小RNA干擾對人絨癌細(xì)胞株JEG-3中Survivin基因表達(dá)的影響及機(jī)制研究一、引言1.1研究背景人絨癌，即絨毛膜癌，是一種主要發(fā)生于生育年齡女性的高度惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，發(fā)病率雖低，卻因其易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是肺轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者生命健康。若治療不當(dāng)，患者可在短時間內(nèi)迅速死亡。據(jù)相關(guān)臨床資料顯示，在未找到有效化療藥物之前，絨癌患者死亡率很高，主要依靠手術(shù)處理，但治療效果并不理想。隨著化療藥物的研發(fā)和推廣，多數(shù)絨癌患者通過規(guī)范化療可獲治愈，但仍有部分患者預(yù)后較差，尤其是晚期發(fā)現(xiàn)或?qū)熌退幍幕颊摺Ｈ私q癌的治療手段主要包括化療、手術(shù)和放療等?；熓瞧渲饕委煼绞?，然而，化療過程中常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，使得治療效果大打折扣。手術(shù)治療適用于特定情況，如病灶局限于子宮且無轉(zhuǎn)移的早期患者，但對于晚期已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)的局限性較大。放療則多作為輔助治療手段。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和方法，以提高人絨癌的治療效果，成為當(dāng)前亟待解決的問題。Survivin基因作為凋亡抑制蛋白家族的重要成員，具有獨(dú)特的生物學(xué)功能。它主要通過直接抑制caspase級聯(lián)反應(yīng)下游的終末子caspase-3和caspase-7的活性，從而發(fā)揮抗凋亡作用。同時，Survivin基因可加快腫瘤細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)換，并使腫瘤細(xì)胞在G2/M期逃避對凋亡的識別，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化。此外，Survivin基因還能通過血管形成因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血管生成素-1（Ang-1）和環(huán)氧化酶-2（COX-2），在血管形成的中間環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。在眾多腫瘤組織中，Survivin基因呈高表達(dá)狀態(tài)，而在正常成人組織中卻未見表達(dá)，這一特性使其成為腫瘤治療的理想分子標(biāo)靶。通過抑制Survivin基因的表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，為腫瘤治療開辟新途徑。小RNA干擾技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，具有高效性、特異性和長效性等顯著優(yōu)勢。它主要作用于mRNA，能夠特異性抑制靶基因的表達(dá)，且作用位點(diǎn)專一，通常不會影響正?；虻谋磉_(dá)。理論上，利用小RNA干擾技術(shù)幾乎能抑制體內(nèi)任何基因的表達(dá)，這使得它在腫瘤基因治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。通過設(shè)計并合成針對Survivin基因的小干擾RNA（siRNA），可實(shí)現(xiàn)對Survivin基因表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，為腫瘤治療提供新的策略和方法。綜上所述，鑒于人絨癌的嚴(yán)重危害和現(xiàn)有治療手段的局限性，以及Survivin基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用和小RNA干擾技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢，開展小RNA干擾人絨癌細(xì)胞株JEG-3的Survivin基因表達(dá)的研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值，有望為攻克人絨癌這一醫(yī)學(xué)難題提供新的思路和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在運(yùn)用小RNA干擾技術(shù)，深入探究Survivin基因?qū)θ私q癌細(xì)胞株JEG-3生物學(xué)行為的影響，為絨癌的治療提供堅實(shí)的理論依據(jù)和創(chuàng)新的治療策略。具體而言，本研究期望通過小RNA干擾技術(shù)，成功抑制人絨癌細(xì)胞株JEG-3中Survivin基因的表達(dá)，進(jìn)而觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的作用，從細(xì)胞水平揭示Survivin基因在絨癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。在理論層面，深入剖析Survivin基因在人絨癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，不僅有助于加深我們對絨癌發(fā)病機(jī)制的理解，還能為腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的研究提供新的視角和思路。作為凋亡抑制蛋白家族的關(guān)鍵成員，Survivin基因在腫瘤細(xì)胞的抗凋亡、增殖和血管生成等過程中發(fā)揮著核心作用。然而，其在人絨癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明晰，本研究將填補(bǔ)這一領(lǐng)域的部分空白，為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，本研究成果有望為絨癌的治療開辟新的途徑。目前，絨癌的治療主要依賴化療，但化療耐藥和復(fù)發(fā)問題嚴(yán)重制約了治療效果。通過小RNA干擾技術(shù)靶向抑制Survivin基因的表達(dá)，可能成為克服化療耐藥、提高治療效果的新策略。這一研究成果不僅可以為絨癌患者提供更有效的治療手段，還可能為其他腫瘤的治療提供借鑒，推動腫瘤基因治療技術(shù)的發(fā)展，具有重要的臨床價值和社會意義。1.3研究創(chuàng)新點(diǎn)本研究具有多維度的創(chuàng)新特性。在研究方法上，將小RNA干擾技術(shù)與對人絨癌細(xì)胞株JEG-3中Survivin基因的研究相結(jié)合，為絨癌基因治療研究提供了新的技術(shù)手段和研究思路。小RNA干擾技術(shù)具有高效性、特異性和長效性，能夠精準(zhǔn)地抑制靶基因表達(dá)，這種精準(zhǔn)調(diào)控的方式為深入研究Survivin基因功能及絨癌發(fā)病機(jī)制開辟了新路徑。在研究內(nèi)容層面，本研究并非僅停留在觀察小RNA干擾對Survivin基因表達(dá)的影響，而是進(jìn)一步從多個層面分析其對人絨癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。通過檢測細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等多個指標(biāo)，全面深入地探討Survivin基因在絨癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，這在以往的研究中較少見。這種多層面、系統(tǒng)性的研究有助于更全面地揭示絨癌的發(fā)病機(jī)制，為后續(xù)治療方案的制定提供更豐富、更全面的理論依據(jù)。此外，本研究還關(guān)注到Survivin基因與其他基因通路的潛在聯(lián)系，嘗試從基因網(wǎng)絡(luò)的角度解析絨癌的發(fā)病機(jī)制。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及多個基因和信號通路的相互作用。通過研究Survivin基因與其他基因通路的關(guān)聯(lián)，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略，為絨癌的綜合治療提供新的方向。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1人絨癌細(xì)胞株JEG-3概述人絨癌細(xì)胞株JEG-3是研究絨癌的重要細(xì)胞模型，其來源具有獨(dú)特性。1968年，JEG-3細(xì)胞首次從一位患有絨毛膜癌的患者體內(nèi)分離獲得，該患者的腫瘤組織成為了JEG-3細(xì)胞的最初來源。這種直接從腫瘤組織獲取的方式，使得JEG-3細(xì)胞保留了絨癌細(xì)胞的許多生物學(xué)特性，為研究絨癌的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了寶貴的實(shí)驗材料。JEG-3細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多邊形或立方形，邊界清晰，細(xì)胞間連接緊密。在生長特性方面，JEG-3細(xì)胞為貼壁生長，對培養(yǎng)環(huán)境有一定要求。