(19)中華人民共和國國家知識產(chǎn)權局(10)申請公布號CN111087474A(21)申請?zhí)?01911323745.0(22)申請日2019.12.20(71)申請人蘭州大學A61K38/08(2019.01)A61P29/00(2006.01)地址730000甘肅省蘭州市城關區(qū)天水南路222號(72)發(fā)明人方泉許彪張夢娜張潤李寧(74)專利代理機構江蘇圣典律師事務所32237代理人胡建華(54)發(fā)明名稱一種基于大麻肽(r)VD-Hpα和神經(jīng)肽FF的嵌合肽及其制備方法與應用(57)摘要本發(fā)明公開了一種基于大麻肽(r)VD-Hpa和神經(jīng)肽FF的嵌合肽及其制備方法與應用，即基于(r)VD-Hpa的N末端序列與神經(jīng)肽FF的C末端序列構建而成的全新嵌合肽VF-11和VF-13。與現(xiàn)在體內(nèi)的鎮(zhèn)痛活性有所加強，產(chǎn)生了比母體分子更有效的鎮(zhèn)痛效果。(2)VF-11和VF-13解決了經(jīng)典大麻類激動劑以及母體分子存在的鎮(zhèn)痛耐受時間(分鐘)21.一種基于大麻肽(r)VD-Hpa和神經(jīng)肽FF的嵌合肽，其特征在于，其具有式I所示的氨基酸序列，Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Xaa10-Xaal1-Arg-Phe-NH?(I);其中，Xaa10和Xaal1同時缺失，或Xaa10被Pro取代的同時Xaal1被Gln取代。2.根據(jù)權利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，其具有式Ⅱ所示的氨基酸序列；Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Arg-Phe-NH?(Ⅱ)。3.根據(jù)權利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，其具有式Ⅲ所示的氨基酸序列；Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Pro-Gln-Arg-Phe-NH?4.權利要求1所述嵌合肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：N-α-Fmoc保護的氨基酸與脫保護后的氨基樹脂進行縮合反應，茚檢確認縮合成功，再脫保多肽鏈合成完成；(2)用切割劑將步驟(1)合成完成的多肽鏈進行切割，過濾，將濾液旋干，加入冰乙醚析5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的氨基樹脂為Rink-Amide-MBHA或Rink-Amide樹脂；所述的溶脹為將氨基樹脂置于二氯甲脹；二氯甲烷與氨基樹脂的體積質(zhì)量比為8～12mL/g。6.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的脫保護為將處理后其中，所述的混合溶液為哌啶、1,8-二氮雜環(huán)[5,4,0]十一碳-7-烯與N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液，三者的體積比為1:1:98;混合溶液與脫保護的氨基樹脂的體積質(zhì)量比為8~12mL/g;一次攪拌的速率為60～100rpm,一次攪拌的時間為2～6min;二次攪拌的速率為60~100rpm,二次攪拌的時間為8～12min。Fmoc保護的氨基酸、1-羥基苯并三氮唑、N-二異丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到混合溶液；將混合溶液加入脫保護后的氨8.根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，N-α-Fmoc保護的氨基酸、1-羥基苯并三氮唑、苯并三氮唑-N,N,N',N’-四甲基脲六氟磷酸鹽和N,N-二異丙基乙胺的摩爾比為1:0.2～1.5:0.2～1.5:1.5～3;N,N-二甲基甲酰胺與N-α-Fmoc保護的氨基酸的體積質(zhì)量比為20mL/g;所述混合溶液與脫保護后的氨基樹脂的體積質(zhì)量比為4～6mL/g;攪拌速率為60~100rpm;所述的反應為在室溫下反應40～100min。