(45)授權(quán)公告日2022.03.22(21)申請(qǐng)?zhí)?01811534794.4(22)申請(qǐng)日2018.12.14(43)申請(qǐng)公布日2019.06.28所(普通合伙)31233一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻本發(fā)明涉及一種利用高速逆流色譜分離純21.一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻二酚的方法，包括：(2)將得到的大麻粗提物使用乙醇溶解后注入大孔樹脂，經(jīng)梯度洗脫，收集富含大麻二酚的洗脫段，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到大麻二酚粗提物；(3)以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水為分離溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜分離純化，收集大麻二酚餾分段，回收溶劑，后處理得到大麻二酚；其中，正己烷-乙酸為5:0～1:5:1～3;所述高速逆流色譜分離純化為：以分離溶劑體系中的一相為固定相，另一相為流動(dòng)相，以30～50mL/min的流速將所述固定相泵入高速逆流色譜儀中，在25～35℃、主機(jī)轉(zhuǎn)速為700～1000r/min的條件下，以5～10mL/min的流速泵入所述流動(dòng)相，待兩相達(dá)到平衡后，將大麻二酚粗提物用流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣，經(jīng)檢測器檢測后，收集大麻二酚餾分段。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻二酚的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的醇提濃縮采用體積百分濃度為50～95%的乙醇溶液，工業(yè)大麻花或葉與乙醇溶液的質(zhì)量體積比為1g:5～10mL。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻二酚的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的水沉溫度為5～8℃,水沉?xí)r間為24h。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻二酚的方法，其特5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻二酚的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的梯度洗脫采用體積百分濃度為5～85%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫；收集體積百分濃度為70～85%的乙醇溶液洗脫段。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻二酚的方法，其特征在于：所述大麻二酚粗提物用流動(dòng)相溶解后的濃度為50～100mg/mL,進(jìn)樣體積為20mL;檢測的波長為220nm。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻二酚的方法，其特征在于：所述步驟(3)中的后處理包括減壓濃縮、結(jié)晶和真空冷凍干燥。3技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于大麻二酚提取領(lǐng)域，特別涉及一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻二酚的方法。背景技術(shù)(tetrahydrocannabinol,THC)、大麻二酚(cannabidiol,CBD)、大麻酚(cannabinol,CBN)及大麻萜酚(cannabichromene,CBC)等，其中前三者占大麻酚類化合物的90%以上，四氫大麻生長期內(nèi)大麻花、葉中的四氫大麻酚(THC)含量低于0.3%,不具備提取毒性成分四氫大麻酚的價(jià)值或直接作為毒品吸食，可以合法進(jìn)行規(guī)?；N植與工業(yè)化開發(fā)利用。[0004]近年來，通過對(duì)大麻活性成分的研究發(fā)現(xiàn)，大麻二酚(cannabidiol)不具有神經(jīng)毒性，為非成癮性活性成分，藥用價(jià)值明顯。藥理研究表明，其能拮抗四氫大麻酚對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)的影響，并具有抗痙攣、鎮(zhèn)靜催眠、抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗焦慮等藥理活性，是一種在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域極具應(yīng)用前景的天然活性成分。