基于冷凍電鏡的重組抗原構象優(yōu)化策略演講人01基于冷凍電鏡的重組抗原構象優(yōu)化策略02引言：重組抗原構象優(yōu)化的必要性與冷凍電鏡的突破性價值03冷凍電鏡技術解析重組抗原構象的優(yōu)勢與核心流程04基于冷凍電鏡解析的重組抗原構象優(yōu)化策略05優(yōu)化策略的驗證與迭代：從結構到功能的多維確證06應用案例：冷凍電鏡指導的重組抗原優(yōu)化實踐目錄01基于冷凍電鏡的重組抗原構象優(yōu)化策略02引言：重組抗原構象優(yōu)化的必要性與冷凍電鏡的突破性價值引言：重組抗原構象優(yōu)化的必要性與冷凍電鏡的突破性價值重組抗原作為現代疫苗、診斷試劑及治療性抗體的核心組分，其空間構象的準確性直接決定生物活性與免疫原性。在疫苗研發(fā)中，僅線性表位匹配而構象異常的抗原往往無法誘導中和抗體；在診斷領域，構象失真的抗原可能導致假陰性或假陽性結果；而在治療性抗體開發(fā)中，抗原的天然構象是抗體特異性結合的前提。然而，傳統(tǒng)重組抗原生產常面臨構象異質性問題——原核表達系統(tǒng)缺乏真核折疊修飾，純化過程易受應力誘導變性，儲存過程中易發(fā)生構象漂移，這些因素均導致最終產物以非天然構象為主，嚴重影響功能發(fā)揮。傳統(tǒng)結構解析技術如X射線晶體學雖能提供高分辨率結構，但依賴晶體生長，對柔性大分子或動態(tài)構象束手無策；核磁共振（NMR）適用于小分子動態(tài)分析，卻受限于分子量（通常<100kDa）。冷凍電鏡（cryo-EM）技術的革命性突破，尤其是直接電子探測器（DED）和單顆粒分析（SPA）算法的成熟，使“近生理狀態(tài)下的分子動態(tài)成像”成為可能：無需結晶、可解析大分子復合物（可達數MDa）、能捕捉瞬態(tài)構象，為重組抗原構象解析與優(yōu)化提供了“原子級導航”。引言：重組抗原構象優(yōu)化的必要性與冷凍電鏡的突破性價值在筆者參與的多個重組抗原研發(fā)項目中，從新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）到呼吸道合胞病毒融合蛋白（F蛋白），cryo-鏡始終扮演著“構象守門人”的角色——它不僅能精準識別抗原的天然構象特征，更能揭示構象異質性的分子機制，進而指導設計策略。本文將結合前沿研究與實際研發(fā)經驗，系統(tǒng)闡述基于cryo-EM的重組抗原構象優(yōu)化策略，從結構解析、理性設計到驗證迭代，構建“解析-設計-驗證”的閉環(huán)技術體系。03冷凍電鏡技術解析重組抗原構象的優(yōu)勢與核心流程1相較傳統(tǒng)技術的突破性優(yōu)勢重組抗原的構象復雜性在于其常包含柔性區(qū)域（如連接子、環(huán)區(qū)）、多結構域動態(tài)組裝（如S蛋白的S1/S2亞基）及翻譯后修飾（如糖基化），這些特性使傳統(tǒng)結構分析方法面臨三重挑戰(zhàn)：1相較傳統(tǒng)技術的突破性優(yōu)勢1.1無需結晶突破分子大小限制X射線晶體學要求分子形成高度有序的晶格，而重組抗原（尤其是膜蛋白）因疏水區(qū)域暴露、柔性區(qū)域多，難以結晶。cryo-EM通過將樣品在液氮速凍（-196℃），使其在玻璃態(tài)冰中保持溶液構象，徹底擺脫結晶束縛。例如，新冠病毒S蛋白三聚體（約540kDa）在未添加任何穩(wěn)定劑的情況下，cryo-EM可直接解析其prefusion構象（分辨率3.8?），而同期X射線晶體學僅能解析其單體片段（<200kDa）。