(19)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局312號(hào)國(guó)檢廣場(chǎng)公司35100專(zhuān)利代理師林文弘蔡學(xué)俊GO1N33/03(2006.0一種食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方本發(fā)明公開(kāi)了一種食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)空度20Mpa下運(yùn)行時(shí)間1h得到食用油基質(zhì)大麻值的大麻素，并能調(diào)節(jié)每種大麻素的含量和比21.一種食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)采用體積比為1:1的乙酸乙酯和環(huán)己烷溶劑將大麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解并超聲混勻得到大麻素標(biāo)準(zhǔn)品；(2)將步驟(1)得到的大麻素標(biāo)準(zhǔn)品加入食用油中，充分?jǐn)嚢璨⑦M(jìn)行超聲混勻，最后放入真空干燥箱中，在40℃、真空度20Mpa下運(yùn)行時(shí)間1h得到食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于，大麻素3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于，步驟(1)中大麻素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為100mg/L。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于，步驟(2)中食用油為不含大麻素的市售食用油，所述市售食用油包括橄欖油、花生油、大豆油或5.一種如權(quán)利要求1-4所述的制備方法制得的食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品在食用油食品中大麻素的檢測(cè)中的應(yīng)用。3一種食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于食品非法添加物質(zhì)檢測(cè)的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域，提出了一種食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法及其應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]由?？浦参锎舐楦稍锕麑?shí)火麻仁冷榨得到的植物油脂火麻油在我國(guó)具有悠久的食用歷史?；鹇橛秃写舐樘赜幸活?lèi)含有烷基和單萜分子的次生代謝產(chǎn)物大麻素，主要包括△9-四氫大麻酚(△9-Tetrahydrocannabinol,△9-THC)、大麻酚(Cannabinol,CBN)和大麻二酚(Cannabidiol,CBD),其中，△9-THC因具有影響中樞神經(jīng)的作用而最為受到關(guān)注，在世界各國(guó)均受到了嚴(yán)格管控。[0003]由于火麻油的原料品種、產(chǎn)地來(lái)源及制備工藝的不同，其中各種大麻素的含量存在很大差異，但幾乎所有火麻油中都有不同含量大麻素存在。隨著工業(yè)大麻食品的日益普繼發(fā)布了政策與法規(guī)，對(duì)火麻油等食用油中△9-THC含量制定了5mg/kg~20mg/kg的限量要求。我國(guó)有大量火麻油產(chǎn)品上市銷(xiāo)售，也頒布了相關(guān)加工要求的地方標(biāo)準(zhǔn)如山西省地方標(biāo)準(zhǔn)DB14/T2273-2021《冷榨火麻油加工技術(shù)規(guī)范》,但尚未出臺(tái)包括火麻油在內(nèi)的工業(yè)[0004]當(dāng)前大麻素的標(biāo)準(zhǔn)品大多為進(jìn)口，售價(jià)昂貴、購(gòu)買(mǎi)不便且大多為純品，缺少結(jié)合了檢測(cè)基質(zhì)特性標(biāo)準(zhǔn)樣品，使得在檢測(cè)時(shí)無(wú)法有效的反應(yīng)不同樣品間的基質(zhì)效應(yīng)，從而造成檢測(cè)結(jié)果的偏差。國(guó)際上常用帶有實(shí)際基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品(referencematerials)開(kāi)展質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)或量值傳遞，也用于量值溯源、實(shí)驗(yàn)室的能力評(píng)價(jià)或代替純標(biāo)準(zhǔn)品，但目前暫無(wú)食用油中大麻素的標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究展實(shí)驗(yàn)室間量值傳遞與量值比對(duì)，可提高實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)分析數(shù)據(jù)的可比性，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室能力，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室方法可行性分析、儀器核查、人員技術(shù)水平考核、檢測(cè)質(zhì)量控制等實(shí)驗(yàn)室工作均具有重要意義。