2025/07/15免疫印跡(WB)實(shí)驗(yàn)操作步驟匯報(bào)人：_1751850234CONTENTS目錄01實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作02樣品制備與處理03電泳分離蛋白04轉(zhuǎn)膜過程05免疫反應(yīng)06顯色與結(jié)果分析CONTENTS目錄07實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)08實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保存與報(bào)告實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作01實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)耗材包括移液槍、吸頭、離心管、凝膠板等，確保實(shí)驗(yàn)耗材無菌且完好。配置實(shí)驗(yàn)試劑根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備相應(yīng)的試劑，包括電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜液和封閉液等。準(zhǔn)備樣品和對(duì)照收集實(shí)驗(yàn)樣品，包括待測(cè)蛋白樣品和已知分子量的對(duì)照蛋白。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)設(shè)備確保電泳設(shè)備、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、影像檢測(cè)工具等實(shí)驗(yàn)器具運(yùn)作良好并進(jìn)行精準(zhǔn)校準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)備準(zhǔn)備準(zhǔn)備電泳槽和電源保障電泳槽完好無損，電源運(yùn)行平穩(wěn)，以確保蛋白質(zhì)分離所需的基本條件得到滿足。配置緩沖液和染色液精確設(shè)置電泳緩沖液與凝膠染色液，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精確無誤。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜裝置準(zhǔn)備適合的轉(zhuǎn)膜裝置和濾紙，為蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上提供支持。實(shí)驗(yàn)試劑配制配制電泳緩沖液準(zhǔn)備三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸和十二烷基硫酸鈉（SDS），按既定比例混合，以備蛋白質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)使用。制備轉(zhuǎn)膜液將甲醇、Tris及甘氨酸按照一定比例相溶，作為蛋白質(zhì)從凝膠遷移至膜上的轉(zhuǎn)移液。樣品制備與處理02細(xì)胞或組織樣品的收集細(xì)胞樣品的收集細(xì)胞樣品通常通過離心和洗滌步驟從培養(yǎng)基中分離出來，以去除培養(yǎng)基成分。組織樣品的快速冷凍樣本收集后需立即進(jìn)行低溫保存，以避免蛋白質(zhì)變質(zhì)，常用液氮或固態(tài)二氧化碳實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞裂解液的選擇根據(jù)目標(biāo)蛋白的性質(zhì)選擇合適的細(xì)胞裂解液，如RIPA或NP-40，以確保有效提取。組織勻漿處理對(duì)組織樣本進(jìn)行勻漿化處理，旨在破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，以便于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。蛋白樣品的提取細(xì)胞裂解通過蛋白酶抑制劑的裂解液處理細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放。蛋白純化通過離心和洗滌步驟去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，獲得純凈的蛋白樣品。蛋白定量利用BCA或Bradford技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性。蛋白濃度的測(cè)定細(xì)胞裂解采用蛋白酶抑制劑配制的裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，以釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。組織勻漿將組織樣本在冰上用勻漿器處理，確保蛋白的完整提取。蛋白純化通過離心和洗滌步驟去除雜質(zhì)，獲得高純度的蛋白樣品。電泳分離蛋白03準(zhǔn)備凝膠01配制電泳緩沖液準(zhǔn)備三羥乙基胺、甘氨酸和十二烷基硫酸鈉，按既定比例溶解于水溶液中，以備蛋白質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)使用。02制備轉(zhuǎn)膜液將甲醇、Tris緩沖液與甘氨酸相結(jié)合，制備出適合轉(zhuǎn)膜的緩沖液，確保蛋白質(zhì)能順利轉(zhuǎn)移至膜上。樣品的上樣準(zhǔn)備電泳裝置確保電泳設(shè)備如槽、板、梳子等均清潔完好，且已準(zhǔn)備妥當(dāng)。配置電泳緩沖液為滿足實(shí)驗(yàn)要求，需精確測(cè)量并溶解電泳緩沖液中的化學(xué)物質(zhì)，以保證溶液的濃度準(zhǔn)確無誤。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜設(shè)備準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜槽、濾紙、海綿墊等，確保轉(zhuǎn)膜過程中的設(shè)備無污染且功能正常。電泳過程控制細(xì)胞培養(yǎng)物的收集從培養(yǎng)瓶中取出培養(yǎng)基，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，隨后收集細(xì)胞沉淀以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。組織樣本的快速冷凍在無菌條件下迅速取出組織樣本，立即放入液氮中冷凍，以保持蛋白質(zhì)的活性。血液樣本的分離采集血液樣本，經(jīng)離心處理分離出血清或血漿，移除紅細(xì)胞，從而獲得適用于WesternBlot（WB）分析的樣品。組織勻漿的制備將組織樣本在冰上用勻漿器破碎，加入適當(dāng)?shù)木彌_液，制備成勻漿液用于WB分析。轉(zhuǎn)膜過程04轉(zhuǎn)膜緩沖液的配制準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)耗材包括移液管、離心管、濾紙、凝膠板等，確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。配置實(shí)驗(yàn)試劑根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配置所需試劑，如電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜液等。