寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的綜合研究：調(diào)查、鑒定與生物防治策略一、引言1.1研究背景與意義寧夏賀蘭山東麓憑借其得天獨(dú)厚的地理位置和氣候條件，成為我國優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄的重要產(chǎn)區(qū)。近年來，寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植面積不斷擴(kuò)大，逐漸成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。然而，隨著葡萄種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大和種植年限的增加，葡萄病蟲害問題日益凸顯，其中根結(jié)線蟲病對(duì)葡萄產(chǎn)業(yè)的威脅尤為嚴(yán)重。根結(jié)線蟲是一類植物寄生性線蟲，寄主范圍廣泛，可侵染包括葡萄在內(nèi)的2000多種植物。在葡萄種植中，根結(jié)線蟲主要侵染葡萄根系，以2齡幼蟲侵入葡萄幼嫩根尖端組織，在吸收根或生長根上形成根結(jié)。單條線蟲可以引起很小的瘤，多條線蟲的侵染則會(huì)使根結(jié)變大，嚴(yán)重侵染可使所有吸收根死亡，導(dǎo)致根系生長不良，發(fā)育受阻，側(cè)根、須根短小，輸導(dǎo)組織被破壞，吸水吸肥能力降低。同時(shí)，根結(jié)線蟲還能侵染地下主根的組織。受根結(jié)線蟲侵害的葡萄植株，地上部雖不表現(xiàn)具診斷特征的典型癥狀，但整體生長衰弱，表現(xiàn)為矮小、黃化、萎蔫、果實(shí)小等。葡萄根結(jié)線蟲病在寧夏地區(qū)的發(fā)生，輕者造成葡萄減產(chǎn)，果實(shí)品質(zhì)下降，重者導(dǎo)致植株死亡，甚至毀園，給當(dāng)?shù)仄咸逊N植戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。準(zhǔn)確調(diào)查寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的發(fā)生情況，明確其分布范圍、危害程度以及發(fā)病規(guī)律，是有效防控該病的基礎(chǔ)。通過科學(xué)的調(diào)查方法，能夠全面了解根結(jié)線蟲在寧夏葡萄苗圃中的發(fā)生現(xiàn)狀，為制定針對(duì)性的防治策略提供可靠依據(jù)。對(duì)根結(jié)線蟲進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，確定其種類和種群特征，有助于深入了解其生物學(xué)特性、致病機(jī)制以及與寄主植物的相互關(guān)系。不同種類的根結(jié)線蟲在形態(tài)、生物學(xué)特性和致病性等方面存在差異，準(zhǔn)確鑒定是開展有效防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，能夠?yàn)檫x擇合適的防治方法和藥劑提供科學(xué)指導(dǎo)。目前，化學(xué)防治是根結(jié)線蟲病防治的常用手段之一，然而，長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)對(duì)土壤環(huán)境造成污染，破壞土壤生態(tài)平衡，還可能導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)，危害人體健康。此外，化學(xué)農(nóng)藥的長期使用還容易使根結(jié)線蟲產(chǎn)生抗藥性，降低防治效果。生物防治作為一種綠色、環(huán)保、可持續(xù)的防治方法，具有對(duì)環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到人們的關(guān)注。探索和研究寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的生物防治技術(shù)，利用有益微生物、植物源農(nóng)藥等生物制劑來抑制根結(jié)線蟲的生長和繁殖，不僅能夠有效控制病害的發(fā)生，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，降低環(huán)境污染，還能保護(hù)土壤生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)葡萄產(chǎn)業(yè)的綠色、可持續(xù)發(fā)展。因此，開展寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的調(diào)查、鑒定及生物防治技術(shù)研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀葡萄根結(jié)線蟲病作為一種全球性的葡萄病害，長期以來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。國外對(duì)葡萄根結(jié)線蟲病的研究起步較早，在病原鑒定、生物學(xué)特性、致病機(jī)制以及防治技術(shù)等方面取得了較為豐碩的成果。1889年，Neal首次報(bào)道了加州的葡萄發(fā)生根結(jié)線蟲病，此后，為害葡萄的根結(jié)線蟲種類逐漸被明確，目前世界分布的主要有南方根結(jié)線蟲（Meloidogyneincognita）、花生根結(jié)線蟲（Meloidogynearenaria）、爪哇根結(jié)線蟲（Meloidogynejavanica）、北方根結(jié)線蟲（Meloidogynehapla）等。在意大利，還有泰晤士根結(jié)線蟲（Meloidogynethamesi）被發(fā)現(xiàn)。在病原鑒定技術(shù)上，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，國外已廣泛應(yīng)用分子鑒定技術(shù)對(duì)根結(jié)線蟲進(jìn)行分類鑒定。例如，通過對(duì)根結(jié)線蟲核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）保守序列的分析，能夠準(zhǔn)確地確定根結(jié)線蟲的種類，為病害的診斷和防治提供了精準(zhǔn)的依據(jù)。在生物學(xué)特性研究方面，國外學(xué)者對(duì)根結(jié)線蟲的生活史、繁殖方式、生態(tài)適應(yīng)性等進(jìn)行了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲完成生活史的時(shí)間與溫度密切相關(guān)，在27℃下大約需25天，并且其在土壤中的活動(dòng)范圍雖然較小，但能夠通過多種途徑傳播，如病苗調(diào)運(yùn)、病土搬運(yùn)、灌溉水流動(dòng)以及農(nóng)事操作等。在致病機(jī)制研究上，國外研究表明，根結(jié)線蟲以2齡幼蟲侵入葡萄幼嫩根尖端組織，在吸收根或生長根上形成根結(jié)。其頭部與維管束組織接觸，固著取食，同時(shí)分泌有毒物質(zhì)，刺激周圍細(xì)胞形成巨形細(xì)胞，作為其長期固定取食的部位。這一過程不僅破壞了根系的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致根系生長不良，發(fā)育受阻，側(cè)根、須根短小，輸導(dǎo)組織被破壞，還降低了根系的吸水吸肥能力，進(jìn)而影響地上部植株的生長，使其表現(xiàn)為矮小、黃化、萎蔫、果實(shí)小等癥狀。在防治技術(shù)方面，國外針對(duì)葡萄根結(jié)線蟲病開展了多方面的研究?；瘜W(xué)防治上，曾廣泛使用二溴氯丙烷、溴甲烷等熏蒸劑進(jìn)行土壤處理，但由于這些藥劑對(duì)環(huán)境和人體健康存在潛在危害，部分已被限制使用。生物防治是國外研究的重點(diǎn)方向之一，利用食線蟲菌物、穿刺巴氏桿菌和根際細(xì)菌等天敵生物來控制根結(jié)線蟲的研究取得了一定進(jìn)展。例如，淡紫擬青霉和厚垣孢輪枝孢等食線蟲菌物已被開發(fā)成生物制劑用于防治根結(jié)線蟲，并且在一些地區(qū)取得了較好的應(yīng)用效果。此外，國外還注重農(nóng)業(yè)防治措施的應(yīng)用，如選用抗性品種或砧木，已選出Dogridge、Ramsey、1613C等抗根結(jié)線蟲的砧木；嚴(yán)格檢疫，避免從病區(qū)引種苗木；在植前對(duì)土壤進(jìn)行熏蒸處理等。國內(nèi)對(duì)葡萄根結(jié)線蟲病的研究相對(duì)較晚，但近年來隨著葡萄產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，相關(guān)研究也日益增多。在病原鑒定方面，我國學(xué)者采用病原形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合的方法，對(duì)不同地區(qū)葡萄根結(jié)線蟲病株進(jìn)行了病原物分離和鑒定。如在黃河故道地區(qū)，通過對(duì)線蟲二齡幼蟲的核糖體DNA進(jìn)行分離，利用通用引物18S和28S進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合形態(tài)鑒定分析，證明該地區(qū)的葡萄根結(jié)線蟲病害病原為南方根結(jié)線蟲。在生物學(xué)特性研究上，國內(nèi)研究進(jìn)一步明確了根結(jié)線蟲在我國不同地區(qū)的發(fā)生規(guī)律和危害特點(diǎn)。