準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法及標(biāo)準(zhǔn)樣品。標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)于保證檢測(cè)結(jié)果間的一致性，提高檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量控制，建立檢測(cè)結(jié)果的量值溯源具有十分重要的意義。[0006]市面上銷(xiāo)售的火麻油，不同程度的都含有一定量的大麻素，但是受到產(chǎn)地、品種、生產(chǎn)工藝的影響，不同火麻油中大麻素的含量均不相同。若使用不同含量的火麻油調(diào)配制備標(biāo)準(zhǔn)樣品，存在以下幾個(gè)問(wèn)題：(1)調(diào)配的方法受火麻油中大麻素含量的影響較大，無(wú)法獲得對(duì)質(zhì)量控制最有效的數(shù)值。因調(diào)配的方法只能將原大麻素稀釋而不能提高，而世界各國(guó)對(duì)食用油中的限量從5mg/L~20mg/L不等，這些限量有的已經(jīng)超過(guò)市面上銷(xiāo)售火麻油中大麻素的含量，稀釋調(diào)配的方法不能滿(mǎn)足要求。(2)天然火麻油中均同時(shí)含有△9-THC、CBD、CBN,且含量不一，調(diào)配的方法無(wú)法將這些大麻素分開(kāi)賦值(如希望獲得△9-THC為5mg/L,4標(biāo)準(zhǔn)樣品的量值溯源性。(4)食用油種類(lèi)較多，但調(diào)配稀釋的方法只能得到火麻油這一種基發(fā)明內(nèi)容[0007]針對(duì)目前的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法及其應(yīng)用，其通過(guò)添加法，將大麻素通過(guò)介質(zhì)轉(zhuǎn)換后與食用油結(jié)合，從而能夠獲得預(yù)期數(shù)值的大麻素，并能調(diào)節(jié)每種大麻素的含量和比例，同時(shí)還能結(jié)合食用油的基質(zhì)特征，制備出多種食用油中大麻素的標(biāo)準(zhǔn)樣品。同時(shí)，本方法添加的大麻素為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，從而為制備后樣品的溯源性提供了良好的基礎(chǔ)。[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)一種食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法包括以下步驟：(1)采用體積比為1:1的乙酸乙酯和環(huán)己烷溶劑將大麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解并超聲混勻得到大麻素標(biāo)準(zhǔn)品；(2)將步驟(1)得到的大麻素標(biāo)準(zhǔn)品加入食用油中，充分?jǐn)嚢璨⑦M(jìn)行超聲混勻，最后放入真空干燥箱中，在40℃、真空度20Mpa下運(yùn)行時(shí)間1h,揮發(fā)掉作為介質(zhì)的溶劑(乙酸乙酯和環(huán)己烷),得到食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品。[0010]進(jìn)一步地，步驟(1)中大麻素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為100mg/L。[0011]進(jìn)一步地，步驟(2)中食用油為不含大麻素的市售食用油，所述市售食用油包括橄[0012]進(jìn)一步地，本發(fā)明制得的食用油基質(zhì)大麻素標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于：食用油食品中大麻素的檢測(cè)；食用油樣品中大麻素檢測(cè)的質(zhì)量控制；實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)；檢測(cè)結(jié)果的量值傳遞。[0013]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明的目的是制備一種標(biāo)準(zhǔn)樣品，與傳統(tǒng)上將標(biāo)準(zhǔn)品直接添加到樣品基質(zhì)上的方法不同的是，本發(fā)明將大麻素標(biāo)準(zhǔn)品與樣品基質(zhì)在更深層次上得到結(jié)合(傳統(tǒng)添加法只能是加而沒(méi)有結(jié)合),通過(guò)乙酸乙酯：環(huán)己烷=1:1(體積比)混合溶劑做為介質(zhì)，將樣品基質(zhì)(食用油等)和目標(biāo)物(三種大麻素)溶解后，在物理攪拌和超聲作用下結(jié)合，再通過(guò)真空干燥揮發(fā)掉作為介質(zhì)的溶劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(均勻性和穩(wěn)定性)表明，這種方法制備的標(biāo)準(zhǔn)樣[0014](2)本發(fā)明的制備標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)使用的介質(zhì)溶劑(乙酸乙酯：環(huán)己烷體積比=1:1);一是環(huán)己烷溶解油脂能力強(qiáng)，乙酸乙酯能夠溶解多酚類(lèi)物質(zhì)，能夠很好的溶解食用油基質(zhì)和目標(biāo)物，從而作為中間介質(zhì)溶劑。