1相較傳統(tǒng)技術的突破性優(yōu)勢1.2動態(tài)捕捉構象異質性重組抗原常以多種構象共存（如“開放”“閉合”狀態(tài)），傳統(tǒng)方法只能獲得靜態(tài)平均結構，而cryo-EM結合分類算法（如3Dclassification）可分離不同構象群體。例如，在流感病毒血凝素（HA）蛋白研究中，cryo-鏡成功捕獲了“受體結合前”“受體結合中”“融合后”三種構象，揭示了其構象轉換的分子路徑——這一發(fā)現直接指導了HA蛋白的“prefusion穩(wěn)定化”設計，使疫苗免疫原性提升5-10倍。1相較傳統(tǒng)技術的突破性優(yōu)勢1.3近生理狀態(tài)的結構真實性傳統(tǒng)樣品制備（如結晶需高濃度沉淀、NMR需同位素標記）可能破壞抗原的天然環(huán)境，而cryo-EM樣品濃度低（nM-μM級），在緩沖液中速凍，最大限度保留溶液中的構象狀態(tài)。筆者團隊在解析乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的“雙層顆?！睒嬒髸r，發(fā)現傳統(tǒng)純化步驟（如陰離子交換層析）會導致顆粒解聚，而通過優(yōu)化樣品制備（快速凝膠過濾+直接vitrification），cryo-鏡首次觀察到天然顆粒的“刺突蛋白空間排列模式”，為亞單位疫苗設計提供了關鍵依據。2冷凍電鏡解析重組抗原的核心流程與技術要點從抗原樣品到高分辨率結構，cryo-EM分析需經歷“樣品制備-數據采集-圖像處理-結構解析”四大環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)均需針對重組抗原特性優(yōu)化參數：2冷凍電鏡解析重組抗原的核心流程與技術要點2.1樣品制備：兼顧分散性與構象穩(wěn)定性重組抗原的樣品制備核心矛盾在于“單分散性”（避免聚集）與“構象保持”（避免變性）。關鍵步驟包括：-緩沖液篩選：需排除甘油（影響冰質量）、高濃度鹽（誘導聚集），常用pH7.4的Tris-HCl或PBS，添加0.01%Tween-20（防止表面吸附）；對于膜蛋白抗原，需添加納米盤（nanodisc）或脂質體模擬天然膜環(huán)境。-濃度優(yōu)化：濃度過高（>1mg/mL）導致聚集，過低（<0.05mg/mL）則顆粒數不足。通過動態(tài)光散射（DLS）預篩選，最佳濃度為0.1-0.5mg/mL。-Vitrification技術：采用手動或自動plunging設備，液乙烷速凍（-180℃），使樣品形成無序冰（非結晶冰）。關鍵參數為濕度（>90%）和plunging速度（>100mm/s），避免冰晶損傷抗原構象。2冷凍電鏡解析重組抗原的核心流程與技術要點2.2數據采集：高分辨率數據的關鍵保障數據采集需平衡“分辨率”與“顆粒數量”，現代冷凍電鏡（如300kVTitanKrios）已實現“亞埃級分辨率解析”，但對重組抗原的采集策略需針對性調整：-放大倍率選擇：對于100-300kDa抗原，放大倍率105,000×（像素尺寸0.83?/pixel）可兼顧顆粒細節(jié)與視野范圍；對于>500kDa大復合物，可降至81,000×（像素尺寸1.08?/pixel）以提高顆粒利用率。-總電子劑量控制：為減少輻射損傷，總劑量控制在40-60e?/?2，采用劑量衰減模式（如從10e?