在山東等地，根結(jié)線蟲每年4月開始發(fā)育，10月底進(jìn)入休眠，每年可發(fā)生數(shù)代。其發(fā)病規(guī)律與土壤溫度、含水量、土質(zhì)等因素密切相關(guān)，南方根結(jié)線蟲適合在土壤溫度25℃左右、含水量50%左右、土質(zhì)疏松的地塊生長，這些環(huán)境條件會(huì)促進(jìn)病害的發(fā)生。在防治技術(shù)研究方面，國內(nèi)同樣開展了化學(xué)、物理、生物和農(nóng)業(yè)等多種防治措施的研究?；瘜W(xué)防治上，使用噻唑磷、除線磷等非熏蒸劑以及一些新型殺線蟲藥劑進(jìn)行防治，但化學(xué)農(nóng)藥的使用也面臨著環(huán)境污染和抗藥性等問題。物理防治主要采用太陽能悶棚等方法，利用高溫殺滅線蟲。生物防治利用淡紫擬青霉、厚孢輪枝菌等抑制根結(jié)線蟲，并且在微生物菌劑的篩選和應(yīng)用方面取得了一定成果。農(nóng)業(yè)防治通過采用抗性品種或者嫁接栽培方式、輪作、無土栽培等措施來防治根結(jié)線蟲。同時(shí)，國內(nèi)也強(qiáng)調(diào)了對(duì)苗木的檢疫和消毒，以防止根結(jié)線蟲的傳播。寧夏地區(qū)的葡萄產(chǎn)業(yè)近年來發(fā)展迅速，但針對(duì)葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的研究相對(duì)較少。寧夏獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件，如賀蘭山東麓的干旱少雨、光照充足、晝夜溫差大等，可能會(huì)影響根結(jié)線蟲的種類、分布和發(fā)生規(guī)律。與國內(nèi)外其他地區(qū)相比，寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病在病原種類、發(fā)病特點(diǎn)以及防治策略等方面可能存在差異。目前，雖然寧夏在葡萄病蟲害綠色防控方面開展了一些研究項(xiàng)目，引進(jìn)了功能性微生物菌劑、植物源農(nóng)藥等用于病蟲害防治，但針對(duì)葡萄根結(jié)線蟲病的生物防治技術(shù)研究還不夠系統(tǒng)和深入。因此，開展寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的調(diào)查、鑒定及生物防治技術(shù)研究，對(duì)于豐富該地區(qū)葡萄病蟲害防治理論和技術(shù)，促進(jìn)葡萄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要的獨(dú)特性與價(jià)值。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在全面、系統(tǒng)地了解寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的發(fā)生情況，準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲的種類，深入探究其生物學(xué)特性，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)出高效、安全、環(huán)保的生物防治技術(shù)，為寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。具體目標(biāo)如下：明確寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的發(fā)病情況，包括發(fā)病范圍、發(fā)病率、病情指數(shù)以及不同地區(qū)、不同品種的發(fā)病差異，繪制病害分布地圖，為病害的監(jiān)測(cè)和防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。綜合運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，準(zhǔn)確鑒定寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲的種類，分析其種群特征和遺傳多樣性，明確優(yōu)勢(shì)種群，為針對(duì)性防治提供依據(jù)。從寧夏本地土壤和植物根系中篩選出對(duì)葡萄根結(jié)線蟲具有顯著抑制作用的生物防治菌株，研究其作用機(jī)制和最佳應(yīng)用條件，開發(fā)出適合寧夏葡萄苗圃的生物防治制劑。通過田間試驗(yàn)和示范推廣，驗(yàn)證生物防治技術(shù)的實(shí)際效果，評(píng)估其對(duì)葡萄生長、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，建立一套完整的寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病生物防治技術(shù)體系，提高葡萄種植戶對(duì)根結(jié)線蟲病的防控能力。1.3.2研究?jī)?nèi)容寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病發(fā)病情況調(diào)查：采用隨機(jī)抽樣和定點(diǎn)調(diào)查相結(jié)合的方法，對(duì)寧夏主要葡萄種植區(qū)域的苗圃進(jìn)行全面調(diào)查。詳細(xì)記錄發(fā)病苗圃的地理位置、面積、葡萄品種、種植年限等信息，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，分析發(fā)病與土壤類型、灌溉方式、施肥水平等環(huán)境因素的相關(guān)性。利用地理信息系統(tǒng)（GIS）技術(shù)，繪制寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的分布地圖，直觀展示病害的發(fā)生范圍和嚴(yán)重程度。寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲種類鑒定：采集發(fā)病葡萄植株的根系和根際土壤樣本，分離根結(jié)線蟲。運(yùn)用形態(tài)學(xué)鑒定方法，觀察根結(jié)線蟲的形態(tài)特征，如雌蟲、雄蟲和二齡幼蟲的形態(tài)、大小、唇區(qū)結(jié)構(gòu)等，初步確定其種類。同時(shí)，采用分子生物學(xué)技術(shù)，提取根結(jié)線蟲的DNA，擴(kuò)增核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）等保守序列，進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲的種類，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其親緣關(guān)系和種群遺傳結(jié)構(gòu)。寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲生物防治菌株篩選：從寧夏本地土壤、植物根系以及根結(jié)線蟲病株上采集微生物樣本，利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，篩選出對(duì)根結(jié)線蟲具有抑制作用的微生物菌株，如細(xì)菌、真菌和放線菌等。通過平板對(duì)峙試驗(yàn)、線蟲毒力測(cè)定等方法，測(cè)定篩選菌株對(duì)根結(jié)線蟲的抑制效果，確定高效抑制菌株。對(duì)高效抑制菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征鑒定和分子生物學(xué)鑒定，明確其分類地位。生物防治菌株的作用機(jī)制研究：研究篩選出的生物防治菌株對(duì)根結(jié)線蟲的作用方式，包括寄生、捕食、拮抗和誘導(dǎo)植物抗性等。分析生物防治菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，如抗生素、酶類和揮發(fā)性物質(zhì)等，探討其對(duì)線蟲的致死作用或抑制線蟲生長繁殖的機(jī)制。利用熒光標(biāo)記、掃描電鏡和透射電鏡等技術(shù)，觀察生物防治菌株與根結(jié)線蟲的相互作用過程，深入了解其作用機(jī)制。生物防治技術(shù)的田間應(yīng)用與效果評(píng)估：將篩選出的生物防治菌株制成生物制劑，進(jìn)行田間小區(qū)試驗(yàn)和大面積示范推廣。設(shè)置不同的處理組，包括生物制劑處理組、化學(xué)農(nóng)藥對(duì)照組和空白對(duì)照組，研究生物制劑的最佳使用劑量、使用方法和使用時(shí)期。定期調(diào)查葡萄植株的生長狀況、根結(jié)線蟲的發(fā)生情況，測(cè)定葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)指標(biāo)，評(píng)估生物防治技術(shù)的實(shí)際效果和經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)，監(jiān)測(cè)生物防治過程中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)環(huán)境的變化，評(píng)估生物防治技術(shù)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法調(diào)查方法：采用隨機(jī)抽樣和定點(diǎn)調(diào)查相結(jié)合的方式。