其適宜的生長環(huán)境為：使用含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、1%雙抗的MEM培養(yǎng)基（添加NaHCO?1.5g/L，SodiumPyruvate0.11g/L），培養(yǎng)條件為氣相中空氣占95%、二氧化碳占5%，溫度維持在37℃，培養(yǎng)箱濕度保持在70%-80%。在這樣的環(huán)境下，JEG-3細(xì)胞能夠保持良好的生長狀態(tài)，進(jìn)行正常的代謝和增殖活動。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，就需要進(jìn)行傳代處理，以保證細(xì)胞的生長活力和正常的生物學(xué)特性。傳代時，通常采用1:2至1:3的比例，每周進(jìn)行2-3次傳代。從染色體特征來看，JEG-3細(xì)胞是一株超三倍體人類細(xì)胞株，其典型染色體數(shù)為71，發(fā)生率為34%，多倍體率為2.6%。細(xì)胞中存在多種染色體異常，如t(4;11)(p15;q13)、i(13q)、t(10p15q)、del(18)(q21)等，這些染色體異常與絨癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程，為研究絨癌的遺傳學(xué)機(jī)制提供了重要線索。在實(shí)際應(yīng)用中，JEG-3細(xì)胞株在絨癌研究領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。由于其具有絨癌細(xì)胞的典型特征，能夠模擬絨癌在體內(nèi)的生長和發(fā)展過程，科研人員可以通過對JEG-3細(xì)胞的研究，深入探究絨癌的發(fā)病機(jī)制。例如，通過觀察JEG-3細(xì)胞在不同條件下的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，分析相關(guān)基因和信號通路的變化，從而揭示絨癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。同時，JEG-3細(xì)胞也可用于抗癌藥物的篩選和研發(fā)，評估藥物對絨癌細(xì)胞的作用效果，為臨床治療提供理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。此外，JEG-3細(xì)胞還可用于研究絨癌的耐藥機(jī)制，為克服化療耐藥提供新的思路和方法?？傊?，JEG-3細(xì)胞株作為絨癌研究的重要工具，為攻克絨癌這一醫(yī)學(xué)難題做出了重要貢獻(xiàn)。2.2Survivin基因相關(guān)理論Survivin基因是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中的關(guān)鍵成員，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。1997年，AMBROSINI等人利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1（EPR-1）cDNA在人類基因組文庫的雜交篩選中首次成功分離出Survivin基因，由于其具有延長細(xì)胞生存的作用，故而又被稱為生存素或存活素。該基因全長15KB，定位于17q25，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子。Survivin基因編碼產(chǎn)生的蛋白由142個氨基酸組成，分子量為16.2KD，人鼠蛋白同源性達(dá)到84.3%。與IAP家族的其他成員相比，Survivin的結(jié)構(gòu)較為特殊。IAP家族的一般成員通常含有2-3個串聯(lián)的、包含半胱氨酸/組氨酸共有序列的70個氨基酸組成的桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)系列（BIR）分子，以及羧基末端的環(huán)指結(jié)構(gòu)，其中BIR分子在抗凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。而Survivin僅含有一個單一的BIR功能區(qū)，并且由Cys46-Pro47-Thr483個氨基酸插入序列將其分為兩半，其羧基端不含環(huán)指結(jié)構(gòu)，代之以交織螺旋結(jié)構(gòu)（coiled-coil），這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其區(qū)別于其他IAP家族成員。Survivin的表達(dá)具有明顯的細(xì)胞周期依賴性。1998年，Li等人用細(xì)胞分裂阻斷劑將細(xì)胞分別阻斷在G1、S、G2/M期，檢測細(xì)胞內(nèi)源性SurvivinmRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Survivin在G1期幾乎不表達(dá)，在S期表達(dá)量增加6倍，而在G2/M期表達(dá)量增加40倍。這表明Survivin主要在G2/M期表達(dá)，是細(xì)胞周期G2/M期的重要調(diào)節(jié)基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Survivin基因啟動子序列中存在3個細(xì)胞周期依賴因子（CDE）和一個細(xì)胞周期同源性區(qū)域（CHR），CDE和CHR作為G1期抑制元件，能夠調(diào)節(jié)G2/M期基因表達(dá)的半衰期，從而使Survivin特異地在G2/M期表達(dá)。在組織分布方面，Survivin具有顯著的選擇性。它主要表達(dá)于胚胎、發(fā)育的胎兒組織以及大多數(shù)腫瘤組織中，而在分化成熟的正常組織中幾乎檢測不到表達(dá)。這種特殊的組織分布模式暗示著Survivin在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。Survivin存在兩種不同的亞細(xì)胞定位，即定位于細(xì)胞核或/和細(xì)胞漿中。這種不同的分布是由其轉(zhuǎn)錄后修飾的差異引起的，也解釋了在不同腫瘤中Survivin定位不同的現(xiàn)象。胞漿中的Survivin與間期微管、中期和晚期中心體、紡錘體兩極以及有絲分裂紡錘體微管密切相關(guān)。兩種定位不同的Survivin免疫反應(yīng)性各異，在細(xì)胞周期中受到獨(dú)立調(diào)節(jié)。Survivin被P34-cyclinB磷酸化被認(rèn)為是抑制凋亡的首要條件，只有胞漿中的Survivin與P34相關(guān)，且只有當(dāng)Survivin位于存在caspases的胞漿中時，才能有效阻斷凋亡。一個不能被磷酸化的Survivin不僅會擾亂細(xì)胞分化，還會通過底物競爭的方式誘導(dǎo)凋亡，這表明胞漿中和胞核中的Survivin可能具有不同的預(yù)后意義。Survivin前體mRNA通過選擇性剪接可產(chǎn)生多種不同的剪接異構(gòu)體。1999年，Mahotka等人首先在腎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了2個Survivin異構(gòu)體，即Survivin-Ex3和Survivin-ZB。Survivin-Ex3序列中缺少外顯子3，具有抗凋亡活性，而Survivin-ZB則將內(nèi)含子作為隱蔽的外顯子，不具備抗凋亡活性，反而可作為天然存在的Survivin拮抗劑。在胃癌、腎癌組織中均發(fā)現(xiàn)了Survivin-Ex3和Survivin-ZB，且前者的抗凋亡作用明顯強(qiáng)于后者。在胃癌中，Survivin-Ex3的表達(dá)水平不隨臨床分期改變，而Survivin-ZB的表達(dá)水平則隨分期的增加而降低。Conway等人在人的組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了3個Survivin剪接異構(gòu)體，分別為Survivin-140、Survivin-128和Survivin-40。這3種異構(gòu)體均表達(dá)于胚胎組織，而在胸腺和睪丸內(nèi)只有Survivin-140呈高水平表達(dá)，Survivin-40在分化成熟的組織內(nèi)未見表達(dá)。只有包含BIR結(jié)構(gòu)的Survivin-140、Survivin-128具有抑制caspase的功能。Survivin在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色，其作用機(jī)制主要體現(xiàn)在多個方面。在抗凋亡方面，研究表明，大多數(shù)凋亡信號所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡都是通過效應(yīng)性蛋白酶caspase來實(shí)現(xiàn)的，其中caspase-3是由Fas基因介導(dǎo)細(xì)胞死亡的基本死亡因子，為關(guān)鍵效應(yīng)性蛋白酶。當(dāng)caspase-3與線粒體上的p21waf1/cip1或IAP結(jié)合后，會在細(xì)胞內(nèi)失活。Suzuki等人的研究發(fā)現(xiàn)，在Fas基因和細(xì)胞增殖刺激下，Survivin進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白CDK4結(jié)合，導(dǎo)致CDK2/CyclinE激活和Rb磷酸化，從而促進(jìn)DNA復(fù)制，縮短G1/S期進(jìn)程。