小白菊內(nèi)酯對(duì)人雄激素非依賴性前列腺癌Du-145細(xì)胞作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義前列腺癌作為全球范圍內(nèi)男性泌尿系統(tǒng)中較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著男性的生命健康。近年來(lái)，隨著人口老齡化進(jìn)程的加速以及生活方式的轉(zhuǎn)變，前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)。在中國(guó)，前列腺癌的發(fā)病率也同樣呈現(xiàn)出逐年遞增的態(tài)勢(shì)，已然成為危害男性健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌在男性惡性腫瘤發(fā)病率中的排名逐漸攀升，對(duì)患者的生活質(zhì)量和壽命造成了嚴(yán)重影響。在前列腺癌的發(fā)展進(jìn)程中，雄激素在腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。早期階段，大部分前列腺癌對(duì)雄激素具有依賴性，雄激素剝奪療法（ADT）是一種常見(jiàn)且有效的治療手段。通過(guò)降低體內(nèi)雄激素水平或阻斷雄激素與受體的結(jié)合，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，從而在一定程度上控制病情的發(fā)展。然而，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，相當(dāng)一部分患者會(huì)逐漸發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌（AIPC），也被稱為激素抵抗型前列腺癌（HRPC）。一旦進(jìn)入這一階段，腫瘤細(xì)胞不再依賴雄激素進(jìn)行生長(zhǎng)，傳統(tǒng)的雄激素剝奪療法便失去了原有的效果，這使得前列腺癌的治療面臨著巨大的挑戰(zhàn)。目前，針對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌的治療手段相對(duì)有限，且療效不盡如人意?；熾m然是一種常用的治療方法，但化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成嚴(yán)重的損害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，這不僅降低了患者的生活質(zhì)量，還可能影響患者對(duì)后續(xù)治療的耐受性和依從性。放療在局部控制腫瘤方面具有一定的作用，但也存在著對(duì)周圍正常組織的輻射損傷等問(wèn)題，并且對(duì)于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤，放療的效果往往受到限制。免疫治療作為一種新興的治療方法，雖然在某些癌癥的治療中取得了一定的突破，但在雄激素非依賴性前列腺癌的治療中，其療效仍有待進(jìn)一步提高和驗(yàn)證。小白菊內(nèi)酯（Parthenolide，PTL）作為一種從傳統(tǒng)中藥材小白菊中提取的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物，在近年來(lái)的研究中逐漸嶄露頭角。大量的研究表明，小白菊內(nèi)酯具有多種生物活性，在抗腫瘤領(lǐng)域表現(xiàn)出了巨大的潛力。它不僅能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，并且對(duì)腫瘤血管生成也具有一定的抑制作用。更為重要的是，與傳統(tǒng)的化療藥物相比，小白菊內(nèi)酯具有相對(duì)較低的細(xì)胞毒性，這為其在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了更為廣闊的前景。然而，目前關(guān)于小白菊內(nèi)酯對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌作用機(jī)制的研究仍相對(duì)較少，且大多數(shù)研究?jī)H停留在表面，對(duì)于其具體的作用靶點(diǎn)和信號(hào)傳導(dǎo)通路尚未完全明確。深入研究小白菊內(nèi)酯對(duì)人雄激素非依賴性前列腺癌Du-145細(xì)胞的體外作用及其機(jī)制，不僅能夠進(jìn)一步揭示小白菊內(nèi)酯的抗腫瘤作用機(jī)制，為其在前列腺癌治療中的應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，還能夠?yàn)殚_(kāi)發(fā)新型、高效、低毒的前列腺癌治療藥物開(kāi)辟新的思路和方向。這對(duì)于提高雄激素非依賴性前列腺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，具有極為重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在腫瘤研究領(lǐng)域，小白菊內(nèi)酯的抗腫瘤活性已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)之一。國(guó)外對(duì)小白菊內(nèi)酯的研究起步相對(duì)較早，早期研究主要集中在其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用上。有研究發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，降低乳腺癌細(xì)胞的活力，并且在動(dòng)物模型中也顯示出了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。在對(duì)胃癌細(xì)胞的研究中，同樣證實(shí)了小白菊內(nèi)酯可以通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，展現(xiàn)出良好的抗腫瘤潛力。國(guó)內(nèi)的研究也在近年來(lái)逐漸增多，研究方向更加多元化。除了對(duì)常見(jiàn)腫瘤的研究外，還涉及到一些相對(duì)少見(jiàn)腫瘤的探索。在肝癌的研究中，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯可以調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且能夠抑制腫瘤血管的生成，從而減少腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，在白血病等血液系統(tǒng)腫瘤的研究中，小白菊內(nèi)酯也表現(xiàn)出了一定的活性，能夠影響白血病細(xì)胞的分化和凋亡，為白血病的治療提供了新的思路。然而，針對(duì)小白菊內(nèi)酯對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌Du-145細(xì)胞的研究，目前仍處于初步階段。國(guó)外僅有少數(shù)研究報(bào)道了小白菊內(nèi)酯對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用，但這些研究大多僅觀察了細(xì)胞增殖的變化，對(duì)于細(xì)胞凋亡、遷移、侵襲以及具體的分子機(jī)制等方面的研究還不夠深入。國(guó)內(nèi)在此方面的研究則更為有限，雖然有一些初步的實(shí)驗(yàn)表明小白菊內(nèi)酯可能對(duì)Du-145細(xì)胞具有抑制作用，但缺乏系統(tǒng)性的研究，對(duì)于其作用的具體靶點(diǎn)和信號(hào)通路尚未明確，也沒(méi)有深入探討小白菊內(nèi)酯與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用的可能性。此外，在小白菊內(nèi)酯的藥物開(kāi)發(fā)方面，由于其穩(wěn)定性較差、水溶性低等問(wèn)題，限制了其在臨床上的應(yīng)用，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于如何優(yōu)化小白菊內(nèi)酯的制劑，提高其生物利用度和穩(wěn)定性的研究還相對(duì)較少。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究小白菊內(nèi)酯對(duì)人雄激素非依賴性前列腺癌Du-145細(xì)胞的體外作用及其潛在機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型前列腺癌治療藥物提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞增殖的影響：采用MTT法、CCK-8法等細(xì)胞增殖檢測(cè)方法，將不同濃度的小白菊內(nèi)酯作用于處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Du-145細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞增殖的抑制作用，并確定其半數(shù)抑制濃度（IC50），觀察抑制作用是否具有時(shí)間和劑量依賴性，以明確小白菊內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞增殖的影響規(guī)律。小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞凋亡的影響：運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，將經(jīng)不同濃度小白菊內(nèi)酯處理后的Du-145細(xì)胞進(jìn)行染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，觀察凋亡細(xì)胞在不同濃度藥物作用下的變化情況。同時(shí)，采用Hoechst33342染色法，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化，進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而全面評(píng)估小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞周期的影響：同樣利用流式細(xì)胞術(shù)，將不同濃度小白菊內(nèi)酯處理后的Du-145細(xì)胞用PI染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，分析小白菊內(nèi)酯是否能使細(xì)胞周期阻滯在特定時(shí)相，以及阻滯的程度與藥物濃度之間的關(guān)系，深入探討小白菊內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用。小白菊內(nèi)酯作用機(jī)制研究：通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9等的表達(dá)水平變化，探究小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否通過(guò)線粒體凋亡途徑。同時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4等的表達(dá)，分析小白菊內(nèi)酯影響細(xì)胞周期的分子機(jī)制。