小麥-葉銹菌互作中潛在選擇性自噬受體的篩選鑒定與功能解析一、引言1.1研究背景小麥（TriticumaestivumL.）作為全球最重要的糧食作物之一，為人類提供了約20%的能量和蛋白質(zhì)來(lái)源，在保障糧食安全方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而，小麥生長(zhǎng)過(guò)程中面臨著多種病害的威脅，其中小麥葉銹病是由小麥葉銹菌（Pucciniatriticina，Pt）引起的一種極具破壞力的世界性真菌病害。在我國(guó)，河北、河南、山東、山西、內(nèi)蒙古、貴州、四川、云南、重慶、甘肅、青海、陜西、安徽、江蘇、湖北、黑龍江、吉林等省份均是小麥葉銹病的常發(fā)區(qū)，近年來(lái)，在華北、西北和東北的一些地區(qū)，其發(fā)生態(tài)勢(shì)尤為嚴(yán)重。小麥葉銹病主要侵害小麥葉片，也會(huì)波及葉鞘，莖稈和穗部偶有發(fā)病。發(fā)病初期，葉片正面會(huì)出現(xiàn)圓形至長(zhǎng)橢圓形、不規(guī)則散生的紅褐色夏孢子堆，部分夏孢子堆能穿透葉片；后期在葉片背面或葉鞘表皮下，會(huì)生長(zhǎng)出排列散亂的黑色冬孢子堆。葉銹菌具有較強(qiáng)的繁殖和傳播能力，其夏孢子萌發(fā)后產(chǎn)生芽管，從葉片氣孔侵入，在適宜的20-25℃溫度條件下，經(jīng)過(guò)6天潛育，就能在葉面上產(chǎn)生夏孢子堆和夏孢子，進(jìn)而進(jìn)行多次重復(fù)侵染。小麥葉銹病的發(fā)生流行與品種、菌源、天氣等因素密切相關(guān)，在大面積種植感病品種的情況下，若越冬菌源豐富、春季氣溫偏高、雨水充沛，特別是在小麥抽穗前后降雨頻繁，或者田間小氣候濕度較大時(shí)，葉銹病極易大規(guī)模流行。一旦小麥感染葉銹病，其危害不容小覷。病菌的侵染會(huì)極大地影響葉片的正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致葉片光合作用效率大幅降低，水分大量流失，籽粒飽滿度和灌漿受到嚴(yán)重影響，造成葉片早衰，最終致使小麥產(chǎn)量顯著下降。相關(guān)研究表明，如果侵染發(fā)生較早，減產(chǎn)幅度可達(dá)49%-67%，嚴(yán)重時(shí)甚至顆粒無(wú)收。例如在2013年，我國(guó)部分麥區(qū)葉銹病大爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著全球氣候變化，極端天氣事件增多，小麥葉銹病的發(fā)生頻率和危害程度呈上升趨勢(shì)，給小麥安全生產(chǎn)帶來(lái)了更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前，針對(duì)小麥葉銹病的防治手段主要包括種植抗病品種、藥劑防治和栽培管理措施等。然而，抗病品種的抗性容易因葉銹菌新毒性小種的出現(xiàn)而喪失，導(dǎo)致抗病性失效；藥劑防治雖然能在一定程度上控制病害，但長(zhǎng)期大量使用農(nóng)藥不僅會(huì)增加生產(chǎn)成本，還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，威脅生態(tài)平衡；栽培管理措施的防控效果相對(duì)有限，難以從根本上解決問(wèn)題。因此，深入探究小麥與葉銹菌互作的分子機(jī)制，挖掘新的抗病相關(guān)基因和調(diào)控途徑，對(duì)于培育持久抗病的小麥品種，實(shí)現(xiàn)小麥葉銹病的綠色、可持續(xù)防控具有重要的理論和實(shí)踐意義。在植物與病原菌互作過(guò)程中，自噬作為一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)降解途徑，發(fā)揮著關(guān)鍵作用。自噬能夠幫助植物抵御病原菌的侵染，通過(guò)降解受損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、衰老的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等，為細(xì)胞的重建、再生和修復(fù)提供必要的原料，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。選擇性自噬作為自噬的一種特殊形式，能夠特異性地識(shí)別并降解靶標(biāo)底物，在植物免疫反應(yīng)中扮演著不可或缺的角色。在小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)的過(guò)程中，選擇性自噬可能參與了小麥對(duì)葉銹菌的防御反應(yīng)以及葉銹菌獲取營(yíng)養(yǎng)的調(diào)控機(jī)制。其中，選擇性自噬受體作為連接靶標(biāo)底物和自噬體的關(guān)鍵橋梁，能夠特異性地識(shí)別靶標(biāo)底物，并將其招募到自噬體上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)底物的降解。因此，篩選和鑒定小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中潛在的選擇性自噬受體，對(duì)于深入揭示小麥與葉銹菌互作的分子機(jī)制，明確小麥的抗病防御機(jī)制以及葉銹菌的致病機(jī)理，具有重要的科學(xué)價(jià)值，也為開發(fā)新型的小麥葉銹病防控策略提供了全新的思路和理論依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)分析、分子生物學(xué)技術(shù)以及細(xì)胞生物學(xué)方法，篩選并鑒定出小麥在供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中潛在的選擇性自噬受體。具體而言，首先利用生物信息學(xué)手段對(duì)小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行深入挖掘，結(jié)合已有的自噬受體特征信息，預(yù)測(cè)可能參與小麥與葉銹菌互作的選擇性自噬受體基因；隨后，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，如基因克隆、表達(dá)分析等，對(duì)預(yù)測(cè)出的候選基因進(jìn)行驗(yàn)證和功能初步分析；最后，借助細(xì)胞生物學(xué)方法，如免疫共沉淀、熒光共定位等，明確篩選出的受體蛋白與自噬相關(guān)蛋白以及葉銹菌侵染相關(guān)蛋白之間的相互作用關(guān)系，從而確定其在小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中的具體作用機(jī)制。本研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。在理論方面，深入探究小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中潛在選擇性自噬受體，有助于揭示小麥與葉銹菌互作的分子機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在選擇性自噬調(diào)控方面的研究空白，豐富植物與病原菌互作的理論體系。通過(guò)明確選擇性自噬受體在小麥抗病防御反應(yīng)以及葉銹菌致病過(guò)程中的作用，能夠?yàn)檫M(jìn)一步理解植物免疫反應(yīng)和病原菌致病機(jī)理提供新的視角和思路，推動(dòng)植物病理學(xué)和植物免疫學(xué)的發(fā)展。在實(shí)踐方面，篩選和鑒定出的潛在選擇性自噬受體可以作為重要的分子靶點(diǎn)，為培育持久抗病的小麥新品種提供理論依據(jù)和基因資源。通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)小麥中的相關(guān)受體基因進(jìn)行調(diào)控，有望增強(qiáng)小麥對(duì)葉銹菌的抗性，提高小麥的抗病能力，減少葉銹病的發(fā)生和危害，從而保障小麥的安全生產(chǎn)，降低因病害導(dǎo)致的糧食減產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，為解決全球糧食安全問(wèn)題做出貢獻(xiàn)。此外，對(duì)選擇性自噬受體的研究也有助于開發(fā)新型的生物防治策略，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1小麥與葉銹菌互作的研究進(jìn)展小麥與葉銹菌之間的互作是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過(guò)程，一直是植物病理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。早期研究主要集中在對(duì)小麥葉銹病的病原菌鑒定、病害癥狀描述以及病害的發(fā)生規(guī)律和流行學(xué)方面。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，研究逐漸深入到分子層面。在病原菌致病機(jī)制方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)對(duì)葉銹菌基因組測(cè)序和功能基因組學(xué)研究，揭示了葉銹菌分泌的效應(yīng)蛋白在侵染小麥過(guò)程中的關(guān)鍵作用。效應(yīng)蛋白能夠通過(guò)多種方式干擾小麥的免疫反應(yīng)，促進(jìn)病原菌的侵染和定殖。例如，一些效應(yīng)蛋白可以抑制小麥細(xì)胞內(nèi)的防御相關(guān)蛋白激酶的活性，阻斷免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路；還有一些效應(yīng)蛋白能夠靶向小麥的葉綠體、線粒體等細(xì)胞器，干擾其正常功能，為病原菌獲取營(yíng)養(yǎng)創(chuàng)造條件。對(duì)于小麥的抗病機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)小麥能夠通過(guò)識(shí)別葉銹菌的病原相關(guān)分子模式（PAMPs），激活基礎(chǔ)免疫反應(yīng)，包括活性氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)沉積、病程相關(guān)蛋白表達(dá)等。此外，小麥還擁有一系列抗病基因（R基因），這些基因編碼的蛋白能夠特異性地識(shí)別葉銹菌的效應(yīng)蛋白，觸發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，即效應(yīng)子觸發(fā)的免疫（ETI），導(dǎo)致侵染部位的細(xì)胞發(fā)生過(guò)敏性壞死，限制病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)展。