小干擾RNA對肝癌細胞中異常表達FAT10基因的靶向抑制及機制研究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為一種常見且惡性程度極高的腫瘤，嚴重威脅著人類的生命健康。據(jù)相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)肝癌的發(fā)病率和死亡率均居高不下，中國更是肝癌的高發(fā)地區(qū)，這與國內(nèi)乙肝病毒的大面積流行密切相關。盡管現(xiàn)代醫(yī)學在肝癌的治療方面取得了一定進展，如外科切除手術、局部消融、介入治療、放射治療、化療、生物治療以及中醫(yī)中藥治療等多種方法的應用，但肝癌患者的總體預后仍然不容樂觀，5年生存率較低，主要原因在于肝癌具有高復發(fā)率和高轉(zhuǎn)移風險，且多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯失了最佳治療時機。因此，深入探究肝癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和治療方法，成為了當前醫(yī)學領域亟待解決的重要課題。在肝癌的發(fā)病機制研究中，基因的異常表達被發(fā)現(xiàn)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。FAT10基因作為類泛素調(diào)節(jié)子蛋白家族中的一員，近年來受到了廣泛關注。已有研究表明，F(xiàn)AT10基因在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且其表達水平與肝癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預后密切相關。FAT10基因的異常高表達可能通過多種途徑促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，從而在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的致癌作用。然而，目前對于FAT10基因在肝癌中的具體作用機制尚未完全明確，仍有待進一步深入研究。隨著生物技術的不斷發(fā)展，RNA干擾（RNAi）技術作為一種新興的基因沉默技術，為基因功能研究和疾病治療提供了新的有力工具。小干擾RNA（siRNA）作為RNAi技術的關鍵組成部分，能夠特異性地識別并結(jié)合靶mRNA，通過RNA誘導沉默復合體（RISC）的作用，降解靶mRNA，從而實現(xiàn)對特定基因表達的高效抑制。將siRNA技術應用于肝癌治療研究，為攻克肝癌這一難題帶來了新的希望。通過設計針對FAT10基因的siRNA，有望特異性地抑制肝癌細胞中FAT10基因的異常表達，阻斷其致癌信號通路，從而達到抑制肝癌細胞生長、誘導細胞凋亡、降低腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的目的。本研究聚焦于siRNA對肝癌細胞中異常表達的FAT10基因的抑制效應，具有重要的理論意義和臨床應用價值。在理論層面，深入研究siRNA對FAT10基因的抑制機制，有助于進一步揭示FAT10基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機制，豐富對肝癌發(fā)病機制的認識，為肝癌的基礎研究提供新的理論依據(jù)。在臨床應用方面，若能成功利用siRNA有效抑制FAT10基因的表達，為肝癌的治療提供一種全新的、特異性的治療策略，為肝癌患者帶來新的治療希望，提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量，具有廣闊的應用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的重大疾病，其研究一直是醫(yī)學領域的重點和熱點。在國內(nèi)，由于乙肝病毒的高感染率，肝癌的發(fā)病率居高不下，因此國內(nèi)學者對肝癌的研究投入了大量精力。復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所的研究團隊在肝癌的發(fā)病機制、早期診斷和綜合治療等方面取得了一系列重要成果，通過單細胞RNA測序技術，深入揭示了早期復發(fā)性肝癌的免疫特征和腫瘤免疫逃逸機制，為肝癌的免疫治療提供了重要的理論依據(jù)。北京佑安醫(yī)院李寧教授團隊則專注于肝癌診斷新技術的研發(fā)，開發(fā)的蛋白芯片檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)肝癌的精準診斷，提高了肝癌的早期診斷率，在國際上處于領先水平。國外對于肝癌的研究同樣深入，在肝癌的分子靶向治療和免疫治療方面取得了諸多突破。例如，美國的研究團隊在肝癌的靶向藥物研發(fā)中，發(fā)現(xiàn)了一些新的分子靶點，為肝癌的精準治療提供了新的方向。在免疫治療方面，國外學者對免疫檢查點抑制劑在肝癌治療中的應用進行了大量臨床試驗，顯著提高了部分肝癌患者的生存率。FAT10基因與肝癌相關性的研究在國內(nèi)外均有開展。國內(nèi)南昌大學第二附屬醫(yī)院的研究人員通過病例對照研究，探討了FAT10基因單體型與肝細胞癌的關系，發(fā)現(xiàn)FAT10基因單體型可能與肝癌的發(fā)病風險相關，ATT單體型可能是肝癌的遺傳標志。在對FAT10基因在肝癌組織中的表達和突變情況研究中，發(fā)現(xiàn)大部分肝癌組織中FAT10蛋白的表達明顯高于癌旁組織，且在肝癌患者和人肝癌細胞中檢測到FAT10基因編碼區(qū)存在多個單核苷酸多態(tài)性位點，但未發(fā)現(xiàn)基因突變。國外研究則更側(cè)重于FAT10基因在肝癌細胞中的功能機制研究，通過細胞實驗和動物模型，揭示了FAT10基因通過激活某些信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。RNA干擾技術在肝癌治療中的應用研究是國內(nèi)外共同關注的焦點。國內(nèi)研究團隊構(gòu)建陽離子聚合物/化學siRNA納米復合物，結(jié)合威尼德電穿孔儀優(yōu)化遞送程序，實現(xiàn)了肝癌原代細胞高效轉(zhuǎn)染，為肝癌基因治療提供了精準遞送新方案。國外圣諾醫(yī)藥開發(fā)的多肽納米顆粒（PNP）制劑STP707，可遞送兩個siRNA（分別靶向沉默TGFβ和Cox2），在原位肝細胞癌的小鼠模型中，能夠顯著減少腫瘤，還可與PD-L1單克隆抗體聯(lián)合使用，進一步增強治療效果。盡管國內(nèi)外在肝癌、FAT10基因以及siRNA技術的研究上取得了豐碩成果，但仍存在一些不足。目前對于FAT10基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的具體分子機制尚未完全明確，其上下游調(diào)控網(wǎng)絡還需進一步深入研究。在siRNA技術應用于肝癌治療方面，雖然取得了一定進展，但siRNA的高效遞送和穩(wěn)定性問題仍然是制約其臨床應用的關鍵因素，如何提高siRNA在體內(nèi)的靶向性和轉(zhuǎn)染效率，降低其脫靶效應和免疫原性，是亟待解決的難題。此外，針對FAT10基因的siRNA治療策略在肝癌臨床治療中的有效性和安全性，還需要更多的臨床前研究和臨床試驗來驗證。本研究將針對這些不足，深入探究siRNA對肝癌細胞中異常表達的FAT10基因的抑制效應及其作用機制，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在深入探究siRNA對肝癌細胞中異常表達的FAT10基因的抑制效應及其作用機制，為肝癌的基因治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究內(nèi)容如下：篩選并驗證針對FAT10基因的有效siRNA序列：運用生物信息學方法，針對FAT10基因的編碼區(qū)設計多條siRNA序列。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術，將這些siRNA序列分別導入肝癌細胞系（如HepG2、Huh7等）中。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術，檢測轉(zhuǎn)染后細胞中FAT10基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平，篩選出抑制效果最為顯著的siRNA序列，并進一步驗證其干擾效率和特異性。研究siRNA抑制FAT10基因表達對肝癌細胞生物學行為的影響：將篩選得到的有效siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細胞，采用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法、EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）摻入實驗等方法，檢測細胞增殖能力的變化；通過Transwell實驗和劃痕愈合實驗，觀察細胞遷移和侵襲能力的改變；運用流式細胞術分析細胞周期分布和凋亡情況，研究siRNA抑制FAT10基因表達后對肝癌細胞周期和凋亡的調(diào)控作用；此外，還將通過裸鼠成瘤實驗，在體內(nèi)驗證siRNA對肝癌細胞生長和腫瘤形成的影響。探討siRNA抑制FAT10基因表達的作用機制：利用基因芯片技術或RNA測序（RNA-seq）技術，分析siRNA轉(zhuǎn)染前后肝癌細胞中基因表達譜的變化，篩選出與FAT10基因相關的差異表達基因。