酵母雙雜交實驗步驟詳解一、實驗原理概述酵母雙雜交技術(shù)（YeastTwo-HybridSystem）依托轉(zhuǎn)錄因子的模塊化結(jié)構(gòu)實現(xiàn)蛋白互作檢測。以經(jīng)典的GAL4系統(tǒng)為例，轉(zhuǎn)錄因子GAL4包含DNA結(jié)合域（BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（AD）：BD負(fù)責(zé)結(jié)合報告基因的啟動子區(qū)域，AD則招募轉(zhuǎn)錄機器以啟動基因表達。當(dāng)誘餌蛋白（與BD融合）和靶蛋白（與AD融合）發(fā)生相互作用時，BD與AD會因蛋白互作在空間上靠近，形成有功能的轉(zhuǎn)錄因子，進而激活下游報告基因（如*HIS3*、*ADE2*、*LacZ*）的表達。通過營養(yǎng)缺陷篩選（如在缺失His、Ade的培養(yǎng)基中篩選）或顯色反應(yīng)（如用X-gal檢測LacZ），即可判斷蛋白是否存在互作。二、實驗材料準(zhǔn)備1.菌株與載體酵母菌株：常用AH109（含*HIS3*、*ADE2*、*LacZ*報告基因，營養(yǎng)缺陷型為*trp1-901*、*leu2-3,112*）、Y187（可用于單雜交或文庫篩選）；質(zhì)粒載體：誘餌載體（如pGBKT7，含*TRP1*標(biāo)記、GAL4-BD）、靶載體（如pGADT7，含*LEU2*標(biāo)記、GAL4-AD）；大腸桿菌菌株：*DH5α*或*Top10*（用于質(zhì)粒擴增）。2.培養(yǎng)基與試劑酵母培養(yǎng)基：YPD（全營養(yǎng)培養(yǎng)基，用于菌株活化）、SD系列缺陷培養(yǎng)基（如SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade，可按需添加3-AT以抑制*HIS3*本底）；轉(zhuǎn)化試劑：50%PEG3350、1MLiAc（醋酸鋰）、TE緩沖液（pH7.5）、變性鮭魚精DNA（ssDNA，新鮮制備或-20℃保存）；分子克隆試劑：限制性內(nèi)切酶（如*Eco*RⅠ、*Bam*HⅠ）、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR試劑；驗證試劑：X-gal（LacZ顯色）、ONPG（β-半乳糖苷酶活性定量）、蛋白上樣緩沖液、抗體（如HA、Myc標(biāo)簽抗體，用于Westernblot驗證蛋白表達）。3.儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱（30℃，用于酵母培養(yǎng)）、搖床（30℃，用于液體培養(yǎng)）、高速離心機、PCR儀、超凈工作臺、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀（用于定量β-半乳糖苷酶活性）。三、實驗步驟詳解1.誘餌與靶蛋白的載體構(gòu)建（1）目的基因擴增與克隆從cDNA文庫或基因組DNA中擴增目的基因（誘餌或靶蛋白的編碼序列），設(shè)計引物時需確保閱讀框正確（即目的基因與載體的BD/AD編碼框完全匹配，避免移碼突變）。例如，pGBKT7的多克隆位點閱讀框為：`...ATG(BD)-[MCS]-...`，需保證目的基因的起始密碼子與BD的終止密碼子（或酶切位點后的序列）閱讀框連續(xù)。（2）載體酶切與連接用相同的限制性內(nèi)切酶（如*Eco*RⅠ+*Bam*HⅠ）酶切載體（pGBKT7/pGADT7）和目的基因PCR產(chǎn)物，膠回收純化；按載體:插入片段=1:3~1:10的摩爾比，加入T4DNA連接酶，16℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化*DH5α*感受態(tài)細(xì)胞，涂布含相應(yīng)抗生素（如卡那霉素、氨芐青霉素）的LB平板，37℃培養(yǎng)12~16h。（3）陽性克隆驗證挑取單菌落，用菌落PCR或質(zhì)粒雙酶切驗證插入片段；對陽性克隆進行測序，確認(rèn)閱讀框、序列完整性無誤后，提取質(zhì)粒備用。2.酵母菌株的準(zhǔn)備（1）菌株活化從-80℃凍存管中取少量AH109菌株，接種至YPD液體培養(yǎng)基（或平板），30℃搖床培養(yǎng)16~20h（液體培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200rpm），使菌株復(fù)蘇并達到對數(shù)生長期（OD???≈1.0~1.5）。（2）感受態(tài)細(xì)胞制備（LiAc/PEG法）取1~5mL活化的酵母菌液，5000rpm離心5min收集菌體；用10mL無菌水重懸，離心洗滌2次；用1mLTE/LiAc（10mMTris-HClpH7.5，1mMEDTA，0.1MLiAc）重懸菌體，調(diào)整OD???至1.0左右，即為感受態(tài)細(xì)胞（現(xiàn)用現(xiàn)制或4℃保存不超過24h）。3.