二是三種大麻素目標(biāo)物都屬于多酚類(lèi)物質(zhì)，這是一種芳香烴環(huán)上的氫被羥基取代的化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)分析和文獻(xiàn)報(bào)道，這類(lèi)目標(biāo)物的化學(xué)極性較弱，根據(jù)化學(xué)極似的相似相溶原理，目標(biāo)物易溶于極性較弱的溶劑中。根據(jù)化學(xué)溶劑極性表中的數(shù)據(jù)，相似極性的溶劑大多為苯、氯仿的組合，但多酚類(lèi)目標(biāo)物又不溶于苯或氯仿，且這兩種試劑的毒性都較高。在比較化學(xué)極性表、目標(biāo)物溶解性、參考試劑毒性和多次試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)乙酯乙酯：環(huán)己烷=1:1的溶劑組合能夠滿(mǎn)足極性相似、目標(biāo)物溶解性的要求，且試劑毒性小。三是乙酸乙酯和環(huán)己烷都易揮發(fā)，在完成樣品制備后，很容易被揮發(fā)除去，既不在制5[0015](3)超聲波的方式除了能進(jìn)步將目標(biāo)物和食用油基質(zhì)混勻外，還能將目標(biāo)物與基質(zhì)產(chǎn)生有機(jī)結(jié)合，從而增強(qiáng)樣品的均勻性和穩(wěn)定性。具體實(shí)施方式[0016]為讓本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉實(shí)施例，作詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。2.1選擇檢測(cè)為陰性的市售食用油(橄欖油)作為基質(zhì)樣品，便于獲得、儲(chǔ)運(yùn)和模擬實(shí)際檢測(cè)的需求。[0019]2.2將△9-THC、CBD、CBN大麻素標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸乙酯：環(huán)己烷=1:1溶解后至濃度100mg/L,超聲5min混勻。[0020]2.3在陰性基質(zhì)樣品中加入三種大麻素標(biāo)準(zhǔn)品，40℃下超聲2h混勻。按每1kg橄欖[0021]2.4將上述樣品放入真空干燥箱中，40℃,真空度20Mpa,運(yùn)行時(shí)間1h,揮發(fā)掉作為介質(zhì)的溶劑(乙酸乙酯和環(huán)己烷)。[0022]2.5對(duì)制得的食用油基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定值和不確定度評(píng)估。[0023]2.6對(duì)制得的食用油基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)。制得的標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于：食用油食品中大麻素的檢測(cè)；食用油樣品中大麻素檢測(cè)[0025]用于檢測(cè)主要體現(xiàn)在當(dāng)無(wú)法獲得大麻素的標(biāo)準(zhǔn)品，或因純品標(biāo)準(zhǔn)品太貴等原因不能使用時(shí)，可使用本標(biāo)準(zhǔn)樣品代替標(biāo)準(zhǔn)品去檢測(cè)待測(cè)樣品。由于本標(biāo)準(zhǔn)樣品是通過(guò)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制得，具有一定的量值溯源性，因此可以實(shí)現(xiàn)上述用途。具體做法是：將本標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)樣品一同檢測(cè)，將待測(cè)樣品的峰面積/信號(hào)值與本標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積/信號(hào)值進(jìn)行比較，由于標(biāo)準(zhǔn)樣品中大麻素的含量是已知的，因此可以換算出待測(cè)樣品中的大麻素含量。4.1材料與試劑譜純)德國(guó)Merck公司；乙酸銨(色譜純);CaptivaEMR-Lipid固相萃取柱(100mg,3mL)。[0027]4.2儀器與設(shè)備XevoTQD液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源(ESI))美國(guó)Waters公司；3-18K高速離心機(jī)德國(guó)Sigma公司。[0028]4.