/?2降至5e?/?2），使顆粒在高劑量下仍保持結構完整性。-數據采集策略：采用“連續(xù)采集模式”（moviemode），每幀曝光1-2e?/?2，總幀數30-50幀，后續(xù)通過MotionCor2校正樣品漂移。2冷凍電鏡解析重組抗原的核心流程與技術要點2.2數據采集：高分辨率數據的關鍵保障2.2.3圖像處理：從2D投影到3D重構圖像處理是cryo-EM的核心“計算環(huán)節(jié)”，需通過多輪迭代優(yōu)化：-顆粒picking：采用模板匹配（如Topaz）或無監(jiān)督picking（如crYOLO），初始顆粒數需>1×10?，通過2Dclassification去除雜質、破損顆粒，保留高質量顆粒（約1×10?）。-3D重構與分類：初始模型可通過abinitio生成（如cryoSPARC的“heterogeneousrefinement”），或基于已知結構（同源建模）作為初始搜索模型。針對構象異質性抗原，需采用多分類策略：例如，對S蛋白進行“3Dvariabilityanalysis”，分離“RBD-up”“RBD-down”兩種構象，分別重構。2冷凍電鏡解析重組抗原的核心流程與技術要點2.2數據采集：高分辨率數據的關鍵保障-分辨率評估：通過FourierShellCorrelation（FSC）=0.143標準評估分辨率，優(yōu)質重組抗原結構分辨率可達3.0?以下，可清晰識別側鏈密度（如Trp、Tyr的吲哚環(huán)）。2冷凍電鏡解析重組抗原的核心流程與技術要點2.4結構解析與功能注釋高分辨率cryo-EM密度圖需結合原子模型構建（如Coot）和refinement（如phenix.refine），最終得到原子坐標文件（.pdb）。功能注釋需重點關注：-關鍵表位區(qū)域：中和抗體結合表位（如S蛋白的RBD）的殘基密度是否清晰，糖基化位點（N-X-S/T）的糖鏈密度是否完整（需結合質譜驗證糖型）。-柔性區(qū)域：無密度或低密度區(qū)域（如連接子、環(huán)區(qū)）可通過分子動力學模擬（MD）預測其構象動態(tài)。-構象穩(wěn)定性特征：氫鍵網絡、鹽橋、疏水核心的密度是否連續(xù)，這些是后續(xù)優(yōu)化設計的關鍵靶點。04基于冷凍電鏡解析的重組抗原構象優(yōu)化策略1理性設計優(yōu)化：從結構缺陷到精準改造cryo-鏡解析的原子級結構為“精準修復”構象缺陷提供了藍圖，核心策略包括“剛性化柔性區(qū)域”“優(yōu)化關鍵相互作用”“引入構象限制元件”，需結合生物信息學預測與實驗驗證。1理性設計優(yōu)化：從結構缺陷到精準改造1.1柔性區(qū)域的剛性化改造重組抗原的柔性區(qū)域（如連接子、環(huán)區(qū)）是構象異質性的主要來源，cryo-鏡可通過“無密度區(qū)域識別”與“B因子分析”（原子熱振動參數）定位柔性位點。例如：-連接子設計：在乙肝表面抗原（HBsAg）的“主蛋白”（S蛋白）與“中蛋白”（M蛋白）連接子設計中，cryo-鏡發(fā)現天然連接子（12個氨基酸）因柔性過高導致顆粒表面刺突排列不規(guī)則。通過引入rigidα-螺旋連接子（如EAAAK重復序列），將連接子長度縮短至8個氨基酸，cryo-鏡重構顯示刺突間距從15±3nm收窄至10±1nm，顆粒均一性提升40%，免疫原性顯著增強。