[0005]肖培云等在《中國醫(yī)藥工業(yè)雜志》(2008年39卷4期)發(fā)表了對(duì)在不同生長期工業(yè)大中的含量也很低，如何盡量去除THC等具有致幻及成癮作用成分并保證高純度CBD的產(chǎn)率，是CBD開發(fā)應(yīng)用的前提。[0006]目前，公開信息中有一些關(guān)于從工業(yè)大麻中提取大麻二酚的方法的報(bào)道，多采用有技術(shù)中所提及的從工業(yè)大麻中提取大麻二酚的方法，主要存在以下問題：[0007]1)工業(yè)大麻植物中大麻素類成分復(fù)雜，已知的有80多種，極性相似成分較多，采用[0008]2)提取純化后，仍可檢出精神毒性成分THC,產(chǎn)品安全性不能得到保證，產(chǎn)品流通[0009]3)傳統(tǒng)技術(shù)中反復(fù)柱層析分離純化，勢必會(huì)造成CBD的損耗，產(chǎn)率下降，使產(chǎn)能受到限制。發(fā)明內(nèi)容[0010]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻二酚的方法，該方法采用大孔樹脂層析柱和高速逆流色譜儀相結(jié)合，去除雜質(zhì)和四氫大麻酚4效果更好。[0011]本發(fā)明提供了一種利用高速逆流色譜分離純化制備大麻二酚的方法，包括：[0013](2)將得到的大麻粗提物使用乙醇(稀)溶解后注入大孔樹脂，經(jīng)梯度洗脫，收集富含大麻二酚的洗脫段，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到大麻二酚粗提物；[0014](3)以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(也可以是正己烷-甲醇-水組成的三溶劑體系)為分離溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜分離純化，收集大麻二酚餾分段，回收溶劑，后處理得到大麻二酚。[0015]所述步驟(1)中的醇提濃縮采用體積百分濃度為50～95%的乙醇溶液，工業(yè)大麻花或葉與乙醇溶液的質(zhì)量體積比為1g:5～10mL。[0016]所述步驟(1)中的水沉溫度為5～8℃,水沉?xí)r間為24h。[0018]所述步驟(2)中的梯度洗脫采用體積百分濃度為5～85%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫；收集體積百分濃度為70～85%的乙醇溶液洗脫段。[0019]所述步驟(3)中的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的體積比為5:0～1:5:1～3。[0020]所述步驟(3)中的高速逆流色譜分離純化具體為：以分離溶劑體系中的一相為固定相，另一相為流動(dòng)相，以30～50mL/min的流速將所述固定相泵入高速逆流色譜儀中，在25~35℃、主機(jī)轉(zhuǎn)速為700～1000r/min的條件下，以5～10mL/min的流速泵入所述流動(dòng)相，待兩相達(dá)到平衡后，將大麻二酚粗提物用流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣，經(jīng)檢測器檢測后，收集大麻二酚餾分段。[0021]其中，以溶劑體系中的上相為固定相，下相為流動(dòng)相；或者以溶劑系統(tǒng)的下相為固定相，上相為流動(dòng)相。高速逆流色譜儀可以采用正接正轉(zhuǎn)模式，也可以采用正接反轉(zhuǎn)模式。所述正接即從首端和尾端的連接模式。[0022]所述大麻二酚粗提物用流動(dòng)相溶解后的濃度為50～100mg/mL,進(jìn)樣體積為20mL;檢測的波長為220nm。[0023]所述步驟(3)中的后處理包括減壓濃縮、結(jié)晶和真空冷凍干燥。[0024]本發(fā)明的樣品經(jīng)過大孔吸附樹脂粗分離后，樣品中的大部分雜質(zhì)被除去，大麻二酚得到富集；再經(jīng)過高速逆流色譜儀進(jìn)一步精分離去除雜質(zhì)，尤其是去除四氫大麻酚，降低[0025]本發(fā)明所采用的高速逆流色譜法與柱層析等方法相比，不使用固態(tài)的載體，因此不存在固態(tài)載體造成的樣品不可逆吸附和損耗，分離效果高，能最大限度的利用原料，降低一種高效快捷的從工業(yè)大麻中分離高純度CBD的方法。[0026]有益效果[0027]本發(fā)明采用大孔樹脂層析柱和高速逆流色譜儀相結(jié)合，通過優(yōu)化工藝參數(shù)，從工業(yè)大麻花葉中分離得到高純度的大麻二酚，同時(shí)去除了精神毒性成分四氫大麻酚，所用溶5附圖說明[0028]圖1為實(shí)施例1中大麻二酚粗提物的高效液相色譜圖；[0029]圖2為實(shí)施例1中最終產(chǎn)物大麻二酚的高效液相色譜圖；[0030]圖3為實(shí)施例1中用高速逆流色譜儀分離純化大麻二酚粗提物的圖譜。