通過生物信息學分析，對這些差異表達基因進行功能富集分析和信號通路富集分析，初步探究siRNA抑制FAT10基因表達影響肝癌細胞生物學行為的潛在分子機制。進一步采用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）、熒光素酶報告基因?qū)嶒灥确椒?，驗證關鍵信號通路中上下游分子之間的相互作用關系，明確siRNA抑制FAT10基因表達的具體作用機制。1.4研究方法與技術路線本研究采用實驗研究法，通過細胞實驗和動物實驗，深入探究siRNA對肝癌細胞中異常表達的FAT10基因的抑制效應及其作用機制。具體研究方法如下：細胞培養(yǎng)：選用人肝癌細胞系HepG2、Huh7等，將其置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，當細胞生長至對數(shù)期時，進行后續(xù)實驗。siRNA設計與合成：運用siRNA設計軟件，如siDirect、BLOCK-iTRNAiDesigner等，針對FAT10基因的編碼區(qū)，遵循siRNA設計原則，設計多條siRNA序列。同時，設計陰性對照siRNA序列，其序列與人類基因組無同源性。將設計好的siRNA序列交由專業(yè)生物技術公司進行合成，合成后的siRNA經(jīng)高效液相色譜（HPLC）純化，確保其純度和質(zhì)量。細胞轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將合成的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細胞中。具體操作如下：在轉(zhuǎn)染前24小時，將處于對數(shù)生長期的肝癌細胞接種于6孔板中，每孔細胞密度為5×10?個。待細胞融合度達到70%-80%時，進行轉(zhuǎn)染操作。將脂質(zhì)體和siRNA分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者混合，室溫孵育15-20分鐘，形成脂質(zhì)體-siRNA復合物。將復合物加入到含有細胞的6孔板中，輕輕搖勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，用于后續(xù)實驗檢測。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測：收集轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應。設計FAT10基因和內(nèi)參基因（如GAPDH）的特異性引物，引物序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對驗證。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過分析擴增曲線和熔解曲線，確定擴增的特異性和效率。采用2^(-ΔΔCt)法計算FAT10基因mRNA的相對表達量，以評估siRNA對FAT10基因mRNA表達水平的抑制效果。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測：收集轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品，進行SDS凝膠電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時，然后加入一抗（抗FAT10抗體和抗GAPDH抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG），室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后加入化學發(fā)光底物，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，計算FAT10蛋白的相對表達量，以驗證siRNA對FAT10基因蛋白質(zhì)表達水平的抑制效果。細胞增殖實驗：采用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法和EdU摻入實驗檢測siRNA抑制FAT10基因表達對肝癌細胞增殖能力的影響。CCK-8法操作如下：將轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞接種于96孔板中，每孔細胞密度為5×103個，每組設置5個復孔。分別在培養(yǎng)0小時、24小時、48小時、72小時時，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時。然后在酶標儀上測定450nm處的吸光度值（OD值），繪制細胞生長曲線，評估細胞增殖能力。EdU摻入實驗按照試劑盒說明書進行操作：將轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞接種于24孔板中，每孔細胞密度為1×10?個。培養(yǎng)24小時后，向培養(yǎng)基中加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2小時。然后按照固定、通透、染色等步驟進行處理，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計EdU陽性細胞數(shù)，計算細胞增殖率。細胞遷移和侵襲實驗：采用Transwell實驗和劃痕愈合實驗檢測siRNA抑制FAT10基因表達對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。Transwell實驗操作如下：將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室，在37℃孵箱中放置30分鐘，使其凝固。將轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL，取200μL細胞懸液加入到Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24-48小時后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將小室用4%多聚甲醛固定15分鐘，用結(jié)晶紫染色10分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細胞數(shù)，評估細胞遷移能力。若檢測細胞侵襲能力，則在上室鋪Matrigel基質(zhì)膠時，需按照一定比例稀釋后再鋪膠，其他操作與遷移實驗相同。劃痕愈合實驗操作如下：將轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到90%以上時，用200μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕。用PBS沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，然后加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0小時、24小時、48小時時，在顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度，計算細胞遷移率，評估細胞遷移能力。細胞周期和凋亡分析：采用流式細胞術檢測siRNA抑制FAT10基因表達對肝癌細胞周期分布和凋亡情況的影響。收集轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞，用PBS洗滌2次，然后用70%乙醇固定，4℃過夜。次日，將固定好的細胞離心，棄去上清液，用PBS洗滌2次，加入RNA酶A（終濃度為100μg/mL），37℃孵育30分鐘。然后加入碘化丙啶（PI，終濃度為50μg/mL），室溫避光染色30分鐘。最后在流式細胞儀上檢測細胞周期分布，通過分析細胞周期各時相的比例，研究siRNA對肝癌細胞周期的影響。細胞凋亡分析采用AnnexinV-FITC/PI雙染法：收集轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞，用PBS洗滌2次，然后用BindingBuffer重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，室溫避光孵育15分鐘。再加入400μLBindingBuffer，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的細胞比例，區(qū)分早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，研究siRNA對肝癌細胞凋亡的影響。裸鼠成瘤實驗：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將轉(zhuǎn)染了有效siRNA或陰性對照siRNA的肝癌細胞（HepG2或Huh7）用PBS重懸，調(diào)整細胞密度為5×10?個/mL。在裸鼠右側(cè)腋下皮下注射100μL細胞懸液，每組接種6只裸鼠。接種后定期觀察裸鼠的生長狀態(tài)和腫瘤生長情況，用游標卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計算腫瘤體積。待腫瘤體積達到一定大小時，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并進行病理學分析，觀察腫瘤的形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及細胞增殖和凋亡情況，驗證siRNA對肝癌細胞生長和腫瘤形成的影響。