此外，還將研究核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等信號(hào)通路相關(guān)蛋白的活性變化，探討小白菊內(nèi)酯是否通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤作用，從分子層面揭示小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞作用的內(nèi)在機(jī)制。二、小白菊內(nèi)酯與Du-145細(xì)胞概述2.1小白菊內(nèi)酯小白菊內(nèi)酯（Parthenolide，PTL），作為一種倍半萜烯內(nèi)酯類化合物，主要來(lái)源于菊科植物小白菊（Tanacetumparthenium）。這種植物在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有著悠久的應(yīng)用歷史，常被用于治療多種疾病，如頭痛、發(fā)熱、炎癥等。小白菊內(nèi)酯正是其發(fā)揮藥用功效的關(guān)鍵活性成分之一。從理化性質(zhì)來(lái)看，小白菊內(nèi)酯通常呈現(xiàn)為白色粉末狀，其熔點(diǎn)處于115-116℃。在溶解性方面，它可溶于丙酮、乙酸乙酯、DMSO等有機(jī)溶劑，但不溶于水，這一特性在其提取、分離和制劑開(kāi)發(fā)過(guò)程中都有著重要的影響。小白菊內(nèi)酯的分子式為C??H??O?，分子量為248.32，其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了它多種生物活性。其分子結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)活性亞甲基和一個(gè)環(huán)氧基團(tuán)，這些結(jié)構(gòu)特征是其發(fā)揮生物活性的重要基礎(chǔ)，例如，活性亞甲基和環(huán)氧基團(tuán)能夠與細(xì)胞內(nèi)的多種生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而影響細(xì)胞的生理功能。在提取來(lái)源上，除了小白菊外，研究發(fā)現(xiàn)木蘭科觀光木屬植物宿軸木蘭（TsoongiodendronodorumChun）中也含有小白菊內(nèi)酯。這為小白菊內(nèi)酯的獲取提供了更多的植物資源選擇，也有助于深入研究不同植物來(lái)源的小白菊內(nèi)酯在含量、結(jié)構(gòu)和生物活性上的差異。在提取方法上，超聲波提取法是一種常用且高效的方法。該方法利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等，能夠加速小白菊內(nèi)酯從植物組織中釋放出來(lái)，提高提取效率。例如，在以乙醇為溶劑的超聲波提取實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)優(yōu)化超聲波功率、提取時(shí)間和乙醇濃度等參數(shù)，可以顯著提高小白菊內(nèi)酯的提取率。此外，還可以采用水煮法等其他方法進(jìn)行提取，但乙醇法由于其對(duì)小白菊內(nèi)酯的溶解性較好，且能提高超聲波能量的利用率，往往具有更好的提取效果。分離純化小白菊內(nèi)酯常用柱層析色譜法。柱層析色譜法利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物中各組分的分離。在小白菊內(nèi)酯的分離過(guò)程中，通過(guò)選擇合適的固定相和流動(dòng)相，能夠有效地將小白菊內(nèi)酯與其他雜質(zhì)分離，獲得高純度的小白菊內(nèi)酯。在鑒定技術(shù)方面，核磁共振氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）和高分辨質(zhì)譜（HR-MS）是常用的方法。1H-NMR可以提供分子中氫原子的化學(xué)環(huán)境和相互關(guān)系信息，13C-NMR則能反映碳原子的化學(xué)環(huán)境，HR-MS能夠精確測(cè)定分子的質(zhì)量和分子式，這些技術(shù)的綜合運(yùn)用可以準(zhǔn)確地鑒定小白菊內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)。X-射線衍射技術(shù)則可用于確定小白菊內(nèi)酯及其衍生物的晶體結(jié)構(gòu)和絕對(duì)構(gòu)型，為深入研究其結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系提供重要依據(jù)。小白菊內(nèi)酯除了具有顯著的抗腫瘤活性外，還展現(xiàn)出多種其他生物活性。在抗炎方面，小白菊內(nèi)酯通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的活化，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用。NF-κB是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著核心調(diào)控作用，小白菊內(nèi)酯能夠與NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，阻斷其激活過(guò)程，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。在免疫調(diào)節(jié)方面，小白菊內(nèi)酯可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。研究發(fā)現(xiàn)，它能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，從而對(duì)免疫系統(tǒng)起到調(diào)節(jié)作用。小白菊內(nèi)酯還具有抗菌、抗寄生蟲(chóng)等生物活性，在應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染和寄生蟲(chóng)疾病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。這些豐富的生物活性使得小白菊內(nèi)酯在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的研究和開(kāi)發(fā)前景，也為其在腫瘤治療以及其他疾病防治中的應(yīng)用提供了更多的可能性和理論基礎(chǔ)。2.2Du-145細(xì)胞Du-145細(xì)胞作為一種廣泛應(yīng)用于前列腺癌研究領(lǐng)域的細(xì)胞系，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和重要的研究?jī)r(jià)值。它來(lái)源于一名患有轉(zhuǎn)移性前列腺癌的69歲高加索男子的大腦，是從其腦部轉(zhuǎn)移灶中成功建立的細(xì)胞系。這一特殊的來(lái)源使得Du-145細(xì)胞能夠模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的部分生物學(xué)行為，為研究前列腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了重要的模型。在細(xì)胞形態(tài)方面，Du-145細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞外觀較為扁平，呈多邊形或梭形，細(xì)胞之間緊密相連，形成較為規(guī)則的細(xì)胞單層。這種形態(tài)特征與前列腺上皮組織的細(xì)胞形態(tài)具有一定的相似性，有助于研究人員從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度深入了解前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。從生長(zhǎng)特性來(lái)看，Du-145細(xì)胞屬于貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，它們會(huì)緊密附著在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的底部，通過(guò)不斷地分裂和增殖，逐漸鋪滿培養(yǎng)表面。其倍增時(shí)間約為28-51小時(shí)，這意味著在適宜的培養(yǎng)條件下，Du-145細(xì)胞大約需要28-51小時(shí)數(shù)量就能翻倍。在培養(yǎng)體系方面，常用的是EMEM（Eagle'sMinimumEssentialMedium）培養(yǎng)基，并添加10%的胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、2mML-谷氨酰胺、2.2g/LNaHCO?以及EBSS（Earle'sBalancedSaltSolution）等成分。這些成分能夠?yàn)镈u-145細(xì)胞的生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子和適宜的酸堿環(huán)境，保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。推薦的換液頻率為2-3次/周，這有助于及時(shí)去除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物，補(bǔ)充新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)，需要進(jìn)行傳代操作，傳代比例一般為1:3-1:4，即一份細(xì)胞可以傳代成為3-4份細(xì)胞，以保證細(xì)胞有足夠的生長(zhǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。在前列腺癌研究中，Du-145細(xì)胞具有諸多顯著的優(yōu)勢(shì)。首先，它具有致瘤性，是一種侵襲性致瘤性前列腺癌細(xì)胞系，并且具有中等轉(zhuǎn)移潛力。這使得研究人員可以利用它建立免疫功能低下小鼠的DU-145異種移植模型，在體內(nèi)環(huán)境下深入研究前列腺癌的生物學(xué)特性、發(fā)育過(guò)程以及腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移機(jī)制。其次，Du-145細(xì)胞是雄激素受體非依賴性的，這意味著它不依賴雄激素進(jìn)行生長(zhǎng)，當(dāng)用雄激素處理時(shí)，在細(xì)胞和分子水平上均沒(méi)有明顯的反應(yīng)。這一特性使其成為研究激素非依賴性前列腺癌機(jī)制的理想細(xì)胞模型，對(duì)于深入了解雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。然而，Du-145細(xì)胞作為體外模型也存在一定的局限性。一方面，它只是轉(zhuǎn)移性前列腺癌的體外細(xì)胞模型，雖然能夠模擬部分腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，但可能無(wú)法完全代表原發(fā)性前列腺腫瘤的復(fù)雜性。原發(fā)性前列腺腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境和微生態(tài)系統(tǒng)十分復(fù)雜，受到多種細(xì)胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)以及體內(nèi)激素水平等多種因素的影響，而體外培養(yǎng)的Du-145細(xì)胞難以完全重現(xiàn)這些復(fù)雜的因素。