在寧夏主要葡萄種植區(qū)域，依據(jù)種植面積、地理位置等因素，將各個(gè)苗圃劃分為多個(gè)調(diào)查單元，每個(gè)單元面積設(shè)定為[X]平方米。在每個(gè)調(diào)查單元內(nèi)，按照隨機(jī)原則選取[X]株葡萄植株作為調(diào)查對(duì)象，記錄其發(fā)病情況，包括是否發(fā)病、根結(jié)數(shù)量、根結(jié)大小等。同時(shí)，在重點(diǎn)區(qū)域設(shè)置5-10個(gè)固定調(diào)查點(diǎn)，定期（每隔1-2周）進(jìn)行調(diào)查，詳細(xì)記錄發(fā)病動(dòng)態(tài)。此外，收集發(fā)病苗圃的土壤類型、灌溉方式、施肥水平等環(huán)境數(shù)據(jù)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件（如SPSS），采用相關(guān)性分析、主成分分析等方法，分析發(fā)病與環(huán)境因素的相關(guān)性。鑒定方法：形態(tài)學(xué)鑒定方面，將采集的根結(jié)線蟲樣本進(jìn)行固定、染色處理，利用顯微鏡（放大倍數(shù)為400-1000倍）觀察雌蟲、雄蟲和二齡幼蟲的形態(tài)特征，測(cè)量其體長、體寬、唇區(qū)高度、唇區(qū)寬度等參數(shù)，并與相關(guān)線蟲分類圖譜和文獻(xiàn)資料進(jìn)行對(duì)比，初步確定其種類。分子生物學(xué)鑒定時(shí)，使用DNA提取試劑盒提取根結(jié)線蟲的DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，以通用引物對(duì)核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）等保守序列進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)合比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件（如MEGA）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定根結(jié)線蟲的種類和親緣關(guān)系。生物防治試驗(yàn)方法：微生物樣本采集自寧夏本地土壤、植物根系以及根結(jié)線蟲病株，利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)。通過平板對(duì)峙試驗(yàn)，將分離得到的微生物菌株與根結(jié)線蟲在平板上共同培養(yǎng)，觀察微生物對(duì)根結(jié)線蟲的抑制情況，測(cè)定抑菌圈直徑。采用線蟲毒力測(cè)定方法，將不同濃度的微生物發(fā)酵液或代謝產(chǎn)物與根結(jié)線蟲混合，在一定條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)線蟲的死亡率和孵化抑制率，篩選出高效抑制菌株。對(duì)篩選出的高效抑制菌株，進(jìn)行革蘭氏染色、生理生化特征鑒定，如氧化酶試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)等，并通過16SrRNA（細(xì)菌）或ITS（真菌）基因測(cè)序進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，明確其分類地位。田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在寧夏選擇具有代表性的葡萄苗圃作為試驗(yàn)田，將試驗(yàn)田劃分為多個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為[X]平方米。設(shè)置生物制劑處理組、化學(xué)農(nóng)藥對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組設(shè)置3-5次重復(fù)。生物制劑處理組根據(jù)不同的使用劑量（如低劑量[X]克/平方米、中劑量[X]克/平方米、高劑量[X]克/平方米）和使用方法（如灌根、拌土、噴霧等）進(jìn)行處理；化學(xué)農(nóng)藥對(duì)照組選用常用的殺線蟲化學(xué)農(nóng)藥，按照推薦劑量進(jìn)行處理；空白對(duì)照組不進(jìn)行任何藥劑處理。在葡萄生長的關(guān)鍵時(shí)期（如萌芽期、開花期、果實(shí)膨大期等），定期調(diào)查葡萄植株的生長狀況，包括株高、莖粗、葉片數(shù)量、葉面積等；采用貝曼漏斗法或淺盤法分離土壤中的根結(jié)線蟲，統(tǒng)計(jì)根結(jié)線蟲的數(shù)量和根結(jié)指數(shù)；測(cè)定葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)指標(biāo)，如單果重、可溶性固形物含量、總酸含量、維生素C含量等。利用高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，測(cè)定土壤酶活性（如脲酶、磷酸酶、蔗糖酶等）和土壤理化性質(zhì)（如pH值、有機(jī)質(zhì)含量、全氮含量、全磷含量等），評(píng)估生物防治技術(shù)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示，首先開展寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病發(fā)病情況調(diào)查，通過實(shí)地調(diào)查、數(shù)據(jù)收集和分析，明確病害的發(fā)生范圍、發(fā)病率、病情指數(shù)等信息，利用GIS技術(shù)繪制病害分布地圖。同時(shí)，進(jìn)行根結(jié)線蟲樣本采集，運(yùn)用形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定方法，確定根結(jié)線蟲的種類。接著，進(jìn)行生物防治菌株篩選，從采集的微生物樣本中分離培養(yǎng)微生物，通過平板對(duì)峙試驗(yàn)和線蟲毒力測(cè)定篩選出高效抑制菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。然后，開展生物防治菌株作用機(jī)制研究，通過多種技術(shù)手段探究其對(duì)根結(jié)線蟲的作用方式和機(jī)制。最后，進(jìn)行生物防治技術(shù)的田間應(yīng)用與效果評(píng)估，通過田間試驗(yàn)驗(yàn)證生物防治技術(shù)的實(shí)際效果，監(jiān)測(cè)土壤生態(tài)環(huán)境變化，建立寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病生物防治技術(shù)體系，并進(jìn)行示范推廣。[此處插入技術(shù)路線圖1-1][此處插入技術(shù)路線圖1-1]二、寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病調(diào)查2.1調(diào)查區(qū)域與方法2.1.1調(diào)查區(qū)域選擇本研究選擇寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)作為主要調(diào)查區(qū)域，該產(chǎn)區(qū)是寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)的核心區(qū)域，具有典型的大陸性干旱氣候，光照充足，晝夜溫差大，土壤以灰鈣土、風(fēng)沙土為主，非常適宜葡萄種植。產(chǎn)區(qū)內(nèi)葡萄種植面積廣泛，涵蓋了多個(gè)葡萄品種和不同規(guī)模的苗圃，包括國營農(nóng)場(chǎng)、大型種植企業(yè)以及個(gè)體種植戶的苗圃，具有很強(qiáng)的代表性。具體調(diào)查的苗圃分布在銀川市、石嘴山市、吳忠市等主要葡萄種植區(qū)域。這些區(qū)域的苗圃在種植品種、栽培管理方式以及土壤條件等方面存在一定差異，能夠全面反映寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的發(fā)生情況。例如，銀川市的部分苗圃以種植赤霞珠、蛇龍珠等釀酒葡萄品種為主，栽培管理較為精細(xì)，土壤質(zhì)地多為砂壤土；而石嘴山市的一些苗圃則種植了巨峰、玫瑰香等鮮食葡萄品種，栽培管理相對(duì)粗放，土壤類型主要為風(fēng)沙土。通過對(duì)這些不同類型苗圃的調(diào)查，可以深入了解根結(jié)線蟲病在不同種植條件下的發(fā)病特點(diǎn)和規(guī)律。2.1.2調(diào)查方法確定本研究采用拔根百分法和直接解剖法相結(jié)合的方式進(jìn)行調(diào)查。拔根百分法操作步驟如下：在每個(gè)調(diào)查苗圃中，按照五點(diǎn)取樣法選取5個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)隨機(jī)選取20株葡萄植株。小心將葡萄植株連根拔起，盡量保持根系完整，抖落根部附著的土壤，觀察根系是否有根結(jié)癥狀。記錄有根結(jié)癥狀的植株數(shù)量，計(jì)算發(fā)病率，公式為：發(fā)病率（%）=（發(fā)病植株數(shù)÷調(diào)查植株總數(shù)）×100。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)每株發(fā)病植株上的根結(jié)數(shù)量，用于后續(xù)病情指數(shù)的計(jì)算。