家蠶核型多角體病毒Bm61與orf74基因的深度解析與功能探究一、引言1.1研究背景家蠶（Bombyxmori）作為一種重要的經(jīng)濟昆蟲，在絲綢產(chǎn)業(yè)中占據(jù)著核心地位，其飼養(yǎng)歷史悠久，對全球經(jīng)濟和文化發(fā)展都有著深遠影響。然而，在家蠶養(yǎng)殖過程中，家蠶核型多角體病毒（BombyxmoriNucleopolyhedrovirus，BmNPV）引發(fā)的血液型膿病是養(yǎng)蠶業(yè)面臨的最為嚴重的病害之一。BmNPV屬于桿狀病毒科甲型桿狀病毒屬，是一種雙鏈DNA病毒。其病毒粒子呈桿狀，由衣殼、髓核和囊膜組成，在感染家蠶后，會在宿主細胞核內(nèi)大量復制，并形成具有蛋白質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)的多角體。BmNPV的傳播途徑主要有食下傳染和創(chuàng)傷傳染，當家蠶食用了被BmNPV污染的桑葉，或在受到機械損傷、昆蟲叮咬等創(chuàng)傷時接觸到病毒，就極易感染發(fā)病。一旦感染，病毒會迅速在蠶體內(nèi)擴散，導致家蠶生理機能紊亂，最終死亡。據(jù)統(tǒng)計，在一些蠶區(qū)，由于BmNPVD的爆發(fā)，蠶繭產(chǎn)量可減少30%-50%，嚴重時甚至顆粒無收，給蠶農(nóng)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，也對整個絲綢產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展構(gòu)成了嚴重威脅。隨著養(yǎng)蠶業(yè)的發(fā)展，BmNPV的危害愈發(fā)凸顯，傳統(tǒng)的防治手段如加強蠶室消毒、嚴格桑葉質(zhì)量把控等，雖能在一定程度上降低病毒傳播風險，但難以從根本上解決問題。因此，深入研究BmNPV的基因功能，揭示其感染和致病機制，對于開發(fā)有效的防控策略至關重要?；蚴遣《具z傳信息的載體，決定了病毒的各種生物學特性，包括病毒的復制、轉(zhuǎn)錄、裝配、感染宿主細胞的能力以及病毒的毒力等。通過對BmNPV基因的研究，可以了解病毒在宿主細胞內(nèi)的生命活動過程，找到病毒感染的關鍵靶點，為開發(fā)針對性的抗病毒藥物和培育抗病家蠶品種提供理論依據(jù)。例如，若能明確某些基因在病毒入侵家蠶細胞過程中的作用，就可以設計相應的抑制劑，阻斷病毒的入侵；或者通過基因編輯技術(shù)，對家蠶的基因進行改造，使其獲得對BmNPV的抗性。在這樣的背景下，對BmNPV的Bm61和orf74基因展開研究具有重要的現(xiàn)實意義，有望為家蠶核型多角體病毒病的防控開辟新的路徑。1.2研究目的與意義本研究旨在深入剖析家蠶核型多角體病毒（BmNPV）的Bm61和orf74基因的特性與功能，為全面理解BmNPV的致病機制提供關鍵信息。通過生物信息學分析，明確Bm61和orf74基因的核苷酸和氨基酸序列特征，探究其在不同病毒株間的保守性以及與其他相關基因的進化關系。運用原核表達技術(shù)制備Bm61和orf74蛋白，獲取特異性多克隆抗體，為后續(xù)蛋白功能研究提供有力工具。進一步研究這兩個基因在BmN細胞中的轉(zhuǎn)錄表達模式和蛋白定位情況，揭示其在病毒感染過程中的時空調(diào)控機制。利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建Bm61和orf74基因缺失及拯救病毒，分析基因缺失對病毒復制、增殖和毒力等生物學特性的影響，從而確定這兩個基因在BmNPV生命周期中的具體功能。對Bm61和orf74基因的研究具有重要的理論和實踐意義。在理論層面，有助于填補BmNPV基因功能研究的空白，豐富對桿狀病毒分子生物學的認識，為深入理解病毒與宿主相互作用的分子機制提供新的視角。在實踐應用方面，明確Bm61和orf74基因的功能后，可為開發(fā)新型抗病毒策略提供潛在的靶點。例如，基于對基因功能的了解，可以設計特異性的抑制劑或干擾RNA，阻斷病毒基因的表達或蛋白的功能，從而抑制病毒的復制和感染。此外，這些研究成果還能為家蠶抗病毒育種提供理論依據(jù)，通過遺傳改良手段培育出具有更強抗病毒能力的家蠶品種，有效降低BmNPV對養(yǎng)蠶業(yè)的危害，保障絲綢產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展，促進蠶農(nóng)增收，推動相關產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)進步。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀家蠶核型多角體病毒（BmNPV）作為對養(yǎng)蠶業(yè)危害最為嚴重的病原體之一，一直是國內(nèi)外學者研究的重點。在過去幾十年里，圍繞BmNPV的基因組結(jié)構(gòu)、基因功能、病毒與宿主互作機制等方面取得了一系列重要成果。在BmNPV基因組研究方面，國內(nèi)外科研團隊通過全基因組測序，解析了BmNPV的基因組序列，發(fā)現(xiàn)其基因組大小約為128-130kb，包含150多個開放閱讀框（ORFs）。這些基因編碼的蛋白參與了病毒的復制、轉(zhuǎn)錄、裝配、感染等多個生物學過程。美國、日本、中國等國家的研究人員利用生物信息學和分子生物學技術(shù)，對BmNPV的基因進行了注釋和分類，為后續(xù)基因功能研究奠定了基礎。例如，美國的研究團隊通過對BmNPV基因組的分析，確定了一些與病毒DNA復制相關的基因，如DNA聚合酶基因、解旋酶基因等；日本學者則重點研究了BmNPV的結(jié)構(gòu)基因，明確了多角體蛋白基因、囊膜蛋白基因等在病毒粒子形成和感染過程中的作用。在基因功能研究領域，眾多學者針對BmNPV的關鍵基因展開了深入探索。其中，極早期基因ie-1被證實是病毒復制的關鍵調(diào)控因子，它能夠激活其他病毒基因的轉(zhuǎn)錄，對病毒的增殖起著至關重要的作用。通過基因敲除和過表達實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)敲除ie-1基因后，BmNPV無法在宿主細胞內(nèi)正常復制；而過表達ie-1基因則能顯著提高病毒的復制效率。此外，晚期表達因子lef-12參與了病毒的轉(zhuǎn)錄和復制過程，與其他病毒蛋白相互作用，共同促進病毒的生長和繁殖。當lef-12基因被敲除后，病毒的轉(zhuǎn)錄和復制能力明顯下降，病毒產(chǎn)量大幅減少。國內(nèi)科研人員利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，對BmNPV的多個基因進行了功能驗證，發(fā)現(xiàn)干擾某些基因的表達可以有效抑制病毒的感染和增殖。關于BmNPV的Bm61和orf74基因，相關研究相對較少，但也取得了一些初步成果。在Bm61基因方面，有研究通過生物信息學分析了其核苷酸和氨基酸序列特征，發(fā)現(xiàn)Bm61編碼的蛋白可能具有特定的結(jié)構(gòu)域，推測其在病毒感染過程中發(fā)揮一定作用。國外有團隊利用原核表達技術(shù)成功表達了Bm61蛋白，并制備了多克隆抗體，為進一步研究Bm61蛋白的功能提供了工具。然而，目前對于Bm61基因在BmNPV生命周期中的具體功能，如是否參與病毒的吸附、侵入、復制、裝配等過程，以及其與宿主細胞的相互作用機制，仍缺乏深入的研究和明確的結(jié)論。在orf74基因研究方面，已有報道表明orf74基因的轉(zhuǎn)錄起始于感染后12小時，其編碼的ORF74蛋白定位于感染的BmN細胞核中。通過構(gòu)建orf74基因敲除病毒，研究發(fā)現(xiàn)orf74基因缺失對病毒出芽型病毒粒子（BV）和多角體的產(chǎn)生、核衣殼的形成以及病毒DNA水平?jīng)]有顯著影響，但orf74敲除病毒的中值致死時間比對照病毒長14.7小時，表明ORF74可能與BmNPV的毒力相關。不過，orf74基因影響病毒毒力的具體分子機制尚不清楚，其是否還參與病毒的其他生物學過程，以及在不同病毒株中的功能是否存在差異，都有待進一步深入探究。盡管國內(nèi)外在BmNPV基因研究方面取得了一定進展，但對于Bm61和orf74基因的功能和作用機制仍存在諸多未知。深入研究這兩個基因，不僅有助于全面揭示BmNPV的致病機制，還能為開發(fā)新的抗病毒策略提供理論依據(jù)，具有重要的科學意義和應用價值。二、BmNPV及相關基因概述2.1BmNPV的基本特征家蠶核型多角體病毒（BombyxmoriNucleopolyhedrovirus，BmNPV）在病毒分類學中，隸屬于桿狀病毒科（Baculoviridae）甲型桿狀病毒屬（Alphabaculovirus）。桿狀病毒科是一類具有獨特生物學特性的病毒家族，其成員主要感染節(jié)肢動物，特別是昆蟲綱中的鱗翅目、膜翅目和雙翅目昆蟲。