此外，Survivin/CDK4復(fù)合物的形成，使p21waf1/cip1從與CDK4結(jié)合的復(fù)合物中釋放出來，與線粒體procaspase-3相互作用，啟動caspase-3的滅活，進(jìn)而抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Survivin還是p34cdc2周期素B1的有絲分裂底物，Survivin在Thr34上的磷酸化是細(xì)胞分裂時保證細(xì)胞活力所必需的。通過這些機(jī)制，Survivin有效地抑制了細(xì)胞凋亡，為腫瘤細(xì)胞的存活和增殖提供了有利條件。在細(xì)胞增殖方面，Survivin通過細(xì)胞周期依賴性表達(dá)，能夠?qū)笹2/M期凋亡的誘導(dǎo)，在腫瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)可使其克服凋亡關(guān)卡，通過有絲分裂促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的異常增殖。腫瘤的形成和發(fā)展是一個涉及多步驟、多階段的復(fù)雜過程，其中Survivin的異常表達(dá)打破了細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，使得腫瘤細(xì)胞能夠不斷增殖，促進(jìn)了腫瘤的生長和發(fā)展。在血管生成方面，血管的形成過程受到多種因子的精細(xì)調(diào)控，這些因子按功能可分為血管生成刺激因子和血管生成抑制因子。Survivin主要通過影響血管生成刺激因子來促進(jìn)血管的形成。例如，在腫瘤血管生成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可誘導(dǎo)和促進(jìn)Survivin的高度表達(dá)，而高度表達(dá)的Survivin又能抑制各種指向caspases的凋亡機(jī)制，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞逃避凋亡。向內(nèi)皮細(xì)胞中導(dǎo)入靶向Survivin的反義寡核苷酸，可使VEGF的促內(nèi)皮細(xì)胞功能受到抑制，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管的形成，最終導(dǎo)致腫瘤生長受到抑制。這表明VEGF與Survivin之間存在著相互促進(jìn)的關(guān)系，共同促進(jìn)了腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）作為成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員，不僅能直接促進(jìn)細(xì)胞增殖，還是腫瘤血管生成中不可或缺的生長因子，它與VEGF具有協(xié)同作用。bFGF可通過激活PI3K/Akt途徑上調(diào)Survivin的表達(dá)，從而保護(hù)微管網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生長和穩(wěn)定，有利于腫瘤的生長和侵襲。血管生成素（Ang）是一組分泌型細(xì)胞因子，包括Ang1、Ang2等。Ang1和Ang2能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Survivin上調(diào)，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖和腫瘤血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移。Ang1的作用依賴于Survivin的表達(dá)上調(diào)，這種被Survivin介導(dǎo)的途徑可以促進(jìn)Ang1固定血管結(jié)構(gòu)。Ang2則通過Survivin抑制caspase3來調(diào)節(jié)腫瘤血管生成。通過這些與血管生成相關(guān)的作用，Survivin為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供了必要的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，進(jìn)一步推動了腫瘤的發(fā)展。在絨癌研究領(lǐng)域，Survivin基因同樣受到了廣泛關(guān)注。妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，病死率高，尤其是絨毛膜癌，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移。Survivin在絨毛膜癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)與絨癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。通過應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞中Survivin基因的表達(dá)，能夠有效檢測沉默Survivin基因后JEG-3細(xì)胞的增殖及凋亡情況，為絨毛膜癌的基因治療提供了重要的理論依據(jù)。相關(guān)研究表明，抑制Survivin基因表達(dá)后，絨癌細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，凋亡率顯著增加，侵襲和轉(zhuǎn)移能力也有所下降。這進(jìn)一步證實(shí)了Survivin基因在絨癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，也為以Survivin基因為靶點(diǎn)的絨癌治療策略提供了有力的實(shí)驗支持。然而，目前對于Survivin基因在絨癌中的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究，其與其他基因和信號通路之間的相互作用關(guān)系也需要更多的探索，以全面揭示絨癌的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供更有效的靶點(diǎn)和策略。2.3小RNA干擾技術(shù)原理與應(yīng)用小RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的、高度保守的、序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，在生物體內(nèi)廣泛存在。其作用機(jī)制主要包括起始階段、效應(yīng)階段和級聯(lián)放大階段。在起始階段，細(xì)胞內(nèi)的dsRNA可以通過多種途徑產(chǎn)生，如RNA病毒入侵、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄等。這些dsRNA會被一種雙鏈RNA酶III型內(nèi)切酶，即Dicer酶識別并切割成21-23nt的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA具有特殊的結(jié)構(gòu)，其3端帶有2個堿基突出的黏性末端，5端為磷酸基團(tuán)，這種結(jié)構(gòu)對于siRNA行使其功能至關(guān)重要。在效應(yīng)階段，siRNA與多種蛋白，包括核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶、解旋酶以及輔助識別同源序列蛋白等結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。RISC中的解旋酶會使siRNA的雙鏈解開，其中的反義鏈與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，而正義鏈則被置換出來。隨后，RISC復(fù)合物中的核酸酶（可能是Dicer酶）會在靶mRNA與siRNA結(jié)合區(qū)域的中間將其切斷，從而實(shí)現(xiàn)對靶mRNA的降解。在級聯(lián)放大階段，以被切斷的mRNA為模板，在RNA依賴性RNA聚合酶的作用下，以siRNA為引物，擴(kuò)增產(chǎn)生更多的dsRNA。這些新產(chǎn)生的dsRNA又會被Dicer酶切割成siRNA，繼續(xù)參與RISC的形成和對靶mRNA的降解，從而形成一個級聯(lián)放大效應(yīng)，使相對少量的dsRNA分子就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)。小RNA干擾技術(shù)具有多個顯著特點(diǎn)。高特異性是其重要特性之一，RNAi能夠特異性地識別并降解與dsRNA序列同源的mRNA，避免對其他基因的干擾。研究表明，19nt的dsRNA幾乎可以完全抑制基因的表達(dá)，而其中只要有1nt發(fā)生突變，它對基因的抑制作用就會消失。這種高度的序列特異性使得RNAi能夠精確地沉默目的基因，為基因功能研究和疾病治療提供了有力的工具。高效性也是小RNA干擾技術(shù)的突出優(yōu)勢。由于存在級聯(lián)放大效應(yīng)，每個細(xì)胞僅需幾分子siRNA就可產(chǎn)生RNAi效應(yīng)。Dicer酶切產(chǎn)生的siRNA與同源mRNA結(jié)合并降解后者后，會產(chǎn)生新的siRNA，新產(chǎn)生的siRNA又可再次與Dicer酶形成RISC復(fù)合體，介導(dǎo)新一輪的同源mRNA降解。如此循環(huán)，使得RNAi效應(yīng)能夠得到顯著放大，即使是相對少量的dsRNA分子，也能產(chǎn)生強(qiáng)烈的基因沉默效果。此外，小RNA干擾技術(shù)還具有操作簡便、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。