9.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的切割為將步驟(1)合成完成的多肽鏈置于切割劑中室溫反應1.5～4h;其中，所述的切割劑為三氟乙酸：三異丙基硅烷和水按照95:2.5:2.5的體積比混合而成的溶液；切割劑與步驟(1)合成完成的多肽鏈與的體積質(zhì)量比為10～20mL/g。10.權利要求1所述的嵌合肽在制備鎮(zhèn)痛藥中的應用。3用于疼痛的治療已有幾千年的歷史(JPsychoactiveDrugs.1981,13(1):23;PainResManag.2001,6(2):80)。生物體內(nèi)的大麻系統(tǒng)主要包括兩種大麻受體(CB1受體和CB2受ExpMed.2007,16(6):807)。經(jīng)典的內(nèi)源性大麻配體包括花生四烯乙醇胺(AEA)(Science.1992,258(5090):1946)和花生四烯酰甘油(2-AG)(BiochemPharmacol.1995,50BiolChem.2003,278:8547)。Hemopressin對于急性疼痛和病理性疼痛均可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)間存在很高的氨基酸序列同源性(Neuropeptides.2017,63:83)。進一步的藥理學研究表[0004]神經(jīng)肽FF(NPFF)于1985年被首次在牛腦中分離。NPFF系統(tǒng)包括兩種受體前體(Pro-NPFFA和NPFFB)和兩種受體(NPFF?和NPFF?)(FEBSLett.1997,409:426;的鎮(zhèn)痛以及耐受和便秘副作用也有明顯的調(diào)節(jié)作用(EurJPharmacol.2015,767:119;4響小的優(yōu)點。然而，(m)VD-Hpa的鎮(zhèn)痛效果仍不理想，且長期給藥過程中會出現(xiàn)明顯的鎮(zhèn)痛耐受現(xiàn)象。發(fā)明內(nèi)容[0006]發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種鎮(zhèn)痛效果好、副作用低的基于大麻肽(r)VD-Hpa和神經(jīng)肽FF的嵌合肽。[0007]本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述嵌合肽的制備方法。[0008]本發(fā)明最后要解決的技術問題是提供上述嵌合肽的應用。[0009]為了解決上述技術問題，本發(fā)明公開了一種基于大麻肽(r)VD-Hpa和神經(jīng)肽FF的嵌合肽，其是以大麻肽(r)VD-Hpa(VDPVNFKFLSH-OH)和NPFF(FLFQPQRF-NH?)的關鍵藥效團為化學模板構建而成的，其N末端為大麻肽(r)VD-Hpa的“關鍵藥效團”,C末端為NPFF的“關鍵藥效團”,其具有式I所示的氨基酸序列，[0010]Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Xaa10-Xaal1-Arg-Phe-NH?[0011]其中，Xaa10和Xaal1同時缺失，或Xaa10被Pro[0012]優(yōu)選地，當Xaa10和Xaa11同時缺失時，所述的嵌合肽具有式Ⅱ所示的氨基酸序列，嵌合肽標記為VF-11。[0015]優(yōu)選地，當Xaa10被Pro取代的同時Xaal1被Gln取代時，所述的嵌合肽具有式Ⅲ所示的氨基酸序列，嵌合肽標記為VF-13。[0018]上述嵌合肽的制備方法包括如下步驟：[0019](1)采用Fmoc固相合成法制備多肽：[0020](i)樹脂預處理：先溶脹氨基樹脂，減壓抽干，洗滌；5[0022](iii)氨基酸的縮合：脫保護后，將第一個N-α-Fmoc保護的氨基酸(Fmoc-Aa)與脫保護后的氨基樹脂進行縮合反應，茚檢確認縮合成功；再脫保護并洗滌，茚檢確認脫保護完鏈合成完成；[0024](2)用切割劑將步驟(1)合成完成的多肽鏈進行切割，過濾，將濾液，即切割液減壓旋干，加入冰乙醚析出沉淀，用20%的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽，冷凍干燥得白色粗肽粉末；并通過反相高效液相色譜將粗肽進一步分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰，得到多靶點多肽產(chǎn)品。