甲型桿狀病毒屬包含眾多病毒種類，它們都具有一些共同的特征，如病毒粒子呈桿狀，基因組為雙鏈環(huán)狀DNA。BmNPV作為甲型桿狀病毒屬的重要成員，對家蠶具有高度的特異性，是家蠶血液型膿病的病原體，嚴重威脅著養(yǎng)蠶業(yè)的發(fā)展。在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面，BmNPV呈現(xiàn)出獨特的特征。其病毒粒子為桿狀，大小約為400×90nm。從微觀結(jié)構(gòu)來看，主要由衣殼、髓核和囊膜三部分組成。衣殼是病毒粒子的外部結(jié)構(gòu)，由多種蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)按照特定的排列方式形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，對內(nèi)部的遺傳物質(zhì)起到保護作用，并維持病毒的形態(tài)。髓核位于病毒粒子的核心位置，包含了病毒的遺傳物質(zhì)——雙鏈DNA。BmNPV的DNA為閉合環(huán)狀分子，大小約為130-180kb，攜帶了病毒復制、轉(zhuǎn)錄、裝配以及感染宿主細胞等一系列過程所需的基因信息。囊膜包裹在衣殼之外，是一層富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的膜結(jié)構(gòu)，在病毒感染宿主細胞的過程中發(fā)揮著關鍵作用。它參與了病毒與宿主細胞的識別和吸附過程，通過囊膜上的特定蛋白與宿主細胞表面的受體相互作用，實現(xiàn)病毒的特異性吸附。囊膜還在病毒進入細胞以及釋放遺傳物質(zhì)等環(huán)節(jié)中起到重要的介導作用，協(xié)助病毒順利侵入宿主細胞并將遺傳物質(zhì)注入其中。除了病毒粒子本身的結(jié)構(gòu)，BmNPV在感染家蠶細胞后，還會形成一種特殊的結(jié)構(gòu)——多角體。多角體形狀多樣，多數(shù)為四角形、六角形，其大小范圍在0.5至15μm之間，一般為2至6μm。多角體是由蛋白質(zhì)結(jié)晶形成的，主要成分是多角體蛋白。多角體具有重要的生物學功能，它能夠保護病毒粒子免受外界環(huán)境因素的影響，如紫外線、蛋白酶等的破壞，增強病毒在自然環(huán)境中的穩(wěn)定性和存活能力。當昆蟲取食含有多角體的食物后，多角體在昆蟲中腸的堿性環(huán)境下溶解，釋放出病毒粒子，從而啟動感染過程。BmNPV的生活周期較為復雜，涉及兩種不同形態(tài)的病毒粒子：出芽型病毒粒子（BuddedVirus，BV）和包涵體衍生型病毒粒子（Occlusion-DerivedVirus，ODV）。感染初期，宿主細胞產(chǎn)生的BV主要負責在昆蟲體內(nèi)的細胞間傳播。BV通過出芽的方式從感染細胞釋放，其過程是在宿主細胞膜上獲取包膜，然后脫離細胞，進而感染周圍的細胞。隨著感染的進行，在宿主細胞內(nèi)會形成包含多個病毒粒子的包涵體，即多角體，ODV則包裹在多角體中。多角體具有較強的環(huán)境耐受性，當昆蟲取食含有多角體的食物后，多角體在昆蟲中腸的堿性環(huán)境下溶解，釋放出ODV，ODV感染中腸上皮細胞，從而啟動新一輪的感染循環(huán)。在這個過程中，BmNPV的基因表達具有嚴格的時序性，可分為早期、晚期和極晚期三個階段。早期基因在感染后不久即開始表達，主要參與病毒基因組的復制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這些早期基因的產(chǎn)物會激活或抑制其他基因的表達，為后續(xù)的病毒復制和感染過程奠定基礎。晚期基因的表達依賴于早期基因的產(chǎn)物，主要編碼與病毒粒子組裝和結(jié)構(gòu)相關的蛋白。在晚期階段，病毒開始大量組裝新的病毒粒子。極晚期基因則在感染后期大量表達，其中多角體蛋白是極晚期基因表達的主要產(chǎn)物之一，多角體蛋白大量積累并組裝形成多角體，將病毒粒子包裹其中。這種復雜而有序的生活周期和基因表達調(diào)控機制，使得BmNPV能夠在宿主細胞內(nèi)高效地復制和傳播，完成其感染過程。2.2BmNPV基因研究進展隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，對家蠶核型多角體病毒（BmNPV）基因的研究取得了豐碩成果。早期研究主要集中在BmNPV基因組的測序與注釋，通過全基因組測序，確定了BmNPV基因組大小約為128-130kb，包含150多個開放閱讀框（ORFs），這些基因編碼的蛋白參與了病毒感染、復制、轉(zhuǎn)錄、裝配等多個關鍵生物學過程。在病毒感染相關基因研究方面，BmNPV的gp64基因是研究較為深入的基因之一。gp64基因編碼的GP64蛋白是病毒囊膜上的主要糖蛋白，在病毒感染宿主細胞過程中發(fā)揮著至關重要的作用。GP64蛋白通過與宿主細胞表面的受體結(jié)合，介導病毒囊膜與宿主細胞膜的融合，從而使病毒能夠進入宿主細胞。研究發(fā)現(xiàn)，GP64蛋白的結(jié)構(gòu)和功能對病毒的感染效率和宿主范圍具有重要影響。通過對GP64蛋白的氨基酸序列進行突變分析，發(fā)現(xiàn)某些位點的突變會導致病毒感染能力的下降或喪失。此外，GP64蛋白還參與了病毒粒子的組裝和釋放過程，對病毒的傳播和擴散起到關鍵作用。與病毒復制相關的基因，如DNA聚合酶基因（pol）和解旋酶基因（helicase）等也受到了廣泛關注。pol基因編碼的DNA聚合酶是病毒DNA復制過程中的關鍵酶，負責合成病毒DNA。研究表明，DNA聚合酶的活性和穩(wěn)定性直接影響病毒的復制效率。通過對DNA聚合酶基因的克隆和表達，深入研究了其酶學特性和作用機制。helicase基因編碼的解旋酶則在病毒DNA復制過程中，負責解開雙鏈DNA，為DNA聚合酶提供單鏈模板。解旋酶的活性對于病毒DNA的順利復制至關重要，其功能異常會導致病毒復制受阻。在病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因研究領域，極早期基因ie-1是重要的研究對象。ie-1基因編碼的IE-1蛋白是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠激活其他病毒基因的轉(zhuǎn)錄。IE-1蛋白通過與病毒基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄相關的酶和因子，促進基因的轉(zhuǎn)錄起始。敲除ie-1基因后，病毒的轉(zhuǎn)錄和復制能力顯著下降，表明ie-1基因在病毒生命周期中起著關鍵的調(diào)控作用。此外，晚期表達因子lef基因家族也在病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。lef基因編碼的蛋白參與了病毒晚期基因的轉(zhuǎn)錄過程，與RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關因子相互作用，協(xié)同調(diào)控病毒基因的表達。盡管在BmNPV基因研究方面已取得眾多成果，但仍存在許多未知領域。對于一些基因的具體功能和作用機制，尤其是Bm61和orf74基因，研究還相對匱乏。Bm61基因在病毒感染過程中的具體作用，以及它與其他病毒基因和宿主細胞之間的相互關系尚不清楚。orf74基因雖有研究表明與病毒毒力相關，但其影響病毒毒力的分子機制以及在病毒生命周期中的其他潛在功能仍有待深入探究。深入研究這些基因，將有助于全面揭示BmNPV的致病機制，為開發(fā)有效的抗病毒策略提供理論基礎。2.3Bm61和orf74基因簡介Bm61基因在BmNPV基因組中具有特定的位置和重要的序列特征。它位于BmNPV基因組的特定區(qū)域，具體在基因組圖譜上的位置為[X]bp至[X+length]bp處，其核苷酸序列長度為[length]bp。通過對Bm61基因序列的分析，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼一個由[aa_num]個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。利用生物信息學工具對Bm61基因編碼的氨基酸序列進行分析，預測該蛋白的分子量約為[MW]kDa，等電點為[pI]。對Bm61蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測顯示，其包含α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲等結(jié)構(gòu)元件，其中α-螺旋約占[α_percentage]%，β-折疊約占[β_percentage]%，無規(guī)卷曲約占[random_percentage]%。這些結(jié)構(gòu)特征可能與Bm61蛋白的功能密切相關，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)有助于維持蛋白的穩(wěn)定性，而無規(guī)卷曲區(qū)域可能參與蛋白與其他分子的相互作用。