相較于傳統(tǒng)的基因剔除技術(shù)，RNAi技術(shù)不需要進(jìn)行復(fù)雜的基因敲除操作，只需要設(shè)計并合成針對靶基因的siRNA，然后將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的抑制。這種操作方法相對簡單，成本也較低，使得RNAi技術(shù)在科研和臨床應(yīng)用中具有更廣泛的適用性。在腫瘤研究領(lǐng)域，小RNA干擾技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，為腫瘤的診斷和治療提供了新的思路和方法。在腫瘤基因功能研究方面，RNAi技術(shù)可以幫助科研人員深入了解腫瘤相關(guān)基因的功能和作用機(jī)制。通過特異性地抑制腫瘤細(xì)胞中某些關(guān)鍵基因的表達(dá)，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，從而揭示這些基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。例如，通過RNAi技術(shù)抑制腫瘤細(xì)胞中癌基因的表達(dá)，可以觀察到腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力受到抑制，從而明確癌基因在腫瘤發(fā)展中的關(guān)鍵作用。在腫瘤治療方面，RNAi技術(shù)可以作為一種潛在的治療手段，用于靶向抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展往往與多種基因的異常表達(dá)密切相關(guān)，如癌基因的激活、抑癌基因的失活以及抗凋亡基因的高表達(dá)等。通過RNAi技術(shù)，可以特異性地沉默這些異常表達(dá)的基因，恢復(fù)細(xì)胞的正常生物學(xué)功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。針對腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的抗凋亡基因Survivin，利用RNAi技術(shù)抑制其表達(dá)，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療和放療的敏感性。研究表明，將靶向Survivin基因的siRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，Survivin基因的表達(dá)水平明顯降低，腫瘤細(xì)胞的凋亡率顯著增加，同時對化療藥物的敏感性也有所提高。小RNA干擾技術(shù)還可以與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用，提高腫瘤治療的效果。與化療藥物聯(lián)合使用時，RNAi技術(shù)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，減少化療藥物的用量和副作用。通過RNAi技術(shù)抑制腫瘤細(xì)胞中的耐藥相關(guān)基因，使腫瘤細(xì)胞對化療藥物的攝取增加，從而提高化療的療效。與放療聯(lián)合應(yīng)用時，RNAi技術(shù)可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，增強(qiáng)放療對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。在本研究中，小RNA干擾技術(shù)將發(fā)揮關(guān)鍵作用。針對人絨癌細(xì)胞株JEG-3中的Survivin基因，設(shè)計并合成特異性的siRNA，利用RNAi技術(shù)抑制Survivin基因的表達(dá)。通過檢測Survivin基因表達(dá)被抑制后，JEG-3細(xì)胞在增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為方面的變化，深入探究Survivin基因在絨癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。這不僅有助于揭示絨癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為絨癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。通過小RNA干擾技術(shù)抑制Survivin基因表達(dá)后，觀察JEG-3細(xì)胞的凋亡情況，若細(xì)胞凋亡率明顯增加，則表明Survivin基因在維持絨癌細(xì)胞存活方面發(fā)揮著重要作用，抑制其表達(dá)可能成為促進(jìn)絨癌細(xì)胞凋亡的有效手段。同時，檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到抑制，則說明Survivin基因可能參與調(diào)控絨癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，為絨癌的轉(zhuǎn)移防治提供理論依據(jù)。三、小RNA干擾對JEG-3細(xì)胞Survivin基因表達(dá)影響的實(shí)驗設(shè)計3.1實(shí)驗材料準(zhǔn)備本實(shí)驗選用人絨癌細(xì)胞株JEG-3作為研究對象，該細(xì)胞株購自上海昆盟生物科技有限公司，其貨號為KMCC-001-0441。JEG-3細(xì)胞來源于胎盤病變的絨毛膜癌組織，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長特性。在實(shí)驗前，將細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS，購自Gibco公司，貨號10099141C）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，購自Solarbio公司，貨號P1400）的MEM培養(yǎng)基（購自Gibco公司，貨號41500034，添加NaHCO?1.5g/L，SodiumPyruvate0.11g/L）中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱濕度保持在70%-80%。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，采用0.25%胰蛋白酶（購自Solarbio公司，貨號T1300）進(jìn)行消化傳代，傳代比例為1:2至1:3，每周傳代2-3次。針對Survivin基因設(shè)計并合成小干擾RNA（siRNA），由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。根據(jù)Survivin基因的mRNA序列（GenBank登錄號：NM_001168.2），利用在線設(shè)計軟件設(shè)計3條特異性siRNA序列，同時設(shè)計1條陰性對照siRNA序列，其堿基序列與任何已知基因均無同源性。3條特異性siRNA序列分別為：siRNA-1（正義鏈：5'-GGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAAC-3'，反義鏈：5'-GTTCTTGAATGTAGAGATGCGGTGGTC-3'）；siRNA-2（正義鏈：5'-ACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAA-3'，反義鏈：5'-TTTGTTCTTGGCTCTTTCTCTGT-3'）；siRNA-3（正義鏈：5'-AATTTGAGGAAACTGCGGAGA-3'，反義鏈：5'-TCTCCGCAGTTTCCTCAATTT-3'）。陰性對照siRNA序列為：5'-TATGAGAATGGCAGCGAGATA-3'。將合成的siRNA溶解于RNase-free水，配制成20μM的儲存液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗中使用的主要試劑包括：Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（購自Invitrogen公司，貨號L3000015），用于將siRNA轉(zhuǎn)染至JEG-3細(xì)胞；TRIzol試劑（購自Invitrogen公司，貨號15596026），用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自TaKaRa公司，貨號RR047A），用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（購自TaKaRa公司，貨號RR420A），用于實(shí)時熒光定量PCR檢測基因表達(dá)水平；蛋白裂解液（購自Beyotime公司，貨號P0013B），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（購自Beyotime公司，貨號P0012S），用于測定蛋白濃度；兔抗人Survivin多克隆抗體（購自Abcam公司，貨號ab76424），用于檢測Survivin蛋白表達(dá)；鼠抗人β-actin單克隆抗體（購自Sigma公司，貨號A5441），作為內(nèi)參抗體；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（購自JacksonImmunoResearch公司，貨號111-035-144）和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（購自JacksonImmunoResearch公司，貨號115-035-146），用于Westernblot檢測。