小麥苗期抗寒性鑒定方法及相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析一、引言1.1研究背景與意義小麥（TriticumaestivumL.）作為全球最重要的糧食作物之一，為世界約35%-40%的人口提供主食，在保障糧食安全方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。在小麥的生長周期中，會遭遇多種復(fù)雜的環(huán)境脅迫，其中低溫脅迫是影響小麥生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵非生物脅迫因素之一。低溫對小麥的影響貫穿其整個生育期，尤其在苗期，小麥對低溫更為敏感。當(dāng)遭遇低溫時，小麥的生理生化過程會發(fā)生顯著變化。從細胞膜的穩(wěn)定性來看，低溫會破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，使膜的流動性降低，導(dǎo)致細胞膜透性增加，細胞內(nèi)的物質(zhì)外滲，進而影響細胞的正常生理功能。例如，研究表明，在低溫脅迫下，小麥幼苗葉片的相對電導(dǎo)率會顯著升高，這意味著細胞膜受到了損傷。在抗氧化酶系統(tǒng)方面，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的活性會發(fā)生改變。這些酶是植物體內(nèi)重要的抗氧化防御系統(tǒng)，它們能夠清除低溫脅迫下產(chǎn)生的過多活性氧（ROS），維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡。然而，當(dāng)?shù)蜏孛{迫超過一定程度時，抗氧化酶系統(tǒng)可能會失衡，導(dǎo)致ROS積累，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷。在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)方面，可溶性糖、游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)會在細胞內(nèi)積累，以調(diào)節(jié)細胞的滲透壓，維持細胞的水分平衡。如在低溫處理下，小麥幼苗葉片中的可溶性糖和游離脯氨酸含量會明顯增加，增強小麥的抗寒性。但如果低溫持續(xù)時間過長或強度過大，這些生理調(diào)節(jié)機制可能無法有效抵御低溫傷害，從而導(dǎo)致小麥生長受阻，甚至死亡。在全球氣候變化的大背景下，極端低溫事件的發(fā)生頻率和強度呈上升趨勢，這使得小麥遭受低溫凍害的風(fēng)險日益增加。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計，在過去的幾十年里，因低溫凍害導(dǎo)致的小麥減產(chǎn)幅度在某些地區(qū)達到了30%以上，嚴(yán)重影響了小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，對糧食安全構(gòu)成了巨大威脅。此外，低溫還會限制小麥的種植區(qū)域，使得一些原本適合種植小麥的地區(qū)因溫度降低而不再適宜，這不僅影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的布局，也減少了小麥的種植面積，進一步加劇了糧食供應(yīng)的壓力。因此，深入研究小麥苗期的抗寒性，對于保障小麥的安全生產(chǎn)和提高小麥的產(chǎn)量具有至關(guān)重要的意義。通過鑒定小麥苗期的抗寒性方法，可以篩選出具有強抗寒性的小麥品種，為小麥生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。利用全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)挖掘與小麥抗寒性相關(guān)的基因位點，能夠揭示小麥抗寒的分子機制，為小麥抗寒育種提供理論基礎(chǔ)和基因資源。這不僅有助于提高小麥在低溫環(huán)境下的適應(yīng)能力，減少低溫凍害對小麥生產(chǎn)的影響，保障糧食安全，還能推動農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用價值。1.2小麥苗期抗寒性研究現(xiàn)狀在小麥苗期抗寒性的鑒定方法方面，目前已發(fā)展出多種技術(shù)。傳統(tǒng)的田間鑒定方法通過在自然低溫環(huán)境下觀察小麥苗期的凍害癥狀，如葉片萎蔫、干枯程度以及植株死亡率等，來直觀評價小麥的抗寒性。這種方法雖然能夠反映小麥在實際生產(chǎn)環(huán)境中的抗寒表現(xiàn)，但易受年份、地域等環(huán)境因素的影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性相對較低。為了更精確地鑒定小麥苗期抗寒性，生理生化指標(biāo)測定方法得到了廣泛應(yīng)用。相對電導(dǎo)率是常用的指標(biāo)之一，它能反映細胞膜受低溫損傷的程度。當(dāng)小麥遭受低溫脅迫時，細胞膜透性增大，細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致相對電導(dǎo)率升高，因此相對電導(dǎo)率與小麥抗寒性呈負相關(guān)。例如，研究表明，在相同低溫處理下，抗寒性強的小麥品種相對電導(dǎo)率增幅較小，而抗寒性弱的品種相對電導(dǎo)率明顯上升。可溶性糖和游離脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量變化也可用于抗寒性鑒定。低溫脅迫下，小麥細胞會積累可溶性糖和游離脯氨酸，以降低細胞內(nèi)水勢，維持細胞的水分平衡，增強抗寒性。有研究發(fā)現(xiàn)，在低溫處理過程中，抗寒品種的小麥幼苗體內(nèi)可溶性糖和游離脯氨酸含量顯著高于不抗寒品種。此外，葉綠素?zé)晒鈪?shù)也逐漸成為鑒定小麥苗期抗寒性的重要手段。葉綠素?zé)晒饪梢苑从彻夂献饔眠^程中光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化效率，低溫脅迫會影響光合作用的正常進行，導(dǎo)致葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)生變化。