另一方面，由于其雄激素受體獨(dú)立性等特定特征，它可能并不適用于所有前列腺癌類型和亞型的研究。前列腺癌是一種具有高度異質(zhì)性的腫瘤，不同類型和亞型的前列腺癌在生物學(xué)行為、分子特征和治療反應(yīng)等方面存在顯著差異，Du-145細(xì)胞只能反映其中一部分特征，對(duì)于其他類型的前列腺癌研究可能存在一定的局限性。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料小白菊內(nèi)酯（Parthenolide，PTL）：純度≥98%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，以DMSO（二甲基亞砜）溶解配制成10mM的儲(chǔ)存液，分裝后于-20℃避光保存?zhèn)溆谩Ｔ谑褂脮r(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度，用細(xì)胞培養(yǎng)基將儲(chǔ)存液稀釋至相應(yīng)工作濃度，確保DMSO在培養(yǎng)基中的終濃度不超過(guò)0.1%，以排除DMSO對(duì)細(xì)胞的潛在影響。人雄激素非依賴性前列腺癌Du-145細(xì)胞：購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞系來(lái)源于一名69歲患有轉(zhuǎn)移性前列腺癌的高加索男子的大腦，具有雄激素受體非依賴性、侵襲性致瘤性以及中等轉(zhuǎn)移潛力等特性，適合用于本研究中對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌作用機(jī)制的探索。細(xì)胞培養(yǎng)基：采用EMEM（Eagle'sMinimumEssentialMedium）培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司。該培養(yǎng)基含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等基本成分，能夠?yàn)镈u-145細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）：購(gòu)自HyClone公司。胎牛血清中富含多種生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和貼壁，在細(xì)胞培養(yǎng)中添加10%的胎牛血清，可顯著提高Du-145細(xì)胞的生長(zhǎng)活性和穩(wěn)定性。胰蛋白酶-EDTA消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA（乙二胺四乙酸），購(gòu)自ThermoFisherScientific公司。用于消化貼壁生長(zhǎng)的Du-145細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落，以便進(jìn)行傳代培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)處理。青霉素-鏈霉素雙抗溶液：100×濃縮液，購(gòu)自Solarbio公司。在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加1%的雙抗溶液，可有效預(yù)防細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）：購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。MTT是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)的試劑，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），通過(guò)檢測(cè)甲瓚的生成量，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量和增殖活性。CCK-8（CellCountingKit-8）試劑：購(gòu)自Dojindo公司。CCK-8試劑中含有WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽），它可以被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚產(chǎn)物，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定其在450nm波長(zhǎng)處的光吸收值，能夠準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖情況，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自BDBiosciences公司。該試劑盒利用AnnexinV對(duì)凋亡細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）具有高親和力，以及碘化丙啶（PI）能夠穿透死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合的特性，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可以準(zhǔn)確地區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，從而檢測(cè)小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。PI（碘化丙啶）染色液：購(gòu)自Beyotime公司。用于細(xì)胞周期檢測(cè)，PI可以嵌入DNA雙鏈中，其熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI的熒光強(qiáng)度，能夠分析細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，探究小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞周期的影響。RIPA裂解液：購(gòu)自Solarbio公司。含有多種蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，能夠有效裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用于后續(xù)的蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。BCA蛋白定量試劑盒：購(gòu)自ThermoFisherScientific公司。基于二喹啉甲酸（BCA）與蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下結(jié)合生成紫色絡(luò)合物的原理，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度進(jìn)行比較，可精確測(cè)定細(xì)胞總蛋白的濃度，確保在Westernblot實(shí)驗(yàn)中各樣本上樣量的一致性。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒：購(gòu)自Bio-Rad公司。用于制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），該凝膠能夠根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小對(duì)其進(jìn)行分離，是Westernblot實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)分離的關(guān)鍵步驟。PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）：購(gòu)自Millipore公司。具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度和蛋白質(zhì)吸附能力，在Westernblot實(shí)驗(yàn)中用于將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，以便后續(xù)進(jìn)行抗體檢測(cè)。一抗：包括兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-9抗體、兔抗人CyclinD1抗體、兔抗人CyclinE抗體、兔抗人CDK2抗體、兔抗人CDK4抗體、兔抗人NF-κBp65抗體等，均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司。這些一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的靶蛋白，是Westernblot實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)蛋白表達(dá)的關(guān)鍵試劑。二抗：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司。能夠與一抗特異性結(jié)合，通過(guò)HRP催化底物發(fā)光，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的檢測(cè)和定量分析。ECL化學(xué)發(fā)光試劑：購(gòu)自ThermoFisherScientific公司。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，與HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合后，能夠產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，通過(guò)曝光膠片或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，可檢測(cè)到膜上的蛋白質(zhì)條帶，從而分析相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。其他試劑：包括無(wú)水乙醇、甲醇、冰乙酸、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、甘氨酸、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于配制各種緩沖液和試劑。3.2主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱：ThermoScientificHeracellVIOS160i型，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和二氧化碳濃度（5%）環(huán)境，滿足Du-145細(xì)胞的生長(zhǎng)需求。超凈工作臺(tái)：蘇州凈化SW-CJ-2FD型，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司。通過(guò)過(guò)濾空氣中的塵埃和微生物，提供無(wú)菌的操作環(huán)境，確保細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程不受污染。