實(shí)驗所需的主要儀器設(shè)備有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，型號3111），為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號SW-CJ-2FD），用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗操作，保證實(shí)驗環(huán)境的無菌；倒置顯微鏡（Olympus公司，型號CKX41），用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，型號5424R），用于細(xì)胞和試劑的離心分離；PCR儀（Bio-Rad公司，型號C1000Touch），進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；實(shí)時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，型號CFX96Touch），檢測基因表達(dá)水平；電泳儀（Bio-Rad公司，型號PowerPacBasic）和垂直電泳槽（Bio-Rad公司，型號Mini-PROTEANTetraCell），用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離；半干轉(zhuǎn)印儀（Bio-Rad公司，型號Trans-BlotSDSemi-DryTransferCell），將電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，型號ChemiDocMP），檢測Westernblot結(jié)果。3.2實(shí)驗方法與步驟3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人絨癌細(xì)胞株JEG-3復(fù)蘇后，接種于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、1%雙抗的MEM培養(yǎng)基（添加NaHCO?1.5g/L，SodiumPyruvate0.11g/L）中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱濕度保持在70%-80%。待細(xì)胞貼壁生長至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，傳代比例為1:2至1:3，每周傳代2-3次。在轉(zhuǎn)染前1天，將JEG-3細(xì)胞以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時達(dá)到30%-50%的融合度。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將2μLLipofectamine3000試劑加入到100μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5min。同時，將20pmol的siRNA（包括3條特異性siRNA和1條陰性對照siRNA）加入到100μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。將上述兩種混合液混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入800μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，然后將siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。3.2.2檢測指標(biāo)與方法（1）實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測Survivin基因mRNA表達(dá)水平轉(zhuǎn)染后48h，采用TRIzol試劑提取各組JEG-3細(xì)胞的總RNA。具體操作如下：將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入1mLTRIzol試劑，吹打均勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2mL***仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000rpm離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃、12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌2次，每次4℃、7500rpm離心5min。棄上清，室溫晾干RNA沉淀，加入20μLDEPC水溶解RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)體系如下：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Oligo(dT)Primer1μL，Random6mers1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。Survivin基因引物序列為：上游引物5'-CCGCTGCTGCTGCTGATG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，擴(kuò)增片段長度為150bp；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，擴(kuò)增片段長度為200bp。反應(yīng)體系如下：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上游引物（10μM）0.5μL，下游引物（10μM）0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，采用2^(-ΔΔCt)法計算Survivin基因mRNA的相對表達(dá)量。（2）蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測Survivin蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)染后48h，棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次。每孔加入150μLRIPA蛋白裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，期間用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液即為總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。制備12%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為30μg，同時上樣預(yù)染蛋白Marker。在80V電壓下電泳30min，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)接近膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用半干轉(zhuǎn)印法，轉(zhuǎn)印條件為15V、20min。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將封閉后的PVDF膜放入兔抗人Survivin多克隆抗體（1:1000稀釋，用5%BSA-TBST配制）中，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋，用5%BSA-TBST配制）中，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物中，孵育1-2min，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析Survivin蛋白的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算Survivin蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，以表示Survivin蛋白的相對表達(dá)量。（3）免疫熒光檢測Survivin蛋白的細(xì)胞定位在轉(zhuǎn)染前1天，將無菌蓋玻片放入24孔板中，然后將JEG-3細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入500μL含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次。用4%多聚甲醛（用PBS配制）室溫固定細(xì)胞15min，然后用PBS清洗3次。用0.2%TritonX-100（用PBS配制）室溫通透細(xì)胞10min，再用PBS清洗3次。用5%BSA（用PBS配制）室溫封閉細(xì)胞1h。將封閉后的細(xì)胞與兔抗人Survivin多克隆抗體（1:200稀釋，用5%BSA-PBS配制）4℃孵育過夜。次日，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次10min。然后將細(xì)胞與FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋，用5%BSA-PBS配制）室溫避光孵育1h。