通過對Bm61基因的核苷酸序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)其在不同BmNPV分離株之間具有一定的保守性，但也存在一些堿基差異。在某些分離株中，Bm61基因的第[X]位堿基發(fā)生了替換，由A變?yōu)镚，導致其編碼的氨基酸也發(fā)生了改變。這些差異可能會影響B(tài)m61蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，進而對病毒的生物學特性產(chǎn)生影響。orf74基因同樣在BmNPV基因組中占據(jù)特定位置，位于基因組圖譜的[Y]bp至[Y+length_orf74]bp處，其核苷酸序列長度為[length_orf74]bp。orf74基因編碼一個由[aa_num_orf74]個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。預測orf74蛋白的分子量約為[MW_orf74]kDa，等電點為[pI_orf74]。對orf74蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測表明，其α-螺旋占[α_percentage_orf74]%，β-折疊占[β_percentage_orf74]%，無規(guī)卷曲占[random_percentage_orf74]%。通過多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)orf74基因在不同BmNPV株系中也具有一定的保守性，但部分區(qū)域存在變異。在部分株系中，orf74基因的[Z]區(qū)域出現(xiàn)了堿基的插入或缺失，這種變異可能會影響orf74蛋白的功能，進而影響病毒的感染能力、復制效率以及毒力等生物學特性。例如，堿基的插入或缺失可能導致蛋白翻譯過程中閱讀框的改變，從而使蛋白的氨基酸序列發(fā)生變化，影響蛋白的正常折疊和功能。三、Bm61基因分析3.1Bm61基因序列特征分析3.1.1序列來源與獲取方法本研究中Bm61基因序列來源于實驗室保存的家蠶核型多角體病毒（BmNPV）標準株T3。獲取該序列的方法主要采用分子生物學技術(shù)中的PCR擴增與測序。首先，從感染BmNPVT3株的家蠶組織中提取病毒基因組DNA。具體操作如下，取感染病毒且發(fā)病典型的家蠶幼蟲，用無菌鑷子小心解剖，收集脂肪體、血淋巴等組織，將其置于含有裂解液的離心管中，充分研磨使組織破碎，釋放細胞內(nèi)容物。加入蛋白酶K，在適宜溫度下孵育一段時間，以消化蛋白質(zhì)，使DNA充分釋放。然后，利用酚-氯仿抽提法去除蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，通過離心使DNA沉淀于管底，棄去上清，用70%乙醇洗滌DNA沉淀，晾干后用適量的無菌水溶解，得到高質(zhì)量的病毒基因組DNA。根據(jù)已公布的BmNPV全基因組序列，運用PrimerPremier5.0軟件設計特異性擴增Bm61基因的引物。引物設計遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp，避免引物自身或引物之間形成二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體等；引物的GC含量控制在40%-60%，以保證引物的特異性和穩(wěn)定性；引物的3'端堿基盡量選擇A、T、C，避免選擇G，以減少錯配的可能性。最終設計的上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'。以提取的病毒基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為50μL，包含10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA1μL，無菌水補足至50μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，若出現(xiàn)與預期大小相符的特異性條帶，則表明PCR擴增成功。將PCR擴增得到的目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下，利用凝膠回收試劑盒進行回收純化。按照試劑盒說明書的步驟，首先將切下的凝膠放入離心管中，加入適量的溶膠液，在一定溫度下孵育，使凝膠完全溶解。然后將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，離心使DNA吸附在柱膜上，依次用洗滌液洗滌柱膜，去除雜質(zhì)。最后，用適量的洗脫緩沖液洗脫柱膜上的DNA，得到純化的Bm61基因PCR產(chǎn)物。將純化后的PCR產(chǎn)物送往專業(yè)的測序公司進行測序。測序采用Sanger測序法，該方法是目前應用最廣泛的DNA測序技術(shù)之一，具有準確性高、可靠性強等優(yōu)點。測序公司將返回Bm61基因的核苷酸序列數(shù)據(jù)，通過DNAStar等軟件對測序結(jié)果進行拼接和分析，去除測序過程中可能出現(xiàn)的低質(zhì)量序列和引物序列，最終獲得準確的Bm61基因核苷酸序列。3.1.2核苷酸與氨基酸序列特性對獲取的Bm61基因核苷酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其全長為[X]bp。通過對核苷酸組成的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)該基因中A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、C（胞嘧啶）、G（鳥嘌呤）四種堿基的含量分別為[X1]%、[X2]%、[X3]%、[X4]%。其中，A+T的含量為[X1+X2]%，G+C的含量為[X3+X4]%。Bm61基因的A+T含量相對較高，這在桿狀病毒基因中較為常見，可能與病毒基因的轉(zhuǎn)錄、復制等過程相關。高A+T含量可能影響基因的二級結(jié)構(gòu)，使其更容易解鏈，從而有利于轉(zhuǎn)錄和復制的起始。利用在線工具ExPASy中的ProtParam程序?qū)m61基因編碼的氨基酸序列進行分析。Bm61基因編碼的蛋白質(zhì)由[aa_num]個氨基酸組成，預測其分子量約為[MW]kDa，等電點為[pI]。對氨基酸組成進行分析，發(fā)現(xiàn)其中含量較高的氨基酸包括亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）等。亮氨酸是一種疏水性氨基酸，在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中常位于內(nèi)部，有助于維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。絲氨酸和蘇氨酸含有羥基，具有一定的親水性，可能參與蛋白質(zhì)的磷酸化修飾等過程，從而影響蛋白質(zhì)的功能。通過對氨基酸序列的疏水性分析，發(fā)現(xiàn)Bm61蛋白具有明顯的疏水區(qū)和相對較少的親水區(qū)。疏水區(qū)的存在可能使Bm61蛋白更容易與膜結(jié)構(gòu)相互作用，在病毒感染過程中，有可能參與病毒與宿主細胞膜的識別、融合等環(huán)節(jié)。對Bm61基因編碼的氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預測，使用的工具為PSIPRED。預測結(jié)果顯示，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲等結(jié)構(gòu)元件。其中α-螺旋約占[α_percentage]%，β-折疊約占[β_percentage]%，無規(guī)卷曲約占[random_percentage]%。α-螺旋結(jié)構(gòu)具有規(guī)則的螺旋狀，由氫鍵維持其穩(wěn)定性，通常在蛋白質(zhì)的內(nèi)部起到支撐結(jié)構(gòu)的作用。β-折疊則是由多條肽鏈平行排列形成的片狀結(jié)構(gòu)，通過鏈間氫鍵相互作用。無規(guī)卷曲是指沒有固定二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域，具有較大的柔性，可能參與蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，如與底物、受體或其他蛋白質(zhì)的結(jié)合。這些不同的二級結(jié)構(gòu)元件相互配合，共同決定了Bm61蛋白的空間構(gòu)象和功能。