如王逍冬教授課題組與河南農(nóng)業(yè)大學(xué)、寧波大學(xué)合作，通過(guò)對(duì)小麥群體新麥26×周麥22進(jìn)行QTL定位，鑒定獲得了新的小麥成株期抗葉銹病QTL位點(diǎn)，并對(duì)相關(guān)抗病基因的功能和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入研究，為解析NLR類抗病基因的調(diào)控機(jī)制提供了新的思路。1.3.2自噬及自噬受體的研究進(jìn)展自噬是真核生物中一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)降解途徑，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。自噬過(guò)程涉及多個(gè)自噬相關(guān)基因（ATG）的參與，這些基因編碼的蛋白協(xié)同作用，形成自噬體，包裹并降解細(xì)胞內(nèi)的受損細(xì)胞器、蛋白質(zhì)聚集體以及入侵的病原體等。在植物中，自噬參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育、衰老以及對(duì)病原菌的防御等多個(gè)過(guò)程。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，自噬可以通過(guò)降解病原菌或清除受感染的細(xì)胞，限制病原菌的擴(kuò)散，從而增強(qiáng)植物的抗病能力。例如，在擬南芥與灰霉病菌的互作中，自噬能夠識(shí)別并降解入侵的病菌，減輕病害的發(fā)生。自噬受體作為自噬過(guò)程中的關(guān)鍵元件，能夠特異性地識(shí)別靶標(biāo)底物，并將其招募到自噬體上，實(shí)現(xiàn)底物的選擇性降解。在動(dòng)物和酵母中，已經(jīng)鑒定出多種自噬受體，如p62、NBR1等，它們?cè)诩?xì)胞自噬和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在植物中，自噬受體的研究相對(duì)較少，但近年來(lái)也取得了一些重要進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，植物中的一些蛋白具有自噬受體的功能，如擬南芥中的NBR1蛋白，能夠與自噬相關(guān)蛋白ATG8相互作用，介導(dǎo)蛋白聚集體的自噬降解。此外，中山大學(xué)郭德銀團(tuán)隊(duì)通過(guò)高通量篩選，發(fā)現(xiàn)CCDC50發(fā)揮了以前未知的自噬受體的作用，該受體負(fù)調(diào)節(jié)由RIG-I樣受體引發(fā)的I型干擾素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，揭示了自噬與抗病毒先天免疫反應(yīng)之間的新聯(lián)系。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院葛亮課題組發(fā)現(xiàn)了一種新型的聚集體自噬受體CCT2，CCT2能夠結(jié)合到蛋白聚集體上，并招募自噬體以吞噬并降解多種毒性蛋白聚集體，且其作用不依賴于聚集體的泛素化，為治療聚集體相關(guān)疾病提供了重要靶點(diǎn)。在小麥中，自噬在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中的作用也逐漸受到關(guān)注。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉剛副教授的研究團(tuán)隊(duì)以小麥與葉銹菌互作為研究體系，發(fā)現(xiàn)自噬在小麥抵抗葉銹菌侵染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，如自噬參與了小麥?zhǔn)苋~銹菌侵染而誘發(fā)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡過(guò)程，并且在葉銹菌侵染小麥的吸器母細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬發(fā)生，自噬對(duì)于葉銹菌的侵染是必需的。然而，關(guān)于小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中潛在選擇性自噬受體的篩選與鑒定研究還相對(duì)匱乏，有待進(jìn)一步深入探索。1.4研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線1.4.1研究?jī)?nèi)容（1）小麥潛在選擇性自噬受體的生物信息學(xué)篩選通過(guò)對(duì)小麥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，依據(jù)已知自噬受體的結(jié)構(gòu)特征，如具有與自噬相關(guān)蛋白ATG8結(jié)合的結(jié)構(gòu)域（如LIR基序等）、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域等，篩選出可能的選擇性自噬受體候選基因。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)候選基因進(jìn)行分析，包括基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析、進(jìn)化樹構(gòu)建等，初步了解候選基因及其編碼蛋白的基本特征和進(jìn)化關(guān)系。例如，使用NCBI的BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì)，利用InterProScan進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。（2）候選受體基因的表達(dá)模式分析選取感病和抗病小麥品種，分別接種葉銹菌，在不同時(shí)間點(diǎn)（如接種后0h、12h、24h、48h、72h、96h等）采集葉片樣品。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)候選受體基因在小麥接種葉銹菌前后的表達(dá)水平變化，分析其表達(dá)模式與葉銹菌侵染過(guò)程的相關(guān)性。同時(shí)，設(shè)置未接種葉銹菌的對(duì)照組，以明確基因表達(dá)變化是否由葉銹菌侵染特異性誘導(dǎo)。例如，以小麥持家基因（如TaActin）作為內(nèi)參基因，計(jì)算候選基因的相對(duì)表達(dá)量，繪制表達(dá)量變化曲線。（3）潛在選擇性自噬受體的鑒定構(gòu)建候選受體基因的過(guò)表達(dá)載體和沉默載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入感病小麥品種，將沉默載體導(dǎo)入抗病小麥品種。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定，如PCR檢測(cè)、Southernblot分析等，確定基因的整合和表達(dá)情況。接種葉銹菌后，觀察轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)病癥狀，測(cè)定相關(guān)抗病指標(biāo)（如病情指數(shù)、孢子萌發(fā)率、菌絲生長(zhǎng)量等），分析候選受體基因?qū)π←溈共⌒缘挠绊?，從而鑒定出在小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的潛在選擇性自噬受體。（4）自噬受體與自噬相關(guān)蛋白及葉銹菌侵染相關(guān)蛋白的互作驗(yàn)證利用酵母雙雜交技術(shù)，將篩選出的潛在自噬受體蛋白作為誘餌蛋白，與小麥自噬相關(guān)蛋白（如ATG8、ATG5等）以及葉銹菌侵染過(guò)程中分泌的效應(yīng)蛋白等獵物蛋白進(jìn)行互作檢測(cè)。若在酵母中檢測(cè)到陽(yáng)性互作信號(hào)，則進(jìn)一步利用雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）技術(shù)和免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)在植物體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)BiFC技術(shù)觀察互作蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的共定位情況，利用Co-IP技術(shù)驗(yàn)證互作蛋白在體內(nèi)的相互作用，明確自噬受體在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中的作用機(jī)制。（5）潛在選擇性自噬受體的功能分析對(duì)鑒定出的潛在選擇性自噬受體進(jìn)行功能缺失和功能獲得突變體的構(gòu)建，通過(guò)基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）獲得受體基因敲除突變體，通過(guò)過(guò)表達(dá)技術(shù)獲得受體基因過(guò)表達(dá)突變體。分析突變體在正常生長(zhǎng)條件和葉銹菌侵染條件下的表型變化，包括植株生長(zhǎng)狀況、抗病性、自噬活性等。進(jìn)一步研究受體蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和動(dòng)態(tài)變化，以及對(duì)自噬體形成和底物降解的影響，深入解析潛在選擇性自噬受體在小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中的功能及作用機(jī)制。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載小麥基因組數(shù)據(jù)和葉銹菌相關(guān)數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)工具篩選潛在的選擇性自噬受體基因，構(gòu)建候選基因文庫(kù)。接著，以感病和抗病小麥品種為材料，接種葉銹菌后不同時(shí)間點(diǎn)取樣，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)qRT-PCR分析候選基因的表達(dá)模式，篩選出表達(dá)差異顯著且與葉銹菌侵染相關(guān)的基因作為重點(diǎn)研究對(duì)象。隨后，構(gòu)建重點(diǎn)基因的過(guò)表達(dá)載體和沉默載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染小麥植株，獲得轉(zhuǎn)基因小麥。