第5部分生物技術(shù)與工程專題22基因工程

生物學(xué)新高考、新教材適用體系透視重難透析題型透析考點(diǎn)1重組DNA技術(shù)的基本工具考點(diǎn)2基因工程的基本操作程序及應(yīng)用 考點(diǎn)3蛋白質(zhì)工程題型

核酸序列的閱讀及引物、限制酶的選擇（熱考點(diǎn)）考點(diǎn)1

重組DNA技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀”——限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)來(lái)源主要是原核生物作用具體作用識(shí)別并切割雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列作用化學(xué)鍵磷酸二酯鍵作用結(jié)果限制酶切割DNA分子產(chǎn)生的末端通常有兩種形式(如圖所示):

“分子縫合針”——DNA連接酶作用將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái),恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵分類E.coliDNA連接酶來(lái)自大腸桿菌,只能連接具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段T4DNA連接酶來(lái)自T4噬菌體,連接互補(bǔ)的黏性末端和平末端,但連接平末端的效率相對(duì)較低“分子運(yùn)輸車”——基因載體作用將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞種類質(zhì)粒(最常用)定義裸露的(不與組蛋白結(jié)合)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外,并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)具有復(fù)制原點(diǎn)(在細(xì)胞中能夠自我復(fù)制)、標(biāo)記基因(便于重組DNA分子的篩選)、一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)(供目的基因插入)其他載體噬菌體、動(dòng)植物病毒等知識(shí)拓展

基因工程中的同尾酶同尾酶是指識(shí)別DNA分子中不同核苷酸序列,但能切割產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶,

如圖:

由同尾酶產(chǎn)生的黏性末端,能夠通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)彼此連接,可用于基因表達(dá)載體的

構(gòu)建。易混易錯(cuò)

DNA連接酶和DNA聚合酶的異同類型DNA連接酶DNA聚合酶作用化學(xué)鍵磷酸二酯鍵參與過(guò)程基因表達(dá)載體的構(gòu)建PCR、DNA復(fù)制作用時(shí)是否需要模板不需要模板需要模板作用時(shí)是否需要引物不需要引物需要引物作用機(jī)理連接兩個(gè)DNA片段將單個(gè)脫氧核苷酸加到已有的

核酸片段的3'端考點(diǎn)2基因工程的基本操作程序及應(yīng)用一、DNA的粗提取、PCR、電泳鑒定1.DNA的粗提取及鑒定實(shí)驗(yàn)原理粗提取(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白質(zhì)溶于酒精,利用這一原理,可以

初步分離DNA與蛋白質(zhì);(2)DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2mol/L

的NaCl溶液鑒定DNA+二苯胺試劑

藍(lán)色實(shí)驗(yàn)步驟

注意事項(xiàng)(1)過(guò)濾時(shí)應(yīng)選用紗布而不是濾紙,如果用濾紙,可能會(huì)把DNA分子

吸附在濾紙上。(2)低溫操作能防止DNA酶降解DNA。(3)粗提取的DNA中可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)2.PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))原理DNA半保留復(fù)制和DNA的熱變性PCR的條件模板目的基因(所在)的雙鏈片段原料四種游離的脫氧核苷酸(dNTP)引物一般為根據(jù)目的基因兩端序列設(shè)計(jì)的能與之互補(bǔ)配對(duì)的短單

鏈DNA片段(一般需要選擇2種引物分別擴(kuò)增兩條模板鏈)酶耐高溫的DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)緩沖液需含有Mg2+,以激活DNA聚合酶PCR的步驟和結(jié)果

小表達(dá)

(選必3P77改編)PCR技術(shù)操作中為什么需要用2種不同的引物?DNA分子由兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈構(gòu)成,PCR擴(kuò)增時(shí)只能從各自模板鏈

的3'端開始,故需堿基序列不同的2種引物。電泳的定義DNA分子具有可解離的基團(tuán),在一定的pH下,這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)

電荷。在電場(chǎng)的作用下,這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移

動(dòng)檢測(cè)原理在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等

有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過(guò)染色,可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢

測(cè)出來(lái)3.瓊脂糖凝膠電泳電泳結(jié)果及初步分析電泳結(jié)果示意圖(常規(guī)結(jié)果)

電泳結(jié)果及初步分析結(jié)果初步分析根據(jù)條帶位置判斷DNA分子大小(1)泳道1為Marker,由一些分子大小已知的DNA片段組成,可以作為電泳

