引言當(dāng)今女性要面臨的各方面壓力很大，因此會(huì)造成許多疾病的滋生。而乳腺癌就是這種典型疾病中的一種，我國作為世界上人口最多的國家，自然也就成為了乳腺癌的聚集區(qū)。從中國抗癌協(xié)會(huì)發(fā)布的官方數(shù)據(jù)中可以看出，我國最近幾年來患乳腺癌的病人呈現(xiàn)一個(gè)逐年增加的趨勢，大約是以每年3%的速度增加的?；熓谴蠖鄶?shù)癌癥及腫瘤患者的首選方法，但是對大多數(shù)患者來說副作用比較多，如惡心，嘔吐，食欲不振等。所以近年來人們將目光投向了更加安全，不良反應(yīng)更加減緩的中藥治療。中藥具有多途徑，多靶點(diǎn)，多環(huán)節(jié)的特點(diǎn)，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究特色就是整體性，系統(tǒng)性，考慮藥物間的相互作用，所以我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來研究當(dāng)歸—枸杞的治療作用。中藥當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv)Diels.的根。它的主要作用是促進(jìn)血液循環(huán)，調(diào)節(jié)月經(jīng)，緩解疼痛，通便，但也有一些別的微妙作用。人們都說“十藥九歸”，在所有的中藥中，當(dāng)歸幾乎是中藥中最經(jīng)常使用的一味中藥了。主要治療各種因貧血引起的病癥，如血虛瘀血、月經(jīng)不調(diào)、腹痛、瘀傷和便秘等。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，當(dāng)歸和它的主要成分當(dāng)歸多糖、阿魏酸等不光是能夠提高機(jī)體的非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫等，還可能誘生細(xì)胞因子。據(jù)報(bào)道，當(dāng)歸水提物可以促進(jìn)人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞增殖。而與此相反，當(dāng)歸油卻能夠明顯地減少人前列腺癌PC3細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞。枸杞是茄科(枸杞科)的一種植物，它的果實(shí)被叫作枸杞子，嫩葉被稱為枸杞頭。枸杞子體積較小，也因此服用較為方便，不僅可以入藥和嚼服，還可以泡酒，效果各有不同，也因人而異。但有一點(diǎn)需要謹(jǐn)記，外感熱，脾虛濕熱及腹瀉不可多服或禁服。在中醫(yī)領(lǐng)域內(nèi)，被經(jīng)常用來治療患有肝腎陰虛，腰膝酸軟，頭暈，健忘，眼昏花多淚和遺精等病癥的病人。當(dāng)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明枸杞子不單可以調(diào)理機(jī)體的免疫功用，明顯地抑制腫瘤生長和細(xì)胞突變，還能夠延緩衰老，抗脂肪肝等，并且已有個(gè)別功用被應(yīng)用于臨床。枸杞中的黃酮類化合物就對癌癥和腫瘤等疾病有相對明顯的治療效果，況且已經(jīng)有不少實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，而且還是通過不同機(jī)制表現(xiàn)出來的，比如：抑制雌激素的合成與轉(zhuǎn)化、抑制對ER的激活、抑制雌激素介導(dǎo)的DNA損傷等。材料與方法材料中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫（HYPERLINK"/tcmsp.php）；UniProt"/tcmsp.php）；UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(HYPERLINK");swisstargetprediction（http;//www.swisstargetprediction.ch/）;string數(shù)據(jù)庫（/Version%2010.5);Cytoscape3.6.0");swisstargetprediction（http;//www.swisstargetprediction.ch/）;string數(shù)據(jù)庫（/Version10.5);Cytoscape3.6.0軟件;David數(shù)據(jù)庫（/home.jsp)當(dāng)歸—枸杞藥對活性成分的篩選操縱中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP)，然后收集整理“當(dāng)歸—枸杞”藥對中的所有化學(xué)因素，并依據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18選出當(dāng)歸和枸杞中的活性成分。候選化合物靶點(diǎn)的預(yù)測通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將TCMSP挑選出的目標(biāo)蛋白名轉(zhuǎn)化為基因名，并找出其對應(yīng)的UniprotID，最后進(jìn)行匯總并整理。靶點(diǎn)蛋白的補(bǔ)充從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）的候選化合物的“PubchemCid”中進(jìn)入，然后復(fù)制2.1.4“CanonicalSMILES”中的SMILES格式，將其粘貼到SwissTargetPrediction網(wǎng)站中，將“Organism（物種）”設(shè)置成“Homosapiens(智人)”,最后進(jìn)行預(yù)測靶點(diǎn)蛋白，將其與之前的基因匯總到一起，進(jìn)行收集整理。