宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)：解鎖海洋無脊椎動物RNA病毒組奧秘的鑰匙一、引言1.1研究背景與意義海洋占據(jù)了地球表面約70%的面積，是地球上最為龐大且復雜的生態(tài)系統(tǒng)之一，蘊藏著豐富的生物資源。海洋無脊椎動物作為海洋生物群落的重要組成部分，種類繁多、數(shù)量巨大，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量流動以及食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)中扮演著關(guān)鍵角色。然而，海洋無脊椎動物易受到各種病原體的侵襲，其中RNA病毒是一類重要的病原體，它們能夠感染海洋無脊椎動物，對其健康和生存產(chǎn)生嚴重威脅。海洋無脊椎動物RNA病毒的研究對于理解海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定具有重要意義。病毒作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中數(shù)量最為豐富的生物實體，參與了海洋生物地球化學循環(huán)、食物鏈的調(diào)控以及生物群落結(jié)構(gòu)的塑造。RNA病毒感染海洋無脊椎動物后，可能導致宿主個體的死亡、種群數(shù)量的下降以及群落結(jié)構(gòu)的改變，進而影響整個海洋生態(tài)系統(tǒng)的功能和穩(wěn)定性。例如，某些RNA病毒感染貝類后，會導致貝類大量死亡，破壞海洋底棲生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能；感染蝦類的RNA病毒則可能影響蝦類的生長、繁殖和免疫能力，對海洋漁業(yè)資源造成損失。因此，深入研究海洋無脊椎動物RNA病毒組，有助于揭示病毒在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的生態(tài)角色和作用機制，為保護海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康和穩(wěn)定提供科學依據(jù)。從生物安全角度來看，海洋無脊椎動物RNA病毒的研究具有重要的現(xiàn)實意義。隨著海洋經(jīng)濟的快速發(fā)展，海洋養(yǎng)殖、海洋捕撈等產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴大，海洋生物的跨區(qū)域運輸和貿(mào)易日益頻繁，這增加了海洋無脊椎動物RNA病毒傳播和擴散的風險。一些病毒可能通過感染海洋無脊椎動物，影響海洋養(yǎng)殖生物的健康，導致養(yǎng)殖產(chǎn)量下降、質(zhì)量降低，給海洋養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。此外，一些病毒還可能對人類健康構(gòu)成潛在威脅，如某些海洋無脊椎動物攜帶的病毒可能通過食物鏈傳遞給人類，引發(fā)人類疾病。因此，開展海洋無脊椎動物RNA病毒組研究，能夠及時發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測潛在的病毒威脅，為制定有效的生物安全防控策略提供技術(shù)支持，保障海洋產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和人類健康。研究海洋無脊椎動物RNA病毒組對于揭示病毒的進化歷程和遺傳多樣性也具有不可替代的作用。RNA病毒具有較高的突變率和重組率，其基因組結(jié)構(gòu)和遺傳信息復雜多樣。通過對海洋無脊椎動物RNA病毒組的研究，可以發(fā)現(xiàn)大量新的病毒種類和基因序列，豐富對病毒遺傳多樣性的認識。這些新發(fā)現(xiàn)的病毒資源為研究病毒的進化起源、進化機制以及病毒與宿主之間的協(xié)同進化關(guān)系提供了寶貴的素材。例如，通過對不同海域、不同宿主的海洋無脊椎動物RNA病毒組進行比較分析，可以揭示病毒在不同生態(tài)環(huán)境下的進化適應策略；研究病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系，有助于深入理解病毒的致病機制和宿主的免疫防御機制，為開發(fā)新型抗病毒藥物和疫苗提供理論基礎(chǔ)。1.2海洋無脊椎動物RNA病毒組研究現(xiàn)狀近年來，隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，海洋無脊椎動物RNA病毒組的研究取得了顯著進展，人們對其遺傳多樣性、分布和傳播等方面有了一定程度的認識，但仍存在諸多未知領(lǐng)域。在遺傳多樣性方面，研究已揭示海洋無脊椎動物RNA病毒具有令人矚目的遺傳多樣性。中國科學院上海巴斯德研究所的研究人員從不同海域采集了3門6綱58種海洋無脊椎動物樣品，運用宏轉(zhuǎn)錄組測序方法對RNA病毒組展開研究，成功鑒定出涵蓋9個病毒家族的363個RNA病毒，其中315個與已知RNA病毒相似度極低，被認定為全新的RNA病毒。這一發(fā)現(xiàn)極大地拓展了我們對海洋無脊椎動物RNA病毒遺傳多樣性的認知，表明海洋中可能蘊藏著大量尚未被發(fā)現(xiàn)的病毒種類。不同海域的海洋無脊椎動物RNA病毒組也呈現(xiàn)出明顯的差異，這種差異可能與海洋環(huán)境的復雜性以及宿主的多樣性密切相關(guān)。比如，深海區(qū)域由于其獨特的高壓、低溫和黑暗環(huán)境，可能孕育著與淺海區(qū)域截然不同的RNA病毒群落。然而，目前我們對于海洋無脊椎動物RNA病毒遺傳多樣性的認識還僅僅是冰山一角，還有大量的海洋生態(tài)環(huán)境和無脊椎動物物種尚未被深入研究，新的病毒種類和遺傳特征仍有待被發(fā)現(xiàn)。關(guān)于分布情況，海洋無脊椎動物RNA病毒廣泛分布于全球各大洋，從熱帶海域到極地海域，從淺海到深海，幾乎在所有的海洋生態(tài)環(huán)境中都能檢測到它們的存在。研究表明，病毒的分布與宿主的分布以及海洋環(huán)境因素緊密相連。某些RNA病毒可能特異性地感染特定種類的海洋無脊椎動物，因此其分布范圍受到宿主分布的限制；而海水溫度、鹽度、營養(yǎng)物質(zhì)含量等環(huán)境因素也會對病毒的生存和傳播產(chǎn)生影響。在溫度較高的熱帶海域，一些病毒的活性和傳播速度可能會加快；而在營養(yǎng)物質(zhì)豐富的海域，宿主生物的數(shù)量增加，也可能為病毒提供更多的感染機會，從而影響病毒的分布。盡管如此，目前我們對于海洋無脊椎動物RNA病毒在不同海洋生態(tài)系統(tǒng)中的具體分布模式和規(guī)律的了解還不夠全面和深入，尤其是在一些極端海洋環(huán)境和偏遠海域，相關(guān)研究還十分匱乏。在傳播模式上，雖然已有研究揭示了不同海域間、不同宿主類別間可能存在病毒傳播現(xiàn)象，但對于其具體的傳播途徑和機制，我們?nèi)匀恢跎?。海洋無脊椎動物之間的直接接觸、食物鏈傳遞以及海水的流動都可能是病毒傳播的潛在途徑。比如，當感染病毒的小型無脊椎動物被其他動物捕食時，病毒可能會隨之進入新的宿主體內(nèi)，從而實現(xiàn)傳播；海水的流動則可能攜帶病毒在不同海域之間擴散。此外，人類活動，如海洋貿(mào)易、海洋養(yǎng)殖和海上運輸?shù)?，也可能對海洋無脊椎動物RNA病毒的傳播產(chǎn)生影響。然而，這些傳播途徑和機制還需要更多的實驗研究和實地調(diào)查來進一步證實和完善，我們對于病毒在傳播過程中與宿主之間的相互作用以及環(huán)境因素對傳播的影響等方面的認識還存在很大的空白。1.3宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)簡介1.3.1宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的原理宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)是一門在整體水平上研究某一特定環(huán)境、特定時期群體生物全基因組轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學科。其核心在于能夠檢測和比較大量基因的表達水平，為研究生物群落的功能和生態(tài)提供關(guān)鍵信息。宏轉(zhuǎn)錄組測序的流程主要分為樣品準備、樣品標記和數(shù)據(jù)分析三個關(guān)鍵步驟。在樣品準備階段，首先要從特定環(huán)境樣本中獲取生物材料，這些樣本來源廣泛，對于海洋無脊椎動物RNA病毒組研究而言，樣本可能取自不同海域、不同種類的海洋無脊椎動物。隨后，需要運用物理、化學或酶學方法將樣品分解成小片段，以便后續(xù)檢測基因表達水平。比如，可通過超聲破碎、酶切等技術(shù)將生物樣品中的核酸大分子打斷成合適長度的片段，這些小片段更易于操作和分析。樣品標記環(huán)節(jié)也至關(guān)重要，在每個片段上添加特定標記，能夠方便在后續(xù)測序過程中識別。常見的標記方法有熒光標記、放射性標記等。以熒光標記為例，通過將熒光分子連接到核酸片段上，在測序時利用熒光信號的檢測來確定片段的序列信息，這種方式能夠顯著提高測序的準確性和效率。