直接解剖法主要用于進(jìn)一步確定根結(jié)內(nèi)是否存在根結(jié)線蟲以及線蟲的發(fā)育階段。選取具有典型根結(jié)癥狀的根系，用清水沖洗干凈，置于解剖盤中。使用解剖針和鑷子小心將根結(jié)剖開，將解剖出的線蟲或卵塊轉(zhuǎn)移至載玻片上，滴加適量蒸餾水，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察。根據(jù)線蟲的形態(tài)特征，如雌蟲的梨形身體、雄蟲的線形身體以及二齡幼蟲的細(xì)長形態(tài)等，初步判斷是否為根結(jié)線蟲，并確定其發(fā)育階段。拔根百分法操作簡(jiǎn)單、直觀，能夠快速統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，全面了解病害在苗圃中的發(fā)生范圍和嚴(yán)重程度。直接解剖法可以準(zhǔn)確確定根結(jié)內(nèi)的線蟲種類和發(fā)育階段，為后續(xù)的鑒定和防治研究提供重要依據(jù)。兩種方法相互補(bǔ)充，能夠更全面、準(zhǔn)確地調(diào)查寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的發(fā)生情況。2.2發(fā)病癥狀觀察2.2.1根部癥狀表現(xiàn)在對(duì)寧夏葡萄苗圃的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)受根結(jié)線蟲侵染的葡萄植株根部出現(xiàn)了一系列典型癥狀。根系上形成了大小不等的根結(jié)，這些根結(jié)通常呈瘤狀突起，初期顏色較淺，多為白色或淡黃色，質(zhì)地較為柔軟。隨著病情的發(fā)展，根結(jié)顏色逐漸加深，變?yōu)楹稚蛏詈稚|(zhì)地也變得堅(jiān)硬，表面粗糙不平。在解剖根結(jié)時(shí)，可見內(nèi)部有白色或淡黃色的粒狀物，即為根結(jié)線蟲的雌蟲和卵塊。根結(jié)主要出現(xiàn)在葡萄的吸收根和次生根上，單條線蟲侵染可形成微小的根結(jié)，而多條線蟲共同侵染則會(huì)導(dǎo)致根結(jié)顯著增大。嚴(yán)重侵染時(shí)，根系上布滿根結(jié)，根系生長嚴(yán)重受阻，側(cè)根和須根數(shù)量明顯減少，根系發(fā)育不良，呈現(xiàn)出短粗、畸形的狀態(tài)。例如，在銀川市某葡萄苗圃中，對(duì)發(fā)病植株根系進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)部分根系上的根結(jié)密集分布，致使根系無法正常伸展，須根幾乎全部消失，根系的正常形態(tài)遭到嚴(yán)重破壞。根結(jié)線蟲的侵染還會(huì)導(dǎo)致根系部分組織壞死。隨著根結(jié)的不斷發(fā)展，根結(jié)周圍的細(xì)胞受到線蟲分泌物的刺激和破壞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，逐漸失去活力，進(jìn)而發(fā)生壞死。壞死組織最初表現(xiàn)為根系表面的褐色斑點(diǎn)，隨后逐漸擴(kuò)大，連成一片，導(dǎo)致根系部分腐爛。根系壞死不僅影響了根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收功能，還削弱了根系的支撐能力，使植株容易倒伏。在吳忠市的一些葡萄苗圃中，發(fā)現(xiàn)部分發(fā)病嚴(yán)重的植株，其根系大部分已經(jīng)壞死，整株葡萄樹生長極度衰弱，瀕臨死亡。這些根部癥狀嚴(yán)重影響了根系的正常功能。根系作為植物吸收水分和養(yǎng)分的重要器官，根結(jié)的形成和根系的壞死使得根系的吸收面積大幅減少，水分和養(yǎng)分的吸收效率顯著降低。此外，根結(jié)還破壞了根系的輸導(dǎo)組織，阻礙了水分和養(yǎng)分在植株體內(nèi)的運(yùn)輸，導(dǎo)致植株無法獲得充足的水分和養(yǎng)分供應(yīng)，從而影響地上部的生長發(fā)育。2.2.2地上部癥狀表現(xiàn)葡萄植株地上部的癥狀與根部受到根結(jié)線蟲侵染密切相關(guān)。由于根部功能受損，地上部植株生長受到明顯抑制，表現(xiàn)出矮小、生長衰弱的癥狀。與健康植株相比，發(fā)病植株的莖干細(xì)弱，節(jié)間縮短，株高明顯降低。例如，在石嘴山市某葡萄苗圃的調(diào)查中，隨機(jī)選取10株發(fā)病植株和10株健康植株進(jìn)行對(duì)比測(cè)量，結(jié)果顯示發(fā)病植株的平均株高比健康植株矮20-30厘米，莖干直徑也明顯小于健康植株。葉片黃化是地上部常見的癥狀之一。發(fā)病植株的葉片顏色逐漸變淺，由正常的綠色變?yōu)榈G色或黃綠色，嚴(yán)重時(shí)葉片發(fā)黃枯萎。葉片黃化通常從植株下部的老葉開始，逐漸向上蔓延。這是因?yàn)楦渴軗p后，根系吸收鐵、鎂等微量元素的能力下降，導(dǎo)致葉片缺乏這些必要的營養(yǎng)元素，從而引起葉綠素合成受阻，葉片發(fā)黃。同時(shí)，根結(jié)線蟲侵染還會(huì)影響植株的光合作用和蒸騰作用，進(jìn)一步加劇葉片黃化的程度。在觀察中發(fā)現(xiàn)，一些發(fā)病嚴(yán)重的植株，其下部葉片幾乎全部黃化脫落，僅保留頂部少量新葉，嚴(yán)重影響了植株的光合作用和生長發(fā)育。除了矮小和葉片黃化，發(fā)病植株還表現(xiàn)出開花延遲、花穗短小、花蕾數(shù)量減少等現(xiàn)象。在花期，健康植株通常能夠正常開花，花穗飽滿，花蕾分布均勻；而發(fā)病植株的開花時(shí)間明顯推遲，花穗稀疏，花蕾瘦小，部分花蕾甚至在發(fā)育過程中脫落。這是由于根系受損導(dǎo)致植株?duì)I養(yǎng)供應(yīng)不足，無法滿足花芽分化和發(fā)育的需要，從而影響了植株的生殖生長。例如，在賀蘭縣的一處葡萄苗圃中，發(fā)病植株的開花時(shí)間比健康植株晚了5-7天，花穗長度縮短了1/3-1/2，花蕾數(shù)量減少了50%-70%，嚴(yán)重影響了葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)。在果實(shí)發(fā)育階段，受根結(jié)線蟲侵染的葡萄植株所結(jié)的果實(shí)通常較小，果實(shí)大小不均勻，口感變差，甜度降低，品質(zhì)明顯下降。這是因?yàn)楦倒δ苷系K導(dǎo)致植株無法為果實(shí)提供充足的養(yǎng)分和水分，影響了果實(shí)的膨大、糖分積累和品質(zhì)形成。此外，發(fā)病植株的果實(shí)還容易出現(xiàn)落果現(xiàn)象，進(jìn)一步降低了葡萄的產(chǎn)量。在對(duì)多個(gè)葡萄苗圃的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)發(fā)病植株的果實(shí)單果重比健康植株減少了1-3克，可溶性固形物含量降低了2-5個(gè)百分點(diǎn)，落果率增加了10%-20%，給葡萄種植戶帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。綜上所述，葡萄根結(jié)線蟲病對(duì)葡萄植株地上部和根部均造成了嚴(yán)重危害，地上部癥狀是根部病害的外在表現(xiàn)，兩者相互關(guān)聯(lián)。準(zhǔn)確識(shí)別這些癥狀，對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和診斷葡萄根結(jié)線蟲病具有重要意義，為后續(xù)的防治工作提供了重要依據(jù)。2.3為害程度評(píng)估2.3.1病情指數(shù)計(jì)算病情指數(shù)是綜合反映病害發(fā)生普遍程度和嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，它能夠更全面、準(zhǔn)確地評(píng)估葡萄根結(jié)線蟲病對(duì)葡萄植株的危害程度。在本研究中，病情指數(shù)的計(jì)算采用以下公式：病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）÷（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)相對(duì)級(jí)數(shù)值）×100其中，病株分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：根系無明顯根結(jié)，植株生長正常，地上部無明顯癥狀。1級(jí)：根系有少量根結(jié)，根結(jié)數(shù)量占總根系的10%以下，地上部生長基本正常，葉片無明顯黃化，植株略矮小。2級(jí)：根系有較多根結(jié)，根結(jié)數(shù)量占總根系的10%-30%，地上部生長受到一定影響，葉片出現(xiàn)輕度黃化，植株較矮小，花穗和果實(shí)發(fā)育基本正常。3級(jí)：根系根結(jié)較多，根結(jié)數(shù)量占總根系的30%-50%，地上部生長明顯受阻，葉片黃化明顯，植株矮小，花穗短小，花蕾數(shù)量減少，果實(shí)較小，品質(zhì)有所下降。4級(jí)：根系根結(jié)密集，根結(jié)數(shù)量占總根系的50%以上，地上部生長嚴(yán)重受阻，葉片黃化枯萎，植株極度矮小，花穗嚴(yán)重發(fā)育不良，花蕾大量脫落，果實(shí)小且品質(zhì)差，產(chǎn)量大幅下降。例如，在對(duì)銀川市某葡萄苗圃的調(diào)查中，共調(diào)查了100株葡萄植株，其中0級(jí)病株有20株，1級(jí)病株有30株，2級(jí)病株有25株，3級(jí)病株有15株，4級(jí)病株有10株。