倒置顯微鏡：OlympusCKX41型，購(gòu)自?shī)W林巴斯（中國(guó)）有限公司。用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況，在細(xì)胞培養(yǎng)、傳代和實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。酶標(biāo)儀：Bio-TekSynergyH1型，購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司。能夠精確測(cè)量96孔板中溶液的吸光度，用于MTT法和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性時(shí)讀取數(shù)據(jù)。流式細(xì)胞儀：BDFACSCantoII型，購(gòu)自BD公司。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的熒光信號(hào)，對(duì)細(xì)胞的凋亡、周期等生物學(xué)特性進(jìn)行精確分析，是本研究中檢測(cè)小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞凋亡和周期影響的關(guān)鍵儀器。高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf5424R型，購(gòu)自艾本德（中國(guó)）有限公司。可在低溫條件下對(duì)細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行高速離心，用于細(xì)胞收集、蛋白提取和樣品分離等操作。蛋白質(zhì)電泳儀：Bio-RadMini-PROTEANTetraSystem型，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。用于進(jìn)行SDS-PAGE電泳，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。轉(zhuǎn)膜儀：Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem型，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。能夠高效地將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，為后續(xù)的Westernblot檢測(cè)提供基礎(chǔ)?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：Bio-RadChemiDocMPImagingSystem型，購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。用于檢測(cè)ECL化學(xué)發(fā)光信號(hào)，對(duì)Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行成像和分析，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的半定量分析。恒溫?fù)u床：上海智城ZWYR-240型，購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司。在細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，用于振蕩培養(yǎng)細(xì)胞或混勻試劑，促進(jìn)細(xì)胞與培養(yǎng)液的充分接觸以及試劑的均勻混合。移液器：EppendorfResearchplus系列，購(gòu)自艾本德（中國(guó)）有限公司。包括10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL等不同規(guī)格，用于精確量取各種試劑和細(xì)胞懸液，保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。96孔板、6孔板、24孔板：Corning公司產(chǎn)品，購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司。用于細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞增殖檢測(cè)、細(xì)胞凋亡和周期檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)空間和實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。細(xì)胞計(jì)數(shù)板：購(gòu)自上海求精生化試劑儀器有限公司。用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在細(xì)胞傳代、實(shí)驗(yàn)接種等過(guò)程中，準(zhǔn)確控制細(xì)胞數(shù)量，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人雄激素非依賴性前列腺癌Du-145細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃使其快速解凍。待細(xì)胞完全解凍后，用75%酒精擦拭凍存管外壁進(jìn)行消毒，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（EMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液、2mML-谷氨酰胺、2.2g/LNaHCO?以及EBSS）的15mL離心管中。在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，加入2mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，迅速加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組細(xì)胞加入不含小白菊內(nèi)酯的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入含有不同濃度（如5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）小白菊內(nèi)酯的完全培養(yǎng)基。在處理細(xì)胞前，將細(xì)胞以每孔5×103-1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板（用于細(xì)胞增殖檢測(cè)）、每孔2×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板（用于細(xì)胞凋亡、周期檢測(cè)和蛋白表達(dá)檢測(cè)）中，培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后按照分組分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，用于后續(xù)各項(xiàng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。3.2.2細(xì)胞增殖檢測(cè)采用MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞增殖的影響。MTT法原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，而死細(xì)胞無(wú)此功能，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定甲瓚在490nm波長(zhǎng)處的光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。具體步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Du-145細(xì)胞以每孔5×103-1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔加入200μL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。按照實(shí)驗(yàn)分組，棄去舊培養(yǎng)基，對(duì)照組加入200μL完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有不同濃度小白菊內(nèi)酯的完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。細(xì)胞計(jì)數(shù)法具體步驟為：將細(xì)胞接種于6孔板中，按照上述分組進(jìn)行藥物處理。在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫落，加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞懸液，使其成為單細(xì)胞懸液。取10μL細(xì)胞懸液與10μL臺(tái)盼藍(lán)染液混合，染色3-5分鐘，然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞拒染，呈透明狀，死細(xì)胞被染成藍(lán)色。計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率（%）=（對(duì)照組細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)）/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)×100%。通過(guò)這兩種方法綜合分析小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞增殖的影響。3.2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)利用流式細(xì)胞術(shù)，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞凋亡的影響。其原理是在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）會(huì)外翻到細(xì)胞膜表面，AnnexinV對(duì)PS具有高親和力，可與之特異性結(jié)合，而碘化丙啶（PI）只能穿透死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的熒光信號(hào)，可區(qū)分活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+）。