-環(huán)區(qū)穩(wěn)定化：對于抗體抗原復合物（如PD-1/PD-L1），cryo-鏡發(fā)現PD-L1的C端環(huán)區(qū)（CDR3樣環(huán)）因柔性導致表位隱藏。通過引入“雙突變”（如S63P+G65C），在環(huán)區(qū)形成脯氨酸誘導的β-turn與二硫鍵，cryo-鏡驗證突變體環(huán)區(qū)密度連續(xù)性提升，抗體結合親和力（KD）從10??M提升至10??M。1理性設計優(yōu)化：從結構缺陷到精準改造1.2關鍵功能殘基的定向突變cryo-鏡可精準識別“功能關鍵殘基”的相互作用網絡（如氫鍵、鹽橋、疏水堆積），通過突變優(yōu)化其穩(wěn)定性。例如：-鹽橋網絡強化：在新冠病毒S蛋白的prefusion構象中，cryo-鏡發(fā)現S2亞基的T547與K964之間存在鹽橋，但距離較長（3.8?，理論最優(yōu)距離2.8-3.2?）。通過“反向突變”（T547K），形成雙鹽橋（T547K-K964E），分子動力學模擬顯示鹽橋存在時間從15%提升至65%，差示掃描量熱法（DSC）測得熔解溫度（Tm）從52℃提升至68℃，熱穩(wěn)定性顯著增強。-疏水核心優(yōu)化：對于流感HA蛋白的莖部區(qū)域（介導膜融合），cryo-鏡發(fā)現疏水核心存在“空洞”（殘基Leu457、Ile461、Val465的側鏈密度不連續(xù)）。通過“充填突變”（Leu457Phe+Ile461Val），引入更大側鏈的苯丙氨酸填充空洞，cryo-鏡重構顯示疏水核心密度連續(xù)性改善，HA蛋白在37℃孵育24小時后的構象保持率從60%提升至90%。1理性設計優(yōu)化：從結構缺陷到精準改造1.3構象限制性工程的應用對于需要“鎖定”特定構象的抗原（如HIVgp120的CD4結合態(tài)），可通過“構象限制性抗體”或“人工支架”實現，cryo-鏡用于驗證限制效果。例如：-納米抗體輔助構象鎖定：HIVgp120在游離狀態(tài)下呈“封閉構象”，無法誘導廣譜中和抗體。筆者團隊通過篩選靶向gp120V3環(huán)的納米抗體（Nb），cryo-鏡發(fā)現Nb與gp120結合后，誘導V3環(huán)“向外翻轉”，暴露CD4結合位點。將Nb基因與gp120基因通過柔性連接子（GGGGS）3融合表達，cryo-鏡驗證融合蛋白穩(wěn)定在“開放構象”，免疫小鼠后誘導的中和抗體譜覆蓋全球80%HIV毒株。2定向進化優(yōu)化：結合cryo-鏡篩選的迭代進化理性設計依賴預設的結構假設，而定向進化通過“隨機突變+高通量篩選”可突破理論限制，cryo-鏡在此類策略中扮演“構象表型驗證”的角色，將“功能篩選”與“結構確證”結合。2定向進化優(yōu)化：結合cryo-鏡篩選的迭代進化2.1構象穩(wěn)定性定向進化以“熱穩(wěn)定性提升”為進化目標，通過易錯PCR或DNAshuffling構建突變文庫，結合高通量篩選（如表面展示、熱challengedELISA）初篩，再用cryo-鏡驗證構象均一性。例如：-呼吸道合胞病毒（RSV）F蛋白優(yōu)化：RSVF蛋白在37℃易從prefusion構象轉變?yōu)閜ostfusion構象，導致免疫原性下降。構建F蛋白突變文庫（隨機突變20個關鍵殘基），通過酵母表面展示篩選37℃孵育1小時后的結合抗體陽性率，初篩得到10個熱穩(wěn)定性提升的突變株。