醫(yī)學重要真菌鑒定指南醫(yī)學重要真菌的準確鑒定是感染性疾病診斷、治療及預后評估的關鍵環(huán)節(jié)。臨床實驗室需結合形態(tài)學觀察、培養(yǎng)特性分析、生理生化反應及分子生物學技術，針對不同真菌的生物學特性制定系統(tǒng)性鑒定策略。以下從基礎檢測方法到常見醫(yī)學真菌的具體鑒定要點展開詳細闡述。一、真菌鑒定的基礎檢測方法（一）直接鏡檢與染色技術直接鏡檢是快速篩查真菌的首要步驟，通過觀察標本中真菌的形態(tài)特征（如菌絲、孢子、莢膜等）為初步鑒定提供依據。常用方法包括：1.KOH濕片法：適用于皮膚、毛發(fā)、甲屑等角質化標本。取少量標本置于載玻片，滴加10%-20%KOH溶液，覆蓋蓋玻片后微加熱（加速角質溶解），顯微鏡下觀察是否存在分枝分隔菌絲（如皮膚癬菌）或芽生孢子及假菌絲（如念珠菌）。2.墨汁負染法：專門用于隱球菌屬的檢測。取腦脊液或組織滲出液與印度墨汁混合，隱球菌的寬厚莢膜在黑色背景下呈現(xiàn)透亮光暈，可與其他酵母樣真菌區(qū)分。3.染色技術：-革蘭染色：酵母樣真菌（如念珠菌）呈革蘭陽性，菌絲（如曲霉）細胞壁薄，染色可能不均；-瑞氏-吉姆薩染色：適用于血液、骨髓或組織印片，可清晰顯示組織胞漿菌等胞內寄生真菌的形態(tài)；-六胺銀染色（GMS）：真菌壁的多糖成分與銀離子結合后呈黑色，能敏感顯示各種菌絲和孢子，尤其適用于組織標本中真菌的定位；-過碘酸雪夫染色（PAS）：真菌細胞壁的多糖被氧化后與雪夫試劑反應呈紅色，與周圍組織對比明顯，常用于病理切片觀察。（二）分離培養(yǎng)與菌落觀察分離培養(yǎng)是真菌鑒定的核心環(huán)節(jié)，通過選擇合適培養(yǎng)基、控制培養(yǎng)條件獲取純菌落，進一步觀察宏觀及微觀形態(tài)。1.培養(yǎng)基選擇：-沙堡弱葡萄糖瓊脂（SDA）：基礎培養(yǎng)基，含4%葡萄糖、1%蛋白胨，pH5.6，適用于多數(shù)真菌的分離培養(yǎng)。添加氯霉素（抑制細菌）和放線菌酮（抑制腐生真菌）的SDA（SDA-CAF）常用于臨床標本的選擇性培養(yǎng)；-腦心浸液瓊脂（BHI）：營養(yǎng)豐富，添加血液或小牛血清后可促進雙相真菌（如組織胞漿菌、馬爾尼菲籃狀菌）的酵母相生長；-CHROMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基：通過特定酶底物顯色反應區(qū)分不同念珠菌（如白念珠菌呈綠色，熱帶念珠菌呈藍色，光滑念珠菌呈粉色），縮短鑒定時間；-咖啡酸瓊脂：用于隱球菌屬的鑒定，新生隱球菌可產生黑色素，菌落呈深棕色。2.培養(yǎng)條件：-溫度：多數(shù)真菌在25-30℃（絲狀真菌）或35-37℃（酵母樣真菌）生長良好，雙相真菌需分別在25℃（菌絲相）和37℃（酵母相）培養(yǎng)以觀察形態(tài)轉換；-時間：酵母樣真菌通常1-3天可見菌落，絲狀真菌需5-14天，部分慢生長真菌（如組織胞漿菌）可能需要4周以上；-需氧環(huán)境：多數(shù)醫(yī)學真菌為需氧或兼性厭氧，毛霉屬等接合菌需較高氧氣濃度。3.菌落形態(tài)觀察：-宏觀特征：包括菌落大小、表面（光滑/褶皺/放射狀溝紋）、邊緣（整齊/鋸齒狀）、質地（酵母樣/奶油狀/棉絮狀/絨毛狀）及顏色（正面/背面）；-微觀特征：通過乳酸酚棉藍染色制作玻片，觀察菌絲（有隔/無隔）、孢子（分生孢子/孢子囊孢子/關節(jié)孢子）及特殊結構（假菌絲、厚壁孢子、分生孢子頭）。例如，白念珠菌可見假菌絲及頂端厚壁孢子，煙曲霉可見典型的燒瓶狀頂囊及單層小梗。（三）生理生化反應生理生化試驗通過檢測真菌對碳源的利用能力、酶活性等代謝特征，輔助區(qū)分形態(tài)相似的菌種，尤其適用于酵母樣真菌的鑒定。1.芽管試驗：取待測菌接種于0.5ml人血清或小牛血清，37℃孵育2-4小時，顯微鏡下觀察是否形成芽管（無分隔的管狀物，與母細胞連接處無收縮）。白念珠菌95%以上陽性，其他念珠菌（如熱帶念珠菌）偶見假陽性，需結合厚壁孢子試驗確認。2.厚壁孢子形成試驗：將菌接種于玉米吐溫80瓊脂，25℃培養(yǎng)24-48小時，白念珠菌可在假菌絲頂端或側方形成圓形厚壁孢子，光滑念珠菌等不產生。3.糖同化與發(fā)酵試驗：通過檢測真菌能否利用特定碳水化合物（如葡萄糖、麥芽糖、乳糖）產酸產氣，判斷菌種。