最后是數(shù)據(jù)分析階段，利用強大的計算機系統(tǒng)和專業(yè)的生物信息學軟件對測序得到的數(shù)據(jù)進行深度分析。通過一系列算法和統(tǒng)計模型，能夠檢測基因表達水平，比較不同樣品或同一樣品在不同條件下的基因表達差異。例如，通過計算基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，確定哪些基因在特定環(huán)境或生理狀態(tài)下表達上調(diào)或下調(diào)，進而推斷這些基因在生物過程中的功能。同時，還可以通過基因注釋和功能富集分析，了解基因所參與的生物學途徑和代謝過程，揭示生物群落的功能特征和生態(tài)適應性。1.3.2宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在病毒組研究中的優(yōu)勢宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中具有顯著優(yōu)勢，為病毒研究領(lǐng)域帶來了新的突破和發(fā)展機遇。該技術(shù)最大的優(yōu)勢之一在于能夠捕獲環(huán)境中的所有RNA病毒片段，這是傳統(tǒng)病毒檢測方法難以企及的。傳統(tǒng)方法往往依賴于病毒的分離培養(yǎng)，而許多海洋RNA病毒由于其特殊的生存環(huán)境和宿主依賴性，難以在實驗室條件下培養(yǎng)，這就導致大量病毒無法被發(fā)現(xiàn)和研究。宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)則繞過了培養(yǎng)環(huán)節(jié)，直接對環(huán)境樣本中的RNA進行測序，從而能夠獲取所有病毒的遺傳信息，無論是已知病毒還是全新的未知病毒，都能被有效檢測到。中國科學院上海巴斯德研究所的研究團隊在對海洋無脊椎動物RNA病毒組的研究中，利用宏轉(zhuǎn)錄組測序方法，從不同海域采集的樣本中成功鑒定出了大量與已知RNA病毒相似度極低的全新病毒，這充分展示了宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新病毒方面的強大能力。宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在病毒檢測方面具有高靈敏度和全面性。它可以同時檢測多種病毒，無論病毒的濃度高低，都有可能被檢測到。這一特性使得在復雜的海洋環(huán)境中，即使病毒含量極低，也能被精準識別。與基于PCR的方法相比，宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)無需預先知道病毒的序列信息來設(shè)計引物，避免了因引物特異性問題導致的漏檢情況。在檢測海洋無脊椎動物中的多種RNA病毒時，宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)能夠一次性檢測到多個病毒家族的病毒，而傳統(tǒng)PCR方法可能只能針對已知的特定病毒進行檢測，對于未知病毒則無能為力。此外，宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)還能夠提供病毒的基因序列信息，這對于研究病毒的遺傳多樣性、進化關(guān)系以及病毒與宿主之間的相互作用具有重要意義。通過對病毒基因序列的分析，可以了解病毒的進化歷程，推斷病毒的起源和傳播途徑。比如，通過比較不同海域、不同宿主中病毒的基因序列差異，能夠揭示病毒在不同環(huán)境下的進化適應機制，以及病毒在宿主間的傳播規(guī)律，為深入研究海洋RNA病毒的生態(tài)和生物學特性提供了有力的數(shù)據(jù)支持。二、宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中的應用方法2.1樣品采集與處理2.1.1采樣策略樣品采集是宏轉(zhuǎn)錄組研究的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，其策略的科學性和合理性直接關(guān)系到后續(xù)研究結(jié)果的可靠性和代表性。在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中，中國科學院上海巴斯德研究所的科研團隊采用了全面且細致的采樣策略，為該領(lǐng)域的研究提供了寶貴的經(jīng)驗和范例。該團隊在采樣時充分考慮了海洋環(huán)境的復雜性和多樣性，從不同海域進行樣品采集。他們分別從東海、黃海、南海等多個海域收集樣本，這些海域在地理位置、水溫和鹽度、海洋生態(tài)系統(tǒng)等方面存在顯著差異。東海作為太平洋的邊緣海，受到大陸徑流和黑潮暖流的共同影響，具有獨特的海洋生態(tài)環(huán)境，其水溫、鹽度和營養(yǎng)物質(zhì)含量在不同季節(jié)和區(qū)域呈現(xiàn)出復雜的變化；黃海是一個半封閉的淺海，其海底地形較為平坦，海水交換相對較弱，導致其生態(tài)系統(tǒng)與其他海域有所不同；南海則是一個熱帶海域，水溫較高，生物多樣性豐富，擁有獨特的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)。不同海域的這些差異為研究病毒在不同環(huán)境下的分布和演化提供了豐富的樣本資源。通過對這些不同海域的海洋無脊椎動物進行采樣，能夠更全面地揭示海洋RNA病毒的遺傳多樣性和地理分布特征，有助于發(fā)現(xiàn)不同海域特有的病毒種類以及病毒在不同環(huán)境下的適應性進化機制。在物種選擇上，該團隊涵蓋了3門6綱58種海洋無脊椎動物，包括節(jié)肢動物門的蝦類、蟹類，軟體動物門的貝類、螺類，以及棘皮動物門的海參、海膽等。這些物種在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著不同的生態(tài)位，具有不同的生活習性和生理特征。蝦類和蟹類多為底棲生物，它們在海洋底部的沉積物中覓食和棲息，與海底的微生物群落密切接觸，可能攜帶多種與底棲環(huán)境相關(guān)的病毒；貝類和螺類則通過過濾海水獲取食物，它們的攝食方式使得它們?nèi)菀捉佑|到海水中的病毒顆粒；海參和海膽等棘皮動物在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著重要作用，其體內(nèi)的病毒組也可能與它們的生態(tài)功能密切相關(guān)。選擇如此豐富多樣的物種進行研究，可以深入了解病毒在不同宿主間的傳播規(guī)律、病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系，以及病毒對不同生態(tài)位生物的影響。為了確保采集到的樣品能夠真實反映海洋無脊椎動物RNA病毒組的情況，團隊在采樣過程中還嚴格控制了采樣時間和采樣深度等因素。不同季節(jié)的海洋環(huán)境會發(fā)生顯著變化，例如水溫、光照、營養(yǎng)物質(zhì)含量等，這些變化可能會影響海洋無脊椎動物的生理狀態(tài)和病毒的活性與傳播。在夏季，海洋表層水溫升高，浮游生物大量繁殖，可能導致病毒的傳播和感染率增加；而在冬季，水溫降低，海洋生物的代謝活動減緩，病毒的傳播和感染情況也可能發(fā)生變化。因此，在不同季節(jié)進行采樣，可以更好地了解病毒的季節(jié)性變化規(guī)律。采樣深度也是一個關(guān)鍵因素，海洋從表層到深層存在著明顯的生態(tài)梯度，不同深度的水壓、溫度、光照和溶解氧等環(huán)境條件差異巨大，這使得不同深度的海洋生物群落和病毒組也有所不同。淺海區(qū)域光照充足，浮游植物豐富，是許多海洋生物的棲息地，該區(qū)域的病毒組可能與浮游生物的活動密切相關(guān)；而深海區(qū)域則處于高壓、低溫、黑暗的環(huán)境中，生物種類相對較少，但這些生物可能攜帶一些適應極端環(huán)境的特殊病毒。通過采集不同深度的樣品，可以全面揭示海洋RNA病毒在垂直方向上的分布特征和生態(tài)功能。2.1.2RNA提取與質(zhì)量控制從采集的海洋無脊椎動物樣品中提取高質(zhì)量的總RNA是宏轉(zhuǎn)錄組測序的關(guān)鍵步驟，它直接影響到后續(xù)測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和分析結(jié)果的準確性。目前，常用的RNA提取方法有多種，其中Trizol法因其高效、便捷的特點在海洋生物RNA提取中得到了廣泛應用。Trizol試劑是一種由苯酚和異硫氰酸胍配制而成的單相快速抽提總RNA的試劑。在使用Trizol法提取RNA時，首先將采集的海洋無脊椎動物樣品進行預處理。對于體型較小的樣品，如小型貝類、蝦類幼體等，可以直接將整個個體放入含有Trizol試劑的勻漿器中進行勻漿處理；對于體型較大的樣品，如大型蟹類、海參等，則需要先解剖取其可能富含病毒的組織，如鰓、肝胰腺、腸道等，再放入Trizol試劑中進行勻漿。在勻漿過程中，Trizol試劑能夠迅速裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放。其中，苯酚的主要作用是變性蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)與核酸分離；異硫氰酸胍則屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，細胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。