網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析將從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）和SwissTargetPrediction網(wǎng)站中收集到的基因名進(jìn)行查重，得到潛在靶點(diǎn)。將其導(dǎo)入String網(wǎng)站中，把Organism設(shè)置成“Homosapiens”，會(huì)得到“當(dāng)歸—枸杞”藥對中的“活性成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型圖。然后將其以TSV格式通過excel導(dǎo)出后帶入Cytoscape3.6.0軟件中，并利用NetworkAnalyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，繪制網(wǎng)絡(luò)圖。會(huì)得到有關(guān)BetweennessCentrality(介數(shù))和Degree（度值）的一張表，將BetweennessCentrality和Degree中的數(shù)據(jù)選取高于平均值以上，并將其對應(yīng)的基因摘取出來，找出相應(yīng)的UniprotID，便得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。靶標(biāo)的GO富集分析及KEGG通路分析將從“1.5”中得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)UniprotID導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫功能注釋工具中，“SelectIdentifier”設(shè)置為“UNIPROTACCESSION”,并將“ListType”設(shè)置為”GeneList”,然后進(jìn)行分析。進(jìn)入FunctionalAnnotationTool選項(xiàng)的FunctionalAnnotationChart，下載“GeneOntology”中的生物過程（biologicalprocess）,分子功能（molecularfunction）和細(xì)胞組成(cellularcomponent)三項(xiàng)進(jìn)行GO富集分析，并下載“Pathways”中的KEGG_PATHWAYS進(jìn)行KEGG通路分析。預(yù)測目標(biāo)疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)的UniprotID導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫功能注釋工具中，操作進(jìn)入AnnotationSummaryResults界面后，同時(shí)操作“Disease”中的GAD_DISEASE和OMIM_DISEASE,然后進(jìn)入FunctionalAnnotationChart。下載后導(dǎo)入excel中，再根據(jù)其Pvalue值選擇最小值所對應(yīng)的疾病，即為其預(yù)測的疾病。.結(jié)果“當(dāng)歸—枸杞”藥對中活性化合物的篩選利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別以中藥“當(dāng)歸”，“枸杞”為“Herbname”搜索“當(dāng)歸—枸杞”中的所有化學(xué)成分，共得到313個(gè)化學(xué)成分，其中當(dāng)歸有125個(gè)，枸杞有188個(gè)。當(dāng)結(jié)合閾值篩選后(OB≥30%且DL≥0.18)，共得到47個(gè)活性成分，其中當(dāng)歸有2個(gè)，枸杞有45個(gè)。結(jié)果見表1。對篩選后的化合物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸的主要活性成分為β-谷甾醇和豆甾醇。表1當(dāng)歸,枸杞中47個(gè)活性化合物的基本信息分子ID分子名稱口服利用度/%類藥比藥材歸屬M(fèi)OL000358Beta-sitosterol36.910.75當(dāng)歸MOL000449Stigmasterol43.830.76當(dāng)歸MOL001323Sitosterol-alpha143.280.78枸杞MOL003578Cycloartenol38.690.78枸杞MOL001494Mandenol42.000.19枸杞MOL001495Ethyllinolenate46.100.20枸杞MOL001979LAN42.120.75枸杞MOL000449Stigmasterol43.830.76枸杞MOL000358beta-sitosterol36.910.75枸杞MOL005406atropine45.970.19枸杞MOL005438campesterol37.580.71枸杞MOL006209cyanin47.420.76枸杞MOL00744924-methylidenelophenol44.190.75枸杞MOL008173daucosterol_qt36.910.75枸杞MOL008400glycitein50.480.24枸杞MOL010234delta-Carotene31.800.55枸杞MOL000953CLR37.870.68枸杞MOL00960414b-pregnane34.780.34枸杞MOL009612(24R)-4alpha-Methyl-24-ethylcholesta-7,25-dien-3beta-ylacetate46.360.84枸杞MOL00961524-Methylenecycloartan