[0025]步驟(1)中，所述的氨基樹脂為Rink-Amide-MBHA或Rink-Amide樹脂，優(yōu)選Rink-Amide-MBHA樹脂；所述的溶脹為將氨基樹脂置于二氯甲烷中按照60～100rpm的速率攪拌10~40min,優(yōu)選80rpm,攪拌30min,使樹脂充分溶脹；二氯甲烷與氨基樹脂的體積質(zhì)量比為8~12mL/g,優(yōu)選10mL/g;所述的洗滌為加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次，每次3min。[0027]其中，所述的混合溶液為哌啶、1,8-二氮雜環(huán)[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)與DMF的混合溶液，三者的體積比為1:1:98;混合溶液與脫保護的氨基樹脂的體積質(zhì)量比為8~12mL/g,優(yōu)選10mL/g;一次攪拌的速率為60～100rpm,優(yōu)選80rpm;一次攪拌的時間為2~6min,優(yōu)選5min;二次攪拌的速率為60～100rpm,優(yōu)選80rpm;二次攪拌的時間為8～12min,優(yōu)選10min。[0028]步驟(1)中，所述的縮合反應為將N-α-Fmoc保護的氨基酸(Fmoc-Aa)、1-羥基苯并三氮唑(HOBt)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和N,N-二異丙基乙胺(DIEA)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到混合溶液；將混合溶液加入脫保護后的氨基樹脂中，于惰性環(huán)境，優(yōu)選氬氣環(huán)境下攪拌反應，抽干溶劑；用N,N-二甲基甲酰胺洗滌3次，抽的摩爾比為1:0.2～1.5:0.2～1.5:1.5～3,優(yōu)選1:1:1:2;N,N-二甲基甲酰胺與N-α-Fmoc保護的氨基酸的體積質(zhì)量比為20mL/g;其中，DIEA最后加入；所述混合溶液與脫保護后的氨基樹脂的體積質(zhì)量比為4～6mL/g,優(yōu)選5mL/g;攪拌速率為60～100rpm,優(yōu)選80rpm;所述的反應為在室溫下反應40～100min,優(yōu)選60min。[0030]步驟(1)中，所述的茚檢為挑取少量樹脂于無色透明玻璃管中，加入茚檢試劑，置于沸水中靜置3min。如Fmoc基團脫除完全，則樹脂和溶液均呈深藍色。若縮合成功，則樹脂溶液的配制為0.5g茚三酮于10mL無水乙醇，其中苯酚、吡啶和無水乙醇均經(jīng)重蒸處理。[0031]步驟(1)中，所述的肽鏈延長，具體為根據(jù)多肽序列，從C端開始依次選擇相應N-α-Fmoc保護的氨基酸，并將步驟(1.ii)所得脫除Fmoc保護基團的樹脂按步驟(1.iii)的工藝完成肽鏈的縮合，得到側(cè)鏈全保護的肽樹脂。[0032]步驟(2)中，所述的切割為將步驟(1)合成完成的多肽鏈置于切割劑中室溫反應61.5～4h,優(yōu)選3h;優(yōu)選地，每15min于50rpm/min的攪拌速率下攪拌1min。[0033]其中，所述的切割劑為三氟乙酸(TFA):三異丙基硅烷(TIS)和水按照95:2.5:2.5的體積比混合而成的溶；切割劑與步驟(1)合成完成的多肽鏈與的體積質(zhì)量比為10～20mL/g,優(yōu)選15mL/g。[0034]優(yōu)選地，在切割前，將縮合后的樹脂用二氯甲烷DCM(2×3min)、MeOH(1×3min)、DCM(1×3min)、MeOH(2×3min)交替洗滌，將合成儀密[0035]上述嵌合肽在制備鎮(zhèn)痛藥中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，該類全新嵌合肽分子可以在急性痛和病理性痛中產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛效果，且降低了傳統(tǒng)大麻類鎮(zhèn)痛藥物鎮(zhèn)痛耐受的副作用。[0037](1)與已報道的(r)VD-Hpα及(m)VD-Hpα相比，VF-11和VF-13在體內(nèi)的鎮(zhèn)痛活性有所加強，產(chǎn)生了比母體分子更有效的鎮(zhèn)痛效果。