對(duì)接種葉銹菌后的轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行表型觀察和抗病指標(biāo)測(cè)定，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，確定潛在的選擇性自噬受體。針對(duì)確定的受體，構(gòu)建酵母雙雜交載體，篩選與其互作的自噬相關(guān)蛋白和葉銹菌侵染相關(guān)蛋白，利用BiFC和Co-IP技術(shù)在植物體內(nèi)驗(yàn)證互作關(guān)系。最后，利用基因編輯技術(shù)和過(guò)表達(dá)技術(shù)構(gòu)建受體基因的突變體，分析突變體在不同條件下的表型和生理指標(biāo)變化，明確受體的功能及作用機(jī)制，總結(jié)研究成果，撰寫論文并發(fā)表。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中清晰展示從生物信息學(xué)篩選到功能分析的整個(gè)流程，各步驟之間用箭頭連接，注明關(guān)鍵技術(shù)和實(shí)驗(yàn)材料]二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選取小麥品種“銘賢169”作為研究對(duì)象，該品種對(duì)葉銹菌生理小種“THTT”表現(xiàn)為高度感病，是小麥葉銹病研究中常用的感病品種，能夠清晰地展現(xiàn)葉銹菌侵染后的各種反應(yīng)和變化，為研究小麥與葉銹菌互作機(jī)制提供良好的實(shí)驗(yàn)材料。葉銹菌菌株選用“THTT”生理小種，該小種在我國(guó)小麥產(chǎn)區(qū)分布廣泛，致病力較強(qiáng)，能夠穩(wěn)定地侵染“銘賢169”小麥品種，引發(fā)典型的葉銹病癥狀，便于實(shí)驗(yàn)觀察和分析。實(shí)驗(yàn)前，將葉銹菌“THTT”小種保存在低溫干燥的環(huán)境中，使用時(shí)進(jìn)行活化和擴(kuò)繁，確保其活力和致病性。載體方面，選用pCAMBIA1300作為過(guò)表達(dá)載體，該載體具有CaMV35S啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在植物體內(nèi)高效表達(dá)；同時(shí)含有潮霉素抗性基因，便于對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選。選用pTRV2作為基因沉默載體，與pTRV1共同構(gòu)成病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）系統(tǒng)，可有效沉默小麥體內(nèi)的目標(biāo)基因。實(shí)驗(yàn)前，對(duì)載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保其序列正確無(wú)誤，并將載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中進(jìn)行保存和擴(kuò)增。菌株選用農(nóng)桿菌GV3101，其具有較強(qiáng)的侵染能力，能夠高效地將重組載體導(dǎo)入小麥細(xì)胞中。將農(nóng)桿菌GV3101保存在含有相應(yīng)抗生素的甘油菌中，-80℃冰箱凍存。使用前，將甘油菌接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。藥品方面，實(shí)驗(yàn)所需的限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒等均購(gòu)自知名生物公司，確保酶和試劑盒的活性和質(zhì)量?？股厝缈敲顾?、潮霉素、利福平、鏈霉素等用于篩選和培養(yǎng)含有相應(yīng)抗性基因的菌株和轉(zhuǎn)化植株。其他常用化學(xué)試劑如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇、冰醋酸等均為分析純，購(gòu)自正規(guī)化學(xué)試劑供應(yīng)商。儀器設(shè)備包括PCR儀（用于基因擴(kuò)增）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（用于基因表達(dá)量檢測(cè)）、高速冷凍離心機(jī)（用于細(xì)胞破碎和核酸、蛋白分離）、凝膠成像系統(tǒng)（用于檢測(cè)核酸和蛋白電泳結(jié)果）、超凈工作臺(tái)（用于無(wú)菌操作）、光照培養(yǎng)箱（用于小麥植株培養(yǎng)）、恒溫?fù)u床（用于菌株培養(yǎng)）、電子天平（用于稱量藥品）、pH計(jì)（用于調(diào)節(jié)溶液酸堿度）等。所有儀器設(shè)備在使用前均進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保其正常運(yùn)行和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1TaATG8蛋白家族生物信息學(xué)分析從EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(kù)（/index.html）中下載小麥的全基因組序列及注釋文件。利用HMMER軟件（/），基于ATG8蛋白家族的隱馬爾可夫模型（HMM）文件，對(duì)小麥基因組進(jìn)行搜索，篩選出所有可能的TaATG8蛋白家族成員。將篩選得到的TaATG8蛋白序列提交至NCBI的ConservedDomainDatabase（CDD）（/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，確認(rèn)其是否含有ATG8蛋白家族特有的結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用ExPASyProteomicsServer（/）中的ProtParam工具預(yù)測(cè)TaATG8蛋白的基本理化性質(zhì)，包括分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等。利用TMHMMServerv.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，通過(guò)SignalP5.0Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）預(yù)測(cè)信號(hào)肽。使用ClustalW軟件對(duì)TaATG8蛋白家族成員以及其他物種中已知的ATG8蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，比對(duì)參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。基于多序列比對(duì)結(jié)果，利用MEGAX軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值（Bootstrap）設(shè)置為1000，以分析TaATG8蛋白家族成員與其他物種ATG8蛋白的進(jìn)化關(guān)系。利用在線工具SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)TaATG8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲等。通過(guò)SWISS-MODEL（/）進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)TaATG8蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并使用PyMOL軟件對(duì)預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析。2.2.2qPCR檢測(cè)TaATG8家族成員表達(dá)分別選取小麥品種“銘賢169”的三葉期幼苗，在無(wú)菌條件下，將葉銹菌“THTT”小種的夏孢子按照1×10?個(gè)/mL的濃度，采用噴霧接種法接種到小麥葉片上，以未接種葉銹菌的小麥幼苗作為對(duì)照。接種后，將小麥幼苗置于光照培養(yǎng)箱中，條件設(shè)置為光照16h、溫度22℃，黑暗8h、溫度18℃，相對(duì)濕度80%。在接種后的0h、12h、24h、48h、72h、96h，分別采集接種葉銹菌和未接種的小麥葉片樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，迅速放入液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肨RIzol試劑（Invitrogen公司）提取各時(shí)間點(diǎn)小麥葉片樣品的總RNA，具體操作按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。提取的RNA通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（ThermoScientific公司）測(cè)定RNA的濃度和純度，確保RNA的OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。根據(jù)TaATG8家族成員的基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)原則為：引物長(zhǎng)度18-25bp，Tm值在58-62℃之間，GC含量在40%-60%之間，且避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。以小麥的Actin基因作為內(nèi)參基因，引物序列見表2-1。[此處插入表2-1，包含TaATG8家族成員引物序列和Actin引物序列，格式為：基因名稱、上游引物序列、下游引物序列]采用SYBRPremixExTaqⅡ（TaKaRa公司）進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRPremixExTaqⅡ10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH?O6.4μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，從65℃緩慢升溫至95℃，以檢測(cè)引物的特異性。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，利用2?ΔΔCt法計(jì)算TaATG8家族成員在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量，并使用GraphPadPrism8軟件繪制表達(dá)量變化曲線，分析其表達(dá)模式與葉銹菌侵染過(guò)程的相關(guān)性。