常用API20CAUX系統(tǒng)（生物梅里埃），通過20種碳源的同化反應生成編碼，結合數(shù)據庫比對鑒定。4.脲酶試驗：隱球菌屬可分解尿素產氨，使培養(yǎng)基（含酚紅）由黃變粉；念珠菌屬通常陰性。5.β-半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）：用于區(qū)分白念珠菌（陰性）與偽熱帶念珠菌（陽性），后者可水解鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷生成黃色產物。（四）分子生物學技術傳統(tǒng)方法受限于形態(tài)變異、培養(yǎng)時間及操作者經驗，分子生物學技術通過檢測真菌核酸序列，提供更準確、快速的鑒定結果，尤其適用于難培養(yǎng)或形態(tài)不典型菌株。1.ITS區(qū)域測序：真菌核糖體DNA（rDNA）的內轉錄間隔區(qū)（ITS1和ITS2）在種間變異大、種內保守性高，被稱為“真菌通用條形碼”。提取真菌DNA后，通過通用引物（如ITS1/ITS4）擴增ITS區(qū)域，測序后與GenBank、UNITE等數(shù)據庫比對，可鑒定至種甚至亞種水平。2.種特異性引物PCR：針對特定菌種的特異性基因（如白念珠菌的Ca3基因、煙曲霉的aspf1基因）設計引物，通過PCR擴增直接檢測目標菌種，靈敏度可達1-10個拷貝，適用于臨床標本的快速診斷。3.實時熒光定量PCR（qPCR）：在PCR反應體系中加入熒光探針（如TaqMan探針），通過監(jiān)測熒光信號實時定量真菌載量，可用于侵襲性真菌感染的早期診斷及療效監(jiān)測（如曲霉菌病的動態(tài)監(jiān)測）。4.基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOFMS）：通過檢測真菌核糖體蛋白的特征性質譜峰（蛋白質指紋圖譜），與數(shù)據庫中已知菌種的圖譜比對，可在幾分鐘內完成鑒定。該技術對酵母樣真菌（如念珠菌、隱球菌）的鑒定準確率＞90%，對絲狀真菌（如曲霉、毛霉）的鑒定需結合形態(tài)學。二、常見醫(yī)學重要真菌的鑒定要點（一）念珠菌屬（Candida）念珠菌屬是最常見的機會性致病真菌，可引起皮膚黏膜感染至侵襲性念珠菌病。臨床常見種包括白念珠菌（C.albicans）、光滑念珠菌（C.glabrata）、熱帶念珠菌（C.tropicalis）、近平滑念珠菌（C.parapsilosis）等。-白念珠菌：直接鏡檢可見芽生孢子及假菌絲；SDA培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24-48小時形成奶油色、光滑、邊緣整齊的酵母樣菌落；芽管試驗陽性，玉米吐溫80瓊脂可見厚壁孢子；API20CAUX顯示同化葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，不同化乳糖；ITS測序顯示典型序列特征。-光滑念珠菌：鏡下主要為圓形或橢圓形芽生孢子，少見假菌絲；CHROMagar顯色培養(yǎng)基呈粉色；芽管試驗陰性，不產生厚壁孢子；同化葡萄糖、半乳糖，不發(fā)酵任何糖類；MALDI-TOFMS顯示特征性質譜峰（如m/z3697、4387）。-熱帶念珠菌：鏡下可見大量假菌絲及芽生孢子；CHROMagar呈藍色；可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、半乳糖；在SDA培養(yǎng)基上生長較快，菌落表面可出現(xiàn)褶皺；ITS區(qū)域測序與其他種差異顯著。（二）隱球菌屬（Cryptococcus）隱球菌屬以新生隱球菌（C.neoformans）和格特隱球菌（C.gattii）最為常見，主要侵犯中樞神經系統(tǒng)，引起隱球菌性腦膜炎。-形態(tài)與染色：墨汁負染可見圓形或橢圓形菌體，周圍有寬厚莢膜（直徑5-20μm）；革蘭染色呈陽性酵母細胞，偶見芽生孢子。-培養(yǎng)特性：SDA培養(yǎng)基25-37℃均可生長，2-5天形成白色至奶油色、黏液狀菌落（因莢膜多糖分泌）；咖啡酸瓊脂培養(yǎng)2-3天菌落呈深棕色（產黑色素）。-生化反應：脲酶試驗陽性，能同化肌醇（與紅酵母屬鑒別）；不能發(fā)酵任何糖類；乳酚棉藍染色可見芽生孢子，無假菌絲。