[0038](2)VF-11和VF-13解決了經(jīng)典大麻類激動劑以及母體分子存在的鎮(zhèn)痛耐受的問題，產(chǎn)生了無耐受形式的鎮(zhèn)痛效果，可用于急性痛和病理性疼痛的治療。附圖說明[0039]圖1為小鼠側(cè)腦室注射VF-11在急性痛中所產(chǎn)生劑量依賴性鎮(zhèn)痛作用的時效曲線。[0040]圖2為小鼠側(cè)腦室注射VF-13在急性痛中所產(chǎn)生劑量依賴性鎮(zhèn)痛作用的時效曲線。[0041]圖3為小鼠鞘內(nèi)注射VF-11在急性痛中所產(chǎn)生劑量依賴性鎮(zhèn)痛作用的時效曲線。[0042]圖4為小鼠鞘內(nèi)注射VF-13在急性痛中所產(chǎn)生劑量依賴性鎮(zhèn)痛作用的時效曲線。[0043]圖5為小鼠側(cè)腦室注射VF-11和VF-13在炎癥痛中所產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的時效曲線(機械刺激)。[0044]圖6為小鼠側(cè)腦室注射VF-11和VF-13在炎癥痛中所產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的時效曲線(光熱刺激)。[0045]圖7為小鼠側(cè)腦室中連續(xù)6天注射VF-11,VF-13和WIN55,212-2所引起的鎮(zhèn)痛作用的變化。具體實施方式[0046]根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本[0047]儀器：高效液相色譜儀(HPLC)為Waters公司的Delta600,其中分析柱(XBTMBEH130PrepC18,4.6mm×250mm),制備柱(XBridgeTMBEH130PrepC18儀由本實驗室自主設計。冷凍干燥機為美國VIRTIS公司的6KBTEL-85。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為中國上海亞榮公司的RE-5298A。氨基酸(Fmoc-Aa)、N-羥基苯并三氮唑(HOBt)、0-苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲-六氟磷酸鹽(HBTU)購自吉爾生化(上海)有限公司。二異丙基乙胺(DIEA)和1,8-二氮雜二環(huán)十一7碳-7-烯(DBU)購置北京百靈威科技有限公司。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、六氫吡啶(哌啶)、甲醇(MeOH)和吡啶都購自天津第二試劑廠，三氟乙酸(TFA)和苯酚為天津試劑一廠產(chǎn)品；以上有機試劑使用前均經(jīng)過重蒸處理。[0049]實施例1VF-11的合成[0050](1)樹脂預處理：稱取500mg的Rink-Amide-MBHA樹脂于5mL二氯甲烷中80rpm攪拌溶脹，反應時間為30min,反應結(jié)束后抽干30min.隨后加入DMF洗滌3次，每次3min。[0051](2)脫除Fmoc基團保護：在溶脹后的樹脂中加入體積分數(shù)比為1:1DMF的混合溶液，混合溶液與溶脹后的樹脂的體積質(zhì)量比為10mL/g;按照80rpm攪拌5min,重復2次。抽干后，再次加入上述混合溶液，按照80rpm攪拌10min。之后用DMF洗滌4次，每次3min,以清除殘余的哌啶。得到脫除Fmoc保護基團的樹脂；[0052](3)茚檢：挑取少量樹脂于無色透明玻璃管中，加入茚檢試劑，置于沸水中靜置3min。如Fmoc基團脫除完全，則樹脂和溶液均呈深藍色。茚檢試劑：體積比為1:2:1的苯酚：吡啶：茚三酮溶液。其中苯酚溶液的配制為20g苯酚于5mL無水乙醇，吡啶溶液的配制為0.05mLKCN(0.001M)于2.5mL吡啶，茚三酮溶液的配制為0.5g茚三酮于10mL無水乙醇，其中加入。將所得混合溶液加到步驟(2)所得脫除Fmoc基團保護的樹脂中，混合溶液與脫保護后的樹脂的體積質(zhì)量比為5mL/g,在氬氣保護下于合成儀中80rpm攪拌，室溫反應60min,抽干色。