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制6[0029]內(nèi)標(biāo)溶液：移取適量?jī)?nèi)標(biāo)溶液(△9-THC-d3),用甲醇稀釋配制成1.0μg/mL,于-20℃避光保存。[0030]混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，用75%甲醇水溶50.0μg/L內(nèi)標(biāo))的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。[0031]4.4樣品前處理4.4.1樣品提取溶液和10mL乙腈，渦旋混勻30s,50℃下超聲提取15min,10000r/min離心5min,取5mL上清液待凈化。[0032]4.4.2樣品凈化將待凈化液轉(zhuǎn)移至事先用2mL乙腈活化過(guò)的EMR固相萃取小柱中，待其自然重力流出后，用5mL乙腈淋洗小柱，減壓抽干30s。上樣和洗脫流速均應(yīng)小于1mL/min。收集全部流出液，在40℃下氮吹至干，加入1mL75%甲醇水溶液，渦旋混勻30s,超聲3min,過(guò)[0033]4.5分析方法4.5.1色譜條件電離模式：電噴霧正離子模式(ESI+);檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓：3kV;離子源溫度：350℃;霧化氣：氮?dú)猓?000L/h;碰撞[0035]4.6分析結(jié)果對(duì)檢測(cè)結(jié)果采用方法學(xué)分析，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限、準(zhǔn)確度和精密度判斷方法的穩(wěn)定性和靈敏度。結(jié)果表明，該方法在10.0~200.0μg/kg范圍里呈現(xiàn)良好的線性，相關(guān)系數(shù)均大于0.998,方法的檢出限和定量限分別為3μg/kg和10μg/kg,能夠滿(mǎn)足世界各國(guó)對(duì)食用油中大麻素的限量要求，對(duì)1、2、10倍定量限的加標(biāo)結(jié)果表明，三種大麻素的回收率在72.3~108.4%,精密度RSD在4.9~12.4%,方法準(zhǔn)確度和精密度良好，能夠滿(mǎn)足分析7要求。333撤欖油5.1樣品制備在1kg橄欖油樣品中，加入1mL含有100mg/L△9-THC、CBD、CBN備方法所述制得標(biāo)準(zhǔn)樣品后，使用密封蓋棕色玻璃瓶，平均分裝成30份，每份約30g樣[0037]隨機(jī)提取10瓶用于均勻性檢驗(yàn)。另將10瓶置于室溫(20±5)℃,10瓶置于冷藏(4±[0038]5.2檢驗(yàn)方法2008“標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法”中對(duì)“均勻性研究”的要求，采用單因素方差分析(F檢驗(yàn))法，對(duì)制備后的樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。隨機(jī)抽取10份制備好的樣品，每份樣品在重復(fù)性條件下測(cè)定2次，計(jì)算F值，并用95%置信區(qū)間查F分布臨界值果表明，制備的樣品中三種大麻素濃度都是均勻的。8測(cè)試值1,測(cè)試值2,測(cè)試值1,測(cè)試值2,測(cè)試值1,測(cè)試值2,123456789樣品間9樣品內(nèi)樣品間9樣品內(nèi)9樣品內(nèi)2008“標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法”中對(duì)“穩(wěn)定性研究”的要求，使用與均勻性檢驗(yàn)相同的人員、設(shè)備、方法和實(shí)驗(yàn)條件，將均勻性測(cè)定結(jié)果的均值做為參考值，采用t檢驗(yàn)法，對(duì)制備后的樣品進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。將10份制備后的樣品置于(20±5)℃室溫環(huán)境中，另10份置于(4±2)℃環(huán)境中，計(jì)算不同時(shí)間間隔的測(cè)定結(jié)果的t值，按95%置信水平查t臨界值表，當(dāng)測(cè)得的t值小于t均勻性檢驗(yàn)結(jié)果的平均值之間無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表5。穩(wěn)定性檢驗(yàn)的結(jié)果表明，在兩個(gè)不同儲(chǔ)存溫度下保存的樣品都是穩(wěn)定的，且儲(chǔ)存在(4±2)℃條件下的樣品穩(wěn)定性更好。91(5天)10(60天)參照GB/T15000.3-2008“標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)準(zhǔn)不確定度Ue(dil)、檢測(cè)回收引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urei(rec)和重復(fù)性測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uei(rep)。則取k=2,則擴(kuò)展不確定度為U=2×Uc,rel