PAGE1尿酸測定方法研究進展一、尿酸概述生物分子尿酸(2,4,6三羥基嘌呤,簡稱UA)是人體內嘌呤代謝的最終產物,健康成年人正常尿酸的水平為血清中0.15～0.4mmoL/L,尿酸中250～750mg/L(1.49～4.46mmol/(L.24h)。人體內尿酸異常是人體疾病的反映,可以反映出嘌呤代謝的有關的一些疾病。例如:痛風和Lesch-Nyhan綜合癥,高尿酸血等都會引起尿酸異常。因此,近年來,尿酸的檢測和分析在疾病的臨床診斷和治療方面的應用日益廣泛。尿酸分子式為C5H14N4O3,MW168.11,不溶于水,也難溶于酸。尿酸是一種含有嘌呤結構的化合物,也是嘌呤的最重要衍生物。它是一種白色結晶性物質,極難溶于水,也難溶于醚和乙醇,具有弱堿性,可以與強酸成鹽。尿酸在生物體內以鹽的形式存在,因而溶解度較高。尿酸在尿酸酶的作用下,可以被氧化成尿素囊,其反應式為:。食物中核苷酸分解吸收而來的外源性尿酸約占20％，人體內核苷酸分解代謝產生的內源性尿酸約占80％。血漿中尿酸只能通過腎臟排出體外，如尿酸排泄障礙可引起血尿升高。腎臟對尿酸的排泄分4個階段：(1)腎小球自由濾過；(2)近端腎小管主動重吸收(占濾過量的98％～99％)；(3)腎小管的分泌(達濾過量的50％)；(4)髓絆降支被動重吸收(占濾過量的40％～44％)。最終排出量只占濾過量的6％—10％。當腎小球濾過率下降，或腎小管對尿酸的重吸收增加或分泌減少時均可導致高尿酸血癥。尿酸生成過多的原因主要有：(1)嘌呤合成代謝異常，其中大多屬多基因遺傳缺陷，而酶缺陷者僅占少數；(2)食物中嘌呤增加；(3)旺盛的細胞合成和分解。越來越多的證據顯示，高尿酸血癥與肥胖、高血壓、血脂異常、糖尿病、胰島素抵抗密切相關。當出現尿酸結晶形成和沉積，并引起特征性急性關節(jié)炎、痛風石、間質性腎炎及尿酸性尿路結石即為痛風。高尿酸血癥中痛風的發(fā)病率占10％～20％。高尿酸血癥是心腦血管疾病的危險因子，有研究顯示高尿酸血癥甚至是腎損害的起動因子。二、尿酸的測定方法隨著社會的進步,人類對其自身健康水平日益關注。目前建立了許多尿酸的檢測方法,如酶法、尿酸生物傳感器檢測法等,現概述幾種常用的醫(yī)學檢測中應用的尿酸檢測技術及進展。1、尿酸酶法將酶作為測定試劑用于待測物的分析起源于19世紀中葉,20世紀初已開始應用于臨床系列化的測定,但真正現代意義的用于臨床生化測定的酶試劑是20世紀30年代才出現,70年代得到了較大發(fā)展,同時在理論和實踐上也日趨成熟和完善。如果從動力學角度對目前所使用的酶試劑加以分類,可分為單酶法和酶偶聯法。尿酸酶廣泛應用于尿酸測定以提高反應的比色特異性。尿酸酶法是以尿酸酶催化尿酸氧化為尿囊素和H202為基礎進行的檢測。（1）紫外法1947年Kalckar等口刮設計了尿酸酶紫外法。檢測原理為：尿酸、水和氧氣在尿酸酶氧化還原反應后生成尿囊素和H202。尿囊素與尿酸不同，在29HD-293舳處無吸收，通過測定反應前后吸光度的變化計算尿酸的含量。反應方程如下：該方法反應時間長，吸光度的變化小，靈敏度低。檢測波長是293咖，生化分析儀器未設置該波長，不能實現自動化。該方法被推薦為尿酸測定候選的參考方法。（2）基于過氧化氫定量的尿酸間接測定法尿酸酶法測定多數是建立在尿酸酶、過氧化物酶(或過氧化氫酶)與顯色劑偶聯反應的基礎上，凡是可以進行過氧化氫定量的方法幾乎都可以間接測定尿酸。