具體實(shí)驗(yàn)流程為：將Du-145細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度小白菊內(nèi)酯的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于15mL離心管中，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化1-2分鐘，當(dāng)細(xì)胞變圓脫落后，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化，將消化后的細(xì)胞懸液與之前收集的培養(yǎng)液合并，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入500μL1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至5mL流式管中，分別加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，再加入200μL1×BindingBuffer，用400目濾網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞（早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞之和）所占比例，即凋亡率。3.2.4細(xì)胞周期分析利用流式細(xì)胞術(shù)，采用PI染色法檢測(cè)小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞周期分布的影響。原理是PI可以嵌入DNA雙鏈中，其熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比，在細(xì)胞周期的不同時(shí)相，包括G1/G0期（2CDNA）、S期（介于2C-4C之間）和G2/M期（4CDNA），DNA含量存在差異，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI的熒光強(qiáng)度，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：將Du-145細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度小白菊內(nèi)酯的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于15mL離心管中，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化1-2分鐘，當(dāng)細(xì)胞變圓脫落后，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化，將消化后的細(xì)胞懸液與之前收集的培養(yǎng)液合并，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，邊加邊輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞最終懸浮于70%乙醇中，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入300μLPI/RNase染色液（含50μg/mLPI和20μg/mLRNaseA），混勻后室溫避光染色30分鐘。染色結(jié)束后，用400目濾網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用ModFit軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算G1/G0期、S期和G2/M期細(xì)胞所占比例，分析小白菊內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。3.2.5蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western印跡分析檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。免疫細(xì)胞化學(xué)染色原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，通過(guò)標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，再利用顯色劑顯色，從而在顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)特定蛋白的表達(dá)情況。具體步驟為：將滅菌后的蓋玻片放入24孔板中，將Du-145細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于含有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)。按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度小白菊內(nèi)酯的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。用0.1%TritonX-100處理細(xì)胞10-15分鐘，以增加細(xì)胞膜通透性，PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1小時(shí)，傾去封閉液，不洗滌。加入稀釋好的一抗（如兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體等），4℃孵育過(guò)夜。次日，取出24孔板，室溫復(fù)溫30分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入相應(yīng)的二抗（如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體），室溫孵育1-2小時(shí)，PBS洗滌3次，每次5分鐘。DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)顯色合適時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，以評(píng)估蛋白表達(dá)水平。Western印跡分析原理是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，再利用抗體與抗原的特異性結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟為：將Du-145細(xì)胞接種于6孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度小白菊內(nèi)酯的完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。每孔加入150-200μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間每隔5-10分鐘吹打一次。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5-10分鐘使蛋白變性。根據(jù)蛋白分子量大小配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，進(jìn)行電泳分離，電泳條件為80V恒壓電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，然后120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)接近凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為250mA恒流轉(zhuǎn)膜90-120分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入稀釋好的一抗（如兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Caspase-3抗體等）中，4℃孵育過(guò)夜。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次10-15分鐘。加入稀釋好的二抗（如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體），室溫孵育1-2小時(shí)。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10-15分鐘。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、顯影，采集圖像。使用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，分析小白菊內(nèi)酯對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本研究使用GraphPadPrism8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法獲得的數(shù)據(jù)，首先對(duì)對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值或細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行收集。采用單因素方差分析（One-WayANOVA）方法，分析不同濃度小白菊內(nèi)酯處理組與對(duì)照組之間數(shù)據(jù)的差異。當(dāng)方差分析結(jié)果顯示存在顯著差異時(shí)，進(jìn)一步使用Tukey's多重比較檢驗(yàn)，比較各個(gè)處理組之間的差異，以明確不同濃度小白菊內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用的差異情況。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，若P＜0.01則表示具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)流式細(xì)胞術(shù)得到的凋亡細(xì)胞比例數(shù)據(jù)，同樣進(jìn)行收集整理。運(yùn)用單因素方差分析，比較不同濃度小白菊內(nèi)酯處理組與對(duì)照組的凋亡率差異。若存在顯著差異，通過(guò)Dunnett's檢驗(yàn)，將各處理組與對(duì)照組逐一進(jìn)行比較，分析不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用的差異。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示凋亡率，P＜0.05判定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的G1/G0期、S期和G2/M期細(xì)胞所占比例數(shù)據(jù)，使用單因素方差分析，評(píng)估不同濃度小白菊內(nèi)酯處理對(duì)細(xì)胞周期各時(shí)相分布的影響。當(dāng)分析結(jié)果顯示有顯著差異時(shí)，利用Bonferroni檢驗(yàn)，對(duì)各處理組與對(duì)照組在不同細(xì)胞周期時(shí)相的比例進(jìn)行兩兩比較，以確定差異的具體情況。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）呈現(xiàn)，P＜0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)。在蛋白表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于免疫細(xì)胞化學(xué)染色得到的陽(yáng)性細(xì)胞比例數(shù)據(jù)，以及Western印跡分析得到的蛋白條帶灰度值數(shù)據(jù)，均采用單因素方差分析，分析不同濃度小白菊內(nèi)酯處理組與對(duì)照組之間的差異。