同時，Trizol試劑中還加入了8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（核糖核酸酶）的活性，保護RNA分子不被降解。0.1%的8-羥基喹啉與氯仿聯(lián)合使用可增強對RNase的抑制作用；β-巰基乙醇主要破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵，從而有效地維持RNA的完整性。勻漿后的樣品在室溫下放置5分鐘，使細胞充分裂解后，按照每1mlTrizol加0.2ml氯仿的比例加入氯仿。劇烈振蕩15秒后，在室溫下放置2-3分鐘，然后在2℃-8℃條件下以12,000g的離心力離心15分鐘。離心后，樣品會分為三層，上層為水相，含有RNA；中間層為蛋白質(zhì)和DNA；下層為有機相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，按照每1mlTrizol加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，輕輕顛倒混勻5次，在室溫下放置10分鐘，使RNA沉淀。隨后，在2℃-8℃條件下以12,000g的離心力離心10分鐘，RNA會沉淀在管底。棄去上清液，按照每1mlTrizol加1ml75%乙醇的比例加入75%乙醇進行洗滌，渦旋混合后，在2℃-8℃條件下以7500g的離心力離心5分鐘，再次棄去上清液。最后，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥，再用Rnase-freewater溶解RNA沉淀，即可得到總RNA。RNA質(zhì)量控制對于確保后續(xù)測序結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。在提取RNA后，需要對其質(zhì)量進行嚴格檢測。通常采用微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度。RNA的濃度可以通過測量260nm處的吸光度（A260）來確定，根據(jù)公式：濃度（μg/μl）=A260×稀釋倍數(shù)×40/1000進行計算。而純度則通過A260/A280的比值來評估，純凈的RNA樣品A260/A280比值應在1.8-2.2之間。如果比值低于1.8，可能表明RNA樣品中存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染；如果比值高于2.2，則可能存在RNA降解。還會使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。在電泳過程中，RNA會根據(jù)其大小在凝膠中遷移，完整的RNA會呈現(xiàn)出清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的兩倍。如果RNA發(fā)生降解，條帶會變得模糊或出現(xiàn)多條彌散的條帶。只有通過質(zhì)量檢測，確保RNA濃度、純度和完整性都符合要求的樣品，才能用于后續(xù)的宏轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒?，為準確揭示海洋無脊椎動物RNA病毒組的信息提供可靠的樣本基礎(chǔ)。2.2宏轉(zhuǎn)錄組測序流程2.2.1文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建是宏轉(zhuǎn)錄組測序的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其質(zhì)量直接影響后續(xù)測序數(shù)據(jù)的準確性和完整性。在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中，常用的文庫構(gòu)建方法主要基于RNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增技術(shù)。文庫構(gòu)建的第一步是將提取的總RNA進行片段化處理。由于RNA分子通常較長，直接測序難度較大，因此需要將其打斷成適合測序的短片段。常見的片段化方法有化學法、酶法和物理法?；瘜W法通常利用二價陽離子在高溫條件下對RNA進行隨機切割，這種方法操作相對簡單，但片段化的隨機性較強，可能導致片段長度分布不均勻。酶法是使用特定的核酸酶，如RNaseIII，對RNA進行酶切，該方法能夠產(chǎn)生相對均一的片段長度，但酶的特異性可能會影響片段化的效果。物理法如超聲破碎，通過超聲波的機械作用將RNA打斷，這種方法可以精確控制片段長度，且對RNA的損傷較小，在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中應用較為廣泛。以中國科學院上海巴斯德研究所的研究為例，他們在對海洋無脊椎動物樣品進行文庫構(gòu)建時，采用超聲破碎的方法將總RNA片段化，獲得了長度在200-500bp左右的RNA片段，為后續(xù)的文庫構(gòu)建和測序奠定了良好的基礎(chǔ)。片段化后的RNA需要進行逆轉(zhuǎn)錄，將其轉(zhuǎn)化為cDNA，以便于后續(xù)的PCR擴增和測序。逆轉(zhuǎn)錄過程使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機引物或oligo(dT)引物引導合成cDNA第一鏈。隨機引物可以與RNA的任意位置結(jié)合，適用于各種類型的RNA，包括病毒RNA和宿主RNA；而oligo(dT)引物則特異性地與mRNA的poly(A)尾結(jié)合，主要用于富集mRNA。在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中，由于我們關(guān)注的是所有的RNA病毒，因此通常采用隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄，以確保能夠捕獲到各種病毒的RNA信息。逆轉(zhuǎn)錄反應體系中還需要加入dNTPs、緩沖液、RNase抑制劑等成分，以保證逆轉(zhuǎn)錄反應的順利進行。例如，在某研究中，逆轉(zhuǎn)錄反應體系包含5μl的RNA模板、1μl的隨機引物（50μM）、1μl的dNTPs（10mM）、4μl的5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、1μl的RNase抑制劑（40U/μl）和1μl的逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μl），總體積為20μl，反應條件為25℃孵育10分鐘，42℃孵育60分鐘，70℃孵育15分鐘。合成cDNA第一鏈后，還需要進行第二鏈的合成。常用的方法是利用DNA聚合酶I和RNaseH在dNTPs的存在下，以cDNA第一鏈為模板合成cDNA第二鏈。DNA聚合酶I具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，能夠在RNaseH降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA后，填補缺口，合成cDNA第二鏈。合成的雙鏈cDNA需要進行末端修復和加A尾處理。末端修復是使用T4DNA聚合酶、Klenow片段等酶，將雙鏈cDNA的末端修復成平端；加A尾處理則是利用Klenow片段的3'→5'外切酶活性缺失突變體，在雙鏈cDNA的3'末端加上一個突出的“A”堿基。這些處理步驟是為了使雙鏈cDNA能夠與測序接頭有效連接。在文庫構(gòu)建過程中，還需要向雙鏈cDNA中添加特定的測序接頭。測序接頭是一段已知序列的DNA片段，包含引物結(jié)合位點、測序引物結(jié)合位點和樣本標簽等信息。通過連接酶將測序接頭連接到雙鏈cDNA的兩端，就可以為后續(xù)的PCR擴增和測序提供必要的條件。連接反應通常使用T4DNA連接酶，在適當?shù)木彌_液和溫度條件下進行。連接后的產(chǎn)物經(jīng)過PCR擴增，進一步富集含有測序接頭的雙鏈cDNA片段，從而構(gòu)建成高質(zhì)量的測序文庫。PCR擴增的引物與測序接頭上的引物結(jié)合位點互補，通過PCR反應可以使文庫中的目的片段得到指數(shù)級擴增。在擴增過程中，需要嚴格控制PCR的循環(huán)數(shù)，以避免過度擴增導致的文庫偏差和錯誤。一般來說，PCR循環(huán)數(shù)在15-25個之間，具體數(shù)值需要根據(jù)文庫的起始量和質(zhì)量進行優(yōu)化。2.2.2高通量測序平臺選擇目前，市場上存在多種高通量測序平臺，如Illumina平臺、PacBio平臺和Nanopore平臺等，它們各自具有獨特的技術(shù)原理、特點和適用范圍。在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中，選擇合適的高通量測序平臺對于獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)和準確的研究結(jié)果至關(guān)重要。Illumina平臺是目前應用最為廣泛的高通量測序平臺之一，其技術(shù)原理基于邊合成邊測序（SBS）化學。