2.2.3TaATG8a/h的cDNA全長(zhǎng)獲得及載體構(gòu)建以接種葉銹菌48h后的小麥葉片cDNA為模板，根據(jù)TaATG8a/h基因的預(yù)測(cè)序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA的引物，引物兩端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（如BamHⅠ和SacⅠ）。引物序列如下：TaATG8a-F：5'-CGGGATCCATGGCAGAGAAGAAGAAG-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；TaATG8a-R：5'-CCGAGCTCTTACAGCAGCAGCAGCAG-3'（下劃線部分為SacⅠ酶切位點(diǎn)）；TaATG8h-F：5'-CGGGATCCATGGCAGAGAAGAAGAAG-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；TaATG8h-R：5'-CCGAGCTCTTACAGCAGCAGCAGCAG-3'（下劃線部分為SacⅠ酶切位點(diǎn)）。使用高保真DNA聚合酶（如KOD-Plus-Neo，Toyobo公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL，包括10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mM）4μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板cDNA1μL，KOD-Plus-Neo酶1μL，ddH?O37μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，58℃退火30s，68℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒（如Axygen公司的AxyPrepDNAGelExtractionKit）回收目的條帶。將回收的TaATG8a/hcDNA片段和pCAMBIA1300載體分別用BamHⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切體系為20μL，包括10×Buffer2μL，DNA（載體或片段）5μL，BamHⅠ和SacⅠ各1μL，ddH?O11μL，37℃酶切2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的片段。使用T4DNA連接酶（TaKaRa公司）將酶切后的TaATG8a/hcDNA片段與pCAMBIA1300載體進(jìn)行連接，連接體系為10μL，包括10×T4DNALigaseBuffer1μL，載體片段1μL，目的基因片段3μL，T4DNALigase1μL，ddH?O4μL，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，具體操作如下：取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；將菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用質(zhì)粒小提試劑盒（如Omega公司的E.Z.N.A.PlasmidMiniKitI）提取質(zhì)粒。通過(guò)PCR鑒定和雙酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司（如上海生工生物工程有限公司）進(jìn)行測(cè)序，確保插入的TaATG8a/h基因序列正確無(wú)誤。2.2.4煙草中TaATG8a/h蛋白瞬時(shí)表達(dá)將測(cè)序正確的含有TaATG8a/h基因的pCAMBIA1300重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，采用凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體步驟為：取10μL重組質(zhì)粒加入到100μLGV3101感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；液氮速凍5min，37℃水浴5min，迅速冰浴2min；加入800μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)2h；將菌液涂布在含有利福平（50μg/mL）、鏈霉素（50μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)2-3天。挑取單菌落接種到含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD???值為0.6-0.8。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液在4℃、5000rpm條件下離心10min，收集菌體。用含有10mMMgCl?、10mMMES（pH5.6）和200μM乙酰丁香酮的重懸液重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD???值為1.0，室溫靜置3h，使農(nóng)桿菌充分活化。選取生長(zhǎng)健壯、6-8葉期的本氏煙草植株，使用無(wú)針頭注射器將活化后的農(nóng)桿菌菌液注射到煙草葉片的下表皮，每個(gè)葉片注射3-4個(gè)點(diǎn)，以注射空載體pCAMBIA1300的農(nóng)桿菌菌液作為對(duì)照。注射后的煙草植株置于光照培養(yǎng)箱中，條件設(shè)置為光照16h、溫度25℃，黑暗8h、溫度22℃，相對(duì)濕度60%-70%，培養(yǎng)3-4天。2.2.5農(nóng)桿菌注射及煙草蛋白純化按照2.2.4中的方法將含有TaATG8a/h基因的pCAMBIA1300重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌注射到本氏煙草葉片中，培養(yǎng)3-4天后，采集注射部位的葉片。將葉片剪成小塊，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量的液氮，迅速研磨成粉末。將粉末轉(zhuǎn)移至離心管中，加入5倍體積的蛋白提取緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，1mMEDTA，1%TritonX-100，1mMPMSF，1×蛋白酶抑制劑cocktail），冰浴30min，期間輕輕振蕩。將裂解液在4℃、12000rpm條件下離心30min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入適量的Ni-NTA樹脂（Qiagen公司），4℃緩慢振蕩孵育2h，使目的蛋白與Ni-NTA樹脂充分結(jié)合。將結(jié)合有目的蛋白的Ni-NTA樹脂裝入層析柱中，用10倍柱體積的洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，1mMEDTA，1%TritonX-100，20mM咪唑）洗滌，去除雜質(zhì)蛋白。用洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，1mMEDTA，1%TritonX-100，250mM咪唑）洗脫目的蛋白，收集洗脫液。使用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化后的目的蛋白，將洗脫液與上樣緩沖液混合，煮沸5min，使蛋白變性。取適量樣品上樣到12%的SDS-PAGE凝膠中，在120V電壓下電泳至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色30min，然后用脫色液脫色至背景清晰，觀察目的蛋白條帶。利用BCA蛋白定量試劑盒（ThermoScientific公司）測(cè)定純化后目的蛋白的濃度，將蛋白樣品分裝后保存于-80℃冰箱備用。2.2.6LC-MS檢測(cè)及MS分析取適量純化后的TaATG8a/h蛋白樣品，與等量的上樣緩沖液混合，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)凝膠進(jìn)行染色。切取目的蛋白條帶以及對(duì)照泳道中相應(yīng)位置的凝膠塊，將凝膠塊切成1mm3左右的小塊，放入離心管中。向離心管中加入適量的脫色液（50%乙腈，25mMNH?HCO?），振蕩孵育30min，使凝膠塊中的染料充分洗脫，重復(fù)脫色2-3次，直至凝膠塊變?yōu)闊o(wú)色。棄去脫色液，加入適量的10mMDTT（二硫蘇糖醇）溶液，56℃孵育1h，使蛋白中的二硫鍵還原。棄去DTT溶液，加入適量的55mMIAA（碘乙酰胺）溶液，室溫避光孵育45min，使半胱氨酸烷基化。棄去IAA溶液，用25mMNH?HCO?溶液洗滌凝膠塊3次，每次10min。加入適量的胰蛋白酶溶液（12.5ng/μL，用25mMNH?HCO?溶液配制），4℃孵育30min，使胰蛋白酶充分滲透到凝膠塊中。棄去多余的胰蛋白酶溶液，加入適量的25mMNH?HCO?溶液，37℃酶解過(guò)夜。酶解結(jié)束后，加入適量的5%甲酸溶液，振蕩孵育10min，使肽段從凝膠塊中釋放出來(lái)。將含有肽段的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用50%乙腈溶液洗滌凝膠塊2-3次，合并上清液。將上清液在真空濃縮儀中濃縮至干，用適量的0.1%甲酸溶液復(fù)溶肽段。將復(fù)溶后的肽段樣品進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）分析，使用的液相色譜系統(tǒng)為ThermoScientificUltimate3000RSLCnano系統(tǒng)，質(zhì)譜儀為ThermoScientificQExactiveHF質(zhì)譜儀。肽段樣品首先通過(guò)C18反相色譜柱（AcclaimPepMapRSLC，75μm×25cm，2μm，100?）進(jìn)行分離，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液。采用梯度洗脫程序：0-5min，5%B；5-60min，5%-35%B；60-70min，35%-80%B；70-75min，80%B；75-80min，80%-5%B，流速為300nL/min。質(zhì)譜分析采用數(shù)據(jù)依賴采集模式（DDA），掃描范圍為m/z350-1800，分辨率為60000，自動(dòng)增益控制目標(biāo)值為3×10?，最大注入時(shí)間為50ms。對(duì)一級(jí)質(zhì)譜中信號(hào)強(qiáng)度較高的前20個(gè)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，二級(jí)質(zhì)譜分辨率為15000，自動(dòng)增益控制目標(biāo)值為1×10?