蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟及技巧總結(jié)蛋白表達(dá)是生物醫(yī)學(xué)研究、藥物開發(fā)及工業(yè)生產(chǎn)中核心的技術(shù)環(huán)節(jié)，其效率與質(zhì)量直接影響后續(xù)功能研究或產(chǎn)品開發(fā)的成敗。結(jié)合多年實(shí)驗(yàn)實(shí)踐與優(yōu)化經(jīng)驗(yàn)，本文系統(tǒng)梳理不同表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)流程，提煉關(guān)鍵技巧，助力研究者高效獲得目標(biāo)蛋白。一、實(shí)驗(yàn)前的規(guī)劃與準(zhǔn)備（一）目標(biāo)蛋白的特性分析啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)前，需結(jié)合生物信息學(xué)工具（如UniProt、TMHMM）分析目標(biāo)蛋白的分子量、等電點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域、糖基化位點(diǎn)及潛在疏水區(qū)域。若蛋白含復(fù)雜翻譯后修飾（如哺乳動(dòng)物特異性糖基化），需優(yōu)先考慮真核表達(dá)系統(tǒng)；若為結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的胞內(nèi)蛋白，原核系統(tǒng)（如大腸桿菌）可作為首選以降低成本、縮短周期。（二）表達(dá)系統(tǒng)的選擇策略1.原核表達(dá)系統(tǒng)（以大腸桿菌為例）優(yōu)勢(shì)：操作簡(jiǎn)便、周期短、成本低，適合表達(dá)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無復(fù)雜修飾的蛋白。局限：易形成包涵體，對(duì)含二硫鍵的分泌蛋白或膜蛋白兼容性差。2.真核表達(dá)系統(tǒng)酵母系統(tǒng)（如畢赤酵母）：可實(shí)現(xiàn)蛋白的分泌表達(dá)與部分糖基化修飾，適合中等規(guī)模的重組蛋白制備。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)（如HEK293、CHO）：能精準(zhǔn)模擬天然蛋白的翻譯后修飾（如糖基化、磷酸化），但操作復(fù)雜、成本高，適合功能研究或臨床級(jí)蛋白生產(chǎn)。昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)：兼具真核修飾與較高表達(dá)量，適合病毒相關(guān)蛋白或膜蛋白的表達(dá)。二、原核表達(dá)（大腸桿菌）的核心步驟與技巧（一）載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化1.載體選擇：根據(jù)蛋白特性選擇載體，如pET系列（強(qiáng)啟動(dòng)子T7，適合誘導(dǎo)表達(dá)）、pGEX（融合谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，利于純化）。若需分泌表達(dá)，可選擇pET-22b（含pelB信號(hào)肽）。2.轉(zhuǎn)化技巧：采用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞（如BL21(DE3)、Rosetta-gami），轉(zhuǎn)化后先在無抗生素的LB培養(yǎng)基中復(fù)蘇30分鐘（250rpm，37℃），再涂布抗性平板，可提高轉(zhuǎn)化效率。（二）誘導(dǎo)表達(dá)的優(yōu)化1.誘導(dǎo)時(shí)機(jī)：待菌液OD???達(dá)到0.6~0.8時(shí)（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期）加入誘導(dǎo)劑（如IPTG），避免細(xì)胞過度生長(zhǎng)導(dǎo)致代謝壓力。2.溫度與時(shí)間優(yōu)化：若追求可溶性蛋白，可嘗試低溫誘導(dǎo)（16~25℃，誘導(dǎo)12~16小時(shí)），降低蛋白折疊壓力；若需大量表達(dá)（含包涵體），可選擇37℃誘導(dǎo)3~6小時(shí)。3.IPTG濃度梯度試驗(yàn)：從0.1mM到1mM設(shè)置梯度，篩選最佳誘導(dǎo)濃度（部分蛋白對(duì)高濃度IPTG敏感，低濃度反而提高可溶性）。（三）蛋白的收集與處理誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃、5000rpm離心10分鐘收集菌體，用預(yù)冷的PBS重懸（含蛋白酶抑制劑，如PMSF、EDTA）。