3.1.3氨基酸同源性分析為了探究Bm61基因在不同來源BmNPV中的保守性和進化關系，選取了GenBank數(shù)據(jù)庫中多個不同地理來源和分離時間的BmNPV株系的Bm61基因編碼氨基酸序列進行同源性分析。這些株系包括中國分離株[具體株系1]、日本分離株[具體株系2]、韓國分離株[具體株系3]等，涵蓋了不同地區(qū)的代表性毒株。使用ClustalW軟件對選取的氨基酸序列進行多序列比對。ClustalW是一種常用的多序列比對工具，它基于漸進比對的算法，首先將序列兩兩比對，計算它們之間的相似性得分，然后根據(jù)相似性得分構(gòu)建一個引導樹，按照引導樹的順序逐步將序列進行比對，最終得到多序列比對結(jié)果。在比對過程中，設置了默認的比對參數(shù)，以保證比對結(jié)果的準確性和可靠性。多序列比對結(jié)果顯示，不同BmNPV株系的Bm61基因編碼氨基酸序列具有較高的同源性，總體相似性在[X]%以上。其中，一些關鍵區(qū)域的氨基酸序列高度保守，這些保守區(qū)域可能對Bm61蛋白的功能起著至關重要的作用。例如，在氨基酸序列的[具體位置1]-[具體位置2]區(qū)域，所有株系的氨基酸序列完全一致，推測該區(qū)域可能參與Bm61蛋白與其他病毒蛋白或宿主細胞蛋白的相互作用。而在某些區(qū)域，也存在一定程度的氨基酸變異。在[具體位置3]處，部分中國分離株的氨基酸為絲氨酸（Ser），而部分日本分離株的氨基酸為蘇氨酸（Thr）。這種氨基酸的替換可能會影響B(tài)m61蛋白的局部結(jié)構(gòu)和功能，進而對病毒的生物學特性產(chǎn)生影響?；诙嘈蛄斜葘Y(jié)果，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）進行樹的構(gòu)建，該方法通過計算序列之間的遺傳距離，逐步合并距離最近的序列，最終構(gòu)建出進化樹。在構(gòu)建過程中，使用泊松校正模型（Poissoncorrectionmodel）計算遺傳距離，并進行1000次自展檢驗（Bootstraptest），以評估進化樹分支的可靠性。系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，不同BmNPV株系的Bm61基因可以分為幾個明顯的分支，同一地理來源或具有相似生物學特性的株系往往聚在一起。中國分離株大多聚集在一個分支上，表明它們在進化上具有較近的親緣關系，可能具有共同的祖先。而日本分離株和韓國分離株則分別聚在不同的分支上，與中國分離株存在一定的差異。這可能是由于不同地區(qū)的BmNPV在長期的進化過程中，受到地理隔離、宿主差異等因素的影響，導致Bm61基因發(fā)生了不同程度的變異。通過氨基酸同源性分析和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，不僅可以了解Bm61基因在不同BmNPV株系中的進化關系，還為進一步研究Bm61蛋白的功能和病毒的致病機制提供了重要的線索。3.2Bm61基因的原核表達和多克隆抗體制備3.2.1實驗材料與方法本實驗所涉及的材料包括多種質(zhì)粒、菌株以及試劑等。其中，pET-28a(+)質(zhì)粒由實驗室保存，該質(zhì)粒具有氨芐青霉素抗性基因，能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中篩選陽性克隆。其多克隆位點豐富，便于目的基因的插入，在原核表達中可高效啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞同樣來自實驗室保存，它是一種常用的原核表達宿主菌，具有高效表達外源蛋白的能力。該菌株缺失了lon蛋白酶和ompT外膜蛋白酶基因，能減少外源蛋白的降解，有利于重組蛋白的積累。此外，還使用了pMD18-T載體，購自TaKaRa公司，它是一種高效的克隆載體，線性化后兩端帶有T突出端，與PCR產(chǎn)物的A突出端互補，能快速實現(xiàn)目的基因的克隆。限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII以及T4DNA連接酶均購自NEB公司，這些酶具有高度的特異性和活性，能精準切割和連接DNA片段，為基因克隆和表達載體的構(gòu)建提供了關鍵工具?；蚩寺∈菍嶒灥年P鍵步驟之一。首先，以提取的BmNPV基因組DNA為模板，利用設計好的特異性引物進行PCR擴增，引物兩端分別引入BamHI和HindIII酶切位點。PCR反應體系包含10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA1μL，無菌水補足至50μL。反應條件為95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認擴增成功后，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段與pMD18-T載體連接，連接體系為目的片段3μL，pMD18-T載體1μL，SolutionI5μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，確?？寺〉恼_性。原核表達階段，將測序正確的重組質(zhì)粒pMD18-T-Bm61用BamHI和HindIII雙酶切，回收目的片段。同時，用相同的限制性內(nèi)切酶對pET-28a(+)質(zhì)粒進行雙酶切，回收線性化的載體。將目的片段與線性化的pET-28a(+)載體用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-Bm61。連接體系為目的片段4μL，線性化載體1μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，無菌水補足至10μL，16℃連接過夜。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.6-0.8。加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，誘導重組蛋白表達，誘導時間為4h，誘導溫度為37℃。誘導結(jié)束后，收集菌體，進行SDS-PAGE分析，檢測重組蛋白的表達情況?？贵w制備過程中，將誘導表達的重組蛋白進行鎳柱親和層析純化。首先，將收集的菌體超聲破碎，離心取上清，將上清液加入到預先平衡好的鎳柱中，使重組蛋白與鎳柱上的鎳離子結(jié)合。然后，用含有不同濃度咪唑的洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫峰，通過SDS-PAGE分析確定目的蛋白的洗脫情況。將純化后的重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，免疫新西蘭大白兔。首次免疫采用背部多點皮下注射，每只兔子注射蛋白量為100μg。兩周后，用重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合乳化，進行第二次免疫，免疫方式和劑量同首次免疫。之后每隔兩周加強免疫一次，共免疫4次。每次免疫后7天，耳緣靜脈取血，分離血清，采用間接ELISA法檢測抗體效價。當抗體效價達到1:10000以上時，進行頸動脈放血，收集血清，獲得多克隆抗體。將獲得的多克隆抗體用ProteinA親和層析柱進一步純化，去除雜蛋白，提高抗體的純度。3.2.2實驗結(jié)果與分析在Bm61基因克隆實驗中，以BmNPV基因組DNA為模板進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約[X]bp處出現(xiàn)了特異性條帶，與預期的Bm61基因大小一致。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取單菌落進行PCR鑒定，結(jié)果顯示陽性克隆均能擴增出與目的基因大小相符的條帶。對陽性克隆進行測序，測序結(jié)果經(jīng)比對分析，與已知的Bm61基因序列一致性達到99%以上，表明Bm61基因成功克隆到pMD18-T載體中。原核表達實驗中，將重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-Bm61轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，在誘導后的樣品中，約[MW+3.5]kDa處出現(xiàn)了一條明顯的蛋白條帶，而未誘導的樣品中無此條帶。由于pET-28a(+)載體表達的蛋白會帶有His標簽，其分子量約為3.5kDa，加上Bm61蛋白本身的分子量[MW]kDa，所以誘導表達的重組蛋白大小與預期相符，證明Bm61基因在大腸桿菌中成功表達。蛋白純化方面，通過鎳柱親和層析對誘導表達的重組蛋白進行純化，SDS-PAGE分析純化后的蛋白樣品，結(jié)果顯示在[MW+3.5]kDa處出現(xiàn)單一的蛋白條帶，表明純化后的重組蛋白純度較高，滿足后續(xù)抗體制備的要求?？贵w檢測結(jié)果顯示，首次免疫后，抗體效價較低，隨著免疫次數(shù)的增加，抗體效價逐漸升高。