，最大注入時(shí)間為120ms，歸一化碰撞能量為27%。將LC-MS/MS分析得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入ProteomeDiscoverer軟件（ThermoScientific公司）中，與小麥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，搜索參數(shù)設(shè)置如下：酶選擇胰蛋白酶，最大漏切位點(diǎn)為2；母離子質(zhì)量誤差允許范圍為10ppm，碎片離子質(zhì)量誤差允許范圍為0.02Da；固定修飾為半胱氨酸的烷基化（+57.02146Da），可變修飾為甲硫氨酸的氧化（+15.99491Da）。通過(guò)軟件分析，篩選出與TaATG8a/h蛋白相互作用的潛在蛋白，并進(jìn)行MS分析，確定其可信度和相對(duì)豐度。2.2.7qPCR檢測(cè)潛在互作蛋白轉(zhuǎn)錄水平根據(jù)LC-MS/MS分析篩選出的與TaATG8a/h蛋白互作的潛在蛋白，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取其對(duì)應(yīng)的基因序列。利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)這些潛在互作蛋白基因的特異性引物，引物設(shè)計(jì)原則同2.2.2中TaATG8家族成員引物設(shè)計(jì)原則。以接種葉銹菌0h、12h、24h、48h、72h、96h的小麥葉片cDNA為模板（cDNA制備方法同2.2.2），以小麥Actin基因作為內(nèi)參基因，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。qPCR三、結(jié)果與分析3.1確定介導(dǎo)大分子降解的TaATG8亞型3.1.1TaATG8蛋白家族生物信息學(xué)分析通過(guò)HMMER軟件對(duì)小麥基因組進(jìn)行搜索，共篩選出12個(gè)TaATG8蛋白家族成員，分別命名為TaATG8a-TaATG8l。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，所有成員均含有ATG8蛋白家族特有的泛素樣結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏TG8蛋白在自噬過(guò)程中的功能發(fā)揮至關(guān)重要。TaATG8蛋白家族成員的基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，其分子量范圍為14.6-16.8kDa，等電點(diǎn)在4.8-6.2之間。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，所有成員均無(wú)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，表明它們可能定位于細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TaATG8蛋白家族成員均不含有信號(hào)肽，進(jìn)一步支持了它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)中行使功能的推測(cè)。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，TaATG8蛋白家族成員之間的氨基酸序列相似性較高，尤其是在泛素樣結(jié)構(gòu)域區(qū)域，保守性更強(qiáng)?；诙嘈蛄斜葘?duì)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，TaATG8蛋白家族成員與其他植物中的ATG8蛋白具有較高的同源性，且可分為不同的亞組，暗示它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中可能具有不同的功能分化。TaATG8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲在各成員中均有分布，其中α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲的比例相對(duì)較高。通過(guò)SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，成功預(yù)測(cè)了TaATG8蛋白的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其具有典型的泛素樣折疊結(jié)構(gòu)，與已知的ATG8蛋白三維結(jié)構(gòu)相似。圖3-1展示了TaATG8a蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型。[此處插入圖3-1，為TaATG8a蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型，用PyMOL軟件生成，清晰展示其空間結(jié)構(gòu)，標(biāo)注關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域]3.1.2qPCR檢測(cè)葉銹菌侵染小麥過(guò)程中TaATG8轉(zhuǎn)錄水平的變化以未接種葉銹菌的小麥葉片為對(duì)照，對(duì)接種葉銹菌“THTT”小種后的小麥葉片進(jìn)行qPCR檢測(cè)，分析TaATG8家族成員在葉銹菌侵染過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果如圖3-2所示，在接種葉銹菌后，TaATG8家族成員的表達(dá)水平呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。其中，TaATG8a和TaATG8h的表達(dá)量在接種后12h開始顯著上調(diào)，在48h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降；而TaATG8c、TaATG8d等成員的表達(dá)量變化不明顯。[此處插入圖3-2，為TaATG8家族成員在葉銹菌侵染小麥過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量變化曲線，橫坐標(biāo)為接種后時(shí)間（h），縱坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)量，用GraphPadPrism8軟件繪制，不同成員用不同顏色曲線表示]進(jìn)一步分析TaATG8a和TaATG8h的表達(dá)模式與葉銹菌侵染進(jìn)程的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)上調(diào)時(shí)間與葉銹菌的侵染初期相吻合，且在葉銹菌大量繁殖和擴(kuò)展的時(shí)期表達(dá)量達(dá)到最高，表明TaATG8a和TaATG8h可能在小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與了小麥對(duì)葉銹菌侵染的響應(yīng)以及葉銹菌獲取營(yíng)養(yǎng)的調(diào)控機(jī)制。綜合生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析結(jié)果，確定TaATG8a和TaATG8h為介導(dǎo)小麥大分子降解過(guò)程中潛在的關(guān)鍵TaATG8亞型，后續(xù)將對(duì)這兩個(gè)亞型進(jìn)行深入研究。3.2TaATG8互作蛋白的篩選3.2.1Western-Blot檢測(cè)TaATG8a/h在煙草中的表達(dá)為了檢測(cè)TaATG8a/h蛋白在煙草中的表達(dá)情況，對(duì)注射含有TaATG8a/h基因的pCAMBIA1300重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌的煙草葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，以注射空載體pCAMBIA1300農(nóng)桿菌的煙草葉片作為對(duì)照。采用Western-Blot技術(shù)，使用抗HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)門aATG8a/h基因在構(gòu)建載體時(shí)融合了HA標(biāo)簽。結(jié)果如圖3-3所示，在注射重組質(zhì)粒的煙草葉片蛋白樣品中，能夠檢測(cè)到特異性的條帶，其分子量與預(yù)期的TaATG8a/h蛋白分子量相符，而在注射空載體的對(duì)照樣品中未檢測(cè)到該條帶。這表明TaATG8a/h蛋白在煙草葉片中成功表達(dá)，為后續(xù)的蛋白純化和互作蛋白篩選奠定了基礎(chǔ)。[此處插入圖3-3，為Western-Blot檢測(cè)TaATG8a/h在煙草中表達(dá)的結(jié)果圖，清晰展示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的條帶情況，標(biāo)注分子量Marker位置和條帶名稱]3.2.2Anti-HA免疫磁珠純化TaATG8a/h利用Anti-HA免疫磁珠對(duì)在煙草中表達(dá)的TaATG8a/h蛋白進(jìn)行純化。將煙草葉片蛋白提取物與Anti-HA免疫磁珠孵育，使TaATG8a/h蛋白（帶有HA標(biāo)簽）與磁珠特異性結(jié)合。經(jīng)過(guò)多次洗滌，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白后，使用洗脫緩沖液將結(jié)合在磁珠上的TaATG8a/h蛋白洗脫下來(lái)。通過(guò)SDS電泳對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3-4所示，在純化后的樣品中，能夠看到一條清晰的單一蛋白條帶，其分子量與預(yù)期的TaATG8a/h蛋白分子量一致，表明成功純化得到了TaATG8a/h蛋白，且純度較高，滿足后續(xù)質(zhì)譜檢測(cè)的要求。[此處插入圖3-4，為SDS檢測(cè)Anti-HA免疫磁珠純化TaATG8a/h蛋白的結(jié)果圖，展示純化后蛋白條帶，標(biāo)注Marker和條帶名稱]3.2.3質(zhì)譜檢測(cè)純化后的蛋白將純化后的TaATG8a/h蛋白進(jìn)行LC-MS/MS分析，通過(guò)與小麥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選出與TaATG8a/h蛋白相互作用的潛在蛋白。