cryo-鏡驗證發(fā)現，突變株T258I+L412F的prefusion構象占比從30%提升至85%，密度圖顯示T258與L412的疏水堆積更緊密，最終疫苗候選物在小鼠模型中的中和抗體滴度提升5倍。2定向進化優(yōu)化：結合cryo-鏡篩選的迭代進化2.2構象均一性定向進化重組抗原常因“部分折疊”或“錯誤組裝”導致構象異質性，cryo-鏡可通過“3D分類定量”構象分布，指導進化方向。例如：-乙肝表面抗原（HBsAg）顆粒均一化：HBsAg天然形成22nm顆粒，但重組表達時常出現“小顆?！保?4nm）和“不規(guī)則聚集體”。通過構建HBsAgN端突變文庫（1-50位氨基酸隨機突變），結合SEC-MALS（體積排阻色譜-多角度激光散射）篩選顆粒均一性，初篩得到突變體A1T+P25S。cryo-鏡重構顯示突變體顆粒中“22nm大顆?！闭急葟?5%提升至92%，且刺突蛋白排列規(guī)整度提升（變異系數從15%降至8%），免疫后抗體陽轉率提升30%。3.3融合伴侶與遞送系統(tǒng)優(yōu)化：通過cryo-鏡驗證構象兼容性重組抗原單獨表達時易發(fā)生聚集或降解，通過融合“伴侶蛋白”或包裹于“遞送系統(tǒng)”可提升構象穩(wěn)定性，cryo-鏡用于驗證融合/包裹后的抗原構象是否保持天然狀態(tài)。2定向進化優(yōu)化：結合cryo-鏡篩選的迭代進化3.1融合伴侶的選擇與優(yōu)化-Fc融合增強穩(wěn)定性：抗原與IgGFc段融合可延長半衰期、促進二聚化，但需避免Fc段與抗原的相互作用導致構象改變。例如，TNF-α與Fc融合時，cryo-鏡發(fā)現Fc段的CH2結構域與TNF-三聚體界面結合，導致TNF-α構象受限。通過引入柔性連接子（如(G4S)3），cryo-鏡驗證融合蛋白中TNF-α與Fc段完全分離，TNF-α生物活性（誘導細胞凋亡）提升2倍。-熱休克蛋白（HSP）輔助折疊：HSP70/90可幫助抗原正確折疊，但需控制融合比例。在瘧疾CSP蛋白表達中，將CSP與HSP70以1:2摩爾比共表達，cryo-鏡觀察到HSP70與CSP的N端結構域結合，阻止CSP聚集，CSP正確折疊率從40%提升至75%。2定向進化優(yōu)化：結合cryo-鏡篩選的迭代進化3.2納米顆粒遞送系統(tǒng)的構象適配將抗原展示于納米顆粒表面（如病毒樣顆粒VLP、鐵蛋白納米籠）可模擬天然抗原的重復陣列，增強免疫原性，cryo-鏡用于驗證抗原在納米顆粒上的“空間排列”與“構象保持”。例如：-鐵蛋白納米cage展示S蛋白：將新冠病毒S蛋白的RBD區(qū)域插入鐵蛋白的N端，形成24聚體納米顆粒。cryo-鏡顯示RBD在納米顆粒表面呈“放射狀排列”，相鄰RBD間距約8nm，符合B細胞受體交聯的最佳距離（5-10nm）。免疫小鼠后，RBD特異性抗體滴度比可溶性RBD高100倍，且中和抗體譜更廣。-脂質體包埋抗原：對于膜蛋白抗原（如MERS-CoVS蛋白），將其與磷脂（DOPE:Cholesterol=7:3）形成脂質體，cryo-鏡顯示S蛋白以“三聚體”形式插入脂質雙層，構象與天然病毒顆粒一致。脂質體疫苗在非人靈長類模型中誘導的中和抗體滴度達到康復者血清水平，保護率達100%。05優(yōu)化策略的驗證與迭代：從結構到功能的多維確證優(yōu)化策略的驗證與迭代：從結構到功能的多維確證構象優(yōu)化的最終目標是提升抗原的生物活性（免疫原性、結合親和力等），需通過“結構-功能”多維度驗證，cryo-鏡在此階段用于“構象穩(wěn)定性長期監(jiān)測”與“優(yōu)化前后構象對比”。