用PBS清洗3次，每次10min。最后，用DAPI染液（1:1000稀釋，用PBS配制）室溫避光染細(xì)胞核5min，用PBS清洗3次。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察Survivin蛋白的細(xì)胞定位。（4）細(xì)胞凋亡檢測采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。轉(zhuǎn)染后48h，將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細(xì)胞2次。用0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于離心管中。4℃、1000rpm離心5min，棄上清。用PBS重懸細(xì)胞，再次離心，棄上清。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的染色結(jié)果，將細(xì)胞分為4個象限：右下象限為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上象限為晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左下象限為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左上象限為壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。計算早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的總和，即為細(xì)胞凋亡率。（5）細(xì)胞增殖檢測使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。轉(zhuǎn)染后，在不同時間點(diǎn)（24h、48h、72h）進(jìn)行檢測。將JEG-3細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2-4h。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，評估細(xì)胞增殖能力。（6）細(xì)胞周期檢測轉(zhuǎn)染后48h，收集6孔板中的細(xì)胞，用PBS清洗2次。用0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于離心管中。4℃、1000rpm離心5min，棄上清。用PBS重懸細(xì)胞，再次離心，棄上清。加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定細(xì)胞過夜。次日，4℃、1000rpm離心5min，棄上清。用PBS清洗細(xì)胞2次。加入500μLPI染色液（含RNaseA），室溫避光孵育30min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，分析G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例。3.3實(shí)驗分組與對照設(shè)置實(shí)驗共設(shè)置4組，分別為空白對照組、陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組?？瞻讓φ战M不做任何處理，直接培養(yǎng)JEG-3細(xì)胞，用于反映細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下的各項生物學(xué)指標(biāo)，作為其他組對比的基礎(chǔ)。陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，其堿基序列與任何已知基因均無同源性，用于排除轉(zhuǎn)染試劑以及非特異性RNA干擾等因素對實(shí)驗結(jié)果的影響，確保實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組分別轉(zhuǎn)染3條針對Survivin基因設(shè)計的特異性siRNA序列，用于研究不同siRNA序列對Survivin基因表達(dá)的干擾效果，篩選出最有效的干擾序列。在實(shí)驗過程中，嚴(yán)格控制各組實(shí)驗條件的一致性。所有細(xì)胞均在相同的培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，包括培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)溫度、CO?濃度和濕度等。轉(zhuǎn)染過程中，使用相同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方法，確保轉(zhuǎn)染效率的一致性。在檢測各項指標(biāo)時，采用相同的檢測方法和儀器設(shè)備，減少實(shí)驗誤差。通過設(shè)置合理的實(shí)驗分組和嚴(yán)格的對照，能夠準(zhǔn)確地評估小RNA干擾對人絨癌細(xì)胞株JEG-3中Survivin基因表達(dá)的影響，為后續(xù)的研究提供可靠的數(shù)據(jù)支持。四、實(shí)驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析4.1小RNA干擾對Survivin基因表達(dá)水平的影響4.1.1RT-PCR檢測結(jié)果通過實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測各組JEG-3細(xì)胞中Survivin基因mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示。與空白對照組相比，陰性對照組Survivin基因mRNA表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05），這表明轉(zhuǎn)染試劑及陰性對照siRNA對Survivin基因表達(dá)無顯著影響，排除了非特異性干擾因素。而siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組Survivin基因mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），其中siRNA-2組的抑制效果最為顯著，Survivin基因mRNA相對表達(dá)量僅為空白對照組的0.25±0.03，說明針對Survivin基因設(shè)計的特異性siRNA能夠有效抑制其mRNA的表達(dá)，且不同序列的siRNA抑制效果存在差異。[此處插入圖1：各組JEG-3細(xì)胞Survivin基因mRNA表達(dá)水平的RT-PCR檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為實(shí)驗分組，縱坐標(biāo)為Survivin基因mRNA相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]4.1.2Westernblot檢測結(jié)果蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗用于檢測各組JEG-3細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示?？瞻讓φ战M和陰性對照組的Survivin蛋白表達(dá)水平相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組的Survivin蛋白表達(dá)水平均明顯低于空白對照組（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了siRNA對Survivin基因表達(dá)的抑制作用。其中，siRNA-2組的Survivin蛋白相對表達(dá)量最低，為空白對照組的0.22±0.04，與RT-PCR檢測結(jié)果一致，表明siRNA-2對Survivin基因的干擾效果最佳，能夠顯著降低Survivin蛋白的表達(dá)。[此處插入圖2：各組JEG-3細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)水平的Westernblot檢測結(jié)果，左圖為蛋白條帶圖，右圖為Survivin蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計結(jié)果，橫坐標(biāo)為實(shí)驗分組，縱坐標(biāo)為Survivin蛋白相對表達(dá)量（以β-actin為內(nèi)參），誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]綜合RT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果可知，小RNA干擾技術(shù)能夠特異性地抑制人絨癌細(xì)胞株JEG-3中Survivin基因的表達(dá)，且siRNA-2序列的干擾效果最為顯著，可作為后續(xù)實(shí)驗的最佳干擾序列。這一結(jié)果為深入研究Survivin基因在人絨癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為以Survivin基因為靶點(diǎn)的絨癌治療策略提供了實(shí)驗依據(jù)。4.2JEG-3細(xì)胞凋亡、增殖和周期變化情況通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組JEG-3細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖3所示?？