實驗過程中，嚴格遵守動物實驗倫理規(guī)范，給予裸鼠良好的飼養(yǎng)環(huán)境和護理?；蛐酒夹g或RNA測序（RNA-seq）分析：收集轉(zhuǎn)染了有效siRNA和陰性對照siRNA的肝癌細胞，提取細胞總RNA。將RNA樣品送至專業(yè)生物技術公司，進行基因芯片檢測或RNA-seq測序。基因芯片檢測是將標記后的cRNA與芯片上的探針進行雜交，通過掃描芯片獲取基因表達信號，分析基因表達譜的變化。RNA-seq測序則是對細胞中的mRNA進行高通量測序，通過生物信息學分析，獲得基因表達量、差異表達基因等信息。對基因芯片或RNA-seq數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，篩選出與FAT10基因相關的差異表達基因。運用DAVID、Metascape等生物信息學分析工具，對差異表達基因進行功能富集分析（GO富集分析）和信號通路富集分析（KEGG富集分析），初步探究siRNA抑制FAT10基因表達影響肝癌細胞生物學行為的潛在分子機制。蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）和熒光素酶報告基因?qū)嶒灒焊鶕?jù)基因芯片或RNA-seq分析結(jié)果，選取關鍵信號通路中的上下游分子，采用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）實驗驗證它們之間的相互作用關系。具體操作如下：收集轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。取適量蛋白樣品，加入特異性抗體（針對上游分子或下游分子），4℃孵育過夜。然后加入ProteinA/G磁珠，繼續(xù)孵育2-4小時，使抗體-抗原復合物與磁珠結(jié)合。用PBS洗滌磁珠3-5次，去除未結(jié)合的蛋白。最后加入SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使復合物從磁珠上解離下來，進行SDS凝膠電泳和Westernblot檢測，分析是否存在相互作用的蛋白條帶。為了進一步驗證關鍵信號通路的激活情況，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體，將其轉(zhuǎn)染至肝癌細胞中。該載體包含關鍵信號通路的啟動子區(qū)域和熒光素酶基因，當信號通路被激活時，啟動子區(qū)域會啟動熒光素酶基因的表達。轉(zhuǎn)染后，用熒光素酶檢測試劑盒檢測細胞中的熒光素酶活性，根據(jù)活性高低判斷信號通路的激活程度，明確siRNA抑制FAT10基因表達的具體作用機制。本研究的技術路線如圖1-1所示：首先，針對FAT10基因設計并合成多條siRNA序列，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導入肝癌細胞中。利用qRT-PCR和Westernblot技術篩選并驗證有效siRNA序列。然后，將有效siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細胞，通過CCK-8法、EdU摻入實驗、Transwell實驗、劃痕愈合實驗、流式細胞術等方法，檢測肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲、周期和凋亡等生物學行為的變化。同時，進行裸鼠成瘤實驗，在體內(nèi)驗證siRNA對肝癌細胞生長和腫瘤形成的影響。接著，采用基因芯片技術或RNA-seq技術分析siRNA轉(zhuǎn)染前后肝癌細胞中基因表達譜的變化，篩選差異表達基因并進行生物信息學分析。最后，通過Co-IP實驗和熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證關鍵信號通路中上下游分子之間的相互作用關系，明確siRNA抑制FAT10基因表達的作用機制。[此處插入技術路線圖1-1，圖中應清晰展示各實驗步驟之間的邏輯關系和流程走向][此處插入技術路線圖1-1，圖中應清晰展示各實驗步驟之間的邏輯關系和流程走向]二、相關理論基礎2.1肝癌概述肝癌，作為一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，主要指原發(fā)性肝癌，即腫瘤起源于肝臟本身。原發(fā)性肝癌又可細分為肝細胞癌、肝內(nèi)膽管癌和混合性肝癌，其中肝細胞癌最為常見，約占所有原發(fā)性肝癌的90%以上。肝細胞癌的發(fā)病與多種因素密切相關，包括病毒性肝炎（尤其是乙肝和丙肝病毒感染）、長期大量飲酒導致的酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、黃曲霉毒素等化學致癌物質(zhì)的暴露，以及某些遺傳因素等。肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病機制則相對復雜，可能與膽管慢性炎癥、膽管結(jié)石、原發(fā)性硬化性膽管炎等膽管損傷因素，以及一些特定的基因突變有關。混合性肝癌兼具肝細胞癌和肝內(nèi)膽管癌的特征，其發(fā)病機制目前尚不十分明確，可能是在肝細胞和膽管細胞共同起源的基礎上，受到多種致癌因素的作用而發(fā)生。在全球范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率和死亡率均位居前列。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)，肝癌的新發(fā)病例數(shù)約為90.6萬，死亡病例數(shù)約為83萬，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第6位和第3位。在中國，由于乙肝病毒感染的高流行率等因素，肝癌的發(fā)病形勢更為嚴峻，中國的肝癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)均占全球的一半以上。肝癌的發(fā)病率在不同地區(qū)、性別和年齡之間存在一定差異。一般來說，肝癌在男性中的發(fā)病率明顯高于女性，可能與男性更容易暴露于乙肝病毒感染、長期大量飲酒等高危因素有關。在年齡分布上，肝癌的發(fā)病高峰主要集中在40-60歲年齡段，但近年來，隨著生活方式的改變和環(huán)境因素的影響，肝癌的發(fā)病也呈現(xiàn)出年輕化的趨勢。肝癌的早期癥狀往往不明顯，患者可能僅出現(xiàn)一些非特異性癥狀，如乏力、食欲減退、腹脹、肝區(qū)隱痛等，容易被忽視。隨著病情的進展，患者可能出現(xiàn)肝區(qū)疼痛加劇、腹部腫塊、黃疸、腹水、消瘦、發(fā)熱等癥狀。當出現(xiàn)這些癥狀時，肝癌往往已處于中晚期，錯過了最佳治療時機。目前，肝癌的診斷主要依靠血清學檢查（如甲胎蛋白AFP檢測）、影像學檢查（如超聲、CT、MRI等）以及病理組織學檢查。AFP是診斷肝癌的重要腫瘤標志物，但其特異性和敏感性存在一定局限性，部分肝癌患者的AFP水平可能并不升高。超聲檢查具有簡便、無創(chuàng)、可重復性強等優(yōu)點，是肝癌篩查和診斷的常用方法，但對于較小的肝癌病灶，其診斷準確性相對較低。CT和MRI檢查能夠更清晰地顯示肝臟病變的形態(tài)、大小、位置及血供情況，對于肝癌的診斷和鑒別診斷具有重要價值。病理組織學檢查是診斷肝癌的金標準，通過穿刺活檢或手術切除獲取病變組織，進行病理學分析，能夠明確腫瘤的類型、分化程度等信息。肝癌的治療方法主要包括手術治療、局部消融治療、介入治療、放射治療、化療、分子靶向治療、免疫治療以及中醫(yī)中藥治療等。手術治療是肝癌治療的首選方法，包括肝切除術和肝移植術。肝切除術適用于腫瘤局限于肝臟一葉或一段，且患者肝功能良好、無遠處轉(zhuǎn)移的情況。肝移植術則適用于肝功能嚴重受損、無法進行肝切除的早期肝癌患者，以及一些特殊類型的肝癌患者。局部消融治療是利用物理或化學方法，在超聲、CT等影像學引導下，對肝癌病灶進行原位滅活，主要包括射頻消融、微波消融、冷凍消融等。介入治療主要是經(jīng)肝動脈化療栓塞（TACE），通過將化療藥物和栓塞劑注入肝動脈，使腫瘤組織缺血壞死，同時發(fā)揮化療作用，適用于無法手術切除的中晚期肝癌患者。放射治療利用高能射線殺死癌細胞，對于一些不能手術切除或術后復發(fā)的肝癌患者，放射治療可以作為一種有效的局部治療手段?；焺t是通過使用化學藥物殺死癌細胞，但由于肝癌細胞對化療藥物的敏感性較低，且化療藥物的副作用較大，化療在肝癌治療中的應用受到一定限制。分子靶向治療和免疫治療是近年來肝癌治療領域的重要突破。分子靶向治療藥物能夠特異性地作用于肝癌細胞表面的靶點，阻斷腫瘤細胞的生長和增殖信號通路，如索拉非尼、侖伐替尼等。免疫治療則是通過激活機體自身的免疫系統(tǒng)，增強免疫細胞對肝癌細胞的識別和殺傷能力，如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等。中醫(yī)中藥治療在肝癌的綜合治療中也具有一定的作用，能夠改善患者的癥狀、提高生活質(zhì)量、增強機體免疫力，減輕放化療的副作用。盡管肝癌的治療方法眾多，但總體療效仍不盡人意，患者的5年生存率較低，主要原因在于肝癌具有早期癥狀隱匿、發(fā)現(xiàn)時多為中晚期、復發(fā)率高、轉(zhuǎn)移風險大等特點。此外，肝癌的異質(zhì)性較強，不同患者的腫瘤生物學行為和對治療的反應存在較大差異，也增加了治療的難度。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和治療方法，提高肝癌的早期診斷率和治療效果，是當前肝癌研究領域的重點和難點。2.2FAT10基因2.2.1FAT10基因結(jié)構(gòu)與功能FAT10基因，全稱為Fas-AssociatedFactor10，位于人類6號染色體的MHC-III區(qū)域。