茚檢后按步驟(2)脫除Fmoc基團保護，然后再按步驟(3)進行茚檢；[0054](5)肽鏈的延長：將步驟(4)得到的肽樹脂按照步驟(4)的方法依次將Fmoc-ArgOH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-肽樹脂F(xiàn)moc-Val-Asp(OtBu)-Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Arg(pbf)-Phe-Resin。將得到的肽樹脂按步驟(2)脫除Fmoc基團保護，DMF清洗4次，每次3min,然后再按照步驟(3)進行茚檢，得到Val-Asp(OtBu)-Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Arg[0055](6)肽鏈從樹脂上的切割：將步驟(5)所得肽樹脂用DCM(2×3min)、MeOH(1×3min)、DCM(1×3min)、MeOH(2×3min)交替洗滌，將合成儀密封后抽干4h。在抽干的肽樹脂切割劑(15mL/g肽樹脂)。室溫下反應3h,每15min于50rpm攪拌速率下攪拌1min。切割劑為TFA:TIS:水以95:2.5:2.5的體積比混合而成的溶液。反應完成后，將切割液減壓旋干，加入預冷的乙醚析出沉淀，加人20%的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽，通過冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末176.20mg,粗肽產(chǎn)率68.98%。[0056](7)多肽的純化：利用反向高效液相色譜(RP-HPLC)C18柱(XBridgeTMBEH130PrepC18,19mm×250mm)對上述粗肽進行分離純化。流動相為乙腈(含0.1%的TFA)和水(含0.1%的TFA),收集主峰產(chǎn)品。上樣量48.14mg,冷凍干燥后得VF-11的純肽固體粉末10.60mg。質(zhì)譜和色譜分析檢測結(jié)果如表1所示。8[0057]實施例2VF-13的合成[0058](1)樹脂預處理：稱取600mg的Rink-Amide-MBHA樹脂于6mL二氯甲烷中80rpm攪拌溶脹，反應時間為30min,反應結(jié)束后抽干30min.隨后加入DMF洗滌3次，每次3min。的混合溶液，混合溶液與溶脹后的樹脂的體積質(zhì)量為10mL/g;按照80rpm攪拌5min,重復2次。抽干后，再次加入上述混合溶液，按照80rpm攪拌10min.之后用DMF洗滌4次，每次3min,以清除殘余的哌啶。得到脫除Fmoc保護基團的樹脂；[0060](3)茚檢：挑取少量樹脂于無色透明試管中，加入茚檢試如Fmoc基團脫除完全，則樹脂和溶液均呈深藍色。茚檢試劑：體積比為1:2:1的苯酚：吡啶：茚三酮溶液。其中苯酚溶液的配制為20g苯酚于5ml無水乙醇，吡啶溶液的配制為0.05mlKCN(0.001M)于2.5ml吡啶，茚三酮溶液的配制為0.啶和無水乙醇均經(jīng)重蒸處理。入。將所得混合溶液加到步驟(2)所得脫除Fmoc基團保護的樹脂中，混合溶液與脫保護后的樹脂的體積質(zhì)量比為5mL/g,在氬氣保護下于合成儀中80rpm攪拌，室溫反應60min,抽干溶茚檢后按步驟(2)脫除Fmoc基團保護，然后再按照步驟(3)進行茚檢；[0062](5)肽鏈的延長：將步驟(4)得到的肽樹脂按照步驟(4)的方法依次將Fmoc-ArgFmoc-Val-0H縮合到肽樹脂上。得到肽樹脂F(xiàn)moc-Val-Asp(OtBu)-Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Pro-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Phe-Resin。將得到的肽樹脂按步驟(2)脫除Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Pro-Gln(Trt)-Arg(pbf)-[0063](6)肽鏈從樹脂上的切割：將步驟(5)所得肽樹脂用DCM(2×3min)、MeOH(1×3min)、DCM(1×3min)、MeOH(2×3min)交替洗滌，將合成儀密封后抽干4h。在抽干的肽樹脂Val-Asp(OtBu)-Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Pro-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Phe-Resin中加入切割劑(15ml/g肽樹脂)。