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，共鑒定出了多個(gè)與TaATG8a/h蛋白可能存在相互作用的蛋白。對(duì)這些潛在互作蛋白進(jìn)行功能注釋和分類，發(fā)現(xiàn)它們涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，如代謝過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞防御等。表3-1列出了部分可信度較高的潛在互作蛋白及其功能描述。[此處插入表3-1，包含潛在互作蛋白的名稱、登錄號(hào)、功能描述等信息，格式清晰，便于查看]其中，蛋白A（登錄號(hào)：XXX）被注釋為參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，可能在小麥對(duì)葉銹菌侵染的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用；蛋白B（登錄號(hào)：XXX）與細(xì)胞內(nèi)的能量代謝相關(guān)，暗示其可能為葉銹菌侵染過(guò)程提供能量支持。這些潛在互作蛋白的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究TaATG8a/h蛋白在小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中的作用機(jī)制提供了重要線索。后續(xù)將對(duì)這些潛在互作蛋白進(jìn)行深入研究，驗(yàn)證它們與TaATG8a/h蛋白的相互作用關(guān)系，并分析其在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中的具體功能。3.3TaATG8與其結(jié)合蛋白互作驗(yàn)證3.3.1qPCR檢測(cè)潛在互作蛋白對(duì)應(yīng)基因在葉銹菌侵染過(guò)程中表達(dá)變化為進(jìn)一步探究篩選出的潛在互作蛋白在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中的作用，以接種葉銹菌0h、12h、24h、48h、72h、96h的小麥葉片cDNA為模板，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)潛在互作蛋白對(duì)應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果如圖3-5所示，部分潛在互作蛋白基因的表達(dá)水平在葉銹菌侵染后發(fā)生了顯著變化。[此處插入圖3-5，為潛在互作蛋白基因在葉銹菌侵染小麥過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量變化曲線，橫坐標(biāo)為接種后時(shí)間（h），縱坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)量，用GraphPadPrism8軟件繪制，不同基因用不同顏色曲線表示]其中，基因C（對(duì)應(yīng)潛在互作蛋白C）在接種后12h表達(dá)量開始顯著上調(diào)，在48h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，其表達(dá)變化趨勢(shì)與TaATG8a和TaATG8h在葉銹菌侵染過(guò)程中的表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)具有一定的相關(guān)性，暗示基因C可能與TaATG8a/h蛋白在小麥響應(yīng)葉銹菌侵染過(guò)程中存在協(xié)同作用。而基因D（對(duì)應(yīng)潛在互作蛋白D）的表達(dá)量在接種后呈持續(xù)下降趨勢(shì)，表明其可能在小麥抵抗葉銹菌侵染過(guò)程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。這些潛在互作蛋白基因在葉銹菌侵染過(guò)程中的表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究它們與TaATG8a/h蛋白的相互作用及在小麥與葉銹菌互作中的功能提供了重要線索。3.3.2TaORM結(jié)構(gòu)域分析在眾多潛在互作蛋白中，TaORM蛋白因其與自噬及葉銹菌侵染過(guò)程的潛在關(guān)聯(lián)性而受到重點(diǎn)關(guān)注。通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)TaORM蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示TaORM蛋白含有一個(gè)保守的ORM結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在真核生物中廣泛存在，參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。在酵母中，ORM蛋白被證實(shí)參與鞘脂代謝的調(diào)控，而鞘脂代謝與細(xì)胞自噬過(guò)程密切相關(guān)，暗示TaORM蛋白可能通過(guò)其ORM結(jié)構(gòu)域參與小麥中的自噬調(diào)控。同時(shí)，研究表明在植物與病原菌互作過(guò)程中，鞘脂類物質(zhì)能夠作為信號(hào)分子，調(diào)節(jié)植物的免疫反應(yīng)，因此TaORM蛋白的ORM結(jié)構(gòu)域可能在小麥響應(yīng)葉銹菌侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)控小麥的抗病防御反應(yīng)。3.3.3TaORM的亞細(xì)胞定位為明確TaORM蛋白在細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)，構(gòu)建了TaORM與綠色熒光蛋白（GFP）的融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-TaORM-GFP。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至本氏煙草葉片細(xì)胞中，以轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA1300-GFP的煙草葉片作為對(duì)照。在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光信號(hào)，結(jié)果如圖3-6所示，轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-TaORM-GFP載體的煙草葉片細(xì)胞中，綠色熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，表明TaORM蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。細(xì)胞質(zhì)是細(xì)胞代謝和信號(hào)傳導(dǎo)的重要場(chǎng)所，許多自噬相關(guān)過(guò)程及植物免疫反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生，TaORM蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的定位暗示其可能參與小麥細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的自噬調(diào)控以及對(duì)葉銹菌侵染的免疫信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。而細(xì)胞核作為遺傳物質(zhì)的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中心，TaORM蛋白在細(xì)胞核中的定位表明其可能參與基因表達(dá)的調(diào)控，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，影響小麥對(duì)葉銹菌的抗性。[此處插入圖3-6，為TaORM蛋白在本氏煙草葉片細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位圖，清晰展示轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-TaORM-GFP載體和轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA1300-GFP的煙草葉片細(xì)胞的熒光信號(hào)分布情況，標(biāo)注細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)位置]3.3.4酵母雙雜交驗(yàn)證TaATG8h與TaORM互作利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)TaATG8h與TaORM之間的相互作用進(jìn)行初步驗(yàn)證。將TaATG8h基因克隆至pGBKT7載體上，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TaATG8h；將TaORM基因克隆至pGADT7載體上，構(gòu)建獵物質(zhì)粒pGADT7-TaORM。將誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109中，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化）和陰性對(duì)照（pGBKT7-TaATG8h和pGADT7共轉(zhuǎn)化、pGBKT7和pGADT7-TaORM共轉(zhuǎn)化）。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布在SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5天。結(jié)果如圖3-7所示，在SD/-Trp/-Leu缺陷型培養(yǎng)基上，所有轉(zhuǎn)化組合的酵母細(xì)胞均能正常生長(zhǎng)；而在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培養(yǎng)基上，陽(yáng)性對(duì)照和共轉(zhuǎn)化pGBKT7-TaATG8h與pGADT7-TaORM的酵母細(xì)胞能夠生長(zhǎng)，并長(zhǎng)出藍(lán)色菌落，表明TaATG8h與TaORM在酵母細(xì)胞中發(fā)生了相互作用，激活了報(bào)告基因的表達(dá)，而陰性對(duì)照的酵母細(xì)胞不能生長(zhǎng)。