若為包涵體蛋白，需用超聲破碎（功率30%~50%，工作3秒/停5秒，總時(shí)長(zhǎng)10~15分鐘）后，經(jīng)8M尿素或6M鹽酸胍溶解，后續(xù)需復(fù)性；若為可溶性蛋白，直接取上清進(jìn)行純化。三、真核表達(dá)（以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例）的關(guān)鍵流程（一）載體與轉(zhuǎn)染試劑的選擇載體需含真核啟動(dòng)子（如CMV、EF1α）、篩選標(biāo)記（如嘌呤霉素抗性、Zeocin）及信號(hào)肽（如需分泌表達(dá)）。轉(zhuǎn)染試劑推薦：Lipofectamine3000（效率高，毒性低）、PEI（成本低，適合大規(guī)模轉(zhuǎn)染）。（二）轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)1.細(xì)胞狀態(tài)要求：轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將HEK293或CHO細(xì)胞鋪板，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)70%~80%匯合度，且狀態(tài)良好（無懸浮、無污染）。2.轉(zhuǎn)染操作：按試劑說明書混合載體與轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置15分鐘后滴加至細(xì)胞，6~8小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基（含血清，避免無血清導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激）。（三）蛋白的收獲與富集轉(zhuǎn)染后48~72小時(shí)（根據(jù)蛋白半衰期調(diào)整），收集上清（分泌蛋白）或裂解細(xì)胞（胞內(nèi)蛋白）。若表達(dá)量低，可通過換液延長(zhǎng)培養(yǎng)（如96小時(shí)）或使用無血清培養(yǎng)基（如CD293）富集蛋白。四、跨系統(tǒng)通用的技巧與問題解決（一）提高蛋白可溶性的策略1.融合標(biāo)簽的妙用：小標(biāo)簽（如His?、MBP）：簡(jiǎn)化純化，MBP還能顯著提高可溶性；大標(biāo)簽（如GST、Trx）：增強(qiáng)折疊效率，但需后續(xù)酶切去除。2.分子伴侶共表達(dá)：在原核系統(tǒng)中，共轉(zhuǎn)化pGro7（含GroEL/GroES）或pKJE7（含DnaK/DnaJ/GrpE）質(zhì)粒，幫助蛋白正確折疊。3.添加小分子助劑：在培養(yǎng)基或裂解液中加入1~5%甘油、0.1~1mM還原型谷胱甘肽（GSH）或低濃度去污劑（如TritonX-100），穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)。（二）包涵體的復(fù)性與挽救若蛋白以包涵體形式存在，可嘗試：梯度透析復(fù)性：將溶解的包涵體蛋白從8M尿素逐步稀釋至生理緩沖液（如PBS），過程中加入氧化型/還原型谷胱甘肽（比例1:10）促進(jìn)二硫鍵形成；稀釋復(fù)性：將變性蛋白緩慢滴入大量復(fù)性緩沖液（含輔助因子），降低蛋白濃度以減少聚集。（三）表達(dá)量低的排查思路1.轉(zhuǎn)錄水平：通過RT-qPCR檢測(cè)mRNA水平，若低則檢查啟動(dòng)子活性、載體整合效率（哺乳動(dòng)物細(xì)胞）；2.翻譯水平：優(yōu)化密碼子（原核系統(tǒng)中使用Rosetta菌株補(bǔ)充稀有tRNA）、調(diào)整5’UTR序列（避免二級(jí)結(jié)構(gòu)抑制翻譯）；3.降解問題：在培養(yǎng)基或裂解液中加入蛋白酶抑制劑，或在載體中添加泛素化位點(diǎn)突變（如K48R）減少蛋白酶體降解。五、后續(xù)純化與鑒定（一）純化策略親和純化：利用His?、GST等標(biāo)簽，通過Ni-NTA、GSH樹脂快速富集；離子交換/凝膠過濾：進(jìn)一步去除雜蛋白，提高純度（適合結(jié)構(gòu)分析或功能實(shí)驗(yàn)）。（二）鑒定方法SDS與WesternBlot：驗(yàn)證分子量與標(biāo)簽完整性；SEC-HPLC或動(dòng)態(tài)光散射（DLS）：分析蛋白聚集體與均一性；質(zhì)譜或Edman測(cè)序：確認(rèn)N端序列與翻譯后修飾。結(jié)語蛋白表達(dá)是一門“經(jīng)驗(yàn)+設(shè)計(jì)”的技術(shù)，需結(jié)合蛋白特性靈活調(diào)整策略。