在測序過程中，DNA聚合酶將熒光標記的dNTP添加到引物上，每添加一個dNTP，就會釋放出一個熒光信號，通過檢測熒光信號的顏色和強度來確定DNA的堿基序列。Illumina平臺具有高通量、高準確性和相對較低成本的優(yōu)點。它能夠同時對大量的DNA片段進行測序，一次運行可以產(chǎn)生數(shù)十億條讀長（reads），適用于大規(guī)模的宏轉(zhuǎn)錄組測序研究。在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中，中國科學院上海巴斯德研究所等科研團隊通常采用Illumina平臺進行測序，該平臺能夠滿足對多種海洋無脊椎動物樣品進行宏轉(zhuǎn)錄組測序的需求，獲得了大量高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，為揭示海洋RNA病毒的遺傳多樣性和分布特征提供了有力支持。其讀長相對較短，一般在150-300bp左右，對于一些長片段的RNA病毒基因組或復雜的基因結(jié)構(gòu)分析可能存在一定的局限性。PacBio平臺采用單分子實時（SMRT）測序技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對單個DNA分子的實時測序。在測序過程中，DNA聚合酶固定在一個微小的納米孔底部，當dNTP被添加到引物上時，會發(fā)出熒光信號，通過檢測熒光信號的持續(xù)時間和顏色來確定堿基序列。PacBio平臺的最大優(yōu)勢在于其長讀長能力，讀長可達數(shù)kb甚至數(shù)十kb，這使得它在分析長片段的RNA病毒基因組、鑒定病毒的全長轉(zhuǎn)錄本以及研究病毒的基因結(jié)構(gòu)和變異等方面具有獨特的優(yōu)勢。在研究某些具有復雜基因組結(jié)構(gòu)的海洋RNA病毒時，PacBio平臺的長讀長測序數(shù)據(jù)可以準確地拼接出病毒的完整基因組序列，為深入了解病毒的遺傳特征和進化關(guān)系提供了重要信息。PacBio平臺的測序通量相對較低，測序成本較高，這在一定程度上限制了其在大規(guī)模宏轉(zhuǎn)錄組測序研究中的應用。Nanopore平臺則是基于納米孔技術(shù)的單分子測序平臺。其原理是當DNA分子通過納米孔時，會引起納米孔內(nèi)離子電流的變化，不同的堿基會產(chǎn)生不同的電流變化模式，通過檢測這些電流變化來識別DNA的堿基序列。Nanopore平臺的突出特點是能夠?qū)崿F(xiàn)實時測序，并且讀長非常長，理論上可以達到無限長。它還具有便攜性好、操作簡單等優(yōu)點，適用于現(xiàn)場快速檢測和一些對測序速度要求較高的研究。在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中，Nanopore平臺可以用于對一些突發(fā)的病毒感染事件進行快速檢測和分析，及時獲取病毒的遺傳信息。Nanopore平臺的測序錯誤率相對較高，這對于準確分析病毒的基因序列和遺傳特征可能會產(chǎn)生一定的影響，需要通過生物信息學方法進行校正和優(yōu)化。在選擇高通量測序平臺時，需要綜合考慮多個因素。測序通量是一個重要的考量因素，對于大規(guī)模的海洋無脊椎動物RNA病毒組研究，需要選擇高通量的平臺，以確保能夠獲得足夠數(shù)量的測序數(shù)據(jù)，全面揭示病毒組的多樣性和特征。Illumina平臺在這方面具有明顯的優(yōu)勢，能夠滿足大規(guī)模樣本的測序需求。讀長要求也不容忽視，對于研究病毒的基因結(jié)構(gòu)、變異以及全長轉(zhuǎn)錄本等，長讀長的測序數(shù)據(jù)更為有利。如果研究的重點是病毒的遺傳多樣性和相對豐度等方面，較短讀長的Illumina平臺數(shù)據(jù)通常也能夠滿足要求；而對于一些需要深入分析病毒基因組結(jié)構(gòu)的研究，則需要選擇PacBio或Nanopore平臺。測序成本也是需要考慮的因素之一，不同平臺的測序成本差異較大，需要根據(jù)研究經(jīng)費和預算來選擇合適的平臺。Illumina平臺由于其廣泛的應用和成熟的技術(shù)，測序成本相對較低，更適合大規(guī)模的常規(guī)研究；而PacBio和Nanopore平臺由于其技術(shù)特點和設(shè)備成本等原因，測序成本較高，一般適用于一些對讀長有特殊要求且經(jīng)費較為充足的研究項目。2.3生物信息分析方法2.3.1數(shù)據(jù)預處理在宏轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)中，往往包含著大量低質(zhì)量的數(shù)據(jù)以及接頭序列等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會嚴重干擾后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，降低分析結(jié)果的準確性和可靠性。因此，對測序數(shù)據(jù)進行預處理是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，其主要目的是去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)、接頭序列等，從而提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可用性。低質(zhì)量數(shù)據(jù)通常是指那些測序質(zhì)量值較低、堿基識別錯誤率較高的讀段。這些低質(zhì)量讀段可能由于測序過程中的技術(shù)誤差、樣品降解或污染等原因產(chǎn)生。如果不加以去除，它們會在后續(xù)的分析中引入錯誤信息，影響基因表達量的準確計算以及病毒序列的正確鑒定。例如，在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中，低質(zhì)量讀段可能會被錯誤地匹配到病毒基因組上，導致對病毒種類和豐度的誤判。常用的去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)的工具包括FastQC和Trimmomatic等。FastQC是一款功能強大的質(zhì)量控制工具，它能夠?qū)y序數(shù)據(jù)進行全面的質(zhì)量評估，生成詳細的質(zhì)量報告，包括堿基質(zhì)量分布、GC含量、序列重復率等信息。通過查看FastQC報告，可以直觀地了解數(shù)據(jù)的質(zhì)量情況，確定低質(zhì)量數(shù)據(jù)的分布范圍和特征。Trimmomatic則是一種專門用于修剪低質(zhì)量讀段的工具，它可以根據(jù)用戶設(shè)定的質(zhì)量閾值，去除讀段兩端質(zhì)量值低于閾值的堿基，同時還能去除含有N（表示未知堿基）的讀段。在使用Trimmomatic時，通常會設(shè)置質(zhì)量閾值為20-30，即去除質(zhì)量值低于20-30的堿基，以確保保留的數(shù)據(jù)具有較高的質(zhì)量。接頭序列是在文庫構(gòu)建過程中添加到DNA片段兩端的特定序列，其作用是為了便于PCR擴增和測序。在測序完成后，這些接頭序列對于數(shù)據(jù)分析來說是多余的，并且可能會導致序列比對錯誤和拼接異常。因此，需要將接頭序列從測序數(shù)據(jù)中去除。常見的去除接頭序列的工具是Cutadapt。Cutadapt能夠準確識別并去除測序數(shù)據(jù)中的接頭序列，它通過與已知的接頭序列進行比對，將匹配到接頭序列的部分從讀段中切除。在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中，使用Cutadapt去除接頭序列時，需要根據(jù)文庫構(gòu)建時所使用的接頭序列信息進行參數(shù)設(shè)置，以確保能夠準確地去除接頭，提高數(shù)據(jù)的純度。除了去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)和接頭序列外，數(shù)據(jù)預處理還可能包括去除宿主基因組序列。在海洋無脊椎動物樣品中，除了包含病毒RNA外，還會存在大量的宿主RNA。這些宿主RNA在測序數(shù)據(jù)中占據(jù)了很大比例，如果不將其去除，會增加數(shù)據(jù)分析的計算量和復雜性，同時也會干擾病毒序列的鑒定。通常采用與宿主基因組比對的方法來去除宿主序列。將測序數(shù)據(jù)與已知的海洋無脊椎動物宿主基因組序列進行比對，將比對到宿主基因組的讀段過濾掉，從而富集病毒相關(guān)的讀段。常用的比對工具如Bowtie2、BWA等，它們能夠高效地將測序讀段與宿主基因組進行比對，并輸出比對結(jié)果。通過篩選比對結(jié)果中未比對到宿主基因組的讀段，即可得到去除宿主序列后的病毒相關(guān)數(shù)據(jù)，為后續(xù)的病毒序列鑒定和分析提供更純凈的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。2.3.2病毒序列鑒定從宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中準確鑒定病毒序列是研究海洋無脊椎動物RNA病毒組的關(guān)鍵步驟。