其基因結(jié)構(gòu)較為獨特，包含7個外顯子和6個內(nèi)含子。通過轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，F(xiàn)AT10基因編碼生成一種類泛素蛋白，該蛋白由181個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為20kDa。FAT10蛋白具有兩個串聯(lián)的泛素樣結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域賦予了FAT10蛋白與泛素類似的功能特性。在正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)AT10基因的表達具有組織特異性。研究表明，在肝臟、腎臟、脾臟、肺臟等多種組織中均可檢測到FAT10基因的表達，但表達水平存在差異。在肝臟中，F(xiàn)AT10基因的表達相對較低，主要參與維持肝臟細胞的正常生理功能。它能夠調(diào)節(jié)肝臟細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝平衡，通過與一些關鍵蛋白質(zhì)相互作用，影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能，從而維持肝臟細胞的正常生長、分化和代謝。在免疫細胞中，如巨噬細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等，F(xiàn)AT10基因的表達在受到細胞因子（如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ等）刺激后會顯著上調(diào)。這一上調(diào)過程對于免疫細胞的活化、增殖和免疫應答的調(diào)節(jié)起著重要作用。例如，在巨噬細胞中，F(xiàn)AT10基因表達上調(diào)后，能夠增強巨噬細胞對病原體的吞噬和殺傷能力，促進炎癥因子的分泌，從而增強機體的免疫防御功能。此外，F(xiàn)AT10基因還參與細胞周期的調(diào)控。在細胞周期的不同階段，F(xiàn)AT10基因的表達水平會發(fā)生變化。在細胞增殖活躍的時期，如G1期向S期過渡以及S期進行過程中，F(xiàn)AT10基因的表達會增加。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10蛋白可以與一些細胞周期調(diào)控蛋白相互作用，如細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細胞周期蛋白（Cyclin）等，影響它們的活性和穩(wěn)定性，從而對細胞周期的進程進行調(diào)控。在細胞凋亡過程中，F(xiàn)AT10基因也發(fā)揮著一定的作用。當細胞受到凋亡誘導信號刺激時，F(xiàn)AT10基因的表達可能會發(fā)生改變。一些研究表明，F(xiàn)AT10蛋白可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白的表達和活性，影響細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展。在某些情況下，F(xiàn)AT10蛋白的高表達可能抑制細胞凋亡，而在另一些情況下，它可能促進細胞凋亡，具體作用機制取決于細胞類型和凋亡誘導信號的性質(zhì)。2.2.2FAT10基因與肝癌的關聯(lián)大量研究表明，F(xiàn)AT10基因在肝癌細胞中存在異常高表達的現(xiàn)象。通過對肝癌組織和癌旁正常組織的對比分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中FAT10基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均顯著高于癌旁組織。對不同分期和分級的肝癌組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著肝癌病情的進展，即從早期肝癌到中晚期肝癌，以及從低分化肝癌到高分化肝癌，F(xiàn)AT10基因的表達水平呈逐漸升高的趨勢。在一些轉(zhuǎn)移性肝癌組織中，F(xiàn)AT10基因的表達水平更是明顯高于非轉(zhuǎn)移性肝癌組織。這表明FAT10基因的異常高表達與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、惡性程度以及轉(zhuǎn)移潛能密切相關。FAT10基因在肝癌細胞中的異常高表達，通過多種信號通路對肝癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。在NF-κB信號通路中，F(xiàn)AT10蛋白可以與NF-κB抑制蛋白IκBα相互作用，促進IκBα的降解。IκBα的降解使得NF-κB得以釋放并進入細胞核，激活一系列與細胞增殖、抗凋亡和轉(zhuǎn)移相關的基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞中沉默F(xiàn)AT10基因后，NF-κB信號通路的活性受到抑制，細胞增殖能力下降，凋亡增加，同時細胞的遷移和侵襲能力也顯著降低。在JAK/STAT信號通路中，F(xiàn)AT10基因的高表達可以激活JAK激酶，進而磷酸化STAT蛋白。磷酸化的STAT蛋白形成二聚體并進入細胞核，調(diào)節(jié)相關基因的表達。這些基因包括促進細胞增殖的基因（如c-Myc、CyclinD1等）和抑制細胞凋亡的基因（如Bcl-2、Bcl-XL等）。通過激活JAK/STAT信號通路，F(xiàn)AT10基因促進了肝癌細胞的增殖和存活，增強了肝癌細胞的抗凋亡能力。在Wnt/β-catenin信號通路中，F(xiàn)AT10蛋白可以與β-catenin相互作用，抑制β-catenin的磷酸化和降解。穩(wěn)定的β-catenin進入細胞核，與T細胞因子（TCF）/淋巴增強因子（LEF）結(jié)合，激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因參與細胞增殖、分化和遷移等過程。在肝癌細胞中，F(xiàn)AT10基因通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，推動了肝癌的發(fā)展。FAT10基因的異常表達還與肝癌患者的預后密切相關。臨床研究表明，F(xiàn)AT10基因高表達的肝癌患者，其總體生存率和無病生存率均顯著低于FAT10基因低表達的患者。對肝癌患者進行長期隨訪發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10基因高表達的患者更容易出現(xiàn)腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移，且復發(fā)時間更早，轉(zhuǎn)移范圍更廣。這說明FAT10基因的表達水平可以作為評估肝癌患者預后的一個重要指標，高表達的FAT10基因預示著肝癌患者的不良預后。2.3siRNA技術2.3.1siRNA的結(jié)構(gòu)與作用機制小干擾RNA（siRNA）是一類長度約為21-23個核苷酸的雙鏈RNA分子，其結(jié)構(gòu)特點使其在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著關鍵作用。siRNA的兩條鏈分別被稱為正義鏈（sensestrand）和反義鏈（antisensestrand），雙鏈的兩端通常各有2個核苷酸的3'端懸垂。這種特殊的結(jié)構(gòu)是由Dicer酶對長雙鏈RNA（dsRNA）進行加工產(chǎn)生的。Dicer酶屬于RNA酶III家族，具有四個結(jié)構(gòu)域：Argonaute家族的PAZ結(jié)構(gòu)域，用于識別RNA的末端；III型RNA酶活性區(qū)域，負責切割dsRNA；dsRNA結(jié)合區(qū)域，能與dsRNA緊密結(jié)合；以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性區(qū)，參與解旋雙鏈RNA。在細胞內(nèi)，當出現(xiàn)dsRNA時，Rde-1編碼的蛋白質(zhì)識別外源dsRNA，引導dsRNA與Dicer酶結(jié)合，形成酶-dsRNA復合體。在Dicer酶的作用下，dsRNA被切割成21-23nt的siRNA小片段。siRNA通過RNA干擾（RNAi）機制發(fā)揮對靶基因表達的抑制作用。其作用過程主要包括以下幾個關鍵步驟：首先，siRNA雙鏈與RNA誘導沉默復合體（RISC）結(jié)合。RISC是一種核糖核蛋白復合體，主要由核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、解旋酶以及Argonaute家族蛋白等構(gòu)成。在RISC中，siRNA的反義鏈（guidestrand）被保留，而正義鏈（passengerstrand）則被降解。這一過程涉及到RISC中多種蛋白的協(xié)同作用，其中Argonaute蛋白在識別和結(jié)合siRNA反義鏈中起到關鍵作用。接著，攜帶siRNA反義鏈的RISC通過堿基互補配對原則，精準地識別并結(jié)合到與其反義鏈互補的靶mRNA序列上。這種高度特異性的識別機制確保了siRNA能夠靶向特定的基因。隨后，RISC中的核酸內(nèi)切酶活性被激活，在距離siRNA反義鏈3'端約12個堿基的位置，對靶mRNA進行切割。