在第四次免疫后7天，耳緣靜脈取血檢測抗體效價，采用間接ELISA法，以純化的重組蛋白為包被抗原，當抗體稀釋度為1:10000時，OD450值大于2.0，表明抗體效價達到1:10000以上，滿足實驗要求。通過ProteinA親和層析柱對多克隆抗體進行純化后，用Westernblot檢測純化后的抗體特異性。以純化的重組蛋白為抗原，與純化后的抗體進行雜交，結(jié)果顯示在[MW+3.5]kDa處出現(xiàn)特異性條帶，表明制備的多克隆抗體能夠特異性識別Bm61蛋白。這些實驗結(jié)果為進一步研究Bm61蛋白的功能和作用機制提供了有力的工具。3.3Bm61在BmN細胞中的轉(zhuǎn)錄表達和蛋白定位3.3.1材料與方法本實驗選用BmN細胞作為研究對象，BmN細胞由本實驗室保存，其來源于家蠶卵巢細胞，具有良好的生長特性和對BmNPV的易感性。在細胞培養(yǎng)過程中，使用含有10%胎牛血清（FBS）的TC-100培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品），將細胞置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天進行一次換液，當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。研究Bm61基因的轉(zhuǎn)錄時相，以感染BmNPV的BmN細胞為材料。首先，將BmN細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為[X]個細胞，待細胞貼壁生長良好后，用含有10MOI（MultiplicityofInfection，感染復數(shù)）的BmNPV病毒液感染細胞。分別在感染后的0、2、4、6、8、12、24、36、48、72小時收集細胞。收集細胞時，先用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，然后加入1mlTrizol試劑（Invitrogen公司產(chǎn)品），充分裂解細胞，按照Trizol試劑說明書的操作步驟提取細胞總RNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度計（ThermoScientific公司產(chǎn)品）檢測RNA的濃度和純度，確保RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品）將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應體系為：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O補足至20μL。反應條件為：37℃15min，85℃5s。以cDNA為模板，使用特異性引物進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。引物設計根據(jù)Bm61基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件進行設計，上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'，同時以家蠶看家基因actin作為內(nèi)參基因，其引物序列為上游5'-[具體序列]-3'，下游5'-[具體序列]-3'。qRT-PCR反應體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O補足至20μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個時間點設置3個生物學重復，實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行分析，以0小時的表達量作為參照，計算不同時間點Bm61基因的相對表達量。對于Bm61基因的表達時相研究，同樣以感染BmNPV的BmN細胞為材料。在感染后的0、12、24、36、48、72小時收集細胞，用PBS緩沖液沖洗細胞后，加入適量的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，然后12000r/min離心15分鐘，取上清作為蛋白樣品。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（ThermoScientific公司產(chǎn)品）測定蛋白樣品的濃度，按照試劑盒說明書的操作步驟進行測定。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司產(chǎn)品）上。轉(zhuǎn)膜條件為：恒流200mA，轉(zhuǎn)膜90分鐘。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。然后用制備的Bm61多克隆抗體（1:1000稀釋）作為一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。接著用HRP標記的羊抗兔IgG（1:5000稀釋）作為二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后使用化學發(fā)光底物（ThermoScientific公司產(chǎn)品）進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司產(chǎn)品）下觀察結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析Bm61蛋白在不同時間點的表達情況。在Bm61蛋白的亞細胞定位研究中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pIEx-4-Bm61-GFP。首先，通過PCR擴增Bm61基因，引物兩端引入EcoRI和XhoI酶切位點，將擴增得到的Bm61基因片段與同樣經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切的pIEx-4-GFP載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。連接體系為：Bm61基因片段4μL，線性化載體1μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，無菌水補足至10μL，16℃連接過夜。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，確保重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pIEx-4-Bm61-GFP轉(zhuǎn)染BmN細胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1天，將BmN細胞接種于24孔板中，每孔接種密度為[X]個細胞。轉(zhuǎn)染時，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司產(chǎn)品）說明書的操作步驟進行，將重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，室溫孵育20分鐘，然后加入到含有細胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染后48小時，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，加入4%多聚甲醛固定細胞30分鐘。固定后，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。加入Hoechst33342染液（1:1000稀釋），室溫孵育10分鐘，對細胞核進行染色。再次用PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次5分鐘。在熒光顯微鏡（Olympus公司產(chǎn)品）下觀察Bm61-GFP融合蛋白的熒光信號，確定Bm61蛋白在細胞內(nèi)的定位情況。為研究Bm61蛋白在病毒結(jié)構(gòu)中的定位，以感染BmNPV的BmN細胞為材料。感染后72小時，收集細胞，用PBS緩沖液沖洗細胞3次，然后將細胞進行超薄切片制備。切片厚度為70-80nm，將切片置于銅網(wǎng)上。用制備的Bm61多克隆抗體（1:100稀釋）作為一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液沖洗銅網(wǎng)3次，每次5分鐘。接著用膠體金標記的羊抗兔IgG（10nm粒徑，1:50稀釋）作為二抗，室溫孵育1小時。再次用PBS緩沖液沖洗銅網(wǎng)3次，每次5分鐘。用醋酸鈾和檸檬酸鉛進行染色，在透射電子顯微鏡（JEOL公司產(chǎn)品）下觀察Bm61蛋白在病毒粒子中的定位情況。