在這一過程中，中國科學院上海巴斯德研究所崔杰課題組改進的方法為病毒序列鑒定提供了重要的技術(shù)支持，展現(xiàn)出了較高的準確性和可靠性。崔杰課題組改進的方法主要基于對RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）基因的分析。RdRp基因在RNA病毒中具有高度保守性，它編碼的蛋白質(zhì)是RNA病毒復制過程中不可或缺的關(guān)鍵酶，負責以RNA為模板合成RNA。由于其保守性，RdRp基因成為了鑒定RNA病毒的重要分子標記。在具體操作中，首先利用BLAST工具將預處理后的宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫（如NCBI的nr數(shù)據(jù)庫）中的已知病毒序列進行比對。BLAST是一種廣泛應用的序列比對工具，它能夠快速地將查詢序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進行相似性搜索，通過計算序列之間的比對得分和E值來評估序列的相似性。在進行BLAST比對時，設(shè)置合適的E值閾值非常重要，通常會將E值閾值設(shè)置為1e-5或更低，以確保篩選出的序列具有較高的相似性。通過比對，初步篩選出與已知病毒序列具有一定相似性的讀段。對于那些與已知病毒序列相似度較低的讀段，采用基于隱馬爾可夫模型（HMM）的方法進行分析。隱馬爾可夫模型是一種統(tǒng)計模型，它能夠?qū)π蛄械奶卣鬟M行建模和預測。針對RdRp基因，構(gòu)建專門的HMM模型，該模型能夠捕捉RdRp基因的保守結(jié)構(gòu)域和序列特征。將未比對上已知病毒序列的讀段輸入到HMM模型中進行搜索，模型會根據(jù)讀段與RdRp基因特征的匹配程度，輸出相應的得分。通過設(shè)定一定的得分閾值，篩選出可能包含RdRp基因的讀段。這樣可以有效地挖掘出那些在公共數(shù)據(jù)庫中沒有相似序列，但實際上屬于RNA病毒的新序列。除了基于RdRp基因的分析外，還可以結(jié)合其他病毒特異性基因或保守結(jié)構(gòu)域來進一步確認病毒序列。不同的病毒家族可能具有各自獨特的基因或結(jié)構(gòu)域，例如，冠狀病毒具有刺突蛋白基因（S基因），它在病毒感染宿主細胞的過程中發(fā)揮著重要作用；小RNA病毒具有典型的衣殼蛋白基因。在鑒定病毒序列時，可以利用這些病毒特異性基因或結(jié)構(gòu)域的信息，對初步篩選出的病毒序列進行進一步的驗證和分類。通過與已知病毒家族的特異性基因或結(jié)構(gòu)域進行比對，確定病毒所屬的家族或類別，從而更準確地揭示海洋無脊椎動物RNA病毒的多樣性和分類特征。2.3.3病毒基因組組裝與注釋在從宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出病毒序列后，對這些病毒序列進行組裝和功能注釋是深入了解病毒遺傳信息和生物學功能的重要環(huán)節(jié)。病毒基因組組裝的目的是將短的測序讀段拼接成完整或部分完整的病毒基因組序列。由于宏轉(zhuǎn)錄組測序得到的讀段長度較短，且病毒基因組可能存在復雜的結(jié)構(gòu)和變異，因此病毒基因組組裝是一項具有挑戰(zhàn)性的任務。目前常用的組裝軟件有SPAdes、IDBA-UD等。SPAdes是一款功能強大的基因組組裝軟件，它采用了基于DeBruijn圖的算法，能夠有效地處理短讀長數(shù)據(jù)，并在一定程度上克服基因組中的重復序列和變異問題。在使用SPAdes進行病毒基因組組裝時，首先將鑒定出的病毒讀段輸入到軟件中，軟件會根據(jù)讀段之間的重疊關(guān)系構(gòu)建DeBruijn圖。DeBruijn圖是一種以k-mer（固定長度的短序列）為節(jié)點，以相鄰k-mer之間的連接關(guān)系為邊的圖結(jié)構(gòu)，通過分析DeBruijn圖中的路徑，可以確定讀段的正確排列順序，從而實現(xiàn)基因組的組裝。在組裝過程中，還可以通過調(diào)整參數(shù)，如k-mer的長度、最小覆蓋度等，來優(yōu)化組裝結(jié)果。例如，對于一些基因組結(jié)構(gòu)較為簡單的病毒，可以適當增大k-mer的長度，以提高組裝的準確性和連續(xù)性；而對于基因組結(jié)構(gòu)復雜、存在大量重復序列的病毒，則需要降低k-mer的長度，并結(jié)合其他輔助信息，如配對末端讀段的信息，來提高組裝的成功率。病毒基因組注釋是指對組裝得到的病毒基因組序列進行功能分析，確定基因的位置、編碼的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)的功能等信息。這一過程對于理解病毒的生物學特性、致病機制以及病毒與宿主之間的相互作用具有重要意義。常用的注釋工具包括BLASTx、InterProScan等。BLASTx是一種將核酸序列翻譯后與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對的工具，通過BLASTx比對，可以將病毒基因組序列與已知的蛋白質(zhì)序列進行相似性搜索，從而確定病毒基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能。將組裝得到的病毒基因組序列翻譯為蛋白質(zhì)序列，然后使用BLASTx將其與NCBI的nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，根據(jù)比對結(jié)果，可以獲得與病毒基因具有相似性的已知蛋白質(zhì)的信息，進而推測病毒基因的功能。InterProScan則是一種綜合性的蛋白質(zhì)功能注釋工具，它整合了多個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能位點數(shù)據(jù)庫，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)序列進行全面的分析，識別其中的結(jié)構(gòu)域、功能位點以及所屬的蛋白質(zhì)家族等信息。使用InterProScan對病毒蛋白質(zhì)序列進行分析，可以進一步深入了解病毒蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特征，為研究病毒的生物學功能提供更豐富的信息。除了使用這些工具進行注釋外，還可以結(jié)合一些專門的病毒數(shù)據(jù)庫，如病毒分類數(shù)據(jù)庫（ICTVdB）、病毒基因組數(shù)據(jù)庫（ViPR）等，來獲取更多關(guān)于病毒的分類、基因組結(jié)構(gòu)和功能等方面的信息，從而更準確地對病毒基因組進行注釋。三、宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中的應用案例分析3.1崔杰課題組研究案例3.1.1研究概況崔杰課題組的研究聚焦于海洋無脊椎動物RNA病毒組，旨在深入探究其遺傳多樣性、分布規(guī)律以及傳播模式。該研究在海洋生物安全和病毒進化研究領(lǐng)域具有重要的科學價值和現(xiàn)實意義。在樣品采集階段，課題組展現(xiàn)出了全面且嚴謹?shù)目茖W態(tài)度。他們從東海、黃海、南海等多個不同海域進行樣品收集。這些海域在地理位置上跨越了不同的緯度和經(jīng)度，水溫和鹽度等環(huán)境參數(shù)差異顯著。東海受大陸徑流和黑潮暖流的雙重影響，水溫在不同季節(jié)變化明顯，鹽度也因河流淡水注入而有所波動；黃海是半封閉淺海，海水交換相對較弱，鹽度較為穩(wěn)定，但其水溫隨季節(jié)變化幅度較?。荒虾５靥師釒В疁爻Ｄ贻^高，鹽度相對穩(wěn)定，且擁有獨特的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)。不同海域的這些環(huán)境差異為研究病毒在不同生態(tài)條件下的生存和演化提供了豐富的樣本基礎(chǔ)。課題組在物種選擇上涵蓋了3門6綱58種海洋無脊椎動物，包括節(jié)肢動物門的蝦類、蟹類，軟體動物門的貝類、螺類，以及棘皮動物門的海參、海膽等。這些物種在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著不同的生態(tài)位，具有各自獨特的生活習性和生理特征。蝦類多為底棲生物，它們在海底的沉積物中覓食，與海底的微生物群落密切接觸，其體內(nèi)的病毒組可能與底棲環(huán)境中的微生物相互作用；貝類通過過濾海水獲取食物，它們的攝食方式使得它們更容易接觸到海水中的病毒顆粒，因此其病毒組可能反映了海水中病毒的分布情況；海參和海膽等棘皮動物在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著重要作用，它們的病毒組可能與生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性密切相關(guān)。選擇如此豐富多樣的物種進行研究，有助于全面了解病毒在不同宿主間的傳播機制、病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系，以及病毒對整個海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響。在宏轉(zhuǎn)錄組測序過程中，課題組采用了先進且成熟的技術(shù)流程。首先，運用Trizol法從采集的樣品中提取總RNA。