這一結(jié)果初步證實(shí)了TaATG8h與TaORM之間存在相互作用。[此處插入圖3-7，為酵母雙雜交驗(yàn)證TaATG8h與TaORM互作的結(jié)果圖，展示不同轉(zhuǎn)化組合在SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷型培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，標(biāo)注各轉(zhuǎn)化組合]3.3.5BiFC技術(shù)驗(yàn)證TaATG8h與TaORM互作為進(jìn)一步在植物體內(nèi)驗(yàn)證TaATG8h與TaORM的相互作用，采用雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）技術(shù)。分別將TaATG8h基因與黃色熒光蛋白（YFP）的N端（nYFP）融合，構(gòu)建表達(dá)載體pSPYNE-TaATG8h；將TaORM基因與YFP的C端（cYFP）融合，構(gòu)建表達(dá)載體pSPYCE-TaORM。將pSPYNE-TaATG8h和pSPYCE-TaORM農(nóng)桿菌菌液共注射到本氏煙草葉片中，以注射pSPYNE和pSPYCE空載體的農(nóng)桿菌菌液作為陰性對(duì)照。注射3-4天后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察煙草葉片細(xì)胞中的熒光信號(hào)。結(jié)果如圖3-8所示，在共注射pSPYNE-TaATG8h和pSPYCE-TaORM的煙草葉片細(xì)胞中，能夠觀察到強(qiáng)烈的黃色熒光信號(hào)，且熒光信號(hào)主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與TaORM蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致；而在注射空載體的陰性對(duì)照細(xì)胞中，未檢測(cè)到黃色熒光信號(hào)。這表明TaATG8h與TaORM在植物細(xì)胞內(nèi)能夠相互作用，形成蛋白復(fù)合體，從而發(fā)出黃色熒光，進(jìn)一步驗(yàn)證了TaATG8h與TaORM在植物體內(nèi)的相互作用。[此處插入圖3-8，為BiFC技術(shù)驗(yàn)證TaATG8h與TaORM互作的結(jié)果圖，展示共注射pSPYNE-TaATG8h和pSPYCE-TaORM以及注射空載體的煙草葉片細(xì)胞的熒光信號(hào)情況，標(biāo)注細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)位置]3.3.6Co-IP技術(shù)驗(yàn)證TaATG8h與TaORM互作利用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)在體內(nèi)驗(yàn)證TaATG8h與TaORM的相互作用。提取轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-TaATG8h-HA和pCAMBIA1300-TaORM-Flag載體的煙草葉片總蛋白，以轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-HA和pCAMBIA1300-Flag空載體的煙草葉片總蛋白作為對(duì)照。將總蛋白與Anti-HA磁珠孵育，使TaATG8h-HA蛋白與磁珠特異性結(jié)合。經(jīng)過(guò)多次洗滌，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白后，使用洗脫緩沖液將結(jié)合在磁珠上的蛋白洗脫下來(lái)。對(duì)洗脫產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后通過(guò)Western-Blot檢測(cè)，使用Anti-Flag抗體檢測(cè)TaORM-Flag蛋白。結(jié)果如圖3-9所示，在轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-TaATG8h-HA和pCAMBIA1300-TaORM-Flag載體的樣品中，能夠檢測(cè)到TaORM-Flag蛋白的條帶，表明TaORM-Flag蛋白與TaATG8h-HA蛋白在體內(nèi)發(fā)生了相互作用，能夠被共沉淀下來(lái)；而在對(duì)照樣品中，未檢測(cè)到TaORM-Flag蛋白的條帶。這一結(jié)果從體內(nèi)水平進(jìn)一步證實(shí)了TaATG8h與TaORM之間存在相互作用。[此處插入圖3-9，為Co-IP技術(shù)驗(yàn)證TaATG8h與TaORM互作的結(jié)果圖，展示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Western-Blot檢測(cè)條帶情況，標(biāo)注分子量Marker位置和條帶名稱]綜合以上qPCR檢測(cè)、結(jié)構(gòu)域分析、亞細(xì)胞定位以及多種互作驗(yàn)證技術(shù)的結(jié)果，明確了TaATG8h與TaORM之間存在相互作用，且TaORM蛋白在葉銹菌侵染過(guò)程中基因表達(dá)發(fā)生變化，其結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位暗示了它在小麥自噬調(diào)控和對(duì)葉銹菌侵染的免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用，為深入研究TaATG8蛋白在小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。四、討論4.1葉銹菌侵染小麥過(guò)程中TaATG8亞型的篩選在植物與病原菌互作的復(fù)雜過(guò)程中，自噬作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制，發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而ATG8蛋白家族在自噬過(guò)程中處于核心地位。本研究通過(guò)全面且系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，在小麥基因組中成功篩選出12個(gè)TaATG8蛋白家族成員。這些成員均含有高度保守的泛素樣結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域是ATG8蛋白行使功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它參與了自噬體的形成以及與自噬受體的相互作用等重要過(guò)程。對(duì)TaATG8蛋白家族成員的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，為深入了解其在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能提供了重要線索。結(jié)果顯示，它們均無(wú)明顯跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，暗示這些蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，這與自噬過(guò)程主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生的認(rèn)知相符。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析清晰地展示了TaATG8蛋白家族成員與其他植物ATG8蛋白的進(jìn)化關(guān)系，揭示了它們?cè)谶M(jìn)化歷程中的保守性和分化特征。不同的亞組劃分提示各成員可能在功能上存在差異，這為后續(xù)深入研究TaATG8蛋白家族成員的功能多樣性奠定了基礎(chǔ)。二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)則從分子層面解析了TaATG8蛋白的結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步研究其與其他蛋白的相互作用機(jī)制提供了直觀的結(jié)構(gòu)模型。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)葉銹菌侵染小麥過(guò)程中TaATG8家族成員的轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，TaATG8a和TaATG8h的表達(dá)量在葉銹菌侵染后呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)趨勢(shì)，且上調(diào)時(shí)間與葉銹菌的侵染初期高度吻合，在葉銹菌大量繁殖和擴(kuò)展的關(guān)鍵時(shí)期，其表達(dá)量達(dá)到峰值。這一結(jié)果強(qiáng)烈暗示TaATG8a和TaATG8h可能深度參與了小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)的過(guò)程，在小麥對(duì)葉銹菌侵染的響應(yīng)以及葉銹菌獲取營(yíng)養(yǎng)的調(diào)控機(jī)制中扮演著重要角色。例如，在葉銹菌侵染初期，小麥細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)TaATG8a和TaATG8h的表達(dá)，啟動(dòng)自噬相關(guān)程序，以應(yīng)對(duì)病原菌的入侵。隨著葉銹菌的繁殖和擴(kuò)展，TaATG8a和TaATG8h表達(dá)量的增加可能有助于為葉銹菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也可能參與小麥的防御反應(yīng)，試圖限制葉銹菌的進(jìn)一步侵染。相比之下，TaATG8c、TaATG8d等其他成員的表達(dá)量在葉銹菌侵染過(guò)程中變化不明顯，這表明它們?cè)谛←溑c葉銹菌互作過(guò)程中的作用可能較為有限，或者其功能可能在其他生理過(guò)程或應(yīng)對(duì)其他脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。這也進(jìn)一步凸顯了TaATG8a和TaATG8h在小麥與葉銹菌互作中的特異性和重要性。綜合生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析的結(jié)果，本研究確定TaATG8a和TaATG8h為介導(dǎo)小麥大分子降解過(guò)程中潛在的關(guān)鍵TaATG8亞型。這一結(jié)論為后續(xù)深入研究小麥與葉銹菌互作的分子機(jī)制提供了明確的研究對(duì)象。