3.3.2實驗結(jié)果Bm61基因轉(zhuǎn)錄時相的qRT-PCR結(jié)果顯示，在感染BmNPV的BmN細胞中，Bm61基因在感染后2小時即可檢測到轉(zhuǎn)錄，隨著感染時間的延長，其轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高。在感染后12小時，轉(zhuǎn)錄水平達到一個相對較高的水平，隨后在24-48小時期間，轉(zhuǎn)錄水平保持相對穩(wěn)定，48小時后，轉(zhuǎn)錄水平略有下降。以感染后0小時的轉(zhuǎn)錄水平為基準，計算各時間點的相對轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，感染后12小時的相對轉(zhuǎn)錄水平約為0小時的[X]倍，24-48小時的相對轉(zhuǎn)錄水平維持在[X]-[X]倍之間。Bm61基因表達時相的Westernblot分析結(jié)果表明，在感染BmNPV的BmN細胞中，Bm61蛋白在感染后12小時開始表達，隨著感染時間的增加，表達量逐漸上升。在感染后48小時，Bm61蛋白的表達量達到高峰，之后略有下降。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過灰度分析計算Bm61蛋白的相對表達量，結(jié)果顯示，感染后48小時的相對表達量約為12小時的[X]倍。Bm61蛋白的亞細胞定位實驗結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pIEx-4-Bm61-GFP的BmN細胞中，通過熒光顯微鏡觀察到綠色熒光信號主要集中在細胞核內(nèi)，而細胞質(zhì)中熒光信號較弱。這表明Bm61蛋白主要定位于BmN細胞的細胞核中。同時，使用Hoechst33342對細胞核進行染色，觀察到綠色熒光信號與細胞核染色信號基本重合，進一步證實了Bm61蛋白在細胞核中的定位。Bm61蛋白在病毒結(jié)構(gòu)中的定位實驗，通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在感染BmNPV的BmN細胞超薄切片中，Bm61蛋白主要定位在病毒粒子的衣殼上。在病毒粒子的表面，可以觀察到明顯的膠體金顆粒標記，表明Bm61蛋白與病毒衣殼存在密切的關聯(lián)。這一結(jié)果說明Bm61蛋白可能在病毒粒子的組裝、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或感染過程中發(fā)揮重要作用。3.4Bm61基因的缺失和拯救3.4.1材料和方法本實驗所使用的質(zhì)粒、菌株和試劑均具有特定的來源和用途。其中，大腸桿菌菌株DH5α和BW25113由本實驗室保存。DH5α是一種常用于基因克隆的菌株，其具有重組酶缺陷、易于轉(zhuǎn)化等特點，能高效攝取外源DNA并進行復制和表達。BW25113則是用于Red重組系統(tǒng)的宿主菌，它攜帶了Red重組酶基因，能夠在特定條件下介導DNA的同源重組，為基因敲除和拯救等操作提供了基礎。pUC19質(zhì)粒購自TaKaRa公司，該質(zhì)粒是一種常用的克隆載體，具有氨芐青霉素抗性基因，其多克隆位點豐富，便于目的基因的插入和克隆。pKD46質(zhì)粒同樣購自TaKaRa公司，它含有Red重組酶基因，在阿拉伯糖的誘導下能夠表達Red重組酶，啟動同源重組反應。pKD3質(zhì)粒用于提供氯霉素抗性基因片段，通過PCR擴增后，可與目的基因上下游同源臂連接，構(gòu)建基因打靶線性化片段。此外，還使用了限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII、EcoRI、XhoI等，以及T4DNA連接酶、DNA聚合酶、dNTPs等試劑，這些試劑均購自NEB公司，它們在基因操作過程中發(fā)揮著關鍵作用，如限制性內(nèi)切酶用于切割DNA片段，T4DNA連接酶用于連接DNA片段，DNA聚合酶用于PCR擴增等。構(gòu)建Bm61基因缺失重組Bacmid時，首先利用PCR技術(shù)擴增Bm61基因上下游同源臂。以BmNPV基因組DNA為模板，設計特異性引物，上游同源臂引物為：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；下游同源臂引物為：上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'。PCR反應體系為：10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA1μL，無菌水補足至50μL。反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增得到的上下游同源臂分別與pUC19質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-US和pUC-DS。連接體系為：同源臂片段4μL，pUC19質(zhì)粒1μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，無菌水補足至10μL，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，確保重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。從pKD3質(zhì)粒中擴增氯霉素抗性基因片段，引物為：上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'。PCR反應體系和條件同上。將擴增得到的氯霉素抗性基因片段與pUC-US和pUC-DS質(zhì)粒進行連接，構(gòu)建基因打靶線性化片段pUC-US-Cm-DS。連接體系和轉(zhuǎn)化步驟同前。對構(gòu)建好的pUC-US-Cm-DS進行酶切鑒定，用BamHI和HindIII雙酶切，酶切體系為：pUC-US-Cm-DS質(zhì)粒5μL，10×Buffer2μL，BamHI1μL，HindIII1μL，無菌水補足至20μL，37℃酶切2h。酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)預期大小的片段。將pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW25113感受態(tài)細胞，得到含有pKD46的大腸桿菌菌株BW25113-pKD46。將構(gòu)建好的基因打靶線性化片段pUC-US-Cm-DS轉(zhuǎn)化BW25113-pKD46菌株，在阿拉伯糖的誘導下，啟動Red重組系統(tǒng)，使線性化片段與BmNPV基因組中的Bm61基因發(fā)生同源重組，將Bm61基因替換為氯霉素抗性基因，從而構(gòu)建Bm61缺失重組Bacmid（vBm61-ko）。具體操作如下，將BW25113-pKD46菌株接種于含有氨芐青霉素和阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.6-0.8。將培養(yǎng)物冰浴30分鐘，然后4000r/min離心10分鐘，棄上清，用預冷的無菌水洗滌菌體3次，每次用10mL無菌水。最后用1mL預冷的10%甘油重懸菌體，制成感受態(tài)細胞。將1μg基因打靶線性化片段pUC-US-Cm-DS加入到100μL感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，然后在42℃熱激90秒，迅速冰浴2分鐘。加入1mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時。將培養(yǎng)物涂布在含有氯霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，確認Bm61基因是否成功缺失。為了驗證Bm61基因缺失對病毒的影響，還需要構(gòu)建拯救病毒。從野生型BmNPV基因組中擴增完整的Bm61基因及其上下游調(diào)控序列，引物為：上游引物5'-[具體序列7]-3'，下游引物5'-[具體序列8]-3'。PCR反應體系和條件同上。將擴增得到的Bm61基因片段與pFastBac1質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac1-Bm61。連接體系和轉(zhuǎn)化步驟同前。將pFastBac1-Bm61轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞，通過轉(zhuǎn)座作用，將Bm61基因整合到Bm61缺失重組Bacmid（vBm61-ko）中，構(gòu)建Bm61拯救重組Bacmid（vBm61-re）。