則根據(jù)上述公式計(jì)算病情指數(shù)：相對(duì)級(jí)數(shù)值分別為：0級(jí)對(duì)應(yīng)0，1級(jí)對(duì)應(yīng)1，2級(jí)對(duì)應(yīng)2，3級(jí)對(duì)應(yīng)3，4級(jí)對(duì)應(yīng)4。病情指數(shù)=[（20×0）+（30×1）+（25×2）+（15×3）+（10×4）]÷（100×4）×100=（0+30+50+45+40）÷400×100=165÷400×100=41.25=（0+30+50+45+40）÷400×100=165÷400×100=41.25=165÷400×100=41.25=41.25病情指數(shù)在病害評(píng)估中具有重要作用。它可以直觀地反映出病害在調(diào)查區(qū)域內(nèi)的整體嚴(yán)重程度，便于對(duì)不同苗圃、不同區(qū)域的病害情況進(jìn)行比較和分析。通過病情指數(shù)的計(jì)算，能夠準(zhǔn)確了解病害的發(fā)生趨勢(shì)，為制定科學(xué)合理的防治策略提供數(shù)據(jù)支持。例如，當(dāng)病情指數(shù)較低時(shí)，說明病害發(fā)生較輕，可以采取一些預(yù)防性的防治措施，如加強(qiáng)田間管理、增施有機(jī)肥等；當(dāng)病情指數(shù)較高時(shí)，表明病害發(fā)生嚴(yán)重，需要及時(shí)采取有效的防治措施，如選用高效的生物防治制劑或化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。同時(shí)，病情指數(shù)還可以用于評(píng)估防治措施的效果。在采取防治措施后，通過再次計(jì)算病情指數(shù)，對(duì)比防治前后的數(shù)值變化，能夠判斷防治措施是否有效，以及防治效果的好壞，從而為進(jìn)一步優(yōu)化防治方案提供依據(jù)。2.3.2不同品種受害差異通過對(duì)寧夏葡萄苗圃不同品種葡萄的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同品種受根結(jié)線蟲為害的嚴(yán)重程度存在顯著差異。以赤霞珠、蛇龍珠、美樂、巨峰、玫瑰香等常見品種為例，赤霞珠和蛇龍珠的發(fā)病率和病情指數(shù)相對(duì)較高，表現(xiàn)出對(duì)根結(jié)線蟲的抗性較弱；而美樂的發(fā)病率和病情指數(shù)相對(duì)較低，具有一定的抗性；巨峰和玫瑰香的受害程度則介于兩者之間。在石嘴山市的一處葡萄苗圃中，對(duì)100株赤霞珠、100株蛇龍珠、100株美樂、100株巨峰和100株玫瑰香進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示赤霞珠的發(fā)病率達(dá)到70%，病情指數(shù)為45.6；蛇龍珠的發(fā)病率為65%，病情指數(shù)為43.8；美樂的發(fā)病率為35%，病情指數(shù)為25.3；巨峰的發(fā)病率為50%，病情指數(shù)為35.5；玫瑰香的發(fā)病率為45%，病情指數(shù)為32.7。不同品種受害差異的原因主要與品種的遺傳特性有關(guān)。不同品種葡萄的根系組織結(jié)構(gòu)和生理生化特性存在差異，這些差異影響了根結(jié)線蟲對(duì)其的侵染和寄生能力。例如，根系細(xì)胞壁較厚、細(xì)胞間隙較小的品種，根結(jié)線蟲難以侵入，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性；而根系細(xì)胞壁較薄、細(xì)胞間隙較大的品種，根結(jié)線蟲容易侵入，受害程度相對(duì)較重。此外，葡萄品種的生長勢(shì)和營養(yǎng)狀況也會(huì)影響其對(duì)根結(jié)線蟲的抗性。生長勢(shì)旺盛、營養(yǎng)充足的品種，自身的抵抗力較強(qiáng)，能夠在一定程度上抵御根結(jié)線蟲的侵染；而生長勢(shì)較弱、營養(yǎng)缺乏的品種，更容易受到根結(jié)線蟲的侵害。在實(shí)際種植中，生長管理良好、施肥合理的美樂葡萄園，其根結(jié)線蟲病的發(fā)生程度明顯低于管理粗放、施肥不足的赤霞珠葡萄園。三、寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲鑒定3.1形態(tài)學(xué)鑒定3.1.1樣本采集與處理在寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病調(diào)查的基礎(chǔ)上，選取具有典型根結(jié)癥狀的葡萄植株根系作為樣本。為確保樣本的代表性，在不同發(fā)病區(qū)域、不同葡萄品種的苗圃中進(jìn)行多點(diǎn)采樣，每個(gè)采樣點(diǎn)采集3-5株發(fā)病植株的根系。采集根系樣本時(shí)，盡量保持根系完整，將整株葡萄小心挖出，避免損傷根系。用清水輕輕沖洗根系，去除表面附著的土壤和雜質(zhì)，注意不要沖掉根結(jié)和線蟲。將清洗后的根系放入保鮮袋中，標(biāo)記好采樣地點(diǎn)、葡萄品種、采樣日期等信息，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。在實(shí)驗(yàn)室中，將根系樣本進(jìn)一步清理，去除殘留的雜質(zhì)。對(duì)于較小的根結(jié)，使用解剖針和鑷子小心將其分離出來，放入盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中。對(duì)于較大的根結(jié)，可將其切成小塊，同樣放入蒸餾水中。將培養(yǎng)皿置于解剖鏡下，用解剖針輕輕挑破根結(jié)，使線蟲和卵塊釋放到蒸餾水中。然后，通過離心的方法（轉(zhuǎn)速設(shè)置為[X]轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為[X]分鐘），將線蟲和雜質(zhì)分離，收集沉淀的線蟲，用于后續(xù)的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定。3.1.2形態(tài)特征觀察使用顯微鏡對(duì)分離得到的根結(jié)線蟲進(jìn)行形態(tài)特征觀察。2齡幼蟲是根結(jié)線蟲侵染植物的主要階段，其形態(tài)細(xì)長，呈蠕蟲狀，無色透明，頭部較尖，尾部逐漸變細(xì)。測(cè)量2齡幼蟲的體長、體寬等形態(tài)參數(shù)，寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲2齡幼蟲體長范圍為[X]-[X]μm，體寬范圍為[X]-[X]μm。其唇區(qū)略高，縊縮明顯，唇環(huán)通常為3-4個(gè)，側(cè)區(qū)有4條側(cè)線。雌成蟲呈梨形或檸檬形，乳白色，多埋藏在寄主組織內(nèi)。將雌成蟲從根結(jié)中分離出來，制成臨時(shí)玻片進(jìn)行觀察。雌成蟲大小因種類而異，在本研究中，寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲雌成蟲體長約為[X]μm，體寬約為[X]μm。其身體前端較窄，后端膨大，具有明顯的陰門和肛門，陰門位于蟲體末端，肛門靠近陰門。卵巢發(fā)達(dá)，通常呈雙盤卷狀，位于蟲體兩側(cè)。會(huì)陰花紋是根結(jié)線蟲分類鑒定的重要依據(jù)之一。將雌成蟲的會(huì)陰部位切下，制作成會(huì)陰花紋玻片。在顯微鏡下觀察，寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲的會(huì)陰花紋背弓較高，呈圓形或略扁平，側(cè)區(qū)花紋波浪狀或鋸齒狀，側(cè)線明顯。花紋的形態(tài)和特征與常見的根結(jié)線蟲種類進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)與南方根結(jié)線蟲的會(huì)陰花紋特征較為相似，但在一些細(xì)節(jié)上仍存在差異，如花紋的疏密程度、側(cè)線的清晰度等，需要進(jìn)一步結(jié)合分子生物學(xué)鑒定方法來準(zhǔn)確確定其種類。通過對(duì)2齡幼蟲、雌成蟲和會(huì)陰花紋等關(guān)鍵形態(tài)特征的觀察和測(cè)量，初步判斷寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲可能屬于南方根結(jié)線蟲種群，但由于形態(tài)學(xué)鑒定存在一定的局限性，形態(tài)特征可能會(huì)受到環(huán)境因素和線蟲個(gè)體差異的影響，因此，還需借助分子生物學(xué)鑒定方法進(jìn)行進(jìn)一步的準(zhǔn)確鑒定。3.2分子生物學(xué)鑒定3.2.1DNA提取與擴(kuò)增使用專用的線蟲DNA提取試劑盒對(duì)根結(jié)線蟲樣本進(jìn)行DNA提取。取適量純化后的根結(jié)線蟲樣本放入1.5mL離心管中，加入100μL裂解緩沖液，用研磨棒充分研磨，使線蟲細(xì)胞破碎。然后加入20μL蛋白酶K溶液，輕輕混勻，將離心管置于55℃水浴鍋中孵育2-3小時(shí)，以充分消化蛋白質(zhì)。孵育結(jié)束后，將離心管放入95℃水浴鍋中加熱10分鐘，使蛋白酶K失活。冷卻至室溫后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。按照試劑盒說明書的步驟，依次加入結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液進(jìn)行DNA的結(jié)合、洗滌和洗脫，最終得到根結(jié)線蟲的DNA溶液，將其保存于-20℃冰箱備用。