-分子鑒定：通過擴增URA5基因或ITS區(qū)域，結合限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）可區(qū)分新生隱球菌（血清型A/D）和格特隱球菌（血清型B/C）。（三）曲霉屬（Aspergillus）曲霉屬廣泛存在于環(huán)境中，可引起過敏反應、定植及侵襲性曲霉病（IPA），以煙曲霉（A.fumigatus）、黃曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）最常見。-形態(tài)特征：鏡下可見有隔菌絲（直徑3-4μm，分枝呈45°角）；分生孢子頭由頂囊、小梗（單層或雙層）及分生孢子鏈組成。-煙曲霉：頂囊燒瓶狀（直徑20-30μm），僅上半部有單層小梗；分生孢子球形，表面粗糙，綠色至藍綠色；-黃曲霉：頂囊球形或近球形（直徑40-80μm），有雙層小梗（?；托」＃?；分生孢子表面粗糙，黃色至黃綠色；-黑曲霉：頂囊球形（直徑80-100μm），雙層小梗；分生孢子球形，表面有小刺，黑色至棕黑色。-培養(yǎng)特性：SDA培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)5-7天，煙曲霉菌落初為白色，后轉為藍綠色，邊緣白色；黃曲霉菌落初為黃色，后轉為黃綠色，表面有放射狀溝紋；黑曲霉菌落初為白色，后轉為黑色，背面無色或淡黃色。-分子鑒定：通過β-微管蛋白（benA）或鈣調蛋白（calM）基因測序可準確區(qū)分種，尤其適用于形態(tài)不典型菌株。（四）毛霉屬（Mucor）毛霉屬（接合菌門）是毛霉病的主要病原體，好發(fā)于糖尿病酮癥酸中毒、免疫缺陷患者，可引起鼻腦、肺、胃腸道等部位感染。-形態(tài)特征：直接鏡檢可見寬大（直徑6-25μm）、無隔（或極少分隔）、分枝呈直角的菌絲，HE染色易被蘇木精深染，GMS染色呈淡黑色；-培養(yǎng)特性：SDA培養(yǎng)基25-30℃生長迅速（24-48小時），菌落初為白色，后轉為灰色至褐色，質地棉絮狀；顯微鏡下可見孢子囊梗直立，頂端有球形孢子囊（直徑30-100μm），囊內有大量圓形孢子囊孢子；-鑒別要點：與根霉屬的區(qū)別在于毛霉無假根和匍匐菌絲，根霉在孢子囊?；靠梢娂俑愃浦参锔慕Y構）。（五）馬爾尼菲籃狀菌（Talaromycesmarneffei）馬爾尼菲籃狀菌（曾用名馬爾尼菲青霉）是雙相真菌，主要流行于東南亞及我國南方，可引起播散性感染（尤其HIV感染者）。-雙相特性：25℃培養(yǎng)為菌絲相，菌落初為白色，后轉為棕紅色（產生可溶性紅色色素），鏡下可見分隔菌絲、帚狀枝（類似青霉）及圓形至橢圓形分生孢子；37℃培養(yǎng)為酵母相，鏡下可見圓形或臘腸形細胞（2-4μm×3-6μm），可通過出芽或分裂增殖，常聚集成團（類似桑葚）；-組織標本染色：瑞氏-吉姆薩染色可見細胞內酵母相菌體（位于單核細胞或巨噬細胞內），PAS染色呈紅色；-分子鑒定：ITS區(qū)域測序顯示與其他籃狀菌屬的差異，可明確診斷。（六）組織胞漿菌（Histoplasmacapsulatum）組織胞漿菌是雙相真菌，引起組織胞漿菌病，流行于美洲、非洲等地，我國偶見輸入病例。-雙相特性：25℃培養(yǎng)為菌絲相，菌落白色至棕色，鏡下可見特征性大分生孢子（直徑8-14μm），表面有指狀突起（棘狀孢子）；37℃培養(yǎng)為酵母相，鏡下可見圓形或卵圓形細胞（2-4μm），常位于巨噬細胞內（類似利什曼原蟲）；-染色與鏡檢：瑞氏-吉姆薩染色顯示酵母相菌體有清晰莢膜樣結構（實際為細胞壁折射所致），GMS染色呈黑色；-抗原檢測：尿或血清中的組織胞漿菌抗原（HPA）檢測可用于急性期診斷，結合抗體檢測（免疫擴散法）提高準確性；-分子鑒定：通過擴增hsp60基因或ITS區(qū)域，可與其他雙相真菌（如芽生菌、球孢子菌）鑒別。三、鑒定流程的優(yōu)化與質量控制為提高鑒定效率和準確性，臨床實驗室應建立標準化鑒定流程：首先通過直接鏡檢和快速染色（如KOH、墨汁負染）初步判斷真菌類型（酵母樣/絲狀/雙相）；隨后接種選擇性培養(yǎng)基分離純菌落，觀察菌落形態(tài)及微觀結構；結合生理生化試驗（如芽管、脲酶、顯色培養(yǎng)基）縮小菌種范圍；最后通過分子生物學技術（ITS測序、