Trizol試劑能夠迅速裂解細胞，使細胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)分離，同時有效抑制RNase的活性，保證RNA的完整性。提取的RNA經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，確保其濃度、純度和完整性符合要求后，進行文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建采用基于RNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增的方法，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并通過PCR擴增富集目的片段。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，使用隨機引物引導合成cDNA第一鏈，以確保能夠捕獲到各種病毒的RNA信息。合成的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復、加A尾和連接測序接頭等步驟，構(gòu)建成高質(zhì)量的測序文庫。最后，選擇Illumina平臺進行高通量測序。Illumina平臺具有高通量、高準確性和相對較低成本的優(yōu)點，能夠滿足對大量海洋無脊椎動物樣品進行宏轉(zhuǎn)錄組測序的需求，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供充足的數(shù)據(jù)支持。在生物信息分析方面，課題組使用了一系列專業(yè)的工具和方法對測序數(shù)據(jù)進行深度挖掘。利用FastQC和Trimmomatic等工具對測序數(shù)據(jù)進行預處理，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)、接頭序列等雜質(zhì)，提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。FastQC能夠全面評估數(shù)據(jù)的質(zhì)量，包括堿基質(zhì)量分布、GC含量、序列重復率等信息，為數(shù)據(jù)預處理提供重要參考；Trimmomatic則根據(jù)設(shè)定的質(zhì)量閾值，準確去除低質(zhì)量讀段和含有N的讀段。使用改進的基于RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）基因分析方法鑒定病毒序列。首先利用BLAST工具將預處理后的宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫中的已知病毒序列進行比對，初步篩選出與已知病毒序列具有一定相似性的讀段；對于相似度較低的讀段，采用基于隱馬爾可夫模型（HMM）的方法進行分析，挖掘潛在的病毒序列。通過這些方法，課題組成功鑒定出大量的RNA病毒序列，為后續(xù)的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。3.1.2研究成果崔杰課題組通過對海洋無脊椎動物RNA病毒組的深入研究，取得了一系列具有重要科學價值的成果，極大地推動了海洋病毒學領(lǐng)域的發(fā)展。課題組成功鑒定出涵蓋9個病毒家族（Durnavirales、Totiviridae、Bunyavirales、Chuviridae、Picornavirales、Flaviviridae、Hepelivirales、Solemoviridae、Tombusviridae）的363個RNA病毒。這一發(fā)現(xiàn)顯著擴充了已知RNA病毒的種類和數(shù)量，展示了海洋無脊椎動物RNA病毒組的豐富遺傳多樣性。尤為引人注目的是，其中315個RNA病毒與已知的RNA病毒相似度極低，被認定為全新的RNA病毒。這些新發(fā)現(xiàn)的病毒為研究病毒的進化起源、遺傳變異以及病毒與宿主之間的相互作用提供了寶貴的素材，也表明海洋中蘊含著巨大的病毒資源庫，有待進一步深入探索和研究。課題組首次報道了海洋漢坦樣病毒，并基于其與陸地漢坦病毒的比較分析，提出了漢坦病毒可能具有海洋起源的假說。研究發(fā)現(xiàn)，海洋漢坦樣病毒在進化上較陸地漢坦病毒更為古老，其基因組結(jié)構(gòu)和遺傳特征具有獨特性。這一假說的提出為漢坦病毒的起源和進化研究開辟了新的視角，促使科學家重新審視漢坦病毒的進化歷程和傳播途徑。如果漢坦病毒確實起源于海洋，那么海洋生態(tài)系統(tǒng)中的無脊椎動物可能是漢坦病毒的原始宿主，隨著時間的推移，病毒可能通過某種途徑傳播到陸地，感染陸地動物和人類。這一假說的驗證需要進一步的研究，包括對更多海洋和陸地樣本的檢測、病毒基因組的深入分析以及病毒傳播機制的研究等。通過結(jié)合基因組結(jié)構(gòu)和統(tǒng)計學分析，課題組揭示了不同海域間、不同宿主類別間可能存在的病毒傳播現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，某些病毒在不同海域的海洋無脊椎動物中均有檢測到，表明這些病毒可能通過海水的流動、海洋生物的遷徙或食物鏈傳遞等方式在不同海域間傳播。在不同宿主類別間，也發(fā)現(xiàn)了一些共享的病毒種類，這意味著病毒可能具有跨宿主傳播的能力。某些病毒可以同時感染節(jié)肢動物門的蝦類和軟體動物門的貝類，這可能是由于這些宿主在生態(tài)系統(tǒng)中存在密切的相互作用，例如蝦類和貝類可能生活在相同的棲息環(huán)境中，或者存在捕食與被捕食的關(guān)系，從而為病毒的跨宿主傳播提供了機會。課題組還通過線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)病毒跨宿主傳播速率與病毒數(shù)量之間存在一定的相關(guān)性，進一步支持了病毒傳播的假設(shè)。這一成果對于理解病毒在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的傳播規(guī)律和生態(tài)影響具有重要意義，為制定海洋生物安全防控策略提供了科學依據(jù)。3.2其他相關(guān)研究案例除了崔杰課題組的研究，還有許多團隊利用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中取得了重要成果。中山大學醫(yī)學院施莽教授團隊和阿里云李兆融團隊合作開展了一項極具創(chuàng)新性的研究，他們利用人工智能技術(shù)對全球各地10,487份宏轉(zhuǎn)錄組進行病毒挖掘。該研究整合了序列信息與結(jié)構(gòu)信息，運用深度學習方法，成功發(fā)現(xiàn)了513,134條病毒基因組，代表161,979個潛在病毒種類及180個RNA病毒超群（相當于門或綱的分類級別），使RNA病毒超群數(shù)量擴容約9倍。其中23個超群無法通過序列同源性方法識別，被稱為病毒“暗物質(zhì)”。這些神秘的病毒存在于地球上每一種生境中，包括海洋環(huán)境中的海洋無脊椎動物樣本。研究還揭示了有史以來最大的RNA病毒，其基因組長達47,250個核苷酸。這項研究極大地擴展了全球RNA病毒的多樣性，為病毒學研究開創(chuàng)了一種全新的范式，也為海洋無脊椎動物RNA病毒組研究提供了新的思路和方法，讓我們對海洋中未知的RNA病毒有了更深入的認識。復旦大學張永振教授團隊從2015年至2019年，從中國16個省區(qū)，以及包括西沙、南沙、黃巖島等廣泛的南海海域的32個不同環(huán)境中采集了土壤、沉積物、家養(yǎng)和野生動物糞便等樣本，采用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對其中的病毒進行了系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與分析，同時開展了環(huán)境土壤等理化分析。雖然該研究并非專門針對海洋無脊椎動物，但在采集的海洋相關(guān)樣本中，發(fā)現(xiàn)了6624個新型病毒分類單元(vOTUs)，其中符合國際病毒分類委員會分類標準達到種以上的新病毒約為2700種，分布在至少62個病毒科。這些新發(fā)現(xiàn)的病毒包含正鏈、負鏈和雙鏈RNA病毒，大大擴展了已知RNA病毒圈的多樣性，充分說明了病毒在從陸地到海洋等各種自然環(huán)境中的高度多樣性。研究還指出，采樣生境中的有機物含量、真核生物的物種豐度等地理生物因素影響著當?shù)丨h(huán)境病毒組的組成及豐度。這對于理解海洋無脊椎動物所處環(huán)境中的病毒生態(tài)具有重要的參考價值，為進一步研究海洋無脊椎動物RNA病毒組與環(huán)境因素的關(guān)系提供了重要線索。四、宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)應用的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)4.1優(yōu)勢分析4.1.1發(fā)現(xiàn)新病毒的能力宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在發(fā)現(xiàn)全新RNA病毒方面展現(xiàn)出了無可比擬的強大能力，極大地推動了海洋無脊椎動物RNA病毒研究的發(fā)展。