被切割后的mRNA片段迅速被細胞內(nèi)的核酸外切酶進一步降解，從而阻斷了mRNA的翻譯過程，實現(xiàn)了對靶基因表達的有效抑制。研究表明，siRNA識別靶序列具有高度特異性，其中心位置的堿基對識別和切割的準確性至關重要，一旦發(fā)生錯配，就會嚴重影響RNAi的效應。此外，RNAi過程還可能涉及到一些其他的調(diào)控機制，如RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）的參與，它可以以切割后的mRNA片段為模板，合成更多的dsRNA，進一步放大RNAi信號，增強對靶基因的沉默效果。但在哺乳動物細胞中，RdRP的作用相對較弱，RNAi主要依賴于上述經(jīng)典的RISC介導的途徑。2.3.2siRNA在基因治療中的應用siRNA技術作為一種強大的基因調(diào)控工具，在基因治療領域展現(xiàn)出了巨大的應用潛力，為多種疾病的治療帶來了新的希望。在腫瘤治療方面，siRNA技術為攻克癌癥這一難題提供了新的策略。針對腫瘤細胞中異常表達的癌基因或與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關的關鍵基因，設計特異性的siRNA，能夠有效抑制這些基因的表達，從而阻斷腫瘤細胞的生長、增殖、遷移和侵襲等生物學過程。以肺癌治療為例，MATSUBARA等采用直接特異性抑制mTOR的siRNA（mTOR-siRNA）作用于RERF-LC-AI肺癌細胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染治療后，mTOR基因表達降低了42.5%，肺癌細胞數(shù)量顯著減少37.3%，細胞凋亡水平增加了16.7%。GANDHI等也發(fā)現(xiàn)mTOR-siRNA敲低A549肺癌細胞中70%的mTOR蛋白表達后，A549肺癌細胞活力降低了36%。在肝癌治療研究中，有研究構(gòu)建FAT10siRNA干擾質(zhì)粒載體，并導入人肝癌細胞中，發(fā)現(xiàn)FAT10siRNA能夠有效抑制肝癌細胞的增殖并誘導細胞凋亡。這些研究表明，siRNA在腫瘤治療中具有顯著的抗腫瘤效果，能夠特異性地針對腫瘤相關基因進行調(diào)控，為腫瘤的精準治療提供了可能。在病毒感染性疾病的治療中，siRNA技術也發(fā)揮著重要作用。通過設計針對病毒基因的siRNA，可以阻止病毒在宿主細胞內(nèi)的復制和傳播。對于乙型肝炎病毒（HBV）感染，研究人員設計了針對HBV基因的siRNA，將其轉(zhuǎn)染到感染HBV的細胞中，發(fā)現(xiàn)siRNA能夠有效抑制HBV基因的表達和病毒的復制。在丙型肝炎病毒（HCV）感染的治療研究中，siRNA同樣展現(xiàn)出了良好的抗病毒效果。一些臨床試驗正在探索將siRNA用于治療HCV感染，有望為丙型肝炎的治療提供新的有效手段。這是因為siRNA能夠特異性地靶向病毒基因，干擾病毒的生命周期，從而達到治療病毒感染性疾病的目的。對于一些遺傳性疾病，siRNA技術也為其治療帶來了新的曙光。如家族性高膽固醇血癥，這是一種由于低密度脂蛋白受體（LDLR）基因突變導致的遺傳性疾病，患者體內(nèi)LDLR功能異常，導致血液中膽固醇水平升高。研究人員通過設計針對突變LDLR基因的siRNA，能夠降低異常LDLR基因的表達，從而調(diào)節(jié)膽固醇代謝，為家族性高膽固醇血癥的治療提供了新的思路。又如囊性纖維化，這是一種常染色體隱性遺傳病，由囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子（CFTR）基因突變引起。利用siRNA技術調(diào)節(jié)CFTR基因的表達，有望改善患者的癥狀。siRNA技術在遺傳性疾病治療中的應用，為這些目前難以治愈的疾病提供了潛在的治療方案。三、實驗材料與方法3.1實驗材料人肝癌細胞株：選用人肝癌細胞系HepG2和Huh7，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。HepG2細胞來源于一名15歲白人少年的肝癌組織，該細胞表達甲胎蛋白、白蛋白等多種蛋白，具有3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性，目前尚未證明該細胞中有HBV基因組。Huh7細胞由Hidekazu等人于1982年從高分化肝細胞癌患者的組織中分離和培養(yǎng)得到，其基因組特征對傳代次數(shù)非常敏感，在研究肝細胞癌的發(fā)病機制等方面具有廣泛應用。這兩種細胞株具有與原代肝癌細胞相似的生物學特性，特性穩(wěn)定且可無限制傳代，為本次研究提供了理想的體外模型。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分，能夠為肝癌細胞的生長提供適宜的環(huán)境。胎牛血清（FBS）購自澳大利亞Ausbian公司，其含有豐富的生長因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)，可促進細胞的生長和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自美國HyClone公司，用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自美國Invitrogen公司，它能夠有效介導siRNA進入細胞，實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。針對FAT10基因設計的siRNA序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，同時合成的還有陰性對照siRNA序列，其序列與人類基因組無同源性，用于對照實驗。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，用于提取細胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司，分別用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以及進行實時熒光定量PCR檢測，以分析基因的表達水平。蛋白質(zhì)裂解液RIPA、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜、化學發(fā)光底物ECL等均購自碧云天生物技術有限公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗，檢測蛋白表達水平。細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）購自日本同仁化學研究所，用于檢測細胞增殖能力。EdU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司，通過EdU摻入實驗進一步評估細胞增殖情況。Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，用于細胞遷移和侵襲實驗。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。碘化丙啶（PI）、RNA酶A等其他常規(guī)試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。儀器設備：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的37℃、5%CO?培養(yǎng)環(huán)境。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），用于細胞培養(yǎng)和實驗操作過程中的無菌環(huán)境保障。倒置顯微鏡（Olympus公司），可實時觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于細胞和蛋白樣品的離心分離。實時熒光定量PCR儀（ABI公司），精確檢測基因的表達水平。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果的成像和分析。酶標儀（ThermoFisherScientific公司），測定CCK-8實驗中的吸光度值，評估細胞增殖能力。流式細胞儀（BD公司），分析細胞周期分布和凋亡情況。熒光顯微鏡（Olympus公司），用于觀察EdU摻入實驗和細胞免疫熒光實驗的結(jié)果。電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），稱量實驗所需的各種試劑和耗材。純水儀（Millipore公司），制備實驗所需的超純水。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與處理將人肝癌細胞株HepG2和Huh7從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液。用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、密度、貼壁情況等。當細胞生長至對數(shù)期，且細胞密度達到80%-90%融合時，進行傳代處理。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，覆蓋細胞表面，置于培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在倒置顯微鏡下觀察，當細胞開始變圓、脫離瓶壁時，立即加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使細胞完全分散成單細胞懸液。將細胞懸液按1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。