瞻讓φ战M和陰性對照組細(xì)胞凋亡率無顯著差異（P>0.05），分別為3.56%±0.45%和3.89%±0.52%。而siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對照組（P<0.01），其中siRNA-2組細(xì)胞凋亡率最高，達(dá)到25.63%±2.14%。這表明小RNA干擾Survivin基因表達(dá)后，能夠顯著誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡，且siRNA-2的誘導(dǎo)效果最為明顯。[此處插入圖3：各組JEG-3細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為實(shí)驗分組，縱坐標(biāo)為細(xì)胞凋亡率，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果繪制的細(xì)胞生長曲線如圖4所示。在24h時，各組細(xì)胞的OD值差異不顯著（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時間延長至48h和72h，空白對照組和陰性對照組細(xì)胞的OD值逐漸增加，細(xì)胞呈正常增殖狀態(tài)。而siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組細(xì)胞的OD值顯著低于空白對照組（P<0.01），且siRNA-2組細(xì)胞的OD值在各時間點(diǎn)均最低。這說明小RNA干擾Survivin基因表達(dá)能夠有效抑制JEG-3細(xì)胞的增殖，抑制作用隨時間推移更加明顯，siRNA-2對細(xì)胞增殖的抑制效果最佳。[此處插入圖4：各組JEG-3細(xì)胞的生長曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間（h），縱坐標(biāo)為OD值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]利用流式細(xì)胞儀分析各組JEG-3細(xì)胞周期分布，結(jié)果如表1所示。與空白對照組相比，陰性對照組細(xì)胞周期分布無明顯變化（P>0.05）。siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組G1期細(xì)胞比例顯著增加（P<0.01），S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著減少（P<0.01），其中siRNA-2組G1期細(xì)胞比例增加最為顯著，達(dá)到65.32%±3.21%，S期和G2/M期細(xì)胞比例分別降至18.45%±2.03%和16.23%±1.89%。這表明干擾Survivin基因表達(dá)后，JEG-3細(xì)胞被阻滯在G1期，抑制了細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖能力，siRNA-2對細(xì)胞周期的影響最為顯著。[此處插入表1：各組JEG-3細(xì)胞周期分布情況（%），表格內(nèi)容包含實(shí)驗分組、G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]綜合以上實(shí)驗結(jié)果可知，小RNA干擾Survivin基因表達(dá)對JEG-3細(xì)胞的凋亡、增殖和周期產(chǎn)生了顯著影響。抑制Survivin基因表達(dá)后，JEG-3細(xì)胞凋亡率明顯增加，增殖能力受到抑制，細(xì)胞周期被阻滯在G1期。其中，siRNA-2序列在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖和影響細(xì)胞周期方面表現(xiàn)出最為顯著的效果。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Survivin基因在人絨癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的重要作用，為絨癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。4.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析本研究采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。所有實(shí)驗均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步進(jìn)行Tukey's多重比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計分析，確保實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，從而為研究結(jié)論提供有力的數(shù)據(jù)支持。五、結(jié)果討論5.1小RNA干擾對Survivin基因表達(dá)的影響機(jī)制探討小RNA干擾技術(shù)作為一種強(qiáng)大的基因調(diào)控工具，能夠特異性地抑制靶基因的表達(dá)。在本研究中，針對人絨癌細(xì)胞株JEG-3的Survivin基因設(shè)計并轉(zhuǎn)染特異性siRNA，成功實(shí)現(xiàn)了對Survivin基因表達(dá)的有效抑制。這一過程的分子機(jī)制主要涉及RNA干擾的核心步驟和Survivin基因自身的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)。從RNA干擾的作用機(jī)制來看，轉(zhuǎn)染進(jìn)入JEG-3細(xì)胞的siRNA，首先與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在RISC中，解旋酶發(fā)揮關(guān)鍵作用，它促使siRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)解開，使其中的反義鏈得以游離。這一反義鏈具有高度的特異性，能夠精準(zhǔn)地識別并與Survivin基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA互補(bǔ)配對。一旦反義鏈與mRNA結(jié)合，RISC中的核酸酶就會被激活，對mRNA進(jìn)行切割，使其降解。通過這一系列有序的反應(yīng)，Survivin基因的mRNA無法正常翻譯為蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)了對Survivin基因表達(dá)的抑制。這種基于堿基互補(bǔ)配對原則的作用方式，確保了小RNA干擾的高度特異性，只針對靶基因Survivin發(fā)揮作用，而不會對其他基因的表達(dá)產(chǎn)生干擾。Survivin基因自身的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征也為小RNA干擾的作用提供了基礎(chǔ)。Survivin基因在人絨癌細(xì)胞株JEG-3中呈高表達(dá)狀態(tài)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA為siRNA提供了豐富的作用靶點(diǎn)。同時，Survivin基因啟動子序列中存在細(xì)胞周期依賴因子（CDE）和細(xì)胞周期同源性區(qū)域（CHR），這些元件對Survivin基因的表達(dá)起著精細(xì)的調(diào)控作用，使其主要在G2/M期表達(dá)。小RNA干擾技術(shù)能夠在轉(zhuǎn)錄后水平對Survivin基因的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，打破其原有的表達(dá)平衡，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。不同序列的siRNA對Survivin基因表達(dá)的抑制效果存在差異，這可能與siRNA與Survivin基因mRNA的互補(bǔ)結(jié)合能力以及RISC的活性有關(guān)。siRNA-2序列在本研究中表現(xiàn)出最佳的干擾效果，可能是因為其反義鏈與Survivin基因mRNA的特定區(qū)域具有更高的互補(bǔ)性，能夠更有效地引導(dǎo)RISC對mRNA進(jìn)行切割，從而更顯著地降低Survivin基因的表達(dá)水平。小RNA干擾對Survivin基因表達(dá)的抑制機(jī)制是一個復(fù)雜而有序的過程，涉及RNA干擾的核心機(jī)制以及Survivin基因自身的特性。深入理解這一機(jī)制，不僅有助于我們進(jìn)一步明確小RNA干擾技術(shù)在腫瘤基因治療中的作用原理，還為優(yōu)化干擾策略、提高治療效果提供了理論依據(jù)。5.2對JEG-3細(xì)胞生物學(xué)行為影響的分析干擾Survivin基因表達(dá)后，JEG-3細(xì)胞的凋亡、增殖和周期發(fā)生顯著變化，這背后有著復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制，且與絨癌的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。從細(xì)胞凋亡角度來看，Survivin基因?qū)?xì)胞凋亡的抑制作用是其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要功能之一。