質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化與初篩（1）轉(zhuǎn)化體系配制在無菌EP管中依次加入：感受態(tài)細(xì)胞100μL；誘餌質(zhì)粒（pGBKT7-誘餌）1~5μg；靶質(zhì)粒（pGADT7-靶）1~5μg；變性ssDNA（新鮮煮沸后冰浴）50μL；50%PEG3350600μL；輕輕混勻，30℃靜置30min（或搖床緩慢振蕩）。（2）熱激與復(fù)蘇42℃水浴熱激15~20min（注意時間與溫度準(zhǔn)確性，影響轉(zhuǎn)化效率）；5000rpm離心5min，棄上清；用100μL無菌水重懸菌體，涂布于SD/-Trp-Leu雙缺培養(yǎng)基（篩選同時含*TRP1*、*LEU2*標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子），30℃倒置培養(yǎng)3~5天，至單菌落出現(xiàn)。4.互作驗證與篩選（1）營養(yǎng)缺陷篩選（初篩）用滅菌牙簽挑取雙缺平板上的單菌落，點種至SD/-Trp-Leu-His三缺培養(yǎng)基（或SD/-Trp-Leu-His-Ade四缺培養(yǎng)基），同時可在培養(yǎng)基中添加3-AT（如10~50mM）抑制*HIS3*基因的本底表達（減少假陽性）；30℃培養(yǎng)3~7天，觀察菌落生長：能在三缺/四缺培養(yǎng)基生長的菌落，提示誘餌與靶蛋白可能存在互作（因*HIS3*/*ADE2*報告基因被激活）。（2）報告基因驗證（復(fù)篩）LacZ顯色驗證：將初篩陽性菌落接種至SD/-Trp-Leu液體培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)至OD???≈1.0；取1mL菌液，離心收集菌體，用Z緩沖液重懸，加X-gal（終濃度0.8mg/mL），30℃避光孵育，觀察藍色出現(xiàn)（藍色越深，互作越強）。β-半乳糖苷酶活性定量（ONPG法）：按上述方法收集菌體，用液氮凍融或玻璃珠破碎法裂解細(xì)胞；加入ONPG底物，30℃反應(yīng)至出現(xiàn)黃色，加Na?CO?終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測定OD???，計算酶活性（公式：酶活性=1000×OD???/(t×V×OD???)，t為反應(yīng)時間，V為菌液體積）。Westernblot驗證：提取酵母總蛋白，用HA、Myc等標(biāo)簽抗體檢測誘餌（如pGBKT7帶Myc標(biāo)簽）和靶蛋白（如pGADT7帶HA標(biāo)簽）的表達，排除“無互作但報告基因激活”的假陽性（如誘餌蛋白自激活）。5.自激活檢測（關(guān)鍵質(zhì)控步驟）將誘餌質(zhì)粒（pGBKT7-誘餌）單獨轉(zhuǎn)化AH109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于：SD/-Trp培養(yǎng)基（驗證轉(zhuǎn)化成功）；SD/-Trp-His（或SD/-Trp-His-Ade）培養(yǎng)基（加3-AT）；若轉(zhuǎn)化子在SD/-Trp-His培養(yǎng)基上生長，說明誘餌蛋白自身可激活報告基因（自激活），需通過截短蛋白、點突變或更換弱啟動子載體（如pGBKT7-Δ）優(yōu)化，或降低篩選壓力（如減少3-AT濃度）。四、實驗關(guān)鍵注意事項1.閱讀框準(zhǔn)確性：克隆時務(wù)必通過測序驗證目的基因與載體的閱讀框，移碼突變會導(dǎo)致融合蛋白錯誤，徹底喪失互作檢測功能。2.菌株活力與轉(zhuǎn)化效率：酵母菌株需新鮮活化（對數(shù)生長期），轉(zhuǎn)化時ssDNA需新鮮變性（煮沸后冰?。?，PEG/LiAc的濃度與質(zhì)量直接影響轉(zhuǎn)化效率。3.假陽性控制：嚴(yán)格進行自激活檢測，篩選時增加3-AT濃度、使用四缺培養(yǎng)基（同時篩選*HIS3*+*ADE2*），或結(jié)合LacZ顯色與Westernblot驗證，減少“非特異性互作”或“自激活”導(dǎo)致的假陽性。4.培養(yǎng)基選擇：不同酵母菌株的報告基因組合不同（如AH109含*HIS3*/*ADE2*/*LacZ*，Y187含*LacZ*/*HIS3*），需根據(jù)菌株說明書選擇對應(yīng)的缺陷培養(yǎng)基。五、常見問題與解決策略問題現(xiàn)象可能原因解決方法------------------------------雙缺平板無菌落生長轉(zhuǎn)化失?。ㄙ|(zhì)粒濃度低、菌株失活）重新制備感受態(tài)，確保質(zhì)粒濃度>1μg/μL，熱激時間嚴(yán)格控制在15~20min三缺/四缺平板大量菌落生長（假陽性）誘餌自激活、靶庫污染重做自激活檢測，優(yōu)化3-AT濃度（如提高至50mM），重新構(gòu)建靶載體或更換文庫無陽性克隆但蛋白表達正常互作強度弱、篩選條件過嚴(yán)降低3-AT濃度，延長培養(yǎng)時間（至7天），或換用更敏感的報告菌株（如Y2HGold）蛋白無表達（Westernblot陰性）密碼子偏好、啟動子沉默優(yōu)化酵母偏好密碼子（如替換稀有密碼子），檢查質(zhì)粒是否整合到酵