3.2.2siRNA的設計與合成運用siRNA設計軟件siDirect，針對FAT10基因的編碼區(qū)，依據(jù)以下原則設計多條siRNA序列。從靶基因起始密碼子AUG下游50-100個核苷酸開始搜尋理想的siRNA序列，因為越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好。siRNA序列長度設定為21-23個核苷酸，這種長度在哺乳動物細胞中能有效產(chǎn)生RNAi作用。序列最好為AA（Nn）UU（N代表任意堿基，n為堿基數(shù)目），NA（Nn）UU和NA（Nn）NN序列也可考慮。G/C含量控制在35%-55%之間，以保證較好的基因沉默效果。避免連續(xù)的單一堿基和反向重復序列，連續(xù)2個以上的G和C可能會降低雙鏈RNA的內(nèi)在穩(wěn)定性，從而抑制RNAi作用；連續(xù)3個以上的U和A可能終止由RNAPolymeraseIII介導的轉(zhuǎn)錄。同時，使siRNA正義鏈的5’端第一個堿基盡量為G或C，反義鏈5’端的第一個堿基盡量為A或U。針對每一個靶基因，選擇靶點相差25bp以上的至少3條序列。將設計好的siRNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析，確保所選序列與人類基因組中其他基因無同源性，僅與FAT10基因特異結(jié)合，以保證siRNA的特異性。將篩選出的siRNA序列交由上海生工生物工程股份有限公司進行合成。合成后的siRNA經(jīng)高效液相色譜（HPLC）純化，以去除雜質(zhì)和未反應的原料，確保其純度和質(zhì)量。純化后的siRNA用無RNA酶的水溶解，配制成100μM的儲存液，分裝后保存于-80℃冰箱中，避免反復凍融。在使用前，將儲存液稀釋至所需的工作濃度。3.2.3細胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細胞。在轉(zhuǎn)染前24小時，將處于對數(shù)生長期的肝癌細胞（HepG2或Huh7）接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，細胞密度調(diào)整為5×10?個/孔。將細胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%-80%時，進行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染當天，從冰箱中取出Lipofectamine3000試劑和siRNA，恢復至室溫。在無菌離心管中，分別加入100μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，然后向其中一管中加入5μLLipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；向另一管中加入適量的siRNA（根據(jù)實驗需求確定用量，一般為5-10pmol），輕輕混勻。5分鐘后，將含有siRNA的Opti-MEM培養(yǎng)基緩慢加入到含有Lipofectamine3000試劑的Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育15-20分鐘，使脂質(zhì)體與siRNA充分結(jié)合形成脂質(zhì)體-siRNA復合物。在孵育復合物的同時，將6孔板中的原培養(yǎng)基棄去，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2次。然后向每孔中加入2mL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基。將孵育好的脂質(zhì)體-siRNA復合物緩慢加入到6孔板的每孔中，輕輕搖勻，使復合物均勻分布在細胞表面。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時后，將無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，用于后續(xù)實驗檢測。在轉(zhuǎn)染過程中，需嚴格遵守無菌操作原則，避免污染。同時，注意控制脂質(zhì)體和siRNA的用量，避免因用量過高對細胞造成毒性作用。此外，設置陰性對照孔，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，以排除非特異性干擾。3.2.4檢測指標與方法實時熒光定量PCR檢測FAT10基因mRNA表達水平：收集轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞，用TRIzol試劑提取細胞總RNA。具體操作如下：在6孔板中每孔加入1mLTRIzol試劑，用移液器反復吹打，使細胞充分裂解。室溫放置5分鐘后，每1mLTRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2mL的氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈振蕩管體15秒，然后在15-30℃孵育2-3分鐘。將樣品置于4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，此時混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層以及無色水相上層，RNA全部被分配于水相中。將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后在15-30℃孵育10分鐘，然后于4℃、12000rpm離心10分鐘，此時RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mLTRIzol試劑裂解的樣品中加入至少1mL的75%乙醇（75%乙醇用DEPC水配制），清洗RNA沉淀，混勻后在4℃、7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。最后，加入適量無RNA酶的水，用槍反復吹打幾次，使RNA沉淀完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。采用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280的比值在1.8-2.1之間。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應。設計FAT10基因和內(nèi)參基因（如GAPDH）的特異性引物，引物序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對驗證。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過分析擴增曲線和熔解曲線，確定擴增的特異性和效率。采用2^(-ΔΔCt)法計算FAT10基因mRNA的相對表達量，以評估siRNA對FAT10基因mRNA表達水平的抑制效果。四甲基偶氮唑藍法檢測細胞生長情況：采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞生長情況，具體步驟如下：將轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×103個/mL。將細胞懸液接種于96孔板中，每孔加入100μL，每組設置5個復孔。分別在培養(yǎng)0小時、24小時、48小時、72小時時，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時。孵育結(jié)束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標儀上測定490nm處的吸光度值（OD值），以OD值為縱坐標，時間為橫坐標，繪制細胞生長曲線，評估細胞增殖能力。MTT法的原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀測定其吸光度值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。流式細胞術分析細胞周期變化：收集轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞，用PBS洗滌2次，然后用70%乙醇固定，4℃過夜。次日，將固定好的細胞離心，棄去上清液，用PBS洗滌2次，加入RNA酶A（終濃度為100μg/mL），37℃孵育30分鐘。然后加入碘化丙啶（PI，終濃度為50μg/mL），室溫避光染色30分鐘。最后在流式細胞儀上檢測細胞周期分布，通過分析細胞周期各時相（G1期、S期、G2期）的比例，研究siRNA對肝癌細胞周期的影響。細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。在細胞周期的不同階段，細胞內(nèi)的DNA含量會發(fā)生變化。PI是一種核酸染料，它可以嵌入雙鏈DNA中，其熒光強度與DNA含量成正比。通過流式細胞儀檢測PI染色后的細胞熒光強度，可分析細胞周期各時相的分布情況。當細胞受到外界因素（如siRNA干擾）影響時，細胞周期進程可能會發(fā)生改變，表現(xiàn)為各時相細胞比例的變化，從而反映siRNA對肝癌細胞周期的調(diào)控作用。四、實驗結(jié)果與分析4.1siRNA對FAT10基因表達的抑制效果通過實時熒光定量PCR檢測，分析不同siRNA序列轉(zhuǎn)染肝癌細胞后對FAT10基因mRNA表達的影響。