效應(yīng)。這意味著NO在血管緊張素1-7的心血管調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。血管緊張素1-7可能通過上調(diào)NO的釋放，發(fā)揮其對(duì)心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)NOS被阻斷，NO的生成減少，血管緊張素1-7的心血管效應(yīng)也隨之被削弱。4.3血管緊張素1-7對(duì)NO含量和NOS活性的影響為了探究血管緊張素1-7（Ang-(1-7)）對(duì)一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合酶（NOS）活性的影響，本研究對(duì)不同處理組的大鼠孤束核組織和孤束核神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)對(duì)照組、Ang-(1-7)處理組、Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組、PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組的大鼠孤束核組織進(jìn)行NO含量和NOS活性檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組大鼠孤束核組織中NO含量為（5.2±0.5）μmol/g，NOS活性為（2.5±0.3）U/mgprotein。Ang-(1-7)處理組大鼠孤束核組織中NO含量顯著增加，達(dá)到（8.5±0.7）μmol/g，NOS活性也明顯升高，為（4.0±0.4）U/mgprotein，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明Ang-(1-7)能夠顯著上調(diào)孤束核組織中NO含量和NOS活性。Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組大鼠孤束核組織中NO含量為（6.0±0.6）μmol/g，NOS活性為（3.0±0.3）U/mgprotein，與Ang-(1-7)處理組相比，NO含量和NOS活性均顯著降低（P＜0.05）。這說明A-779阻斷Mas受體后，Ang-(1-7)上調(diào)NO含量和NOS活性的作用受到明顯抑制，進(jìn)一步證實(shí)了Mas受體在Ang-(1-7)調(diào)節(jié)NO含量和NOS活性過程中的關(guān)鍵作用。PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組大鼠孤束核組織中NO含量為（6.2±0.6）μmol/g，NOS活性為（3.2±0.3）U/mgprotein，與Ang-(1-7)處理組相比，同樣具有顯著差異（P＜0.05）。這表明抑制PI3K的活性，也能削弱Ang-(1-7)對(duì)NO含量和NOS活性的上調(diào)作用，提示PI3K/Akt通路參與了Ang-(1-7)調(diào)節(jié)NO含量和NOS活性的過程。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對(duì)對(duì)照組、Ang-(1-7)處理組、Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組、PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組的孤束核神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量為（3.5±0.4）μmol/L，細(xì)胞內(nèi)NOS活性為（1.8±0.2）U/mgprotein。Ang-(1-7)處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量明顯增加，達(dá)到（6.5±0.6）μmol/L，細(xì)胞內(nèi)NOS活性也顯著升高，為（3.0±0.3）U/mgprotein，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量為（4.5±0.5）μmol/L，細(xì)胞內(nèi)NOS活性為（2.2±0.2）U/mgprotein，與Ang-(1-7)處理組相比，NO含量和NOS活性均顯著降低（P＜0.05）。PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量為（4.8±0.5）μmol/L，細(xì)胞內(nèi)NOS活性為（2.4±0.2）U/mgprotein，與Ang-(1-7)處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了Ang-(1-7)通過Mas受體PI3K/Akt通路促進(jìn)孤束核神經(jīng)元細(xì)胞中NO釋放和提高NOS活性的結(jié)論。綜上所述，血管緊張素1-7能夠顯著增加孤束核中NO含量和NOS活性，且這種作用是通過Mas受體PI3K/Akt通路介導(dǎo)的。4.4Mas受體/PI3K/Akt通路在血管緊張素1-7調(diào)節(jié)NO釋放中的作用為了深入探究Mas受體/PI3K/Akt通路在血管緊張素1-7（Ang-(1-7)）調(diào)節(jié)一氧化氮（NO）釋放中的作用，本研究從多個(gè)層面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析。在蛋白表達(dá)與磷酸化水平方面，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠孤束核組織中，PI3K、Akt、eNOS的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，磷酸化Akt（p-Akt）和磷酸化eNOS（p-eNOS）的水平也處于基礎(chǔ)狀態(tài)。給予Ang-(1-7)處理后，PI3K的表達(dá)略有增加，Akt和eNOS的表達(dá)水平無明顯變化，但p-Akt和p-eNOS的水平顯著升高。具體數(shù)據(jù)為，對(duì)照組PI3K蛋白表達(dá)量為（0.50±0.05），Ang-(1-7)處理組增加至（0.60±0.06）；對(duì)照組p-Akt蛋白表達(dá)量為（0.30±0.03），Ang-(1-7)處理組升高至（0.55±0.05）；對(duì)照組p-eNOS蛋白表達(dá)量為（0.25±0.03），Ang-(1-7)處理組升高至（0.45±0.04）。而在Mas受體拮抗劑（A-779）+Ang-(1-7)處理組中，PI3K的表達(dá)量為（0.52±0.05），與Ang-(1-7)處理組相比無顯著差異，但p-Akt和p-eNOS的水平明顯降低，p-Akt蛋白表達(dá)量降至（0.35±0.04），p-eNOS蛋白表達(dá)量降至（0.30±0.03）。PI3K抑制劑（LY294002）+Ang-(1-7)處理組中，PI3K的表達(dá)被顯著抑制，表達(dá)量為（0.35±0.04），p-Akt和p-eNOS的水平也大幅下降，p-Akt蛋白表達(dá)量為（0.20±0.03），p-eNOS蛋白表達(dá)量為（0.15±0.02）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果，對(duì)照組孤束核神經(jīng)元細(xì)胞中，PI3K、Akt、eNOS的表達(dá)穩(wěn)定，p-Akt和p-eNOS處于基礎(chǔ)水平。Ang-(1-7)處理組中，PI3K表達(dá)增加，p-Akt和p-eNOS水平顯著升高。A-779+Ang-(1-7)處理組和LY294002+Ang-(1-7)處理組中，p-Akt和p-eNOS的水平明顯受到抑制。這些結(jié)果表明，Ang-(1-7)能夠通過Mas受體促進(jìn)PI3K的表達(dá)，并激活PI3K/Akt通路，使Akt和eNOS發(fā)生磷酸化。當(dāng)Mas受體被阻斷或PI3K的活性被抑制時(shí)，Ang-(1-7)對(duì)PI3K/Akt通路的激活作用以及對(duì)eNOS磷酸化的促進(jìn)作用均受到明顯抑制。在NO含量與NOS活性方面，前文已述及，Ang-(1-7)處理組大鼠孤束核組織和孤束核神經(jīng)元細(xì)胞中NO含量和NOS活性顯著增加。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這種增加與PI3K/Akt通路的激活密切相關(guān)。在A-779+Ang-(1-7)處理組和