吉林省地方計量技術規(guī)范2023-12-01發(fā)布2024-01-01實施吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布熒光定量PCR儀校準規(guī)范I （II） （1） （1） （1） （3） （4） （5） （5） （12） （12） （13） （16） （17） （20）和JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》共同構成支撐本校準規(guī)范制定工作的基礎1173-2010《聚合酶鏈反應分析儀》、GB/T42753-1熒光定量PCR儀校準規(guī)范于聚合酶鏈式反應原理定量或定性分析靶核GB/T42753-2022實時熒光定量PCR儀性能評凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其3.1聚合酶鏈反應polymerasec基于聚合酶鏈式反應原理，通過溫度變化循環(huán)程序進行靶核酸儀器孔位平均溫度達到設定值(偏差±0.5℃以內）且保持該溫度的一段時間。[GB/T3.5溫度示值誤差temperatureindic23.6溫度均勻度temperatur儀器恒溫階段屮，各孔位之間的溫度一致性。[GB/3.7溫度波動度temperatu儀器恒溫階段屮，孔位的溫度變化幅度。[GB/3.8溫度最大過沖量temperaturemaxim均熱塊溫度升高或降低至設定值過程中，所有采樣測量孔溫度超出（高于或低于）設定3.9平均升溫速率mean3.10平均降溫速率meanc3.12熒光強度精密度precisionoffluorescenceintensity對多個檢測孔在同一熒光條件下重復熒光強度檢測每個PCR反應管內的熒光信號達到設定的閾值吋所經歷的循環(huán)次數。[GB/T42753-20均熱塊不同測量孔在同一熒光條件下，閾值3.15熔解溫度melttemperatu3.19通道峰值強度一致性channelpeakheightconsistenc33.20線性靈敏系數linearsensitivityfactor,LSF3.21熔解溫度比ratioofmelttemperature,RTm度不均勻直接相關；RTm>1.20：相同產品熔共同導致的；RTm<0.80：相同產品熔解溫度不同，差異是與光學、光學檢測系統(tǒng)及分析軟件直接相關。3.22樣本示值誤差errorofsample’sindication測得的DNA標準物質濃度對數值與標稱濃度的對數值的誤差。針與模板基因混合后，完成高溫變性、低溫復性和適溫延伸的熱循環(huán)對的探針被切斷，熒光染料游離于反應體系中，在特定光激發(fā)下熒光染環(huán)次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規(guī)律增長，通過實時檢品載臺、軟件控制系統(tǒng)、溫度控制模塊、熒光檢測模塊、均熱塊檢測孔組成，詳細結構如圖41—光源2—濾光片3—準直器4—光導束5—樣品6—均熱123456789≤10%56.1.1溫度15～30）℃；相對濕度：不大于80%；6.1.2其它：符合儀器額定供電電壓和頻率；電源電壓波動不超出±22V，交流頻率的變化溫度與光學校準裝置集成了溫度傳感器和發(fā)射光發(fā)生器兩部分。其溫度測量范圍為（0~120）℃,最大允許誤差為±0.1℃,采樣時間間隔不超過0.5s；發(fā)射光發(fā)生器的波長范圍為校準光學系統(tǒng)項目時，可根據客戶要求與實際情況選擇光學系統(tǒng)物理校準方法或光學系如圖2所示，均熱塊孔數為其他數量時，可參照圖2布點。實時熒等于或大于96孔時，測量點為15個，布點圖如圖3所示，均將儀器及光學標準器各部件連接完好，在光學標準器下部的溫度傳6123456789程7112134溫度達到設定溫度30s后開始記錄測量值，記錄5s，最少均勻記錄5組數據。 T Tn——溫度傳感器數量。溫度達到設定溫度30s后開始記錄測量值，記錄5s，最少均勻記錄5組數據。 溫度達到設定溫度30s后開始記錄各點量值，記錄60s，最少均勻記錄10組ΔTf=±m(xù)ax[(Tjmax?Tjmin)/2]（3）8Tjmax——測量點j溫度傳感器在m次測量中的最高溫度，℃;Tjmin——測量點j溫度傳感器在m次測量中的最低溫度，℃。TTai——50℃溫度點第i個采樣測量孔的測量值，℃;bi——90℃溫度點第i個采樣測量儀器從90℃降溫至50℃時，平均降溫速率的計算按照公式（6）計算：9ΔCtu=Ctqmax?Ctqmin（8）當DNA循環(huán)擴增從最大熒光強度100%減弱到20%時度一致性（CPHC）和線性靈敏系數(LSF)，分別由公式（10）、公式（11）計算：CPHCi（10）LS（11） ALSFi——線性靈敏系數。c)熔解溫度漂移和熔解溫度比i——第i個采樣測量孔熔解溫度漂移，℃;TTRTm——熔解溫度比；TTTTcs（14） cc——儀器測量平均值，copies/μLs——標準物質標稱值，copies/μLCti——系列稀釋標準物質的第i個擴增Ct值； lnc——系列稀釋標準物質濃度對數a)標題：如“校準證書”；），設定溫度點(℃)平均值(℃)實測最高溫度(℃)實測最低溫度(℃)溫度示值誤差(℃)不確定度(℃)溫度均勻度(℃)Tmax-Tmin溫度波動度(℃)三、溫度最大過沖量、平均升溫速率和平均設定溫度點(℃)最低或最高測量值(℃)溫度最大過沖量(℃)平均升溫速率(℃/s）平均降溫速率(℃/s）四、閾值循環(huán)數（Ct值）示值誤差、均勻度、精密度（光學系統(tǒng)物理項目）TAiiAi-Bii-CiCPHCLSFRTm光學標準器分布位置1U2設定溫度點(℃)溫度示值誤差(℃)溫度均勻度(℃)溫度波動度(℃)溫度最大過沖量(℃)平均升溫速率(℃/s）平均降溫速率(℃/s）熔解溫度漂移(℃)與溫度控制模塊接觸良好。按照儀器說明書或用戶要求或推薦使用的溫度TTa)測量重復性引入的標準不確定度分量u1；b)溫度傳感器分辨力引入的標準不確定度分量u1；c)溫度傳感器準確度引入的標準不確定度分量u2。C.4.1重復性測量引入的不確定度分量u1ykj——第j個測量點第k次的測量值，℃; yj——第j個測量點測量值的平均值，℃;不同測量點溫度傳感器測量結果(℃)123456789sp=0.0313℃C.4.2溫度傳感器分辨力引入的不確定度u1'溫度傳感器的分辨力為0.01℃,分散區(qū)間半寬為0.005℃,按均勻分布計算，由于重復測量引入的標準不確定度分量u1大于分辨力引入的標準不確定度C.4.3溫度傳感器準確度引入的標準不確定度分量u2；溫度傳感器的最大允許誤差±0.1℃,按均勻分布計算，則：C.5合成標準不確定度uc模塊中，并確保與溫度控制模塊接觸良好。按照儀器說明書或用戶要a)測量重復性引入的標準不確定度分量u1；b)光學標準器分辨力引入的標準不確定度分量u1'；D.4.1重復性測量引入的不確定度分量u1對同一臺設備，在相同的測量條件下，使用光學標準器按照推薦123456789儀ykj——第j個測量點第k次的測量值； yj——第j個測量點測量值的平均值；值合并樣本標準偏差s