在傳統(tǒng)的病毒研究中，依賴于病毒的分離培養(yǎng)技術(shù)，這使得許多病毒由于難以在實驗室條件下培養(yǎng)而無法被發(fā)現(xiàn)和研究。海洋無脊椎動物生活在復雜多變的海洋環(huán)境中，其攜帶的RNA病毒往往具有特殊的生存需求和宿主依賴性，傳統(tǒng)方法很難對這些病毒進行有效的分離和鑒定。宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)則徹底打破了這一局限，它直接對環(huán)境樣本中的RNA進行測序，無需預先培養(yǎng)病毒，從而能夠捕獲到環(huán)境中所有的RNA病毒片段，無論是已知病毒還是那些與已知病毒相似度極低的全新病毒，都能被納入研究范圍。中國科學院上海巴斯德研究所崔杰課題組的研究便是一個典型的例子。他們從不同海域采集了3門6綱58種海洋無脊椎動物樣品，運用宏轉(zhuǎn)錄組測序方法對RNA病毒組展開深入研究。通過改進的生物信息分析方法，成功鑒定出涵蓋9個病毒家族的363個RNA病毒。令人矚目的是，其中315個RNA病毒與已知的RNA病毒相似度極低，被認定為全新的RNA病毒。這些新發(fā)現(xiàn)的病毒豐富了我們對海洋無脊椎動物RNA病毒遺傳多樣性的認識，為研究病毒的進化起源、遺傳變異以及病毒與宿主之間的相互作用提供了寶貴的素材。如果沒有宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，這些全新的病毒可能仍然隱藏在海洋深處，無法被人類所認知。中山大學醫(yī)學院施莽教授團隊和阿里云李兆融團隊合作開展的研究同樣凸顯了宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新病毒方面的卓越能力。他們利用人工智能技術(shù)對全球各地10,487份宏轉(zhuǎn)錄組進行病毒挖掘，成功發(fā)現(xiàn)了513,134條病毒基因組，代表161,979個潛在病毒種類及180個RNA病毒超群，使RNA病毒超群數(shù)量擴容約9倍。其中23個超群無法通過序列同源性方法識別，被稱為病毒“暗物質(zhì)”。這些新發(fā)現(xiàn)的病毒和病毒超群廣泛存在于地球上的各種生境中，包括海洋環(huán)境，進一步證明了宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)能夠揭示出傳統(tǒng)方法難以發(fā)現(xiàn)的病毒多樣性，為我們打開了一扇認識海洋RNA病毒世界的新窗口。4.1.2揭示病毒多樣性和傳播模式宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)為深入研究海洋無脊椎動物RNA病毒的多樣性和傳播模式提供了強大的技術(shù)支持，使我們能夠從全新的視角認識病毒在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的作用和地位。海洋環(huán)境復雜多樣，海洋無脊椎動物種類繁多，這使得海洋RNA病毒的多樣性極為豐富。宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)能夠同時對大量的海洋無脊椎動物樣品進行分析，全面地檢測出其中的RNA病毒種類和數(shù)量，從而為我們展示出海洋病毒遺傳多樣性的全貌。崔杰課題組的研究中，通過對不同海域、不同種類的海洋無脊椎動物進行宏轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出了363個RNA病毒，涵蓋了9個病毒家族，這充分體現(xiàn)了海洋無脊椎動物RNA病毒的高度多樣性。不同海域的海洋無脊椎動物RNA病毒組存在明顯差異，這可能與海洋環(huán)境的復雜性以及宿主的多樣性密切相關(guān)。東海、黃海、南海的海洋無脊椎動物中檢測到的病毒種類和豐度各不相同，這表明海洋環(huán)境因素，如水溫、鹽度、營養(yǎng)物質(zhì)含量等，以及宿主的生態(tài)位和生活習性，都會對病毒的分布和多樣性產(chǎn)生影響。通過宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，我們能夠深入探究這些因素與病毒多樣性之間的關(guān)系，為理解海洋生態(tài)系統(tǒng)中病毒的生態(tài)功能提供重要依據(jù)。在揭示病毒傳播模式方面，宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過對不同海域、不同宿主類別的海洋無脊椎動物RNA病毒組進行比較分析，我們可以發(fā)現(xiàn)病毒在不同宿主間的傳播線索。崔杰課題組結(jié)合基因組結(jié)構(gòu)和統(tǒng)計學分析，揭示了不同海域間、不同宿主類別間可能存在的病毒傳播現(xiàn)象。某些病毒在不同海域的海洋無脊椎動物中均有檢測到，這表明這些病毒可能通過海水的流動、海洋生物的遷徙或食物鏈傳遞等方式在不同海域間傳播。在不同宿主類別間，也發(fā)現(xiàn)了一些共享的病毒種類，這意味著病毒可能具有跨宿主傳播的能力。某些病毒可以同時感染節(jié)肢動物門的蝦類和軟體動物門的貝類，這可能是由于這些宿主在生態(tài)系統(tǒng)中存在密切的相互作用，例如它們生活在相同的棲息環(huán)境中，或者存在捕食與被捕食的關(guān)系，從而為病毒的跨宿主傳播提供了機會。通過宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，我們能夠深入研究病毒的傳播途徑和機制，為制定有效的海洋生物安全防控策略提供科學依據(jù)。4.2挑戰(zhàn)分析4.2.1技術(shù)層面挑戰(zhàn)宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中雖然取得了顯著成果，但在技術(shù)層面仍面臨諸多挑戰(zhàn)。測序成本較高是一個亟待解決的問題。海洋無脊椎動物RNA病毒組研究通常需要對大量的樣品進行宏轉(zhuǎn)錄組測序，以全面揭示病毒的多樣性和分布特征。這涉及到樣品采集、RNA提取、文庫構(gòu)建以及高通量測序等多個環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都需要投入一定的成本。在樣品采集過程中，需要使用專業(yè)的采樣設(shè)備和船只，前往不同的海域進行采樣，這不僅需要耗費大量的時間和人力，還涉及到設(shè)備的租賃、維護以及人員的差旅費等費用。RNA提取過程中，需要使用高質(zhì)量的試劑和儀器，以確保提取的RNA質(zhì)量和純度符合要求，這些試劑和儀器的采購成本也相對較高。文庫構(gòu)建和高通量測序環(huán)節(jié)同樣需要使用昂貴的試劑和設(shè)備，并且測序費用通常按照測序數(shù)據(jù)量來計算，對于大規(guī)模的研究項目，測序成本可能會成為一個巨大的負擔。這限制了宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中的廣泛應用，特別是對于一些經(jīng)費有限的研究團隊來說，高昂的測序成本使得他們難以開展相關(guān)研究。為了降低測序成本，研究人員可以嘗試優(yōu)化實驗流程，減少不必要的實驗步驟和試劑消耗；也可以與測序服務提供商進行合作，爭取更優(yōu)惠的測序價格；還可以關(guān)注測序技術(shù)的發(fā)展動態(tài)，選擇性價比更高的測序平臺和方法。數(shù)據(jù)處理和分析的復雜性也是宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)面臨的一大挑戰(zhàn)。宏轉(zhuǎn)錄組測序會產(chǎn)生海量的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)不僅包含病毒的RNA序列，還包含大量的宿主RNA序列以及其他雜質(zhì)序列。對這些數(shù)據(jù)進行有效的處理和分析需要具備強大的計算能力和專業(yè)的生物信息學知識。在數(shù)據(jù)預處理階段，需要去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)、接頭序列和宿主基因組序列等雜質(zhì)，這需要使用專門的軟件和算法，并且需要根據(jù)不同的實驗數(shù)據(jù)和研究目的進行參數(shù)調(diào)整。在病毒序列鑒定和基因組組裝過程中，需要使用復雜的生物信息學方法，如序列比對、基因預測和系統(tǒng)發(fā)育分析等，這些方法需要對大量的數(shù)據(jù)進行運算和分析，對計算機的性能要求較高。海洋無脊椎動物RNA病毒組的多樣性和復雜性使得數(shù)據(jù)分析變得更加困難，不同病毒家族的基因組結(jié)構(gòu)和序列特征差異較大，需要針對不同的病毒類型開發(fā)專門的分析方法。為了解決數(shù)據(jù)處理和分析的復雜性問題，研究人員需要不斷提升自身的生物信息學技能，掌握先進的數(shù)據(jù)處理和分析工具；同時，也需要加強與計算機科學和統(tǒng)計學領(lǐng)域的合作，共同開發(fā)更高效、更準確的生物信息學算法和軟件。RNA的易降解性給實驗操作帶來了極大的困難。海洋無脊椎動物樣品中的RNA在采集、運輸和儲存過程中容易受到各種因素的影響而發(fā)生降解，如溫度、濕度、光照以及RNase的污染等。