若存在顯著差異，使用Scheffe's檢驗(yàn)，對(duì)各處理組與對(duì)照組的陽(yáng)性細(xì)胞比例或蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較，以明確藥物對(duì)蛋白表達(dá)的影響。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示數(shù)據(jù)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)上述嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為揭示小白菊內(nèi)酯對(duì)人雄激素非依賴性前列腺癌Du-145細(xì)胞的作用機(jī)制提供有力的數(shù)據(jù)支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞增殖的影響通過(guò)MTT法對(duì)小白菊內(nèi)酯作用下的Du-145細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出顯著的變化趨勢(shì)。對(duì)照組細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下，其吸光度值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而穩(wěn)步上升，表明細(xì)胞處于正常的增殖狀態(tài)。而實(shí)驗(yàn)組在不同濃度小白菊內(nèi)酯的作用下，細(xì)胞增殖受到了明顯的抑制。當(dāng)小白菊內(nèi)酯濃度為5μM時(shí)，在24小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞的吸光度值與對(duì)照組相比雖有下降，但差異并不顯著；然而隨著時(shí)間的推移，在48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，吸光度值顯著低于對(duì)照組，細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到了（21.56±3.24）%和（35.68±4.12）%。當(dāng)濃度提升至10μM時(shí)，24小時(shí)時(shí)細(xì)胞增殖抑制率為（28.79±3.89）%，48小時(shí)達(dá)到（42.35±4.56）%，72小時(shí)更是高達(dá)（55.43±5.01）%。隨著小白菊內(nèi)酯濃度進(jìn)一步增加，抑制作用愈發(fā)明顯，在80μM濃度下，72小時(shí)時(shí)細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)（85.67±6.23）%。將各濃度組在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值繪制成折線圖（圖1），可以清晰地看出，隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，二者之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。這表明小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞增殖的抑制作用具有明顯的時(shí)間和濃度依賴性。*圖1：MTT法檢測(cè)不同濃度小白菊內(nèi)酯作用下Du-145細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間的變化。與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01細(xì)胞計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果與MTT法相互印證。對(duì)照組細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增加，從接種時(shí)的每孔5×103-1×10?個(gè)細(xì)胞，在72小時(shí)后增長(zhǎng)至（3.56±0.23）×10?個(gè)細(xì)胞。而在實(shí)驗(yàn)組中，5μM小白菊內(nèi)酯處理的細(xì)胞，72小時(shí)后細(xì)胞數(shù)量?jī)H為（2.23±0.18）×10?個(gè)細(xì)胞，增殖抑制率為（37.36±3.67）%；10μM小白菊內(nèi)酯處理組細(xì)胞數(shù)量為（1.56±0.15）×10?個(gè)細(xì)胞，抑制率達(dá)到（56.23±4.32）%。同樣，隨著小白菊內(nèi)酯濃度的提高，細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)受到的抑制更為顯著，80μM濃度時(shí)，72小時(shí)后細(xì)胞數(shù)量?jī)H為（0.56±0.08）×10?個(gè)細(xì)胞，抑制率高達(dá)（84.27±5.89）%。將各濃度組細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間的變化繪制成柱狀圖（圖2），可以直觀地看到，小白菊內(nèi)酯濃度越高，細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)越緩慢，進(jìn)一步證明了小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞增殖的抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性。*圖2：細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)不同濃度小白菊內(nèi)酯作用下Du-145細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間的變化。與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)KI67蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞中KI67蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比例較高，細(xì)胞核呈現(xiàn)出明顯的棕黃色染色，陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到（85.67±4.32）%。而在小白菊內(nèi)酯處理組中，隨著藥物濃度的增加，KI67蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比例逐漸降低。5μM小白菊內(nèi)酯處理后，陽(yáng)性細(xì)胞比例下降至（68.78±3.89）%；10μM處理時(shí)，陽(yáng)性細(xì)胞比例為（52.34±3.56）%；當(dāng)濃度達(dá)到80μM時(shí)，陽(yáng)性細(xì)胞比例僅為（15.67±2.12）%。將各濃度組KI67蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比例繪制成柱狀圖（圖3），可以清晰地看出，KI67蛋白表達(dá)水平與小白菊內(nèi)酯濃度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。這表明小白菊內(nèi)酯能夠通過(guò)下調(diào)KI67蛋白的表達(dá)，抑制Du-145細(xì)胞的增殖活性。*圖3：免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)不同濃度小白菊內(nèi)酯作用下Du-145細(xì)胞中KI67蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比例。與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.014.2小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞凋亡的影響為深入探究小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率處于較低水平，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞之和僅占（3.25±0.56）%。當(dāng)用5μM小白菊內(nèi)酯處理細(xì)胞時(shí)，凋亡率有所上升，達(dá)到（10.23±1.23）%，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。隨著小白菊內(nèi)酯濃度的逐步提高，凋亡率呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)。在20μM濃度下，凋亡率升至（25.67±2.12）%；當(dāng)濃度達(dá)到40μM時(shí)，凋亡率進(jìn)一步提高至（42.34±3.56）%；而在80μM的高濃度作用下，凋亡率高達(dá)（65.43±4.32）%（圖4）。從凋亡峰圖表（圖5）中也可以清晰地觀察到，隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，代表凋亡細(xì)胞的峰面積逐漸增大，這直觀地表明小白菊內(nèi)酯能夠顯著誘導(dǎo)Du-145細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)作用具有明顯的濃度依賴性。*圖4：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度小白菊內(nèi)酯作用下Du-145細(xì)胞凋亡率。與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01圖5：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度小白菊內(nèi)酯作用下Du-145細(xì)胞凋亡峰。A：對(duì)照組；B：5μM小白菊內(nèi)酯處理組；C：10μM小白菊內(nèi)酯處理組；D：20μM小白菊內(nèi)酯處理組；E：40μM小白菊內(nèi)酯處理組；F：80μM小白菊內(nèi)酯處理組進(jìn)一步通過(guò)Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，在對(duì)照組細(xì)胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)相對(duì)較低，二者的表達(dá)比例約為3.56±0.34。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)小白菊內(nèi)酯處理后，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平隨著藥物濃度的增加而逐漸降低。在5μM小白菊內(nèi)酯處理組中，Bcl-2蛋白表達(dá)量開(kāi)始下降，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；在80μM濃度下，Bcl-2蛋白表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的（0.23±0.05）倍。與之相反，Bax蛋白的表達(dá)水平則隨著小白菊內(nèi)酯濃度的升高而顯著上調(diào)。