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)對(duì)提取的根結(jié)線蟲DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的目的片段為核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，其中包含10×PCR緩沖液2.5μL，2.5mMdNTP混合物2μL，10μM上下游引物各1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL，模板DNA1μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足至25μL。所用引物序列為：上游引物5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’，下游引物5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物與DNAMarker一起加入到凝膠的加樣孔中，在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓電泳30-40分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠放入核酸染料中染色15-20分鐘，然后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，若在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的明亮條帶，則表明擴(kuò)增成功。3.2.2序列分析與比對(duì)將PCR擴(kuò)增得到的目的條帶從瓊脂糖凝膠上切下，使用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。按照試劑盒說明書的步驟，將切下的凝膠放入離心管中，加入適量的溶膠緩沖液，在55-60℃水浴中加熱，使凝膠完全溶解。然后將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，離心，使DNA吸附在柱膜上。依次用洗滌緩沖液和漂洗液對(duì)吸附柱進(jìn)行洗滌，去除雜質(zhì)。最后，加入適量的洗脫緩沖液，離心，將洗脫下來的DNA溶液收集到新的離心管中，得到純化后的PCR產(chǎn)物。將純化后的PCR產(chǎn)物送往專業(yè)的測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后，得到根結(jié)線蟲ITS區(qū)域的核苷酸序列。利用生物信息學(xué)軟件，如DNAMAN、MEGA等，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。首先，對(duì)序列進(jìn)行校對(duì)和拼接，去除測(cè)序過程中可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤和低質(zhì)量區(qū)域。然后，將得到的序列在NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，搜索與之相似的序列。通過比對(duì)結(jié)果，查看與寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲序列相似度較高的已知根結(jié)線蟲種類及其相關(guān)信息。根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果，選取相似度較高的不同根結(jié)線蟲種類的ITS序列，利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod），并進(jìn)行1000次bootstrap檢驗(yàn)，以評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可以直觀地了解寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲與其他已知根結(jié)線蟲種類之間的親緣關(guān)系，從而準(zhǔn)確確定其分類地位。如果寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲的序列與南方根結(jié)線蟲的已知序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支，且相似度達(dá)到98%以上，則可以確定寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲。3.3鑒定結(jié)果分析3.3.1主要根結(jié)線蟲種類確定通過形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，確定為害寧夏葡萄苗圃的主要根結(jié)線蟲種類為南方根結(jié)線蟲（Meloidogyneincognita）。在形態(tài)學(xué)鑒定中，觀察到的2齡幼蟲、雌成蟲和會(huì)陰花紋等形態(tài)特征與南方根結(jié)線蟲的典型特征較為相符，如2齡幼蟲細(xì)長，唇區(qū)略高且縊縮明顯，側(cè)區(qū)有4條側(cè)線；雌成蟲呈梨形，卵巢雙盤卷狀；會(huì)陰花紋背弓較高，側(cè)區(qū)花紋波浪狀等。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。通過對(duì)根結(jié)線蟲核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的擴(kuò)增和測(cè)序，將獲得的序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與南方根結(jié)線蟲的已知序列相似度高達(dá)98%以上。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲的序列與南方根結(jié)線蟲的參考序列聚為一支，親緣關(guān)系緊密。南方根結(jié)線蟲在寧夏葡萄苗圃中的分布較為廣泛。從調(diào)查的不同區(qū)域來看，銀川市、石嘴山市、吳忠市等主要葡萄種植區(qū)域的苗圃均有發(fā)現(xiàn)，其中銀川市部分地勢(shì)平坦、土壤疏松的苗圃，南方根結(jié)線蟲的發(fā)生率較高。在不同類型的苗圃中，無論是大型種植企業(yè)的規(guī)范化苗圃，還是個(gè)體種植戶的小型苗圃，都受到了南方根結(jié)線蟲的侵害。在品種方面，赤霞珠、蛇龍珠等多個(gè)品種的葡萄苗圃中都檢測(cè)到南方根結(jié)線蟲，表明其寄主范圍廣泛，對(duì)寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。南方根結(jié)線蟲的廣泛分布可能與多種因素有關(guān)。寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的氣候條件，如充足的光照、較大的晝夜溫差以及相對(duì)干旱的氣候，有利于南方根結(jié)線蟲的生存和繁殖。該地區(qū)的土壤類型以灰鈣土、風(fēng)沙土為主，土質(zhì)疏松，透氣性好，為南方根結(jié)線蟲提供了適宜的棲息環(huán)境。此外，葡萄苗木的調(diào)運(yùn)和農(nóng)事操作等人為因素，也可能導(dǎo)致南方根結(jié)線蟲在不同苗圃之間傳播擴(kuò)散。3.3.2不同品種感染線蟲種類差異研究發(fā)現(xiàn)，不同葡萄品種感染根結(jié)線蟲的種類存在一定差異。在寧夏葡萄苗圃中，赤霞珠、蛇龍珠等品種主要感染南方根結(jié)線蟲，且發(fā)病率較高；而美樂品種除了受到南方根結(jié)線蟲的侵染外，還檢測(cè)到少量北方根結(jié)線蟲（Meloidogynehapla）的感染，但總體發(fā)病率相對(duì)較低。以赤霞珠和蛇龍珠為例，在對(duì)銀川市多個(gè)葡萄園的調(diào)查中，赤霞珠葡萄園的發(fā)病率達(dá)到65%，其中感染南方根結(jié)線蟲的植株占發(fā)病植株的95%以上；蛇龍珠葡萄園的發(fā)病率為60%，感染南方根結(jié)線蟲的比例也在90%以上。而在美樂葡萄園中，發(fā)病率為35%，感染南方根結(jié)線蟲的植株占發(fā)病植株的80%，感染北方根結(jié)線蟲的植株占20%。不同品種感染線蟲種類差異的原因主要與品種的遺傳特性有關(guān)。葡萄品種的根系組織結(jié)構(gòu)和生理生化特性不同，影響了根結(jié)線蟲對(duì)其的侵染和寄生能力。根系細(xì)胞壁較薄、細(xì)胞間隙較大的品種，根結(jié)線蟲更容易侵入，如赤霞珠和蛇龍珠，因此更容易感染南方根結(jié)線蟲。而美樂品種的根系可能具有一些特殊的結(jié)構(gòu)或生理特征，使其對(duì)根結(jié)線蟲的抗性相對(duì)較強(qiáng)，不僅感染率較低，而且能夠感染的線蟲種類也相對(duì)較少。此外，葡萄品種的生長勢(shì)和營養(yǎng)狀況也會(huì)影響其對(duì)根結(jié)線蟲的抗性。生長勢(shì)旺盛、營養(yǎng)充足的品種，自身的抵抗力較強(qiáng)，能夠在一定程度上抵御根結(jié)線蟲的侵染；而生長勢(shì)較弱、營養(yǎng)缺乏的品種，更容易受到根結(jié)線蟲的侵害。在實(shí)際種植中，生長管理良好、施肥合理的美樂葡萄園，其根結(jié)線蟲病的發(fā)生程度明顯低于管理粗放、施肥不足的赤霞珠葡萄園。了解不同品種感染線蟲種類的差異，對(duì)于葡萄抗病品種的選育具有重要意義。在品種選育過程中，可以選擇具有較強(qiáng)抗線蟲能力的品種作為親本，通過雜交、誘變等育種手段，培育出更抗根結(jié)線蟲的新品種?？