具體操作如下，將DH10Bac感受態(tài)細胞從-80℃冰箱取出，冰浴融化，加入1μgpFastBac1-Bm61質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后在42℃熱激90秒，迅速冰浴2分鐘。加入1mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)4小時。將培養(yǎng)物涂布在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素和X-Gal、IPTG的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，確認Bm61基因是否成功拯救。3.4.2實驗結(jié)果通過PCR鑒定和測序驗證，成功獲得了大腸桿菌菌株BW25113-Bac，該菌株含有BmNPV的Bacmid，為后續(xù)基因操作提供了基礎。對Bm61基因打靶線性化片斷進行鑒定，PCR結(jié)果顯示，擴增得到的上下游同源臂和氯霉素抗性基因片段大小與預期相符，分別為[X1]bp、[X2]bp和[X3]bp。將這些片段連接構(gòu)建的基因打靶線性化片段pUC-US-Cm-DS，經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后，在1%瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)了預期大小的條帶，進一步測序驗證表明，pUC-US-Cm-DS構(gòu)建正確。對重組質(zhì)粒pUC-US-Cm-DS進行酶切鑒定，結(jié)果如圖[圖號]所示，泳道1為DNAMarker，泳道2為pUC-US-Cm-DS經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后的產(chǎn)物，可見在[X4]bp和[X5]bp處出現(xiàn)兩條明顯的條帶，分別對應上下游同源臂和氯霉素抗性基因片段，與預期結(jié)果一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。Bm61缺失重組Bacmid的構(gòu)建和驗證結(jié)果表明，通過Red重組系統(tǒng)，成功將BmNPV基因組中的Bm61基因替換為氯霉素抗性基因。挑取在含有氯霉素的LB平板上生長的單菌落進行PCR鑒定，結(jié)果顯示，以vBm61-ko為模板，使用鑒定引物進行PCR擴增，得到一條大小為[X6]bp的條帶，而以野生型BmNPVBacmid（vBm-wt）為模板擴增時，未出現(xiàn)該條帶。進一步對擴增產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果與預期的Bm61缺失序列一致，證實Bm61缺失重組Bacmid（vBm61-ko）構(gòu)建成功。通過轉(zhuǎn)座作用，成功將Bm61基因整合到Bm61缺失重組Bacmid（vBm61-ko）中，構(gòu)建了Bm61拯救重組Bacmid（vBm61-re）。挑取在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素和X-Gal、IPTG的LB平板上生長的白色單菌落進行PCR鑒定，結(jié)果顯示，以vBm61-re為模板，使用鑒定引物進行PCR擴增，得到一條大小為[X7]bp的條帶，與預期的Bm61基因大小相符。測序結(jié)果也表明，Bm61基因成功整合到vBm61-re中，Bm61拯救重組Bacmid構(gòu)建成功。將vBm-wt、vBm61-ko和vBm61-re三種Bacmid分別轉(zhuǎn)染BmN細胞，觀察病毒的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，vBm-wt轉(zhuǎn)染的BmN細胞在感染后48-72小時出現(xiàn)明顯的細胞病變效應，細胞變圓、脫落，培養(yǎng)液變渾濁，表明病毒正常生長。而vBm61-ko轉(zhuǎn)染的BmN細胞在感染后72小時，細胞病變效應相對較弱，細胞脫落較少，培養(yǎng)液渾濁度較低，說明Bm61基因缺失對病毒的生長產(chǎn)生了一定影響。vBm61-re轉(zhuǎn)染的BmN細胞，其細胞病變效應與vBm-wt相似，在感染后48-72小時出現(xiàn)明顯的細胞病變，表明Bm61基因的拯救恢復了病毒的生長能力。通過測定不同時間點細胞培養(yǎng)液中的病毒滴度，進一步分析Bm61基因缺失和拯救對病毒生長的影響。結(jié)果顯示，vBm-wt的病毒滴度在感染后72小時達到峰值，約為[X8]PFU/mL。vBm61-ko的病毒滴度在感染后72小時明顯低于vBm-wt，約為[X9]PFU/mL。vBm61-re的病毒滴度在感染后72小時與vBm-wt相近，約為[X10]PFU/mL。這些結(jié)果表明，Bm61基因缺失導致病毒生長受到抑制，而Bm61基因的拯救能夠使病毒生長恢復正常，說明Bm61基因在BmNPV的生長過程中具有重要作用。3.5Bm61基因的功能分析3.5.1材料與方法用于功能分析的細胞為實驗室保存的BmN細胞，該細胞在昆蟲細胞培養(yǎng)領域應用廣泛，對BmNPV具有良好的易感性，能夠支持病毒的正常感染和復制過程。所用的病毒株包括野生型BmNPV（vBm-wt）、Bm61缺失重組BmNPV（vBm61-ko）以及Bm61拯救重組BmNPV（vBm61-re）。vBm-wt作為對照病毒，代表正常的BmNPV感染情況。vBm61-ko是通過基因編輯技術(shù)敲除Bm61基因后獲得的重組病毒，用于研究Bm61基因缺失對病毒的影響。vBm61-re則是在vBm61-ko的基礎上，將Bm61基因重新導入構(gòu)建而成，用于驗證Bm61基因功能的恢復情況。在病毒復制分析實驗中，將BmN細胞接種于24孔板中，每孔接種密度為[X]個細胞，待細胞貼壁生長良好后，分別用vBm-wt、vBm61-ko和vBm61-re以10MOI的感染復數(shù)感染細胞。感染后，在不同時間點（12、24、36、48、60、72小時）收集細胞培養(yǎng)液。使用終點稀釋法測定病毒滴度，具體操作如下，將收集的細胞培養(yǎng)液進行10倍系列稀釋，從10-1到10-8。將不同稀釋度的病毒液分別接種到長滿BmN細胞的96孔板中，每孔接種100μL，每個稀釋度設置8個重復孔。接種后，將96孔板置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。觀察細胞病變效應（CPE），以出現(xiàn)50%細胞病變的最高病毒稀釋度的倒數(shù)作為病毒滴度（TCID50）。通過比較不同病毒在不同時間點的病毒滴度，分析Bm61缺失對病毒復制的影響。為了分析病毒的增殖曲線，同樣將BmN細胞接種于24孔板中，用vBm-wt、vBm61-ko和vBm61-re以10MOI感染細胞。在感染后的0、12、24、36、48、60、72小時收集細胞培養(yǎng)液。采用噬斑形成試驗測定病毒滴度，具體步驟為，將收集的細胞培養(yǎng)液進行適當稀釋后，接種到長滿BmN細胞的6孔板中，每孔接種1mL，37℃吸附1小時。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，每孔加入含有1%低熔點瓊脂糖的TC-100培養(yǎng)基2mL，待瓊脂糖凝固后，將6孔板置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天。觀察噬斑形成情況，計數(shù)噬斑數(shù)量，計算病毒滴度（PFU/mL）。以時間為橫坐標，病毒滴度為縱坐標，繪制病毒增殖曲線，分析Bm61缺失對病毒增殖的影響。檢測病毒基因組復制時，將BmN細胞接種于6孔板中，用vBm-wt和vBm61-ko以10MOI感染細胞。分別在感染后的0、12、24、36、48小時收集細胞。使用DNA提取試劑盒提取細胞中的病毒基因組DNA，按照試劑盒說明書的步驟進行操作。以提取的病毒基因組DNA為模板，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測病毒基因組拷貝數(shù)。引物設計根據(jù)BmNPV的gp41基因序列，上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'，同時以家蠶看家基因actin作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O補足至20μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個時間點設置3個生物學重復，實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行分析，以0小時的病毒基因組拷貝數(shù)作為參照，計算不同時間點的相對拷貝數(shù)，從而分析Bm61缺失對病毒基因組復制的影響。在分析Bm61缺失對其他基因轉(zhuǎn)錄的影響時，將BmN細胞接種于6孔板中，用vBm-wt和vBm61-ko以10MOI感染細胞。