具體實(shí)施方式[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。[0033](1)將10kg工業(yè)大麻粉碎烘干，按照料液比1:5(w/v,g/mL)的比例加入到70%乙醇水溶液充分混合，超聲提取120min,(控制溫度在45℃以下，避光),超聲結(jié)束后真空抽濾，得到的濾渣按上述條件重復(fù)提取2次，合并濾液，在45℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.2,加入5-7倍純化水，在5-8℃條件下，水沉24h,過濾，沉淀物減壓干燥得到大麻粗提物。[0034](2)將AB-8大孔樹脂用乙醇浸泡24h后裝入層析柱中，用乙醇洗至洗出液加等體積去離子水為透明溶液為止。然后用去離子水洗至流出液為中性；將大麻粗提物用乙醇溶解后注入AB-8大孔樹脂中，直至吸附體積達(dá)到樹脂總體積的2/3.先用去離子水以2BV/h的流速?zèng)_洗樹脂，然后分別用10%,30%,50%,70%的乙醇水溶液以2BV/h的流速?zèng)_洗，并收集70%洗脫部分。在45℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到大麻二酚粗提物，高效液相色譜圖如圖1所示。[0035](3)將正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水按5:0.5:5:1的體積比置于分液漏斗中，充分搖高速逆流色譜儀啟動(dòng)預(yù)熱30min后，循環(huán)水浴設(shè)置為25℃,將固定相以30mL/min的流速泵入儀器，然后正接正轉(zhuǎn)，啟動(dòng)儀器，使主機(jī)轉(zhuǎn)速至800r/m入流動(dòng)相，兩相在管路中達(dá)到平衡后，將1000mg大麻二酚粗提物溶于20mL流動(dòng)相中，進(jìn)樣并在紫外檢測器下檢測，收集目標(biāo)峰組分并減壓濃縮除去有機(jī)相，減壓過程中析出的沉淀物抽濾并冷凍干燥即得大麻二酚單體，純度為99.12%,未檢出THC,如圖2和3所示。[0036]實(shí)施例2[0037](1)將10kg工業(yè)大麻粉碎烘干，按照料液比1:10(w/v,g/mL)的比例加入到80%乙醇水溶液充分混合，超聲提取100min,(控制溫度在45℃以下，避光),超聲結(jié)束后真空抽濾，得到的濾渣按上述條件重復(fù)提取2次，合并濾液，在45℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.2,加入5-7倍純化水，在5-8℃條件下，水沉24h,過濾，沉淀物減壓干燥得到大麻粗提物。[0038](2)將D101大孔樹脂用乙醇浸泡24h后裝入層析柱中，用乙醇洗至洗出液加等體積去離子水為透明溶液為止。然后用去離子水洗至流出液為中性；將大麻粗提物用乙醇溶解后注入D101大孔樹脂中，直至吸附體積達(dá)到樹脂總體積的2/3。先用去離子水以2.5BV/h的流速?zèng)_洗樹脂，然后分別用10%,30%,70%,80%的乙醇水溶液以2.5BV/h的流速?zèng)_洗，并6收集70-80%洗脫部分。在45℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到大麻二酚粗提物。儀啟動(dòng)預(yù)熱30min后，循環(huán)水浴設(shè)置為25℃,將固定相以30mL/min的流速泵入儀器，然后正相在管路中達(dá)到平衡后，將1000mg大麻二酚粗提物溶于20mL固定相中，進(jìn)樣并在紫外檢測器下檢測，收集目標(biāo)峰組分并減壓濃縮除去有機(jī)相，得到的粉末用80%乙醇結(jié)晶處理，過濾得到晶體，減壓真空干燥即得大麻二酚單體，純度為99.75%,未檢出THC。[0040]實(shí)施例3[0041](1)將10kg工業(yè)大麻粉碎烘干，按照料液比1:8(w/v,g/mL)的比例加入到80%乙醇水溶液充分混合，超聲提取120min,(控制溫度在45℃以下，避光),超聲結(jié)束后真空抽濾，得到的濾渣按上述條件重復(fù)提取2次，合并濾液，在45℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.2,加入5-7倍純化水，在5-8℃條件下，水沉24h,過濾，沉淀物減壓干燥得到大麻粗提物。[0042](2)將AB-8大孔樹脂用乙醇浸泡24h后裝入層析柱中，用乙醇洗至洗出液加等體積去離子水為透明溶液為止。然后用去離子水洗至流出液為中性；將大麻粗提物用乙醇溶解后注入AB-8大孔樹脂中，直至吸附體積達(dá)到樹脂總體積的2/3.先用去離子水以2BV/h的流速?zèng)_洗樹脂，然后分別用10%,30%,50%,80%的乙醇水溶液以2BV/h的流速?zèng)_洗，并收集80%洗脫部分。在45℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，得到大麻二酚粗提物。[0043](3)將正己烷：甲醇：水按5:5:1的體積比置于分液漏