結(jié)果中的參考系,以反映出待測(cè)片段的分子大小。如泳道4中的DNA片段介于3000bp到5000bp之間。(2)當(dāng)DNA構(gòu)象相同、電泳條件基本一致時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量大的DNA分子遷移速率較小,相對(duì)分子質(zhì)量小的DNA分子遷移速率較大,故泳道3的片段①的相對(duì)分子質(zhì)量>片段②的相對(duì)分子質(zhì)量根據(jù)電泳條帶判斷限制酶酶切位點(diǎn)數(shù)量泳道2和泳道3為同一個(gè)質(zhì)粒經(jīng)不同限制酶處理得到的結(jié)果。泳道2只有1條條帶,說(shuō)明質(zhì)粒只含1個(gè)相應(yīng)限制酶切割位點(diǎn)。泳道3含2條條帶,說(shuō)明質(zhì)粒含2個(gè)相應(yīng)限制酶切割位點(diǎn)。假設(shè)泳道2中DNA分子為4800bp,則泳道3中DNA分子的大小分別為3000bp(片段①)和1800bp(片段②)二、基因工程的基本操作程序及應(yīng)用1.目的基因的篩選與獲取目的基因用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因,主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因(也可能是基因調(diào)控序列等)較為有效的篩選方法從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選目的基因的獲取方法PCR、人工合成法、基因文庫(kù)法等2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(基因工程的核心步驟)構(gòu)建目的(1)讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且遺傳給下一代;(2)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用基因表達(dá)載體的組成

啟動(dòng)子的分類組成型啟動(dòng)子在多數(shù)或全部組織中保持持續(xù)的驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子受外界化學(xué)或物理信號(hào)調(diào)控驅(qū)動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄,如乳糖操縱子特異型啟動(dòng)子具有組織特異性(在特定的組織或器官中驅(qū)動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄)或者發(fā)育時(shí)期特異性(在特定發(fā)育時(shí)期驅(qū)動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄),如水稻胚乳細(xì)胞啟動(dòng)子構(gòu)建基因表達(dá)載體過(guò)程示意圖

限制酶的選擇

結(jié)合兩圖可知:最宜選用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切。注:若用Ti質(zhì)粒,目的基因必須插入T-DNA序列易混易錯(cuò)

啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比

啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子位置DNADNAmRNAmRNA作用RNA聚合酶識(shí)別和

結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)

基因的轉(zhuǎn)錄使轉(zhuǎn)錄停止翻譯的起始信號(hào)

(編碼氨基酸:甲硫

氨酸)翻譯的結(jié)束信號(hào)

(一般不編碼氨基

酸)知識(shí)拓展

(1)標(biāo)記基因的常見類型及相應(yīng)篩選方法標(biāo)記基因常見類型篩選方法標(biāo)記基因?yàn)榭股氐目剐曰蚧虮磉_(dá)載體上攜帶的抗生素抗性基因進(jìn)入受體細(xì)胞并表達(dá)后,可以使受體細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)相應(yīng)抗生素的抗性,在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入致死濃度

的相應(yīng)抗生素后,存活的便是轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞標(biāo)記基因?yàn)楸匦锠I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成基因基因表達(dá)載體上攜帶某種必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成基因,而受體細(xì)胞本身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組分。將細(xì)胞在不含有此營(yíng)養(yǎng)組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng),存活的便是轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞標(biāo)記基因?yàn)閳?bào)告基因[如綠色熒光蛋白(GFP)基因]基因表達(dá)載體上攜帶的GFP基因表達(dá)的綠色熒光蛋白,在一定條件下可發(fā)出綠色熒光。將攜帶該標(biāo)記基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞后,若細(xì)胞可發(fā)出綠色熒光,則說(shuō)明目的基因已成功導(dǎo)入(2)對(duì)空質(zhì)粒的篩選——藍(lán)白斑篩選法:載體上攜帶有抗生素抗性基因及l(fā)acZ基因。

lacZ基因表達(dá)產(chǎn)物可分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì),使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色,否則菌落為白色。該

載體上僅在lacZ基因中存在目的基因插入位點(diǎn),若目的基因插入lacZ基因,則lacZ基因

失去相應(yīng)功能。在大腸桿菌的培養(yǎng)基中加入相應(yīng)抗生素和X-gal后,未導(dǎo)入質(zhì)粒的菌

株不能生長(zhǎng),白色的菌落便是成功導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌,呈現(xiàn)藍(lán)色的菌落則是轉(zhuǎn)

入空質(zhì)粒的大腸桿菌。受體細(xì)胞的種類及方法植物細(xì)胞花粉管通道法我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)。可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。也可以在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi),剪去柱頭,將DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含Ti質(zhì)粒。當(dāng)農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后,能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞,并將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中(T-DNA不會(huì)因目的基因的插入而