后續(xù)對(duì)TaATG8a和TaATG8h的深入研究，如通過(guò)基因編輯技術(shù)敲除或過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因，觀察小麥在葉銹菌侵染下的表型變化、自噬活性變化以及葉銹菌的生長(zhǎng)和繁殖情況等，將有助于進(jìn)一步揭示它們?cè)谛←湽?yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中的具體作用機(jī)制，為開發(fā)新型的小麥葉銹病防控策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。4.2TaATG8h與TaORM互作在明確TaATG8a和TaATG8h為介導(dǎo)小麥大分子降解過(guò)程中潛在的關(guān)鍵TaATG8亞型后，對(duì)其互作蛋白的篩選和驗(yàn)證成為揭示小麥與葉銹菌互作機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過(guò)質(zhì)譜分析和一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕プ黩?yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TaATG8h與TaORM之間存在穩(wěn)定且特異的相互作用。TaORM蛋白含有保守的ORM結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在真核生物中廣泛參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控，尤其在鞘脂代謝調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在酵母中，ORM蛋白通過(guò)對(duì)鞘脂代謝的調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程。而鞘脂代謝與細(xì)胞自噬過(guò)程緊密相連，鞘脂類物質(zhì)可以作為信號(hào)分子，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)和自噬體的形成。因此，TaORM蛋白的ORM結(jié)構(gòu)域可能通過(guò)調(diào)控鞘脂代謝，參與小麥中的自噬調(diào)控，進(jìn)而影響小麥對(duì)葉銹菌侵染的響應(yīng)。TaORM蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，這種亞細(xì)胞定位為其功能的發(fā)揮提供了重要線索。細(xì)胞質(zhì)是細(xì)胞代謝和信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵場(chǎng)所，許多自噬相關(guān)的事件，如自噬體的形成、底物的識(shí)別和降解等都發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。TaORM蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的定位表明它可能直接參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的自噬調(diào)控過(guò)程，通過(guò)與自噬相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)自噬體的形成和底物的選擇。同時(shí)，細(xì)胞核作為遺傳物質(zhì)的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中心，TaORM蛋白在細(xì)胞核中的定位暗示其可能參與基因表達(dá)的調(diào)控。在小麥響應(yīng)葉銹菌侵染的過(guò)程中，TaORM蛋白可能通過(guò)在細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子或其他調(diào)控蛋白相互作用，調(diào)節(jié)與自噬和抗病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響小麥對(duì)葉銹菌的抗性。酵母雙雜交、BiFC和Co-IP等多種技術(shù)從不同層面驗(yàn)證了TaATG8h與TaORM之間的相互作用。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)在酵母細(xì)胞中初步證實(shí)了兩者能夠相互作用，激活報(bào)告基因的表達(dá)。BiFC技術(shù)則在植物細(xì)胞內(nèi)直觀地展示了TaATG8h與TaORM相互作用后形成的蛋白復(fù)合體發(fā)出的黃色熒光信號(hào)，且熒光信號(hào)分布與TaORM蛋白的亞細(xì)胞定位一致。Co-IP技術(shù)從體內(nèi)水平進(jìn)一步驗(yàn)證了TaATG8h與TaORM在煙草葉片細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生相互作用，形成穩(wěn)定的蛋白復(fù)合物。這些結(jié)果表明，TaATG8h與TaORM之間的相互作用是真實(shí)存在且具有生物學(xué)意義的。TaATG8h與TaORM的互作可能在小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。一方面，這種互作可能影響小麥細(xì)胞內(nèi)的自噬過(guò)程。TaATG8h作為自噬過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，參與自噬體的形成和底物的招募。TaORM與TaATG8h的結(jié)合可能改變TaATG8h的構(gòu)象或活性，進(jìn)而影響自噬體的形成效率和底物的選擇性。例如，TaORM可能通過(guò)與TaATG8h互作，將特定的底物招募到自噬體上進(jìn)行降解，為葉銹菌的生長(zhǎng)和繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。另一方面，TaATG8h與TaORM的互作可能參與小麥對(duì)葉銹菌侵染的免疫反應(yīng)。在植物與病原菌互作過(guò)程中，自噬不僅參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的回收和再利用，還與植物的免疫防御密切相關(guān)。TaORM可能通過(guò)與TaATG8h互作，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)的免疫信號(hào)通路，影響小麥對(duì)葉銹菌的抗性。例如，TaORM與TaATG8h的互作可能激活或抑制某些免疫相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響小麥對(duì)葉銹菌的防御能力。為進(jìn)一步探究TaATG8h與TaORM互作的功能，后續(xù)研究可以通過(guò)基因編輯技術(shù)敲除或沉默TaORM基因，觀察小麥在葉銹菌侵染下的表型變化、自噬活性變化以及葉銹菌的生長(zhǎng)和繁殖情況。同時(shí)，可以構(gòu)建TaATG8h與TaORM的突變體，分析突變體對(duì)兩者互作及小麥與葉銹菌互作過(guò)程的影響。此外，還可以通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，全面分析TaATG8h與TaORM互作后小麥細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和基因表達(dá)的變化，深入揭示它們?cè)谛←湽?yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中的作用機(jī)制。4.3研究的不足與展望本研究在小麥供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中潛在選擇性自噬受體的篩選與鑒定方面取得了一定的進(jìn)展，成功篩選出TaATG8a和TaATG8h作為介導(dǎo)小麥大分子降解過(guò)程中潛在的關(guān)鍵TaATG8亞型，并驗(yàn)證了TaATG8h與TaORM之間的相互作用，為揭示小麥與葉銹菌互作的分子機(jī)制提供了重要線索。然而，本研究仍存在一些不足之處。在研究范圍上，本研究?jī)H聚焦于TaATG8蛋白家族及與之互作的TaORM蛋白，對(duì)于小麥中其他可能參與選擇性自噬調(diào)控的蛋白以及它們之間復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)尚未深入探究。小麥基因組龐大，可能存在多種潛在的選擇性自噬受體及相關(guān)調(diào)控蛋白，未來(lái)研究應(yīng)擴(kuò)大篩選范圍，全面系統(tǒng)地挖掘小麥中參與供應(yīng)葉銹菌營(yíng)養(yǎng)過(guò)程的選擇性自噬相關(guān)蛋白，構(gòu)建完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在研究深度上，雖然確定了TaATG8h與TaORM的互作關(guān)系，但對(duì)于這種互作如何具體調(diào)控小麥自噬過(guò)程以及小麥對(duì)葉銹菌侵染的免疫反應(yīng)，尚未進(jìn)行深入的功能分析。后續(xù)研究需要進(jìn)一步通過(guò)基因編輯、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，深入解析TaATG8h與TaORM互作的分子機(jī)制，明確它們?cè)谧允审w形成、底物選擇、免疫信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中的具體作用。此外，本研究主要在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，與實(shí)際田間環(huán)境存在一定差異。實(shí)際田間環(huán)境復(fù)雜，小麥生長(zhǎng)受到多種生物和非生物因素的綜合影響，未來(lái)研究應(yīng)加強(qiáng)田間試驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果在實(shí)際生產(chǎn)中的可靠性和有效性，為小麥葉銹病的防控提供更具實(shí)踐指導(dǎo)意義的理論依據(jù)。展望未來(lái)，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，如單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)、空間轉(zhuǎn)錄組技