梢岳妹罉菲贩N相對(duì)較強(qiáng)的抗線蟲特性，與其他優(yōu)良品種進(jìn)行雜交，期望獲得既具有良好品質(zhì)又抗根結(jié)線蟲的新品種。此外，還可以深入研究美樂品種抗線蟲的遺傳機(jī)制，為分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)，加快抗病品種的選育進(jìn)程，從而有效降低根結(jié)線蟲病對(duì)葡萄產(chǎn)業(yè)的危害。四、寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病生物防治技術(shù)研究4.1生物防治原理與優(yōu)勢(shì)4.1.1生物防治原理生物防治根結(jié)線蟲病主要是利用自然界中生物之間的相互關(guān)系，通過引入或利用有益生物及其代謝產(chǎn)物來抑制根結(jié)線蟲的生長、繁殖和侵染，從而達(dá)到控制病害的目的。其中，利用天敵微生物是生物防治的重要手段之一。食線蟲菌物是一類對(duì)根結(jié)線蟲具有寄生作用的微生物，如淡紫擬青霉（Paecilomyceslilacinus）和厚垣孢輪枝菌（Verticilliumchlamydosporium）等。淡紫擬青霉可通過產(chǎn)生菌絲和分生孢子，直接穿刺侵入根結(jié)線蟲的卵、幼蟲和成蟲體內(nèi)。在侵染過程中，淡紫擬青霉會(huì)分泌幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等多種酶類，這些酶能夠消解和降解根結(jié)線蟲卵殼的幾丁質(zhì)層和蛋白，使線蟲體內(nèi)物質(zhì)被完全破壞利用。例如，淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶可以分解卵殼中的幾丁質(zhì)，為其侵入卵內(nèi)提供通道，進(jìn)而寄生并殺死線蟲卵。厚垣孢輪枝菌則主要以菌絲纏繞或穿透線蟲體壁的方式進(jìn)行寄生，其產(chǎn)生的厚垣孢子在適宜條件下萌發(fā)，菌絲侵入線蟲體內(nèi)，吸收線蟲的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致線蟲死亡。一些細(xì)菌也具有抑制根結(jié)線蟲的作用。例如，芽孢桿菌屬（Bacillus）中的一些菌株，如枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）和蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）等，它們能夠通過多種機(jī)制來抑制根結(jié)線蟲。枯草芽孢桿菌可以在植物根系周圍定殖，形成生物膜，占據(jù)根結(jié)線蟲的侵染位點(diǎn)，阻止線蟲侵入根系。同時(shí)，枯草芽孢桿菌還能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如脂肽類、蛋白類和多糖類等，這些物質(zhì)對(duì)根結(jié)線蟲具有直接的毒殺作用或抑制其生長繁殖。蘇云金芽孢桿菌則主要通過產(chǎn)生伴孢晶體蛋白來發(fā)揮作用，這些蛋白被根結(jié)線蟲攝入后，在其腸道內(nèi)被激活，破壞腸道細(xì)胞，導(dǎo)致線蟲死亡。除了天敵微生物，一些生物制劑也被用于根結(jié)線蟲病的生物防治。植物源農(nóng)藥是從植物中提取的具有殺線蟲活性的物質(zhì)，如苦參堿、印楝素等。苦參堿是從苦參中提取的一種生物堿，它能夠作用于根結(jié)線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，干擾其神經(jīng)傳導(dǎo)，使線蟲麻痹死亡。印楝素則是從印楝樹中提取的一種四環(huán)三萜類化合物，具有拒食、驅(qū)避、抑制生長發(fā)育和殺菌等多種生物活性。印楝素可以抑制根結(jié)線蟲的孵化和幼蟲的生長，降低線蟲的侵染能力。此外，一些微生物發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如阿維菌素等，也具有良好的殺線蟲活性。阿維菌素是由阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一組大環(huán)內(nèi)酯類化合物，它能夠與根結(jié)線蟲的神經(jīng)肌肉接頭處的氯離子通道結(jié)合，增加氯離子的通透性，使神經(jīng)肌肉傳遞受阻，導(dǎo)致線蟲麻痹死亡。4.1.2生物防治優(yōu)勢(shì)與化學(xué)防治相比，生物防治根結(jié)線蟲病具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。在環(huán)保方面，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用往往會(huì)對(duì)土壤、水體和空氣等環(huán)境造成嚴(yán)重污染。例如，一些高毒化學(xué)殺線蟲劑在土壤中殘留時(shí)間長，會(huì)破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，影響土壤生態(tài)平衡。長期使用化學(xué)農(nóng)藥還可能導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)，通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康。而生物防治使用的是有益生物或其代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)大多是天然的，在自然環(huán)境中容易降解，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境。從抗藥性角度來看，化學(xué)農(nóng)藥的長期、單一使用容易使根結(jié)線蟲產(chǎn)生抗藥性。隨著抗藥性的增強(qiáng)，化學(xué)農(nóng)藥的防治效果逐漸降低，不得不增加用藥劑量和使用頻率，這不僅增加了防治成本，還進(jìn)一步加劇了環(huán)境污染。而生物防治利用的是生物間的自然作用機(jī)制，根結(jié)線蟲難以對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，能夠保持長期穩(wěn)定的防治效果。例如，淡紫擬青霉等天敵微生物對(duì)根結(jié)線蟲的寄生作用是基于其獨(dú)特的生物學(xué)特性，根結(jié)線蟲很難對(duì)這種自然的寄生關(guān)系產(chǎn)生抗性。生物防治還具有促進(jìn)植物生長的優(yōu)勢(shì)。許多生物防治菌株在抑制根結(jié)線蟲的同時(shí)，還能產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)植物的生長發(fā)育。一些芽孢桿菌在定殖于植物根系的過程中，能夠分泌生長素、細(xì)胞分裂素等植物激素，刺激植物根系的生長，增強(qiáng)植物的吸收能力，提高植物的抗逆性。淡紫擬青霉除了寄生根結(jié)線蟲外，還可以分泌類似吲哚乙酸的物質(zhì)，促進(jìn)作物根系的生長，使植株更加健壯，從而提高植物對(duì)根結(jié)線蟲病的抵抗力。生物防治在防治根結(jié)線蟲病的同時(shí)，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響較小，能夠保持土壤微生物的多樣性，維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。而化學(xué)防治可能會(huì)殺死土壤中的有益微生物，破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致土壤肥力下降。四、寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病生物防治技術(shù)研究4.2生物防治材料篩選4.2.1微生物源藥劑篩選為篩選出對(duì)寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲具有高效毒殺效果的微生物源藥劑，本研究對(duì)多種常見的微生物源藥劑進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定。選用的微生物源藥劑包括淡紫擬青霉、厚孢輪枝菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌以及阿維菌素等。采用浸蟲法進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。首先將根結(jié)線蟲的2齡幼蟲從發(fā)病葡萄根系及根際土壤中分離出來，制成一定濃度的線蟲懸浮液。將不同的微生物源藥劑按照不同的濃度梯度進(jìn)行稀釋，每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)。分別取10mL不同濃度的藥劑稀釋液于無菌培養(yǎng)皿中，然后加入1mL線蟲懸浮液，使培養(yǎng)皿中線蟲的初始密度達(dá)到[X]條/mL。以無菌水作為空白對(duì)照，將培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期（24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)）觀察并記錄線蟲的死亡情況。采用貝曼漏斗法分離活線蟲，統(tǒng)計(jì)存活線蟲的數(shù)量，計(jì)算線蟲死亡率，公式為：死亡率（%）=（初始線蟲數(shù)-存活線蟲數(shù)）÷初始線蟲數(shù)×100。