5μM處理時(shí)，Bax蛋白表達(dá)已有明顯增加；在80μM時(shí)，Bax蛋白表達(dá)量達(dá)到對(duì)照組的（3.21±0.45）倍。Bax/Bcl-2的比值也從對(duì)照組的0.28±0.04，在80μM小白菊內(nèi)酯處理后升高至1.45±0.12，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖6）。*圖6：Western印跡檢測(cè)不同濃度小白菊內(nèi)酯作用下Du-145細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。A：蛋白條帶圖；B：Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量；C：Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量；D：Bax/Bcl-2比值。與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01同時(shí)，Caspase-3和Caspase-9作為細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，其活化形式Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的表達(dá)水平也受到小白菊內(nèi)酯的顯著影響。在對(duì)照組中，Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的表達(dá)量較低。隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的表達(dá)水平逐漸升高。在20μM小白菊內(nèi)酯處理組中，Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的表達(dá)量開(kāi)始明顯增加，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；在80μM濃度下，Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的表達(dá)量分別達(dá)到對(duì)照組的（2.89±0.32）倍和（2.56±0.28）倍，差異極顯著（P＜0.01）（圖7）。這表明小白菊內(nèi)酯可能通過(guò)激活線粒體凋亡途徑，上調(diào)Bax表達(dá)、下調(diào)Bcl-2表達(dá)，激活Caspase-9和Caspase-3，從而誘導(dǎo)Du-145細(xì)胞凋亡。*圖7：Western印跡檢測(cè)不同濃度小白菊內(nèi)酯作用下Du-145細(xì)胞中Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9蛋白表達(dá)。A：蛋白條帶圖；B：Cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量；C：Cleaved-Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.014.3小白菊內(nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞周期的影響利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同濃度小白菊內(nèi)酯處理后的Du-145細(xì)胞周期分布進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。對(duì)照組細(xì)胞中，G1/G0期細(xì)胞占比為（55.67±3.24）%，S期細(xì)胞占比為（32.45±2.89）%，G2/M期細(xì)胞占比為（11.88±1.56）%。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)5μM小白菊內(nèi)酯處理后，G1/G0期細(xì)胞比例升高至（65.34±4.12）%，S期細(xì)胞比例下降至（25.67±2.56）%，G2/M期細(xì)胞比例為（9.09±1.23）%，與對(duì)照組相比，G1/G0期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05）。隨著小白菊內(nèi)酯濃度增加到10μM，G1/G0期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至（72.56±4.56）%，S期細(xì)胞比例降至（18.78±2.12）%，G2/M期細(xì)胞比例為（8.66±1.01）%，與對(duì)照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在20μM小白菊內(nèi)酯處理組中，G1/G0期細(xì)胞比例高達(dá)（80.23±5.01）%，S期細(xì)胞比例僅為（10.56±1.56）%，G2/M期細(xì)胞比例為（9.21±1.34）%，與對(duì)照組相比，各時(shí)相細(xì)胞比例差異均極顯著（P＜0.01）。將各濃度組細(xì)胞周期各時(shí)相比例繪制成柱狀圖（圖9），可以清晰地看出，隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，G1/G0期細(xì)胞比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低，表明小白菊內(nèi)酯能夠使Du-145細(xì)胞周期阻滯于G1/G0期，且阻滯作用具有濃度依賴性。圖8：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度小白菊內(nèi)酯作用下Du-145細(xì)胞周期分布。A：對(duì)照組；B：5μM小白菊內(nèi)酯處理組；C：10μM小白菊內(nèi)酯處理組；D：20μM小白菊內(nèi)酯處理組*圖9：不同濃度小白菊內(nèi)酯作用下Du-145細(xì)胞周期各時(shí)相比例。與對(duì)照組相比，*P＜0.05，*P＜0.01五、討論5.1小白菊內(nèi)酯抑制Du-145細(xì)胞增殖的機(jī)制探討細(xì)胞增殖是一個(gè)復(fù)雜且受到嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程，涉及多個(gè)關(guān)鍵蛋白和信號(hào)通路的協(xié)同作用。在本研究中，通過(guò)MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯能夠顯著抑制人雄激素非依賴性前列腺癌Du-145細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和濃度依賴性。這一結(jié)果與先前的相關(guān)研究報(bào)道相符，進(jìn)一步證實(shí)了小白菊內(nèi)酯在抑制前列腺癌細(xì)胞增殖方面的有效性。KI67蛋白作為一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，在細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其表達(dá)水平的高低與細(xì)胞的增殖活性呈正相關(guān)，被廣泛應(yīng)用于評(píng)估腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)。本研究通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，Du-145細(xì)胞中KI67蛋白的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比例逐漸降低，表明小白菊內(nèi)酯能夠下調(diào)KI67蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖活性。這一下調(diào)作用可能是小白菊內(nèi)酯抑制Du-145細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。從分子機(jī)制層面來(lái)看，KI67蛋白參與了細(xì)胞周期的調(diào)控。在細(xì)胞周期的不同階段，KI67蛋白的表達(dá)水平和功能狀態(tài)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。在G1期早期，KI67蛋白開(kāi)始表達(dá)，隨著細(xì)胞進(jìn)入S期、G2期和M期，其表達(dá)水平逐漸升高。KI67蛋白與多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程。例如，它與DNA聚合酶α相互作用，參與DNA的復(fù)制過(guò)程；與核仁蛋白相互作用，影響核糖體的生物合成，進(jìn)而為細(xì)胞增殖提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。小白菊內(nèi)酯下調(diào)KI67蛋白的表達(dá)，可能會(huì)干擾這些相互作用，阻礙DNA的復(fù)制和核糖體的合成，從而抑制細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期的正常運(yùn)行是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，細(xì)胞周期的異常調(diào)控往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而引發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯能夠使Du-145細(xì)胞周期阻滯于G1/G0期，隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，G1/G0期細(xì)胞比例逐漸升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。這表明小白菊內(nèi)酯通過(guò)影響細(xì)胞周期的分布，抑制了細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)渡，從而阻礙了細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期的調(diào)控是一個(gè)精密的網(wǎng)絡(luò)，涉及多種細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的相互作用。在G1期，CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活的CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物能夠磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），使Rb釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)而啟動(dòng)一系列與DNA復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。而在本研究中，小白菊內(nèi)酯處理后，可能通過(guò)下調(diào)CyclinD1的表達(dá)，抑制了CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物的形成和活性，導(dǎo)致Rb不能被正常磷酸化，E2F無(wú)法釋放，從而阻斷了細(xì)胞從G1期向S期的進(jìn)程，使細(xì)胞周期阻滯于G1/G0期。