RNA的降解會導致測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量下降，影響病毒序列的鑒定和分析結(jié)果的準確性。在樣品采集時，如果不能及時對樣品進行處理和保存，RNA就可能會在短時間內(nèi)發(fā)生降解。在運輸過程中，如果樣品不能保持低溫和干燥的環(huán)境，也會加速RNA的降解。為了減少RNA的降解，研究人員需要在樣品采集后立即加入RNase抑制劑，并將樣品保存在低溫環(huán)境中，如液氮或-80℃冰箱。在RNA提取過程中，需要使用高質(zhì)量的試劑和儀器，并且要嚴格遵守操作規(guī)程，減少RNase的污染。在實驗操作過程中，還需要定期對RNA的質(zhì)量進行檢測，確保RNA的完整性符合要求。4.2.2生物信息分析挑戰(zhàn)在海洋無脊椎動物RNA病毒組研究中，生物信息分析是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，然而，這一過程面臨著諸多挑戰(zhàn)，嚴重影響了研究的準確性和深入性。病毒序列鑒定的準確性是生物信息分析面臨的首要挑戰(zhàn)。目前，病毒序列鑒定主要依賴于與已知病毒序列的比對以及對特定基因或結(jié)構(gòu)域的分析。由于海洋無脊椎動物RNA病毒的高度多樣性，許多新發(fā)現(xiàn)的病毒與已知病毒的序列相似度極低，這使得傳統(tǒng)的基于序列比對的鑒定方法難以準確識別這些新病毒。一些病毒可能具有獨特的基因結(jié)構(gòu)和序列特征，在現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫中找不到與之匹配的已知病毒序列，從而導致鑒定結(jié)果的不確定性。即使對于那些與已知病毒有一定相似度的序列，由于病毒基因組的變異和進化，也可能存在鑒定錯誤的風險。不同病毒家族之間可能存在基因水平轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象，使得某些病毒的基因序列具有混合特征，增加了鑒定的難度。為了提高病毒序列鑒定的準確性，需要不斷完善和更新病毒數(shù)據(jù)庫，納入更多的病毒序列信息，特別是那些來自海洋無脊椎動物的新病毒序列。開發(fā)更先進的生物信息學算法和工具，結(jié)合多種分析方法，如基于機器學習的方法、結(jié)構(gòu)生物學分析等，以提高對新病毒和復雜病毒序列的鑒定能力。病毒基因組注釋的完整性也是一個重要挑戰(zhàn)。病毒基因組注釋是指對病毒基因組中的基因進行識別、功能預測和分類等工作。由于海洋無脊椎動物RNA病毒的多樣性和特殊性，許多病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能尚未被充分了解，這給基因組注釋帶來了很大的困難。一些病毒可能具有獨特的基因編碼方式和調(diào)控機制，傳統(tǒng)的基因預測工具和注釋方法難以準確識別和注釋這些基因。病毒基因組中還可能存在一些非編碼RNA區(qū)域，它們在病毒的生命周期中發(fā)揮著重要作用，但目前對這些非編碼RNA的功能和作用機制知之甚少，導致在基因組注釋過程中容易忽略這些區(qū)域。為了提高病毒基因組注釋的完整性，需要加強對海洋無脊椎動物RNA病毒的基礎(chǔ)研究，深入了解病毒的基因組結(jié)構(gòu)、功能和進化特征。綜合運用多種生物信息學工具和實驗技術(shù)，如轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白質(zhì)組學分析等，對病毒基因組進行全面的注釋和驗證。病毒與宿主相互作用的分析同樣面臨挑戰(zhàn)。海洋無脊椎動物RNA病毒與宿主之間存在著復雜的相互作用關(guān)系，這種相互作用不僅影響病毒的感染和傳播，也影響宿主的生理功能和生態(tài)適應性。從宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中準確分析病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系是一項極具挑戰(zhàn)性的任務。宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中同時包含病毒和宿主的RNA序列，如何從這些混合數(shù)據(jù)中準確識別出與病毒-宿主相互作用相關(guān)的基因和信號通路是一個難題。病毒與宿主之間的相互作用可能涉及到多個層面，如病毒感染宿主細胞的機制、宿主的免疫反應以及病毒對宿主基因表達的調(diào)控等，目前還缺乏有效的方法來全面分析這些相互作用。為了深入分析病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系，需要建立更完善的實驗模型和數(shù)據(jù)分析方法，結(jié)合多組學技術(shù)，如轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等，從多個角度研究病毒-宿主相互作用的分子機制。加強對病毒和宿主基因功能的研究，明確它們在相互作用過程中的作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為揭示病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系提供更堅實的理論基礎(chǔ)。4.2.3研究樣本與生態(tài)環(huán)境復雜性挑戰(zhàn)海洋無脊椎動物RNA病毒組研究在樣本和生態(tài)環(huán)境方面面臨著諸多復雜的挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)嚴重制約了研究的順利開展和深入推進。海洋環(huán)境的復雜性是研究面臨的首要難題。海洋是一個龐大而復雜的生態(tài)系統(tǒng)，其物理、化學和生物特性在不同的海域、深度和季節(jié)都存在著顯著的差異。海水的溫度、鹽度、酸堿度、溶解氧含量以及營養(yǎng)物質(zhì)濃度等環(huán)境因素都會對海洋無脊椎動物的生存和繁殖產(chǎn)生影響，進而影響其攜帶的RNA病毒的種類、分布和活性。在熱帶海域，海水溫度較高，可能有利于某些病毒的復制和傳播；而在極地海域，低溫環(huán)境則可能限制病毒的活性。海水的鹽度和酸堿度也會影響病毒與宿主細胞的相互作用，不同的鹽度和酸堿度條件下，病毒的感染能力和宿主的免疫反應可能會發(fā)生變化。海洋生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性極為豐富，海洋無脊椎動物與其他生物之間存在著復雜的相互關(guān)系，如共生、寄生和捕食等，這些關(guān)系也會對病毒的傳播和演化產(chǎn)生影響。為了應對海洋環(huán)境復雜性帶來的挑戰(zhàn)，研究人員需要在不同的海域、深度和季節(jié)進行廣泛的采樣，全面了解海洋環(huán)境因素對RNA病毒組的影響。結(jié)合海洋學、生態(tài)學和病毒學等多學科的知識和技術(shù)，建立綜合的研究體系，深入探討海洋環(huán)境與RNA病毒組之間的相互作用機制。樣本采集的困難性也是研究中不可忽視的問題。海洋無脊椎動物分布廣泛，生活在不同的海域和生態(tài)環(huán)境中，有些物種甚至棲息在深海、極地等極端環(huán)境中，這使得樣本采集工作變得異常困難。深海環(huán)境具有高壓、低溫、黑暗和高鹽等特點，對采樣設(shè)備和技術(shù)要求極高。在深海采樣時，需要使用專門的深海采樣器，如載人潛水器、無人潛水器和深海拖網(wǎng)等，這些設(shè)備不僅價格昂貴，而且操作復雜，需要專業(yè)的技術(shù)人員進行操作。極地海域的惡劣氣候條件和復雜的海冰狀況也給樣本采集帶來了很大的阻礙。在極地采樣時，需要克服低溫、大風和海冰的影響，確保采樣設(shè)備的正常運行和樣本的安全采集。海洋無脊椎動物的種類繁多，不同物種的生態(tài)習性和分布規(guī)律各不相同，這也增加了樣本采集的難度。為了獲取具有代表性的樣本，需要對不同種類的海洋無脊椎動物進行針對性的采樣，了解它們的生活習性和分布范圍，選擇合適的采樣地點和方法。樣本保存和運輸?shù)囊蟾咭彩且粋€挑戰(zhàn)。海洋無脊椎動物樣品中的RNA在采集后容易受到環(huán)境因素的影響而發(fā)生降解，因此需要在采樣后立即采取有效的保存措施。通常需要將樣品保存在低溫環(huán)境中，如液氮或-80℃冰箱，以防止RNA的降解。在運輸過程中，也需要保持低溫條件，確保樣品的質(zhì)量不受影響。這對樣品保存和運輸?shù)脑O(shè)備和條件提出了很高的要求。如果在保存和運輸過程中不能滿足低溫條件，RNA就可能會發(fā)生降解，導致測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量下降，影響后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和研究結(jié)果。為了確保樣本保存和運輸?shù)馁|(zhì)量，需要配備專業(yè)的低溫保存設(shè)備和運輸工具，如液氮罐、干冰和低溫運輸箱等。建立完善的樣本保存和運輸管理制度，嚴格按照操作規(guī)程進行操作，確保樣品在保存和運輸過程中的安全性和穩(wěn)定性。五、結(jié)論與展