室溫下反應3h,每15min于50rpm攪拌速率下攪拌1min。切割劑為TFA:TIS:EDT:水以95:2.5:2.5的體積比混合而成的溶液。反應完成后，將切割液減壓旋干，加入預冷的乙醚析出沉淀，加人20%的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽，通過冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末286.2mg,粗肽產(chǎn)率67.5%。[0064](7)多肽的純化：利用反向高效液相色譜(RP-HPLC)C18柱(XBridgeTMBEH130PrepC18,19mm×250mm)對上述粗肽進行分離純化。流動相為乙腈(含0.1%的TFA)和水(含0.1%的TFA),收集主峰產(chǎn)品。上樣量60.14mg,冷凍干燥后得VF-11的純肽固體粉末[0065]質(zhì)譜和色譜分析檢測結(jié)果如表1所示。[0066]表1VF-11和VF-13的質(zhì)譜和色譜檢測結(jié)果9體系1高分辨質(zhì)譜(MD-TOF-MS)保留時間純度1保留時間純度2[0068]注：體系1:梯度洗脫體系1為：10-80%乙腈/水(0.1%TFA)(30min完成),流速為：1mL/min,檢測波長為220nm,分析色譜柱為：XBridgeTMBEH130PrepC18,4.6mm×250mm;體系2:梯度洗脫體系2為：10-100%乙腈/水(0.1%TFA)(30min完成),流速為：1mL/min,檢測波長為220nm,分析色譜柱為：XBridgeTMBEH130PrepC18,4.6mm×250mm;其中，體系1中的乙腈濃度在30min時間內(nèi)從10%升至80%;體系2中乙腈的濃度在30min時間內(nèi)從10%升至100%。[0069]上述方法制備的產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜和色譜分析檢測，與設計的化合物結(jié)構一致。表明成功合成了基于大麻肽(r)VD-Hpa和NPFF的嵌合肽，純化后樣品純度為98%以上。[0070]實施例3:基于大麻肽(r)VD-Hpa和NPFF的嵌合肽的鎮(zhèn)痛實驗[0071]本發(fā)明基于大麻肽(r)VD-Hpa和NPFF的嵌合肽，是基于大麻肽(r)VD-Hpa和NPFF構建的全新嵌合肽，其在發(fā)揮高效鎮(zhèn)痛作用的同時，有效地降低了鎮(zhèn)痛耐受的副作用。下面通過藥理學實驗說明本發(fā)明的嵌合肽VF-11和VF-13的鎮(zhèn)痛及耐受作用。[0073]將實施例1和實施例2制備的化合物VF-11和VF-13通過側(cè)腦室和鞘內(nèi)注射后，在光熱誘導的急性痛和角叉菜膠誘導的炎癥痛模型中進行了體內(nèi)痛覺調(diào)節(jié)作用的活性檢測和[0075]腦立體定位儀為瑞沃德68001型。昆明系雄性小鼠，體重18-22g。用戊巴比妥鈉(i.p.,80mg/kg小鼠體重)麻醉后，置于腦立體定位儀上。手術中用到的器械需進行消毒。將小鼠頭部手術區(qū)的毛發(fā)剃掉，置于腦立體定位儀進行固定，手術區(qū)用碘伏消毒。沿矢狀縫切開頭皮，露出顱骨，找到前囟位置。從前囟向后3mm,向左/右1mm,即為側(cè)腦室的上方位置，用針在此打孔標記。將自制不銹鋼管(外徑0.5mm,內(nèi)徑0.25mm,上面接一段PE-10管)向下插入3mm,即為側(cè)腦室。用醫(yī)科牙托粉固定鋼管，凝固后，插入一段不銹鋼琴弦(28-gauge)于上述鋼管中，以防止腦脊液外溢或感染，縫合傷口。手術完成后小鼠恢復4天，第5天用于后續(xù)實[0077]藥物的鞘內(nèi)注射在清醒小鼠上進行，每只小鼠注射藥物的體積為5μL。用手固定住小鼠的骼骨，將吸有藥物的微量注射器(25μL)通過L5-L6的間隙進入蛛網(wǎng)膜下腔。針尖進入蛛網(wǎng)膜下腔后，小鼠的尾巴會有一個快速甩動且呈現(xiàn)“S”形。藥入蛛網(wǎng)膜下腔。[0079]光熱甩尾實驗用來檢測藥物對急性痛覺反應的影響。動物為上述側(cè)腦室埋管小鼠。環(huán)境溫度控制在22±1℃,實驗動物可自由進食、飲水。實驗開始前，將小鼠放置在實驗臺適應30min,以消除其緊張狀態(tài)。