以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)為指示反應的尿酸酶法測定原理是在過氧化氫酶的作用下，過氧化氫與乙醇反應生成乙醛，乙醛與NADH和H+在脫氫酶的作用下生成NAD+，NADH的下降量與尿酸的含量呈正相關，通過測定340nm處NADH吸光度的變化就可以計算尿酸的含量。反應方程如下：此酶偶聯方法檢測340nm處NADH的變化，吸光率比較大，解決了靈敏度與自動化的問題，線性范圍達到了120mg／L，但反應比較耗時。此反應第一步是特異的，但偶聯的氧化還原反應和脫氫反應受到還原性物質和內源性脫氫酶的干擾。經過改進用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)代替NADH，并在反應體系中加入草酸鹽，可減低檢測受內源性脫氫酶干擾的程度。尿酸測定以基于Trinder反應的酶偶聯法應用最為廣泛。此方法首先由Emerson在1943年提出。反應原理為：尿酸、氧氣和水在尿酸酶的作用下生成H202，H202與聯二茴香胺發(fā)生顏色反應，根據顏色變化來計算尿酸的含量。但是聯二茴香胺是致癌物質，且需要用熱酸或乙醇去蛋白，中間過程比較繁瑣。不適合臨床常規(guī)檢測，沒有得到推廣。后來此方法得到進一步發(fā)展，酶反應生成的H202與4氨基替比林和各種不同的酚反應生成不同顏色的醌類物質。反應方程如下：1973年Kabasalian等報道使用2，4，6-3溴苯酚作為顯色酚，用n-乙酸正丁酯去蛋白，在492砌測定吸光度，線性達到200mg／L，除蛋白過程比較繁瑣，檢測受谷胱甘肽干擾比較明顯。Klose等使用對羥基苯甲酸為顯色酚，不需要去蛋白，500nm檢測吸光度計算尿酸含量，線性達到120r形L，不容易受血清中其他成分的干擾，但膽紅素濃度大于正常會干擾檢測值。1978年Trivedi等報道使用2，4．二氯酚作為顯色酚，檢測505／520硼吸光度，線性達到714μmol／L，但易受甲基多巴的干擾。1980年Fossati等使用3，5．二氯-2-羥基苯磺酸鈉(DHBs)作為顯色酚測定520nm吸光度，此方法線性達到1500μmoL／L，在檢測線性、回收率等性能指標上都得到很大提高。520nm波長測定血清噪音比較小，通過加入抗壞血酸氧化酶、亞鐵氰化物可以去除膽紅素和抗壞血酸的干擾，但對于過高的膽紅素和高脂血清也會影響測定結果，必須除去不加酶的血清吸光度。20世紀90年代以來，一些發(fā)明專利利用N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-m一甲苯胺鈉鹽(TOOs)作為測定H202、4AAP和過氧化物酶的反應體系的顯色酚，形成紅色醌亞胺，在550nm處有強的吸收峰，應用在尿酸、膽固醇、糖等檢測中。T00s作為顯色劑顯色比較單一，反應比較靈敏。加入抗壞血酸氧化酶去除抗壞血酸的干擾。目前臨床使用較多的酶偶聯方法大多屬于這種方法。2、尿酸傳感器檢測法隨著研究的進展,發(fā)現尿酸酶法測定雖然操作簡便,樣品處理簡單,但操作過程太復雜。在此基礎上人們提出了一種利用固相酶技術制作的一種尿酸傳感器檢測方法,并且此方法逐漸被尿酸傳感器檢測方法取代。