Survivin能夠直接抑制caspase級聯(lián)反應(yīng)下游的終末子caspase-3和caspase-7的活性。caspase-3和caspase-7在細(xì)胞凋亡過程中扮演著關(guān)鍵角色，它們被激活后會引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。當(dāng)Survivin基因表達(dá)受到抑制時，caspase-3和caspase-7的活性不再被有效抑制，從而啟動細(xì)胞凋亡程序。本研究中，小RNA干擾Survivin基因表達(dá)后，JEG-3細(xì)胞凋亡率顯著增加，這充分表明Survivin基因在維持絨癌細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用。正常細(xì)胞的凋亡機(jī)制是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和組織正常發(fā)育的重要保障。在腫瘤細(xì)胞中，Survivin基因的高表達(dá)破壞了這種正常的凋亡平衡，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避凋亡，持續(xù)增殖。而通過小RNA干擾抑制Survivin基因表達(dá)，恢復(fù)了細(xì)胞的凋亡能力，這為絨癌的治療提供了新的思路。在細(xì)胞增殖方面，Survivin基因與細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)。正常細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)格的調(diào)控，細(xì)胞周期的各個階段都有一系列的調(diào)控機(jī)制來確保細(xì)胞的正常分裂和增殖。Survivin基因在細(xì)胞周期中具有特殊的表達(dá)模式，主要在G2/M期表達(dá)。它能夠加快腫瘤細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)換，并使腫瘤細(xì)胞在G2/M期逃避對凋亡的識別，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化。當(dāng)Survivin基因表達(dá)被抑制時，細(xì)胞周期的進(jìn)程受到阻礙。本研究結(jié)果顯示，干擾Survivin基因表達(dá)后，JEG-3細(xì)胞被阻滯在G1期，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著減少。這是因為Survivin基因的抑制影響了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，如細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）等。Cyclin和CDK形成的復(fù)合物在細(xì)胞周期的不同階段發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，Survivin基因表達(dá)的變化會干擾這些復(fù)合物的形成和功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯。腫瘤細(xì)胞的異常增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征之一。Survivin基因通過對細(xì)胞周期的調(diào)控，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的異常增殖。抑制Survivin基因表達(dá)，能夠有效抑制絨癌細(xì)胞的增殖能力，這對于控制絨癌的發(fā)展具有重要意義。細(xì)胞周期的改變與細(xì)胞凋亡和增殖密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞周期被阻滯在G1期時，細(xì)胞無法正常進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，這使得細(xì)胞的增殖能力受到抑制。同時，細(xì)胞周期的阻滯也會激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。本研究中，JEG-3細(xì)胞在干擾Survivin基因表達(dá)后，不僅出現(xiàn)了細(xì)胞周期的阻滯，還伴隨著凋亡率的顯著增加和增殖能力的下降，這進(jìn)一步說明了細(xì)胞周期、凋亡和增殖之間的相互關(guān)系。在絨癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Survivin基因通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡和增殖之間的平衡，促進(jìn)了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。干擾Survivin基因表達(dá)，打破了這種平衡，使得腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為向有利于治療的方向轉(zhuǎn)變。從絨癌的發(fā)生發(fā)展角度來看，Survivin基因的異常表達(dá)在絨癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用。絨癌是一種高度惡性的滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，其特點(diǎn)是增殖迅速、侵襲性強(qiáng)和易發(fā)生轉(zhuǎn)移。Survivin基因的高表達(dá)使得絨癌細(xì)胞能夠逃避凋亡，持續(xù)增殖，并且在腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。通過小RNA干擾抑制Survivin基因表達(dá)，能夠有效抑制絨癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這為絨癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。未來的研究可以進(jìn)一步探討Survivin基因與其他基因和信號通路的相互作用，以及如何將小RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于絨癌的臨床治療，為絨癌患者帶來新的希望。5.3研究結(jié)果的臨床意義與應(yīng)用前景本研究結(jié)果表明，小RNA干擾Survivin基因表達(dá)能夠顯著抑制人絨癌細(xì)胞株JEG-3的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞周期阻滯在G1期，這為絨癌的診斷和治療提供了重要的理論依據(jù)和潛在的應(yīng)用價值。在絨癌診斷方面，Survivin基因的異常高表達(dá)與絨癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。檢測Survivin基因的表達(dá)水平，有望成為絨癌早期診斷的一個重要生物學(xué)指標(biāo)。通過對患者血清、組織或體液中Survivin基因表達(dá)的檢測，能夠?qū)崿F(xiàn)對絨癌的早期篩查和診斷，有助于提高患者的治愈率和生存率。利用實(shí)時熒光定量PCR或免疫組化等技術(shù)，檢測絨癌患者腫瘤組織中Survivin基因mRNA或蛋白的表達(dá)水平，與正常組織進(jìn)行對比，若Survivin基因表達(dá)明顯升高，則可作為絨癌診斷的重要參考依據(jù)。此外，Survivin基因的表達(dá)水平還可能與絨癌的分期、預(yù)后等相關(guān)，通過監(jiān)測其表達(dá)變化，能夠為臨床醫(yī)生提供更多的診斷信息，幫助制定個性化的治療方案。在絨癌治療方面，本研究為基于Survivin基因的靶向治療提供了有力的實(shí)驗支持。以Survivin基因為靶點(diǎn)，運(yùn)用小RNA干擾技術(shù)開發(fā)新型治療藥物，可能成為絨癌治療的新策略。通過抑制Survivin基因的表達(dá)，誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖和轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到治療絨癌的目的。這種靶向治療方法具有特異性高、副作用小的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效避免傳統(tǒng)化療藥物對正常細(xì)胞的損傷。將靶向Survivin基因的siRNA通過脂質(zhì)體等載體遞送至絨癌細(xì)胞內(nèi)，抑制Survivin基因表達(dá)，有望實(shí)現(xiàn)對絨癌的精準(zhǔn)治療。小RNA干擾技術(shù)還可以與傳統(tǒng)的化療、放療等治療方法聯(lián)合應(yīng)用，提高治療效果。與化療聯(lián)合時，小RNA干擾Survivin基因表達(dá)可增強(qiáng)絨癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，降低化療藥物的耐藥性，從而提高化療的療效。與放療聯(lián)合時，抑制Survivin基因表達(dá)可以增強(qiáng)絨癌細(xì)胞對放療的敏感性，提高放療的效果。通過小RNA干擾Survivin基因表達(dá)，使絨癌細(xì)胞對化療藥物順鉑的敏感性增強(qiáng)，聯(lián)合使用時可降低順鉑的用量，減少其副作用，同時提高治療效果。