給藥前先測定小鼠的基礎甩尾潛伏期(3-5s),過于敏感或遲鈍的小鼠棄之不用。記錄給藥后第5,10,15,20,30,40,50,60min小鼠的甩尾潛伏期。為防止輻射熱燙傷，甩尾時間超過10s都以10s來計算。[0080]角叉菜膠誘導的炎癥痛模型用來檢測藥物對炎性痛覺反應的影響。動物為上述側(cè)腦室埋管小鼠。環(huán)境溫度控制在22±1℃,實驗動物可自由進食、飲水。實驗開始前，將小鼠單獨放置在實驗臺適應30min,然后分別測定小鼠右腳對于機械刺激和光熱刺激的基礎縮爪閾值。基礎縮爪閾值測定完成后，通過腳掌皮下注射20μL2%的角叉菜膠溶液來構建炎癥痛模型。小鼠注射角叉菜膠24h后用于實驗。在注射角叉菜膠后的第2天，分別記錄小鼠給藥前和給藥后第15,30,45,60min的縮爪閾值。為防止輻射熱燙傷，光熱刺激的最大切斷時間設置為25s。[0082]用最大鎮(zhèn)痛效應MPE(%)來評價藥物的鎮(zhèn)痛效果；光熱甩尾實驗中，MPE(%)的計算方法為：MPE(%)=100×[(給藥后的痛閾-基礎痛閾)/(10s-基礎痛閾)]。角叉菜膠誘導的炎癥痛中，MPE(%)的計算方法為：MPE(%)=100×[(給藥后的痛閾-給藥前的痛閾)/(基礎痛閾-給藥前的痛閾)]。由于藥物鎮(zhèn)痛作用時間可持續(xù)60min,所以藥物在每只小鼠上的鎮(zhèn)痛效果被轉(zhuǎn)化為曲線下面積AUC(areaunderthecurve)(0-60min)來評價藥物的鎮(zhèn)痛效果。不同藥物濃度處理之間的組間差異用單因素方差分析(one-wayANOVA的Dunnett檢驗)來進行統(tǒng)計。**P<0.01,***P<0.001表示MPE(%)值與空白對照生理鹽水組鎮(zhèn)痛作用相比有顯著性差異，實驗結(jié)果如圖1-6所示。ED?0半數(shù)有效量(50%effectivedose,ED?0)在量效反應中指引起50%最大反應強度對應的藥量。通過統(tǒng)計學軟件GraphPadPrism5.0利用MPE(%),以及對應藥物的用量計算出相關的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)ED?0以及95%的置信區(qū)間。[0083]相關的鎮(zhèn)痛數(shù)據(jù)如表2所示。在小鼠光熱甩尾模型中，側(cè)腦室注射VF-11和VF-13均能產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛效果。其鎮(zhèn)痛活性相比于(m)VD-Hpa(6.69nmol,201310087565.3)提高了5.2和3.5倍，比(r)VD-Hpa(6.85nmol,Neuropeptides.2017,63:83)提高了5.3和3.6倍內(nèi)注射VF-11和VF-13同樣可以在光熱甩尾實驗中產(chǎn)生劑量依賴的鎮(zhèn)痛效果，其鎮(zhèn)痛活性相比于(m)VD-Hpa(2.89nmol,201310087565.3)提高了20.6和22.2倍，比(r)VD-Hpa(2.50nmol,Neuropeptides.2017,63:83)提高了17.9和19.2倍。單獨注射神經(jīng)肽FF在光熱甩尾實驗中無明顯鎮(zhèn)痛作用(EurJPharmacol.2015,767:119;Peptides.1995,16:973)。此外，側(cè)腦室注射這兩個嵌合肽可以在炎癥痛模型中產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用(圖5和6)。[0084]表2側(cè)腦室和鞘內(nèi)水平注射VF-11和VF-13的鎮(zhèn)痛作用比較11痛模型EDs0值(nmol)(95%置信區(qū)間)急性痛鞘內(nèi)炎癥痛機械(側(cè)腦室)光熱(側(cè)腦室)[0087]進一步比較了本發(fā)明中的嵌合肽與WIN55,212-2在鎮(zhèn)痛耐受方面的藥理活性。通過小鼠側(cè)腦室連續(xù)6天注射藥物，在光熱甩尾實驗中檢測它們鎮(zhèn)痛作用的耐受現(xiàn)象。[0088](1)小鼠的痛覺耐受實驗方法[0089]昆明系雄性小鼠，側(cè)腦室埋管后恢復4天，連續(xù)注射高劑量藥物6天，每天注射一次。環(huán)境溫度控制在22±1℃,實驗動物可自由進食、飲水。實驗在每天9點到11點之間進