酶電極分析方法作為一種簡便、快速、靈敏和特效的分析技術,一直受到化學家們的重視,近年來許多科學家對酶法檢測尿酸的方法越來越多。目前,最常用的尿酸檢測方法是尿酸氧化酶的尿酸傳感器檢測法。尿酸傳感器采用流動注射分析系統(tǒng),由樣品混合器,恒流泵,覆蓋酶膜的氧化極、流動池、熱交換器、循環(huán)恒溫水浴鍋、溶氧控制器和積分儀組成,當一定的試液注入樣品混合器后,與流速為1.5ml/min的0.02mol/L磷酸緩沖液(PH8.5)混合,一起經熱交換器恒溫(32±0.1)℃,再進入反應室在固定化酶催化下進行氧化反應,使反應液中溶解氧濃度下降,這樣,氧電極就產生差異電流響應峰,由積分儀記錄下來,當溶液中的尿酸經載流液洗脫離開酶反應后,電極很快回到起始狀態(tài),信號隨即回到基線,就可以進行第二次注射分析。這一方法的發(fā)展和酶固定化技術的迅速發(fā)展密切相關。酶固定化技術是制作酶電極的關鍵,它對電極的各項性能起決定作用,目前已開發(fā)了吸附法、載體偶聯法、交聯法和包埋法等各種固定的方法。近來還研究了一種以氧化鋁固定尿酸氧化酶的方法,還應用溴化鋰和氯化鈣溶解家蠶絲素后分別研制出二種固定化氧化物酶和尿酸氧化酶絲素膜,用固定化尿酸氧化酶絲素膜和氧電極,研制了一種流動注射分析尿酸傳感器,目前這種酶膜尿酸傳感器法最具發(fā)展前景,有望得到廣泛應用。3、伏安法Kolthoff和Laitinen等人把基于研究電流-電壓曲線特性而建立起來,通過測量電流-電壓曲線進行分析的方法統(tǒng)稱為“伏安法”。伏安法是目前常用的檢測尿酸的方法,近年來,伏安法檢測尿酸在理論研究和實際運用于臨床診斷上都取得了很大的發(fā)展。伏安法檢測尿酸常用的方法有以下幾種:（1）微電極差示脈沖伏安法在電極表面修飾一層化學物質分子,賦予電極以特定的性質,能有效地降低某些氧化原物質的過電位,從而達到分離或同時測定的目的。例如,Zen和Chen報道了粘土修飾經過陽極極化的玻碳電極(GC),方波伏安法實現了在高濃度抗壞血酸(AA)存在下選擇性測定尿酸和多巴胺,檢測尿酸和靈敏度達5.0×10-2mol/L,Csaba等利用聚N-甲基吡咯修飾的金盤電極并借助酶反應,在大量抗壞血酸存在下測定了尿中的尿酸,測定線性范圍為1×10-2～9×10-4mol/L。Hiroshi等在金電極上修飾了聚磷脂和含硫烷烴雙層聚合膜,并同時將尿酸酶夾在聚合膜中,該電極屏蔽了幾乎所有其它干擾信號而僅對尿酸響應,Jyh-MyngZen等將Nafion膜修飾在陽極極化了的玻碳電極上,陽極極化GC電極是為了提高GC對尿酸的響應靈敏度,而Nafion是只允許陽離子穿過的聚合膜,在PH5.0的條件下,尿酸是以陽離子形式存在(Pka=5.4),而抗壞血酸是以陰離子形式存在(Pka=4.1),這樣Nafion膜可以選擇性地讓陽離子尿酸通過而有效地屏蔽了抗壞血酸,該電極檢測尿酸的檢測下限達10-8mol/L,隨著研究的進展,發(fā)現病人血清中尿酸含量的增長與高血壓和局部缺血性心臟病有關,盡管尿酸增高與局部缺血性心臟病關系的生物機理還不能確定,但對尿酸的檢測提出了在線分析的要求,在線分析必須使用微電極。最近,Angnes等發(fā)表了他們的研究成果,他們將鈀電沉積在金微電極上,借助流動注射分析法測定尿酸在該微電極上的氧化電流,檢測尿酸的線性范圍為2.0×10-6～1.0×10-5mol/L,但該檢測靈敏度,達不到在線分析的要求。