喪失轉(zhuǎn)移功能),通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用,就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞顯微注射法利用顯微注射將目的基因注入動(dòng)物的受精卵中微生物細(xì)胞Ca2+處理法先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞知識(shí)拓展

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖

(1)兩次重組①第一次重組:目的基因(①)與Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組載體。②第二次重組:重組Ti質(zhì)粒上的T-DNA插入染色體DNA。(2)兩次導(dǎo)入①第一次導(dǎo)入:將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入經(jīng)Ca2+處理的農(nóng)桿菌細(xì)胞。②第二次導(dǎo)入:將T-DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞染色體DNA上。

4.目的基因的檢測(cè)與鑒定分子水平的檢測(cè)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞PCR操作方法:設(shè)計(jì)目的基因特異性引物,提取受體細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,如果能夠擴(kuò)增出目的基因片段,說(shuō)明該基因已

經(jīng)導(dǎo)入受體細(xì)胞DNA分子雜交操作方法:把目的基因片段用放射性同位素、生物素或熒光進(jìn)行標(biāo)記,與受體細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行雜交,如果目的基因已經(jīng)導(dǎo)入受體細(xì)胞,那么標(biāo)記的基因片段就會(huì)與其結(jié)合,通過(guò)特殊

的儀器就能夠檢測(cè)出來(lái)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)操作方法:提取受體細(xì)胞內(nèi)的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到cDNA,以獲得的cDNA為模板,設(shè)計(jì)目的基因特異性引物進(jìn)行PCR核酸分子雜交操作方法:從待測(cè)轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞中提取mRNA分子,用已標(biāo)記的目的基因片段作為探針與mRNA雜交分子水平的檢測(cè)檢測(cè)目的基因是否翻譯抗原—抗體雜交操作方法:從受體細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)后,進(jìn)行電泳分離,然后利用目的蛋白的抗體進(jìn)行檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定檢測(cè)目標(biāo)性狀的有無(wú)等,如通過(guò)采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來(lái)確定抗蟲

基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度5.基因工程的應(yīng)用

考點(diǎn)3蛋白質(zhì)工程簡(jiǎn)介設(shè)計(jì)基礎(chǔ)以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)目的改造現(xiàn)有蛋白質(zhì),或制造一種新的蛋白質(zhì)改造方法由于基因決定蛋白質(zhì),因此要對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)改造,最終還必須通過(guò)改造或合成基因來(lái)完成基本思路從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到并改變相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質(zhì)應(yīng)用速效胰島素類似物的研發(fā)、延長(zhǎng)干擾素的體外保存時(shí)間、枯草桿菌蛋白酶的改進(jìn)等小表達(dá)

蛋白質(zhì)工程中為什么通過(guò)對(duì)基因操作來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造?蛋白質(zhì)一般具有十分復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu),基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,容易改造;改造后的

基因可以遺傳給下一代,而直接改造的蛋白質(zhì)無(wú)法遺傳。

題型核酸序列的閱讀及引物、限制酶的選擇(熱考點(diǎn))1.核酸序列的閱讀DNA復(fù)制的方向性(1)DNA的一條單鏈具有兩個(gè)末端,一端有一個(gè)游離的磷酸基團(tuán),

稱作5‘端,另一端有一個(gè)羥基(—OH),稱作3'端,DNA的兩條單鏈

方向相反;(2)DNA復(fù)制時(shí),引物與DNA單鏈的3‘端結(jié)合,子鏈延伸方向?yàn)?'→3'轉(zhuǎn)錄和翻譯核酸序列的閱讀

模板鏈的判斷

轉(zhuǎn)錄的方向?yàn)閱?dòng)子→終止子,轉(zhuǎn)錄沿模板鏈的3‘端到5’端進(jìn)行,故模板鏈的3‘端與啟動(dòng)子相連,b鏈為模板鏈(2024全國(guó)甲,38,15分)(2023山東,25,10分)(2023江蘇,22,12分)知識(shí)拓展

移碼突變構(gòu)建融合基因表達(dá)載體時(shí)易發(fā)生移碼突變,如圖P基因與編碼FLAG的序列形成一

個(gè)融合基因:

編碼鏈與mRNA中堿基排列順序一致(只是mRNA中不含T只含U),起始密碼子是

AUG,那么編碼鏈核酸序列的閱讀、分析就從ATG開始,三聯(lián)體密碼子閱讀框架的改

變會(huì)造成翻譯結(jié)果的改變。若會(huì)發(fā)生移碼突變,應(yīng)在兩基因間插入一定數(shù)量的堿基

對(duì),保持原基因編碼的密碼子順序不變。引物的特點(diǎn)(1)是一段短單鏈核酸,且能與DNA母鏈的一段堿基互補(bǔ)配對(duì);(2)引物的5‘端可以被修飾,而3’端需與DNA模板鏈嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì),故不可被修飾。5‘端常見的修飾:加酶切位點(diǎn)、加熒光標(biāo)記、引入突變位點(diǎn)等;(3)PCR過(guò)程中,引物一般成對(duì)存在且成對(duì)的引物不能堿基互補(bǔ)配對(duì)判斷引物的方向(1)判斷引物的3‘端、5’端:引物與DNA模板鏈的3‘端互補(bǔ),方向相反;(2)DNA復(fù)制從引物的3'端繼續(xù)向前進(jìn)行;(3)由此可知,甲、乙、丙、丁四個(gè)引物的擴(kuò)增方向如圖1所示。2.引物的特點(diǎn)及選擇根據(jù)擴(kuò)增目的選擇引物(1)若擴(kuò)增目的基因序列,則應(yīng)選擇圖1中的引物乙、丙;(2)若要檢驗(yàn)?zāi)康幕蚴欠褚哉_方向插入質(zhì)粒相應(yīng)位點(diǎn),應(yīng)設(shè)計(jì)一個(gè)引物與目的基因外部序列(即質(zhì)粒序列)堿基互補(bǔ)配對(duì),另一個(gè)引物與目的基因內(nèi)部序列堿基互補(bǔ)配對(duì),如圖2所示的引物1、2。

(2023浙江6月選考,19,2分)(2023山東,25,10分)(2022天津,15,10分)3.限制酶的選擇(1)限制酶選擇的原則:①限制酶不能破壞目的基因的完整結(jié)構(gòu),也不能破壞載體上的啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制

原點(diǎn)等必要元件;②應(yīng)使目的基因按照正確的轉(zhuǎn)錄方向插入載體的啟動(dòng)子和終止子之間;③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接,盡量選用不同的限制酶切割目的基

因和質(zhì)粒,即雙酶切。(2)實(shí)例分析:圖1質(zhì)粒為載體,圖2為克隆得到的含W基因的DNA片段,W基因以乙鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈(MfeⅠ和EcoRⅠ為同尾酶,可切出相同的黏性末端)。

限制酶選擇分析:圖1質(zhì)粒中含2個(gè)EcoRⅠ識(shí)別位點(diǎn),選用EcoRⅠ會(huì)切去終止子,選用

BamHⅠ會(huì)破壞啟動(dòng)子,故可選用的限制酶有MfeⅠ、HindⅢ、KpnⅠ;W基因以乙鏈為

轉(zhuǎn)錄模板鏈,RNA聚合酶從模板鏈的3'端開始轉(zhuǎn)錄,故W基因乙鏈的3'端與啟動(dòng)子相連,

5'端與終止子相連,為保證W基因與質(zhì)粒正確連接,質(zhì)粒的終止子一側(cè)應(yīng)選用與W基因

右側(cè)相同的HindⅢ,故切割質(zhì)?？蛇x的限制酶為MfeⅠ、HindⅢ。圖2中選用MfeⅠ會(huì)

破壞W基因,故只能選擇同尾酶EcoRⅠ,因此選用EcoRⅠ、HindⅢ切割圖2中的

DNA。(2021遼寧,24,10分)典例

(2022天津,15,10分)研究者擬構(gòu)建高效篩選系統(tǒng),將改進(jìn)的苯丙氨酸合成關(guān)鍵酶

基因P1導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌,以提高苯丙氨酸產(chǎn)量。

(1)如圖是該高效篩選系統(tǒng)載體的構(gòu)建過(guò)程。載體1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB兩個(gè)標(biāo)記基因,為去除篩選效率較低的SacB,應(yīng)選擇引物

1和

4(以上兩空可調(diào)換),并在引物的5‘(5’/3‘)端引入XhoⅠ酶識(shí)別序列,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)酶切、連接后環(huán)化成載體2。(2)PCR擴(kuò)增載體3中篩選效率較高的標(biāo)記基因RpsL(鏈霉素敏感基因)時(shí),引物應(yīng)包含

XhoⅠ

(EcoRⅠ/HindⅢ/XhoⅠ)酶識(shí)別序列,產(chǎn)物經(jīng)單酶切后連接到載體2構(gòu)建高效

篩選載體4。(3)將改進(jìn)的P1基因整合到載體4構(gòu)建載體5。將載體5導(dǎo)入鏈霉素不敏感(由RpsL突變

造成)、卡那霉素敏感的受體菌。為獲得成功導(dǎo)入載體5的菌株,應(yīng)采用含有卡那霉素