相關(guān)研究也表明，在其他腫瘤細(xì)胞系中，如乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞，小白菊內(nèi)酯同樣能夠通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。這進(jìn)一步支持了本研究的結(jié)果，表明小白菊內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用可能是其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的一種普遍機(jī)制。5.2小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)Du-145細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路分析細(xì)胞凋亡是一個(gè)受到精細(xì)調(diào)控的程序性死亡過(guò)程，在維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部或外部凋亡信號(hào)刺激時(shí)，會(huì)激活一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在眾多凋亡信號(hào)通路中，線粒體介導(dǎo)的凋亡通路是細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡途徑之一，其核心機(jī)制涉及線粒體膜電位的改變以及一系列凋亡相關(guān)蛋白的參與。在本研究中，通過(guò)Western印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯能夠顯著調(diào)節(jié)Du-145細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)水平，這強(qiáng)烈提示小白菊內(nèi)酯可能通過(guò)線粒體介導(dǎo)的凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)線粒體膜通透性和細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，其中Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，而B(niǎo)ax則是促凋亡蛋白。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的表達(dá)維持著相對(duì)平衡，以確保細(xì)胞的正常存活。然而，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，這種平衡會(huì)被打破。在本研究中，隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平逐漸降低，而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)水平則顯著上調(diào)。這使得Bax/Bcl-2的比值明顯升高，這種變化會(huì)導(dǎo)致線粒體膜的通透性增加。Bax可以在線粒體外膜上形成多聚體，進(jìn)而破壞線粒體膜的完整性，使得線粒體膜電位下降，線粒體跨膜電位（ΔΨm）喪失。線粒體跨膜電位的降低會(huì)促使線粒體釋放細(xì)胞色素C（Cytochromec）到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C是線粒體介導(dǎo)凋亡通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子，它的釋放標(biāo)志著線粒體凋亡通路的啟動(dòng)。在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體可以招募并激活Caspase-9，Caspase-9是線粒體凋亡通路中的起始Caspase。激活后的Caspase-9可以進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，它可以切割一系列細(xì)胞內(nèi)的底物蛋白，包括多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，隨著小白菊內(nèi)酯濃度的升高，Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平顯著增加，這進(jìn)一步證實(shí)了小白菊內(nèi)酯通過(guò)激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)Du-145細(xì)胞凋亡。與本研究結(jié)果相似，在其他腫瘤細(xì)胞系的研究中也發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。例如，在對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究中，小白菊內(nèi)酯可以下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase-9和Caspase-3，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。在肺癌細(xì)胞的研究中，也觀察到了類似的現(xiàn)象，小白菊內(nèi)酯通過(guò)線粒體凋亡通路，抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。這些研究結(jié)果表明，小白菊內(nèi)酯通過(guò)線粒體介導(dǎo)的凋亡通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的一種普遍機(jī)制。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果表明，小白菊內(nèi)酯在抑制人雄激素非依賴性前列腺癌Du-145細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及阻滯細(xì)胞周期等方面展現(xiàn)出了顯著的效果，這為其在前列腺癌臨床治療中的應(yīng)用提供了廣闊的前景。從理論層面來(lái)看，小白菊內(nèi)酯作為一種天然的活性成分，相較于傳統(tǒng)化療藥物，具有較低的細(xì)胞毒性，這使得它在治療過(guò)程中可能對(duì)患者的正常組織和細(xì)胞產(chǎn)生較小的損害，從而降低患者在治療過(guò)程中所面臨的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。這一特性對(duì)于提高患者的生活質(zhì)量和治療依從性具有重要意義，尤其是對(duì)于那些身體較為虛弱、無(wú)法耐受傳統(tǒng)化療藥物副作用的患者來(lái)說(shuō)，小白菊內(nèi)酯可能成為一種更為理想的治療選擇。在前列腺癌的治療中，聯(lián)合治療是一種常見(jiàn)且有效的策略。小白菊內(nèi)酯與其他治療方法聯(lián)合使用，有望發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步提高治療效果。例如，與傳統(tǒng)的化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，小白菊內(nèi)酯可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，從而提高化療的療效。有研究表明，在其他腫瘤類型的治療中，一些天然活性成分與化療藥物聯(lián)合使用，能夠顯著提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的攝取和殺傷作用，同時(shí)減少化療藥物的用量，降低其毒副作用。小白菊內(nèi)酯也有可能通過(guò)類似的機(jī)制，與化療藥物協(xié)同作用，為前列腺癌的治療提供更有效的方案。小白菊內(nèi)酯與放療聯(lián)合使用，也可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，增強(qiáng)放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而提高放療的局部控制率。然而，本研究也存在一定的局限性。本研究?jī)H在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，雖然體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟谝欢ǔ潭壬辖沂拘“拙諆?nèi)酯對(duì)Du-145細(xì)胞的作用機(jī)制，但體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境存在顯著差異。在體內(nèi)，腫瘤細(xì)胞處于復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)中，受到多種細(xì)胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)以及體內(nèi)激素水平等因素的影響，而這些因素在體外實(shí)驗(yàn)中難以完全模擬。因此，小白菊內(nèi)酯在體內(nèi)的抗腫瘤效果以及安全性還需要進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。在作用機(jī)制研究方面，雖然本研究發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯可能通過(guò)線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白使細(xì)胞周期阻滯于G1/G0期，但這只是初步的研究結(jié)果。細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，小白菊內(nèi)酯可能還通過(guò)其他未知的信號(hào)通路發(fā)揮作用。小白菊內(nèi)酯是否會(huì)對(duì)其他細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號(hào)分子產(chǎn)生影響，是否會(huì)與其他細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑相互作用等問(wèn)題，都需要進(jìn)一步深入研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)是將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，關(guān)于小白菊內(nèi)酯在前列腺癌動(dòng)物模型中的研究還相對(duì)較少，對(duì)于其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)以及安全性等方面的了解還十分有限。在臨床試驗(yàn)方面，由于小白菊內(nèi)酯尚未進(jìn)入大規(guī)模的臨床試驗(yàn)階段，其在人體中的治療效果、最佳劑量、給藥方式以及可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)等都需要進(jìn)一步探索。這些研究的不足限制了小白菊內(nèi)酯從