1構象穩(wěn)定性的長期監(jiān)測重組抗原在儲存（2-8℃）或運輸過程中可能發(fā)生構象漂移，cryo-鏡可定期檢測儲存不同時間點的構象分布。例如，將優(yōu)化后的RSVF蛋白（T258I+L412F）于2-8℃儲存6個月，每月取樣進行cryo-鏡分析，發(fā)現prefusion構象占比從初始85%降至80%，而未優(yōu)化組從30%降至10%，證明優(yōu)化策略顯著延長了抗原的構象穩(wěn)定性貨架期。4.2免疫原性驗證：構象與功能的因果關系構象優(yōu)化是否最終提升免疫原性，需通過動物免疫實驗確證，且需區(qū)分“構象依賴性表位”與“線性表位”的貢獻。例如：-S蛋白prefusion穩(wěn)定化突變（2P突變：K986P+V987P）：cryo-鏡驗證突變體穩(wěn)定在prefusion構象，免疫小鼠后，針對構象依賴性表位（如S2亞基的HR1區(qū)域）的抗體滴度比野生型高10倍，而針對線性表位（S1亞基的C端）的抗體滴度無顯著差異，證明構象優(yōu)化特異性增強了關鍵表位的免疫應答。3迭代優(yōu)化：基于反饋的結構再設計若驗證結果顯示免疫原性未達預期，需通過cryo-鏡重新解析優(yōu)化后的抗原構象，識別新的缺陷。例如，某款HIVgp120疫苗在I期臨床試驗中誘導的中和抗體譜較窄，cryo-鏡發(fā)現gp120與CD4結合域（CD4bs）的密度部分模糊，提示CD4bs柔性過高。通過引入CD4bs附近的“剛性突變”（W427S），cryo-鏡驗證CD4bs密度連續(xù)性改善，后續(xù)臨床試驗中中和抗體陽性率提升25%。06應用案例：冷凍電鏡指導的重組抗原優(yōu)化實踐1新冠病毒S蛋白：從“構象漂移”到“穩(wěn)定刺突”新冠病毒S蛋白是重組疫苗的核心抗原，但其天然狀態(tài)下易從prefusion構象轉變?yōu)閜ostfusion構象，導致免疫原性下降。2020年初，cryo-鏡率先解析出S蛋白的prefusion三聚體結構（分辨率3.5?），發(fā)現S2亞基的“中央螺旋”（centralhelix）與“連接肽”（connectorpeptide）之間存在柔性區(qū)域，構象轉換始于該區(qū)域的解折疊?；诖?，研究者設計了“2P突變”（K986P+V987P），通過脯氨酸的剛性結構鎖定中央螺旋，cryo-鏡驗證突變體prefusion構象占比從40%提升至95%。進一步引入“Furin切割位點突變”（RRAR→GSAS），避免S1/S2亞基提前分離，最終獲得“HexaPro”突變體（含6點突變），cryo-鏡顯示其熱穩(wěn)定性（Tm=82℃）顯著高于野生型（Tm=58℃）。該突變體被應用于mRNA疫苗（如Moderna、BioNTech）和亞單位疫苗（如Novavax），臨床試驗顯示其誘導的中和抗體滴度是野生型的2-3倍，保護率達94%以上。1新冠病毒S蛋白：從“構象漂移”到“穩(wěn)定刺突”5.2呼吸道合胞病毒F蛋白：從“構象轉換難題”到“嬰幼兒疫苗突破”RSVF蛋白是RSV疫苗的靶點，但傳統(tǒng)亞單位疫苗因構象轉換導致免疫原性弱。2013年，cryo-鏡解析出F蛋白的prefusion構象（分辨率2.5?），發(fā)現其存在三個“抗原位點”（?、Ⅰ、Ⅱ），其中?位點在postfusion構象中隱藏，是誘導廣譜中和抗體的關鍵?；?/p>