-3beta,21-diol37.320.80枸杞MOL00961724-ethylcholest-22-enol37.090.75枸杞MOL00961824-ethylcholesta-5,22-dienol43.830.76枸杞MOL00962024-methyl-31-norlanost-9(11)-enol38.000.75枸杞MOL00962124-methylenelanost-8-enol42.370.77枸杞MOL009622Fucosterol43.780.76枸杞MOL00963131-Norcyclolaudenol38.680,81枸杞MOL00963331-norlanost-9(11)-enol38.350.72枸杞MOL00963431-norlanosterol42.200.73枸杞MOL0096354,24-methyllophenol37.830.75枸杞MOL009639Lophenol38.130.71枸杞MOL0096404alpha,14alpha,24-trimethylcholesta-8,24-dienol38.910.76枸杞MOL0096414alpha,24-dimethylcholesta-7,24-dienol42.650.75枸杞MOL0096424alpha-methyl-24-ethylcholesta-7,24-dienol42.300.78枸杞MOL0096446-Fluoroindole-7-Dehydrocholesterol43.730.72枸杞MOL0096467-O-Methylluteolin-6-C-beta-glucoside_qt40.770.30枸杞MOL009650Atropine42.160.19枸杞MOL009651Cryptoxanthinmonoepoxide46.950.56枸杞MOL009653Cycloeucalenol39.730.79枸杞ML009656(E,E)-1-ethyloctadeca-3,13-dienoate42.000.19枸杞MOL009660methyl(1R,4aS,7R,7aS)-4a,7-dihydroxy-7-methyl-1-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-1,5,6,7a-tetrahydrocyclopenta[d]pyran-4-carboxylate39.430.47枸杞MOL009662LantadeneA38.680.57枸杞MOL009664PhysalinA91.710.27枸杞MOL009665Physcion-8-O-beta-D-gentiobioside43.900.62枸杞MOL009677lanost-8-en-3beta-ol34.230.74枸杞MOL009678lanost-8-enol34.230.74枸杞MOL009681Obtusifolio42.550.76枸杞MOL000098quercetin46.430.28枸杞“活性成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析從TCMSP數(shù)據(jù)庫整理得到的有關(guān)“當(dāng)歸—枸杞”藥對的靶點(diǎn)基因總共有476個(gè)，其中當(dāng)歸有68個(gè)，枸杞有408個(gè)。將“當(dāng)歸—枸杞”藥對的Smiles格式上傳到SwissTargetPrediction網(wǎng)站，會(huì)得到338個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，其中當(dāng)歸有31個(gè)，枸杞有307個(gè)。對匯總到一起的靶點(diǎn)基因進(jìn)行查重后，得到311個(gè)靶點(diǎn)基因，其中當(dāng)歸有57個(gè)，枸杞有254個(gè)，兩種藥物的共同靶點(diǎn)有52個(gè)。這表明當(dāng)歸和枸杞在治療疾病的過程中既有自己的單獨(dú)作用靶點(diǎn)，又有共同的作用靶點(diǎn)，兩藥可協(xié)同發(fā)揮治療作用。利用String網(wǎng)站對查重后的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，會(huì)得到有關(guān)“當(dāng)歸—枸杞”藥對的“活性成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型圖（圖1）。分析其網(wǎng)絡(luò)模型圖，發(fā)現(xiàn)有252個(gè)節(jié)點(diǎn)，996條邊。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（node）表示“當(dāng)歸—枸杞”藥對中的藥物活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)基因；網(wǎng)絡(luò)中的邊(edge)用來表示單位藥與活性成分以及活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。圖1PPI網(wǎng)絡(luò)圖選取degree，betweenness值均在其平均值之上者42個(gè)，作為關(guān)鍵靶標(biāo)，如圖2所示。其中，degree值在前五名的靶點(diǎn)基因分別為：MAPK1，JUN，TP53，AKT1，TNF，表明這些基因在網(wǎng)絡(luò)中具有重要的位置，可作為“當(dāng)歸—枸杞”藥對有效成分作用的靶點(diǎn)基因。研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK1)在胃癌中的表達(dá)率約為74.1%,且根據(jù)其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05可知，其表達(dá)率的高低與年齡和性別均無關(guān)。