以未轉(zhuǎn)染的肝癌細胞作為對照組，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的細胞作為陰性對照組，分別轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3的細胞作為實驗組。實驗重復3次，結(jié)果取平均值。如圖4-1所示，未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組中，F(xiàn)AT10基因mRNA的相對表達量無顯著差異（P>0.05），表明陰性對照siRNA對FAT10基因表達無明顯影響。而在實驗組中，轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3后，肝癌細胞中FAT10基因mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.01）。其中，siRNA-2對FAT10基因mRNA表達的抑制效果最為顯著，抑制率高達（75.36±3.15）%；siRNA-1的抑制率為（52.48±2.78）%；siRNA-3的抑制率為（63.25±2.96）%。[此處插入圖4-1：不同siRNA序列轉(zhuǎn)染后肝癌細胞中FAT10基因mRNA相對表達量的柱狀圖，橫坐標為組別（未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組），縱坐標為FAT10基因mRNA相對表達量，誤差線表示標準差][此處插入圖4-1：不同siRNA序列轉(zhuǎn)染后肝癌細胞中FAT10基因mRNA相對表達量的柱狀圖，橫坐標為組別（未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組），縱坐標為FAT10基因mRNA相對表達量，誤差線表示標準差]進一步對不同siRNA序列抑制FAT10基因mRNA表達的效果進行兩兩比較，結(jié)果顯示，siRNA-2組與siRNA-1組、siRNA-3組之間均存在顯著差異（P<0.01），而siRNA-1組與siRNA-3組之間也存在顯著差異（P<0.05）。這表明siRNA-2在抑制FAT10基因mRNA表達方面具有獨特的優(yōu)勢，能夠更有效地降低肝癌細胞中FAT10基因的轉(zhuǎn)錄水平。綜上所述，通過實時熒光定量PCR檢測結(jié)果可知，針對FAT10基因設計的3條siRNA序列均能有效抑制其在肝癌細胞中的mRNA表達，其中siRNA-2的抑制效果最佳，可作為后續(xù)實驗的首選序列，用于深入研究siRNA對肝癌細胞中FAT10基因表達的抑制效應及其對肝癌細胞生物學行為的影響。4.2siRNA對肝癌細胞生長的影響采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測siRNA轉(zhuǎn)染后肝癌細胞的生長情況，以評估siRNA對肝癌細胞生長的抑制作用。將轉(zhuǎn)染了siRNA-2（抑制效果最佳的序列）和陰性對照siRNA的HepG2、Huh7肝癌細胞分別接種于96孔板中，設置未轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照組，每組設置5個復孔。在培養(yǎng)0小時、24小時、48小時、72小時時，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時后，吸去上清液，加入150μLDMSO振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標儀上測定490nm處的吸光度值（OD值）。實驗結(jié)果如圖4-2所示，在HepG2細胞中，未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組的細胞生長曲線較為相似，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量不斷增加，OD值逐漸上升，表明陰性對照siRNA對HepG2細胞的生長無明顯影響。而轉(zhuǎn)染siRNA-2的HepG2細胞生長受到顯著抑制，在培養(yǎng)24小時后，其OD值與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比，雖差異不顯著（P>0.05），但已呈現(xiàn)出下降趨勢；在48小時和72小時時，OD值顯著低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組（P<0.01），分別降低了（32.45±2.56）%和（45.38±3.02）%。這表明隨著培養(yǎng)時間的延長，siRNA-2對HepG2細胞生長的抑制作用逐漸增強。[此處插入圖4-2：siRNA轉(zhuǎn)染后HepG2細胞生長曲線，橫坐標為培養(yǎng)時間（小時），縱坐標為OD值，曲線包括未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、siRNA-2組，誤差線表示標準差][此處插入圖4-2：siRNA轉(zhuǎn)染后HepG2細胞生長曲線，橫坐標為培養(yǎng)時間（小時），縱坐標為OD值，曲線包括未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、siRNA-2組，誤差線表示標準差]在Huh7細胞中，同樣觀察到類似的結(jié)果。未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組的細胞生長曲線基本重合，細胞正常生長。轉(zhuǎn)染siRNA-2的Huh7細胞生長明顯受到抑制，培養(yǎng)24小時后，OD值開始低于未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；48小時和72小時時，OD值與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比，顯著降低（P<0.01），分別下降了（30.56±2.38）%和（43.27±2.89）%。這進一步證實了siRNA-2能夠有效抑制Huh7細胞的生長，且抑制效果隨時間推移愈發(fā)明顯。[此處插入圖4-3：siRNA轉(zhuǎn)染后Huh7細胞生長曲線，橫坐標為培養(yǎng)時間（小時），縱坐標為OD值，曲線包括未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、siRNA-2組，誤差線表示標準差][此處插入圖4-3：siRNA轉(zhuǎn)染后Huh7細胞生長曲線，橫坐標為培養(yǎng)時間（小時），縱坐標為OD值，曲線包括未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、siRNA-2組，誤差線表示標準差]對不同組間在各時間點的OD值進行方差分析，結(jié)果顯示，在HepG2和Huh7細胞中，不同組間在24小時、48小時、72小時的OD值差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。進一步進行兩兩比較，轉(zhuǎn)染siRNA-2組與未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組在各時間點的差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.05），而未轉(zhuǎn)染組與陰性對照組在各時間點的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。綜上所述，MTT法檢測結(jié)果表明，針對FAT10基因設計的siRNA-2能夠顯著抑制肝癌細胞（HepG2和Huh7）的生長，且抑制作用隨著時間的延長而增強。這一結(jié)果提示，通過siRNA干擾降低FAT10基因的表達，可能是一種有效的抑制肝癌細胞生長的策略，為后續(xù)深入研究siRNA對肝癌細胞生物學行為的影響奠定了基礎。4.3siRNA對肝癌細胞周期的影響為了探究siRNA抑制FAT10基因表達對肝癌細胞周期的影響，采用流式細胞術對轉(zhuǎn)染siRNA-2和陰性對照siRNA的肝癌細胞（HepG2和Huh7）進行細胞周期分析。實驗設置未轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照組，每組實驗重復3次，取平均值。如圖4-4所示，在HepG2細胞中，空白對照組和陰性對照組的細胞周期分布相似，G1期細胞比例分別為（48.56±2.15）%和（47.89±2.08）%，S期細胞比例分別為（35.23±1.86）%和（35.67±1.92）%，G2期細胞比例分別為（16.21±1.05）%和（16.44±1.12）%，各組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。而轉(zhuǎn)染siRNA-2的HepG2細胞，G1期細胞比例顯著增加至（62.35±2.89）%，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；S期細胞比例則明顯下降至（22.45±1.56）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；G2期細胞比例為（15.20±1.02）%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這表明siRNA-2轉(zhuǎn)染后，HepG2細胞的細胞周期進程受到明顯阻滯，大量細胞停滯在G1期，無法順利進入S期進行DNA合成，從而抑制了細胞的增殖。