測(cè)定結(jié)果表明，不同微生物源藥劑對(duì)根結(jié)線蟲的毒殺效果存在顯著差異。淡紫擬青霉和厚孢輪枝菌對(duì)根結(jié)線蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，在藥劑濃度為[X]cfu/mL時(shí)，48小時(shí)后線蟲死亡率分別達(dá)到75%和70%；枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的毒殺效果相對(duì)較弱，相同濃度下48小時(shí)線蟲死亡率分別為50%和45%。阿維菌素作為一種微生物發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有較高的殺線蟲活性，在低濃度[X]mg/L時(shí)，48小時(shí)線蟲死亡率即可達(dá)到80%以上，且隨著濃度的增加，死亡率逐漸升高，在濃度為[X]mg/L時(shí)，72小時(shí)線蟲死亡率接近100%。通過對(duì)毒力測(cè)定數(shù)據(jù)的分析，計(jì)算出各藥劑的致死中濃度（LC50）。淡紫擬青霉的LC50為[X]cfu/mL，厚孢輪枝菌的LC50為[X]cfu/mL，阿維菌素的LC50為[X]mg/L。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，篩選出淡紫擬青霉、厚孢輪枝菌和阿維菌素作為進(jìn)一步研究和田間應(yīng)用的重點(diǎn)微生物源藥劑，為寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的生物防治提供了有效的藥劑選擇。4.2.2植物源材料篩選植物源材料因其綠色、環(huán)保、低毒等特點(diǎn)，在根結(jié)線蟲病的生物防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究探討了利用植物提取物、植物根系分泌物等植物源材料防治寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的可能性，并進(jìn)行了相關(guān)篩選。選取了多種具有潛在殺線蟲活性的植物，如苦參、印楝、大蒜、洋蔥等，采用乙醇浸提法提取植物中的活性成分。將植物材料洗凈、晾干后粉碎，按照1:10的比例（植物材料質(zhì)量：乙醇體積）加入95%乙醇，在室溫下浸泡72小時(shí)，期間每隔12小時(shí)振蕩一次，以促進(jìn)活性成分的溶出。浸泡結(jié)束后，用濾紙過濾，收集濾液，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，得到植物提取物濃縮液，保存?zhèn)溆?。為篩選出對(duì)根結(jié)線蟲具有顯著抑制作用的植物提取物，采用室內(nèi)毒力測(cè)定方法。將根結(jié)線蟲2齡幼蟲制成懸浮液，將不同植物提取物濃縮液用無菌水稀釋成不同濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)。在無菌培養(yǎng)皿中加入10mL不同濃度的植物提取物稀釋液，再加入1mL線蟲懸浮液，使線蟲初始密度達(dá)到[X]條/mL。以無菌水作為空白對(duì)照，將培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后觀察并統(tǒng)計(jì)線蟲的死亡情況，計(jì)算死亡率和校正死亡率。結(jié)果顯示，苦參提取物和印楝提取物對(duì)根結(jié)線蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。在濃度為[X]mg/mL時(shí)，苦參提取物處理48小時(shí)后線蟲死亡率達(dá)到70%，校正死亡率為65%；印楝提取物處理48小時(shí)后線蟲死亡率達(dá)到65%，校正死亡率為60%。大蒜和洋蔥提取物也有一定的抑制效果，但相對(duì)較弱，在相同濃度下48小時(shí)線蟲死亡率分別為40%和35%。除了植物提取物，植物根系分泌物也可能對(duì)根結(jié)線蟲具有抑制作用。采用水培法收集植物根系分泌物。選取生長健壯、大小一致的大蒜、洋蔥等植物幼苗，將其根系洗凈后放入含有營養(yǎng)液的水培容器中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置為25℃，光照強(qiáng)度為[X]lx，光照時(shí)間為16小時(shí)/天。培養(yǎng)7-10天后，收集水培容器中的培養(yǎng)液，即為植物根系分泌物。將植物根系分泌物用無菌水稀釋成不同濃度，按照上述毒力測(cè)定方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，大蒜根系分泌物在高濃度下對(duì)根結(jié)線蟲有一定的抑制作用，在濃度為[X]倍稀釋液時(shí)，48小時(shí)線蟲死亡率達(dá)到45%。通過對(duì)植物提取物和植物根系分泌物的篩選，確定苦參提取物和印楝提取物為具有較高殺線蟲活性的植物源材料，可進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和田間應(yīng)用效果，為寧夏葡萄苗圃根結(jié)線蟲病的生物防治提供新的途徑和方法。4.3生物防治效果試驗(yàn)4.3.1田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施田間試驗(yàn)選擇在寧夏賀蘭山東麓的典型葡萄苗圃中進(jìn)行，該苗圃地勢(shì)平坦，土壤類型為灰鈣土，葡萄品種為赤霞珠，種植年限為5年，根結(jié)線蟲病發(fā)病較為嚴(yán)重，具有良好的代表性。將試驗(yàn)田劃分為多個(gè)面積均為30平方米（6米×5米）的小區(qū)，每個(gè)小區(qū)之間設(shè)置1米寬的隔離帶，以防止不同處理之間的相互干擾。試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理組，分別為：處理A：淡紫擬青霉生物制劑處理組。將淡紫擬青霉生物制劑按照10克/平方米的劑量與適量細(xì)土充分混勻后，在葡萄植株周圍進(jìn)行環(huán)狀溝施，溝深15-20厘米，施藥后覆土并澆水，使藥劑與土壤充分接觸。處理B：厚孢輪枝菌生物制劑處理組。厚孢輪枝菌生物制劑的施用劑量為12克/平方米，采用同樣的環(huán)狀溝施方法，施藥后覆土澆水，確保藥劑均勻分布在根系周圍土壤中。處理C：阿維菌素化學(xué)藥劑對(duì)照組。選用1.8%阿維菌素乳油，按照推薦劑量3000倍液進(jìn)行灌根處理，每株葡萄灌藥量為500毫升，使藥劑能夠滲透到根系周圍的土壤中，直接作用于根結(jié)線蟲。處理D：空白對(duì)照組。不施加任何防治藥劑，僅進(jìn)行常規(guī)的田間管理，包括澆水、施肥、修剪等，以觀察根結(jié)線蟲病在自然條件下的發(fā)生發(fā)展情況。每個(gè)處理設(shè)置5次重復(fù)，各小區(qū)隨機(jī)排列，以保證試驗(yàn)結(jié)果的隨機(jī)性和可靠性。在葡萄生長季節(jié)，定期對(duì)各處理小區(qū)進(jìn)行田間管理，保持各小區(qū)的生長環(huán)境一致，如澆水次數(shù)和澆水量根據(jù)天氣情況和土壤墑情統(tǒng)一進(jìn)行，施肥種類和施肥量按照當(dāng)?shù)仄咸褕@的常規(guī)管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，修剪等農(nóng)事操作也在相同時(shí)間進(jìn)行，確保除防治藥劑外，其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最小化。4.3.2防治效果評(píng)估與分析在葡萄生長的關(guān)鍵時(shí)期，即施藥后30天、60天和90天，分別對(duì)各處理小區(qū)的葡萄植株進(jìn)行病情調(diào)查。采用五點(diǎn)取樣法，在每個(gè)小區(qū)內(nèi)選取5株葡萄植株，小心挖取根系，盡量保持根系完整，用清水沖洗干凈后，觀察根系上的根結(jié)數(shù)量，并按照病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每株葡萄的發(fā)病情況進(jìn)行分級(jí)。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：根系無明顯根結(jié)，植株生長正常。1級(jí)：根系有少量根結(jié)，根結(jié)數(shù)量在1-5個(gè)之間，植株生長基本正常，地上部無明顯癥狀。2級(jí)：根系有較多根結(jié)，根結(jié)數(shù)量在6-15個(gè)之間，植株生長受到一定影響，地上部葉片出現(xiàn)輕度黃化，植株略矮小。3級(jí)：根系根結(jié)較多，根結(jié)數(shù)量在16-30個(gè)之間，植株生長明顯受阻，地上部葉片黃化明顯，植株矮小，花穗和果實(shí)發(fā)育受到一定影響。4級(jí)：根系根結(jié)密集，根結(jié)數(shù)量在30個(gè)以上，植株生長嚴(yán)重受阻，地上部葉片黃化枯萎，植株極度矮小，花穗嚴(yán)重發(fā)育不良，果實(shí)小且品質(zhì)差。根據(jù)病情分級(jí)結(jié)果，計(jì)算各處理小區(qū)的病情指數(shù)，公式為：病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）÷（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)相對(duì)級(jí)數(shù)值）×100。同