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)樣本采集并處理實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞和組織材料，保證樣本的新鮮度及純凈性。校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)儀器保障電泳儀及轉(zhuǎn)膜設(shè)備等設(shè)備的穩(wěn)定運(yùn)行，實(shí)施必要的校準(zhǔn)與保養(yǎng)。膜的選擇與處理細(xì)胞裂解利用含蛋白酶抑制劑的裂解液摧毀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而釋放細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)。組織勻漿將樣本組織置于冰面上，利用勻漿器進(jìn)行攪拌，確保得到均勻的組織蛋白懸浮液。離心分離將裂解后的樣品進(jìn)行高速離心，以去除細(xì)胞碎片和未破碎的組織，獲得澄清的蛋白溶液。轉(zhuǎn)膜操作步驟配制電泳緩沖液準(zhǔn)備三羥乙基胺、甘氨酸和十二烷基硫酸鈉，按既定比例混合于水中，作為蛋白質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)的試劑。制備轉(zhuǎn)膜液將甲醇、Tris及甘氨酸相結(jié)合，制備出適用于轉(zhuǎn)膜過程的緩沖溶液，確保蛋白質(zhì)能夠有效轉(zhuǎn)移到膜上。免疫反應(yīng)05封閉步驟01準(zhǔn)備電泳裝置保障電泳設(shè)備，如電泳槽、凝膠板及梳子等，均清潔且無損傷，并做好充分準(zhǔn)備。02配置電泳緩沖液按照實(shí)驗(yàn)規(guī)范，準(zhǔn)確測(cè)量并混合電泳緩沖劑的固體，以保證溶液的濃度精確無誤。03準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜設(shè)備檢查轉(zhuǎn)膜槽、濾紙、海綿墊等轉(zhuǎn)膜裝置，確保無破損，準(zhǔn)備使用。一抗孵育01配制電泳緩沖液配置Tris、甘氨酸及SDS溶液，依照規(guī)范比例進(jìn)行混勻，以備后續(xù)蛋白質(zhì)電泳分析使用。02制備轉(zhuǎn)膜液將適量甲醇、Tris緩沖液及甘氨酸按適當(dāng)比例混合，配制成轉(zhuǎn)膜溶液，用于將凝膠上的蛋白質(zhì)遷移至膜層。二抗孵育01細(xì)胞裂解采用裂解緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，以此釋放細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)，確保后續(xù)蛋白分析的順利進(jìn)行。02蛋白純化通過離心和過濾等方法去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，獲得較為純凈的蛋白樣品。03蛋白定量通過BCA法或Bradford技術(shù)評(píng)估蛋白含量，以保證實(shí)驗(yàn)所用蛋白樣品的量度精準(zhǔn)無誤。顯色與結(jié)果分析06顯色液的配制01準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)耗材確保實(shí)驗(yàn)所需移液管、離心管、濾紙等材料充足，并保證其質(zhì)量。02配置實(shí)驗(yàn)試劑根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，提前配置好所需的電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜液等試劑。03準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)將要檢測(cè)的細(xì)胞和組織樣本進(jìn)行采集與處理，保證樣本的新鮮度以及清潔度。04校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備確保電泳儀、轉(zhuǎn)膜裝置等實(shí)驗(yàn)設(shè)備正常工作，進(jìn)行必要的校準(zhǔn)和維護(hù)。顯色反應(yīng)細(xì)胞樣品的收集細(xì)胞樣本一般采用離心法進(jìn)行分離，以去除培養(yǎng)液，進(jìn)而收集細(xì)胞沉淀以供后續(xù)蛋白質(zhì)提取之用。組織樣品的采集組織樣品需在無菌條件下迅速采集，然后進(jìn)行勻漿處理，以保持蛋白的完整性。樣品的保存收集后的樣品應(yīng)立即置于-80°C冰箱中冷凍保存，以防止蛋白降解和變性。樣品的分裝為防止樣品因頻繁凍結(jié)和解凍而損害蛋白質(zhì)品質(zhì)，建議將樣本分成若干小份，每次實(shí)驗(yàn)僅取用其中一份。結(jié)果的記錄與分析準(zhǔn)備電泳裝置設(shè)備需保證電泳槽及電泳儀等完好無損，且需事先進(jìn)行徹底清潔和詳查。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜設(shè)備準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜槽、供電設(shè)備、濾紙及PVDF膜等材料，以保障轉(zhuǎn)膜操作能順暢進(jìn)行。準(zhǔn)備顯影設(shè)備準(zhǔn)備顯影儀或暗室，以及顯影液和定影液，為后續(xù)的顯影步驟做好準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)07實(shí)驗(yàn)操作的注意事項(xiàng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)耗材包括移液管、離心管、濾紙等，確保實(shí)驗(yàn)過程中耗材的充足和質(zhì)量。配置實(shí)驗(yàn)試劑依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，預(yù)先準(zhǔn)備所需電泳緩沖液、轉(zhuǎn)膜液等實(shí)驗(yàn)試劑。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)樣本收集并處理好實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞或組織樣本，確保樣本新鮮且無污染。校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備校驗(yàn)與調(diào)整電泳儀、轉(zhuǎn)膜器等實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。結(jié)果解讀的注意事項(xiàng)配制電泳緩沖液將Tris、甘氨酸和SDS按一定比例溶解于水，以備進(jìn)行蛋白質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)使用。制備轉(zhuǎn)膜液將甲醇、Tris和甘氨酸溶液混合，制備用于轉(zhuǎn)膜的緩沖液，確保蛋白質(zhì)能夠順利轉(zhuǎn)移到膜上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保存與報(bào)告08結(jié)果的保存方法細(xì)胞裂解采用添加蛋白酶抑制劑的裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，從而釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。蛋白純化采用離心及洗滌程序，有效清除細(xì)胞殘留及不純物質(zhì)，從而提取出高純度的蛋白質(zhì)樣本。蛋白定量采用BCA或Bradford方