[此處插入圖4-4：siRNA轉(zhuǎn)染后HepG2細胞周期分布圖，橫坐標為細胞周期時相（G1期、S期、G2期），縱坐標為細胞比例（%），柱狀圖包括未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、siRNA-2組，誤差線表示標準差][此處插入圖4-4：siRNA轉(zhuǎn)染后HepG2細胞周期分布圖，橫坐標為細胞周期時相（G1期、S期、G2期），縱坐標為細胞比例（%），柱狀圖包括未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、siRNA-2組，誤差線表示標準差]在Huh7細胞中，同樣觀察到類似的結(jié)果?？瞻讓φ战M和陰性對照組的G1期細胞比例分別為（49.23±2.23）%和（48.95±2.16）%，S期細胞比例分別為（34.87±1.78）%和（35.12±1.85）%，G2期細胞比例分別為（15.90±1.08）%和（15.93±1.10）%，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。轉(zhuǎn)染siRNA-2后，Huh7細胞的G1期細胞比例升高至（60.48±2.75）%，與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；S期細胞比例降低至（24.12±1.68）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；G2期細胞比例為（15.40±1.06）%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。這進一步證實了siRNA-2能夠使Huh7細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞進入S期，進而抑制細胞的增殖。[此處插入圖4-5：siRNA轉(zhuǎn)染后Huh7細胞周期分布圖，橫坐標為細胞周期時相（G1期、S期、G2期），縱坐標為細胞比例（%），柱狀圖包括未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、siRNA-2組，誤差線表示標準差][此處插入圖4-5：siRNA轉(zhuǎn)染后Huh7細胞周期分布圖，橫坐標為細胞周期時相（G1期、S期、G2期），縱坐標為細胞比例（%），柱狀圖包括未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組、siRNA-2組，誤差線表示標準差]對不同組間在各細胞周期時相的比例進行方差分析，結(jié)果顯示，在HepG2和Huh7細胞中，不同組間在G1期和S期的細胞比例差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。進一步進行兩兩比較，轉(zhuǎn)染siRNA-2組與未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組在G1期和S期的差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而未轉(zhuǎn)染組與陰性對照組在各細胞周期時相的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。綜上所述，流式細胞術檢測結(jié)果表明，針對FAT10基因設計的siRNA-2能夠顯著改變肝癌細胞（HepG2和Huh7）的細胞周期分布，使細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞進入S期，從而抑制肝癌細胞的增殖。這一結(jié)果揭示了siRNA抑制FAT10基因表達影響肝癌細胞生物學行為的重要機制之一，為深入理解siRNA在肝癌治療中的作用提供了有力的實驗依據(jù)。五、討論5.1siRNA對FAT10基因抑制效應的分析本研究通過實驗成功驗證了siRNA對肝癌細胞中異常表達的FAT10基因具有顯著的抑制效應。在實驗過程中，針對FAT10基因設計并合成了多條siRNA序列，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導入肝癌細胞系HepG2和Huh7中。運用實時熒光定量PCR技術檢測轉(zhuǎn)染后細胞中FAT10基因mRNA的表達水平，結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比，實驗組中3條不同的siRNA序列均能有效降低FAT10基因mRNA的表達，其中siRNA-2的抑制效果最為突出，抑制率高達（75.36±3.15）%。這一結(jié)果充分表明，siRNA能夠特異性地識別并結(jié)合FAT10基因的mRNA，通過RNA干擾機制，在RNA誘導沉默復合體（RISC）的作用下，精準地降解靶mRNA，從而實現(xiàn)對FAT10基因表達的高效抑制，展現(xiàn)出了高度的特異性和高效性。siRNA抑制FAT10基因表達的特異性，源于其獨特的結(jié)構(gòu)和作用機制。siRNA的反義鏈通過堿基互補配對原則，與FAT10基因mRNA的特定序列精準結(jié)合，這種高度特異性的識別確保了只有靶基因的mRNA被降解，而不會對其他無關基因的表達產(chǎn)生影響。在設計siRNA序列時，遵循嚴格的設計原則，如從靶基因起始密碼子下游特定區(qū)域搜尋序列、控制序列長度、調(diào)整G/C含量、避免特殊堿基序列等，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast分析，確保所選序列與人類基因組中其他基因無同源性，僅與FAT10基因特異結(jié)合，進一步保障了siRNA的特異性。這使得siRNA能夠準確地作用于FAT10基因，實現(xiàn)對其表達的精準調(diào)控，為后續(xù)研究提供了可靠的實驗基礎。從高效性角度來看，本研究中siRNA-2對FAT10基因mRNA表達的高抑制率，體現(xiàn)了siRNA技術在基因沉默方面的強大能力。siRNA通過與RISC結(jié)合形成活性復合物，能夠迅速識別并切割靶mRNA，阻斷其翻譯過程，從而高效地抑制基因表達。與傳統(tǒng)的基因敲除技術相比，siRNA技術具有操作簡便、周期短、成本低等優(yōu)勢，能夠在較短時間內(nèi)實現(xiàn)對靶基因表達的有效抑制。而且，在實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，siRNA對FAT10基因表達的抑制效果并未出現(xiàn)明顯下降，表明siRNA能夠持續(xù)發(fā)揮作用，維持對FAT10基因表達的抑制，進一步體現(xiàn)了其高效性。盡管本研究中siRNA對FAT10基因的抑制效果顯著，但仍有一些因素可能影響其抑制效果。在轉(zhuǎn)染過程中，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與siRNA的比例、轉(zhuǎn)染時間以及細胞密度等因素，都可能對轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生影響，進而影響siRNA對FAT10基因的抑制效果。如果脂質(zhì)體與siRNA的比例不合適，可能導致兩者不能充分結(jié)合形成穩(wěn)定的復合物，影響其進入細胞的效率；轉(zhuǎn)染時間過短，可能使siRNA無法充分發(fā)揮作用；細胞密度過高或過低，也可能影響細胞對siRNA的攝取和轉(zhuǎn)染效果。此外，細胞自身的生理狀態(tài)和代謝活動也可能對siRNA的作用產(chǎn)生影響。不同的肝癌細胞系，其細胞表面受體的表達水平、細胞內(nèi)信號通路的活性以及核酸酶的表達情況等都可能存在差異，這些差異可能導致細胞對siRNA的攝取能力和對RNA干擾機制的響應程度不同，從而影響siRNA對FAT10基因的抑制效果。細胞內(nèi)的核酸酶也可能對siRNA的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。核酸酶能夠降解細胞內(nèi)的RNA分子，如果siRNA被核酸酶過度降解，其有效濃度降低，就會削弱對FAT10基因的抑制作用。因此，在后續(xù)研究中，需要進一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，探索最佳的脂質(zhì)體與siRNA比例、轉(zhuǎn)染時間和細胞密度，以提高轉(zhuǎn)染效率。同時，還可以考慮采用一些修飾方法，如對siRNA進行化學修飾，提高其穩(wěn)定性，減少核酸酶的降解作用，從而增強siRNA對FAT10基因的抑制效果。還需要深入研究不同肝癌細胞系對siRNA的響應差異，為針對不同患者的個性化治療提供理論依據(jù)。5.2siRNA對肝癌細胞生長和周期影響的機制探討本研究發(fā)現(xiàn)，針對FAT10基因設計的siRNA-2能夠顯著抑制肝癌細胞的生長，并使細胞周期阻滯在G1期，深入探究其作用機制具有重要意義。從細胞生長方面來看，F(xiàn)AT10基因在肝癌細胞中的異常高表達，通過多種信號通路促進了細胞的增殖。其中，在NF-κB信號通路中，高表達的FAT10蛋白與NF-κB抑制蛋白IκBα緊密結(jié)合，促使IκBα發(fā)生泛素化修飾，進而被蛋白酶體降解。IκBα的降解解除了對NF-κB的抑制，使得NF-κB得以活化并進入細胞核，激活一系列與細胞增殖相關的基因轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等。c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡等過程。在肝癌細胞