但在胃癌的不同發(fā)展階段，MAPK1的表達(dá)率會(huì)發(fā)生變化,且MAPK1對宮頸癌也有一定的抑制作用。JUN的水平與多種癌癥、腫瘤都有密不可分的關(guān)系，比如肝癌、胃癌和宮頸癌等，也對宮頸癌、卵巢癌等多種婦女惡性腫瘤中的細(xì)胞癌變有關(guān)。TP53作為一種抑制癌癥的基因，在多種癌癥的早期階段出現(xiàn)，所以被人們認(rèn)為是癌癥、腫瘤的一個(gè)“信號(hào)”。TNF-α是人們目前發(fā)現(xiàn)的少數(shù)既具有抗癌作用又具有促癌作用的細(xì)胞因子，它的抗腫瘤作用是通過多個(gè)方面來實(shí)現(xiàn)的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的就有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和干擾血管功能這三條。但TNF-α的促腫瘤作用其具體機(jī)制還不是很清楚。圖242個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)GO分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行GO分析，包括BP(BiologicalProcess),CC(CellularComponent)和MF（MolecularFunction）分析。GOBP分析顯示有208條生物學(xué)過程與此有關(guān)，最顯著的5條分別為：positiveregulationoftranscriptionfromRNApolymeraseIIpromoter（RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的陽性調(diào)控），positiveregulationoftranscription,DNA-templated（轉(zhuǎn)錄的陽性調(diào)節(jié)，DNA模板），signaltransduction（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)），responsetodrug（對藥物的反應(yīng)），negativeregulationofapoptoticprocess（凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)）。GOCC分析顯示有26條細(xì)胞組成與此有關(guān)，最顯著的5條分別為：Nucleoplasm（核質(zhì)），cytoplasm(細(xì)胞質(zhì))，nucleus(核)，cytosol（胞質(zhì)溶膠），plasmamembrane（質(zhì)膜）。GOMF分析顯示有63條分子功能與此有關(guān)，最顯著的5條分別為:proteinbinding(蛋白質(zhì)結(jié)合)，enzymebinding(酶結(jié)合)，identicalproteinbinding（相同的蛋白質(zhì)結(jié)合），DNAbinding(DNA結(jié)合)，transcriptionfactoractivity,sequence-specificDNAbinding（轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合）。說明“當(dāng)歸—枸杞”藥對可以通過參與調(diào)控多種生物學(xué)過程而發(fā)揮治療過程。圖3GO分析KEGG通路分析可以運(yùn)用Omicshare數(shù)據(jù)庫中的高級(jí)氣泡圖技術(shù)，對KEGG進(jìn)行通路分析，前20條通路結(jié)果如下：圖4KEGG通路分析富集最顯著的5條通路為Salmonellainfection(沙門氏菌感染),Non-alcoholicfattyliverdisease（NAFLD）(非酒精性脂肪性肝病),Prolactinsignalingpathway（催乳素信號(hào)通路），InfluenzaA（甲型流感），Glioma（膠質(zhì)瘤）。從圖四可以看出，在與疾病類相關(guān)的37個(gè)基因中，有12個(gè)是與癌癥有關(guān)的，主要有Pathwaysincancer（癌癥的途徑）、Bladdercancer（膀胱癌）、Pancreaticcancer（胰腺癌）、Non-smallcelllungcancer（非小細(xì)胞肺癌）、Proteoglycansincancer（癌癥中的蛋白多糖）、Colorectalcancer（結(jié)直腸癌）、Cholinemetabolismincancer（癌癥中的膽堿代謝）、Endometrialcancer（子宮內(nèi)膜癌）等，可以推測“當(dāng)歸—枸杞”藥對在治療癌癥方面有一定的治療效果。與信號(hào)傳導(dǎo)功能相關(guān)的有TNFsignalingpathway（TNF信號(hào)通路）、Toll-likereceptorsignalingpathway（Toll樣受體信號(hào)通路）、hyroidhormonesignalingpathway（甲狀腺激素信號(hào)通路）、Calciumsignalingpathway（鈣信號(hào)途徑）等。已有相關(guān)研究表明，沙門氏菌在治療腫瘤的過程中發(fā)揮著載體的作用，這也為我們以后研究腫瘤提供了一個(gè)很有效的方向。而催乳素與乳腺癌也有著密不可分的關(guān)系，乳腺癌作為一種腫瘤，主要是依靠激素，而眾所周知內(nèi)分泌治療是針對激素型乳腺癌的一項(xiàng)重要技術(shù)，高催乳素的水準(zhǔn)能夠使女性患乳腺癌的可能性大大增加。相對于非激素型的乳腺癌，Gl