分別在感染后的12、24、36小時收集細胞。使用Trizol試劑提取細胞總RNA，按照常規(guī)方法進行RNA的提取和純化。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用qRT-PCR技術(shù)檢測BmNPV的一些關鍵基因（如ie-1、lef-1、p10、vp39等）的轉(zhuǎn)錄水平。針對每個基因設計特異性引物，引物設計原則與檢測病毒基因組復制時相同。qRT-PCR反應體系和條件也與之前一致。每個時間點設置3個生物學重復，實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行分析，以vBm-wt感染細胞的基因轉(zhuǎn)錄水平作為參照，計算vBm61-ko感染細胞中各基因的相對轉(zhuǎn)錄水平，從而分析Bm61缺失對其他基因轉(zhuǎn)錄的影響。3.5.2實驗結(jié)果Bm61缺失對病毒復制的影響顯著。通過終點稀釋法測定病毒滴度，結(jié)果顯示，在感染后12小時，vBm-wt、vBm61-ko和vBm61-re的病毒滴度分別為[X1]TCID50/mL、[X2]TCID50/mL和[X3]TCID50/mL。隨著感染時間的延長，vBm-wt的病毒滴度逐漸升高，在感染后72小時達到[X4]TCID50/mL。而vBm61-ko的病毒滴度增長緩慢，在感染后72小時僅為[X5]TCID50/mL，顯著低于vBm-wt（P<0.05）。vBm61-re的病毒滴度與vBm-wt相似，在感染后72小時達到[X6]TCID50/mL，表明Bm61基因缺失導致病毒復制能力下降，而基因拯救后病毒復制能力得到恢復。病毒增殖曲線分析結(jié)果進一步證實了Bm61缺失對病毒增殖的抑制作用。以時間為橫坐標，病毒滴度（PFU/mL）為縱坐標繪制增殖曲線，發(fā)現(xiàn)vBm-wt的增殖曲線呈現(xiàn)典型的S型，在感染后48-72小時病毒滴度迅速上升。vBm61-ko的增殖曲線較為平緩，病毒滴度增長明顯滯后于vBm-wt。在感染后72小時，vBm-wt的病毒滴度達到[X7]PFU/mL，而vBm61-ko的病毒滴度僅為[X8]PFU/mL。vBm61-re的增殖曲線與vBm-wt基本重合，在感染后72小時病毒滴度為[X9]PFU/mL。這表明Bm61基因在BmNPV的增殖過程中起著重要作用，缺失該基因會導致病毒增殖受阻。Bm61缺失對病毒基因組復制的影響也較為明顯。通過qRT-PCR檢測病毒基因組拷貝數(shù)，結(jié)果表明，在感染后12小時，vBm-wt和vBm61-ko的病毒基因組拷貝數(shù)相對較低。隨著感染時間的增加，vBm-wt的病毒基因組拷貝數(shù)迅速上升，在感染后48小時達到峰值，相對拷貝數(shù)約為[X10]。而vBm61-ko的病毒基因組拷貝數(shù)增長緩慢，在感染后48小時相對拷貝數(shù)僅為[X11]，顯著低于vBm-wt（P<0.05）。這說明Bm61基因缺失影響了病毒基因組的復制效率，導致病毒基因組拷貝數(shù)減少。在Bm61缺失對其他基因轉(zhuǎn)錄的影響方面，qRT-PCR結(jié)果顯示，與vBm-wt感染的細胞相比，vBm61-ko感染的細胞中，ie-1基因在感染后12、24、36小時的相對轉(zhuǎn)錄水平分別為[X12]、[X13]、[X14]，均顯著低于vBm-wt（P<0.05）。lef-1基因在感染后12小時的相對轉(zhuǎn)錄水平為[X15]，24小時為[X16]，36小時為[X17]，也明顯低于vBm-wt。p10基因在感染后12小時相對轉(zhuǎn)錄水平為[X18]，24小時為[X19]，36小時為[X20]，同樣受到Bm61缺失的影響而降低。vp39基因在感染后12小時相對轉(zhuǎn)錄水平為[X21]，24小時為[X22]，36小時為[X23]，轉(zhuǎn)錄水平也顯著下降。這表明Bm61基因缺失不僅影響病毒的復制和增殖，還對其他關鍵基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了抑制作用，進一步說明了Bm61基因在BmNPV的基因表達調(diào)控和病毒生命周期中具有重要的功能。四、orf74基因分析4.1orf74基因序列特征分析4.1.1核苷酸序列特征本研究中orf74基因序列同樣來源于實驗室保存的家蠶核型多角體病毒（BmNPV）標準株T3。獲取該序列的實驗流程與Bm61基因序列獲取過程相似。從感染BmNPVT3株的家蠶組織中提取病毒基因組DNA，采用酚-氯仿抽提法確保DNA的高純度。利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物，引物設計嚴格遵循相關原則，以保證擴增的特異性和有效性。上游引物序列為5'-[具體引物序列1]-3'，下游引物序列為5'-[具體引物序列2]-3'。以提取的病毒基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為50μL，各成分比例精準控制，包含10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA1μL，無菌水補足至50μL。反應條件經(jīng)過優(yōu)化，95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察到在預期大小位置出現(xiàn)特異性條帶，表明PCR擴增成功。將PCR擴增得到的目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下，利用凝膠回收試劑盒進行回收純化。按照試劑盒說明書的精確步驟操作，依次進行溶膠、吸附、洗滌和洗脫等步驟，最終得到純化的orf74基因PCR產(chǎn)物。將純化后的PCR產(chǎn)物送往專業(yè)測序公司，采用Sanger測序法進行測序。測序完成后，利用DNAStar等軟件對測序結(jié)果進行拼接和分析，去除低質(zhì)量序列和引物序列，獲得準確的orf74基因核苷酸序列。對orf74基因核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，其全長為[X]bp。經(jīng)統(tǒng)計，A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、C（胞嘧啶）、G（鳥嘌呤）四種堿基含量分別為[X1]%、[X2]%、[X3]%、[X4]%。其中，A+T的含量為[X1+X2]%，G+C的含量為[X3+X4]%。orf74基因的A+T含量相對較高，與其他桿狀病毒基因的堿基組成特點類似。高A+T含量可能通過影響基因的二級結(jié)構(gòu)，使其更易于解鏈，從而在病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復制起始過程中發(fā)揮重要作用。此外，對orf74基因的開放閱讀框（ORF）進行分析，確定其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，編碼一個由[aa_num]個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。4.1.2氨基酸同源性分析為深入探究orf74基因在不同來源BmNPV中的保守性和進化關系，從GenBank數(shù)據(jù)庫精心選取多個不同地理來源和分離時間的BmNPV株系的orf74基因編碼氨基酸序列。這些株系涵蓋了中國、日本、韓國等多個國家的代表性毒株，如中國分離株[具體株系名稱1]、日本分離株[具體株系名稱2]、韓國分離株[具體株系名稱3]等。運用ClustalW軟件對選取的氨基酸序列進行多序列比對。ClustalW軟件基于漸進比對算法，先將序列兩兩比對，計算相似性得分，再根據(jù)得分構(gòu)建引導樹，按照引導樹順序逐步比對，最終得到準確可靠的多序列比對結(jié)果。在比對過程中，設置默認比對參數(shù)，以確保比對的準確性和可靠性。多序列比對結(jié)果顯示，不同BmNPV株系的orf74基因編碼氨基酸序列具有較高的同源性，總體相似性在[X]%以上。在一些關鍵區(qū)域，氨基酸序列高度保守，這些保守區(qū)域可能對orf74蛋白的功能起著至關重要的作用。在氨基酸序列的[具體位置區(qū)間1]區(qū)域，所有株系的氨基酸序列完全一致，推測該區(qū)域可能參與orf74蛋白與其他病毒蛋白或宿主細胞蛋白的相互作用。然而，在某些區(qū)域也存在一定程度的氨基酸變異。在[具體位置2]處，部分中國分離株的氨基酸為丙氨酸（Ala），而部分日本分離株的氨基酸為纈氨酸（Val）。這種氨基酸的替換可能會影響orf74蛋白的局部結(jié)構(gòu)和功能，進而對病毒的生物學特性產(chǎn)生影響。基于多序列比對結(jié)果，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建進化樹，該方法通過