目前,微電極差示脈沖伏安法常用的是聚甘氨酸修飾碳纖維微電極差示脈沖伏安法,利用碳纖維微電極(CFME)經過特定的電化學方法活化,活化后的CFME表面修飾一層聚甘氨酸膜,該膜電極對尿酸有近可逆的響應,借助于差示脈沖伏安法(DPV)技術,它檢測尿酸的靈敏度達2×10-8mol/L,檢測線性范圍為3.3×10-7～8.0×10-6mol/L(t=70s)。該方法測定結果準確,可望用于在線檢測,但應用不是十分廣泛。（2）吸附溶出伏安法吸附溶出伏安法是一種高靈敏度,有一定選擇性的電分析方法。它是在Britton-Robinson緩沖體系中(PH7.50),研究尿酸的吸附溶出伏安行為,是測定尿酸的新方法。其實驗方法是在電解池中加入Britton-Robinson緩沖液(PH7.50)和適量的尿酸溶液,定溶后通氮氣除氧氣5min,插入三電極系統(tǒng),選擇合適的富集時間,在+0.10～-0.80V范圍內用SV-1型溶出伏安儀記錄其伏安曲線,這是一種新的測定尿酸的方法,可用于尿酸及血漿中的尿酸分析。此方法的線性范圍為2.0×10-8～1.0×10-5mol/L,檢出限量為1.0×10-8mol/L,該法抗干擾能力強,操作簡便,樣品處理簡單,易于推廣。4、高效液相色譜法該方法是較常用,較基本的尿酸檢測方法,所用流動相簡單,分離效果較好,操作簡便、快速。它的操作主要要注意以下幾點:首先，標準對照品及樣品的制備與全處理。1)標準對照品制備:將尿酸用11.0mmol/L的混合標準溶液S1,將S1倍比稀釋5次至S6；2)樣本收集:收集受試者24h尿液,用甲苯防腐,準確記錄尿量,混勻后取約5ml,同時取靜脈血3ml,及時分離血清,與尿液一起置于-20℃下,于一周內分析；3)準確吸取系列混合標準液,血清及40倍稀釋的尿液0.1ml,滴加1.9ml甲醇在漩渦振蕩器上混勻,于6000r/min離心10min,取上清液1.2ml置于干凈試管中,在氮氣流下吹干,分析前以流動相0.3ml復溶,漩混1min,自動進樣40ul進行色譜分析。其次，色譜條件為：分析柱:Shim-packCLC-ODS15cm—0.6cm預柱Shim-packCLCG-ODS(4);流動相0.02mol/LKH2PO4。最后，用磷酸調PH3.2;流速1ml/min,柱溫35℃AUFS0.001;波長233nm。PHLC檢測法雖然簡單,但常常需要麻煩費時的樣品預處理或使用復雜的柱切換設備,為了解決這些問題,1985年以來不少研究工作者研究了生物體液直接進高效液相色譜固定相,這些固定相包括內表面反相,半滲透表面,混合功能相及屏蔽疏水相等。用這些固定相可以進行含蛋白體液的直接進樣分析,且柱效好,柱壽命長。現在人們常采用體液直接進樣高效液相色譜法測定尿酸,且應用日益廣泛。5、磷鎢酸還原法早在1894年，0ffer發(fā)現尿酸在堿性條件下能還原磷鎢酸。1912年Folin和Denris首先利用這一原理實現對尿酸含量的測定，后又經一系列的改良。其反應原理是：無蛋白的血清濾過液中的尿酸在堿性溶液中被磷鎢酸氧化成尿囊素及C02，而磷鎢酸被還原成鎢藍，可用比色法測定660nm處波長，根據吸光度的變化計算尿酸的含量。磷鎢酸還原法是目前臨床比較常用的方法,利用無蛋白濾液中的尿酸在堿性環(huán)境中可被磷鎢酸氧化