如最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）可衡量光系統(tǒng)II的潛在活性，在低溫脅迫下，F(xiàn)v/Fm值下降幅度越小，表明小麥對低溫的耐受性越強。在小麥苗期抗寒性相關(guān)性狀方面，根系發(fā)育狀況與抗寒性密切相關(guān)。發(fā)達的根系能夠增強小麥對水分和養(yǎng)分的吸收能力，提高植株的抗逆性。研究發(fā)現(xiàn)，抗寒性強的小麥品種在苗期往往具有更深、更密的根系，根系活力也更高。葉片形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征也會影響小麥的抗寒性。較厚的葉片角質(zhì)層和表皮細胞壁能夠減少水分散失，增強對低溫的抵御能力；葉片較小且緊湊的小麥品種，在低溫環(huán)境下散熱較慢，有利于保持植株溫度。在基因挖掘方面，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多與小麥苗期抗寒性相關(guān)的基因被挖掘出來。一些轉(zhuǎn)錄因子基因，如CBF（C-repeatbindingfactor）基因家族，在調(diào)控小麥抗寒過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CBF基因能夠被低溫誘導(dǎo)表達，進而調(diào)控一系列下游抗寒相關(guān)基因的表達，提高小麥的抗寒性。一些功能基因，如編碼抗氧化酶、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶等的基因，也參與了小麥抗寒機制。對這些基因的深入研究，有助于揭示小麥抗寒的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為小麥抗寒育種提供有力的基因資源。1.3全基因組關(guān)聯(lián)分析在小麥研究中的應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-WideAssociationStudy，GWAS）作為一種強大的遺傳學(xué)研究工具，近年來在小麥復(fù)雜性狀研究中得到了廣泛應(yīng)用，為解析小麥的遺傳機制和挖掘優(yōu)異基因提供了新的思路和方法。在小麥產(chǎn)量相關(guān)性狀研究中，GWAS發(fā)揮了重要作用。小麥產(chǎn)量是由多個農(nóng)藝性狀共同決定的復(fù)雜數(shù)量性狀，如單位面積穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重等。通過對大量小麥種質(zhì)資源進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，研究者們成功鑒定出多個與產(chǎn)量相關(guān)性狀緊密關(guān)聯(lián)的基因位點。例如，在對某小麥自然群體的研究中，利用高密度單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記進行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)了位于染色體2B上的一個基因位點與千粒重顯著相關(guān)，該位點的不同等位基因可導(dǎo)致千粒重存在明顯差異。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該基因可能通過調(diào)控淀粉合成相關(guān)酶的活性，影響籽粒的灌漿過程，從而對千粒重產(chǎn)生影響。在小麥品質(zhì)性狀研究方面，GWAS也取得了顯著成果。小麥的品質(zhì)性狀包括籽粒硬度、蛋白質(zhì)含量、淀粉品質(zhì)等，這些性狀直接影響小麥的加工品質(zhì)和營養(yǎng)價值。運用GWAS技術(shù)，研究人員定位到多個與小麥品質(zhì)性狀相關(guān)的基因區(qū)域。在對小麥籽粒硬度的研究中，通過對不同硬度類型小麥品種的全基因組關(guān)聯(lián)分析，確定了位于5D染色體上的Pina和Pinb基因是控制籽粒硬度的關(guān)鍵基因，其等位基因的變異與籽粒硬度的差異密切相關(guān)。對小麥蛋白質(zhì)含量的GWAS分析發(fā)現(xiàn)，一些轉(zhuǎn)錄因子基因參與了蛋白質(zhì)合成的調(diào)控過程，影響著小麥的蛋白質(zhì)含量。對于小麥生物和非生物脅迫抗性研究，GWAS同樣展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢。在生物脅迫方面，針對小麥白粉病、條銹病等病害抗性的GWAS研究，鑒定出許多抗性基因位點。在小麥白粉病抗性研究中，通過對不同抗性小麥品種的全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)了多個與白粉病抗性相關(guān)的QTL位點，其中一些位點已被證實編碼抗病蛋白，參與小麥對白粉病菌的識別和防御反應(yīng)。在非生物脅迫抗性研究中，GWAS被廣泛應(yīng)用于挖掘小麥的抗旱、耐鹽、抗寒等相關(guān)基因。在小麥抗旱性研究中，利用GWAS技術(shù)定位到多個與根系發(fā)育、氣孔調(diào)節(jié)等抗旱相關(guān)性狀相關(guān)的基因位點，這些基因可能通過調(diào)節(jié)植物的水分吸收和利用效率，增強小麥的抗旱能力。在小麥抗寒性研究中，GWAS為挖掘抗寒基因提供了有力手段。通過對不同抗寒性小麥品種進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，可以篩選出與抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，進而定位到潛在的抗寒基因。在一項小麥抗寒性GWAS研究中，對150份小麥材料進行低溫脅迫處理，結(jié)合全基因組SNP標(biāo)記分析，鑒定出20個與抗寒性相關(guān)的顯著關(guān)聯(lián)位點，其中部分位點位于已知的抗寒相關(guān)基因區(qū)域，為進一步解析小麥抗寒分子機制提供了重要線索。通過GWAS挖掘到的抗寒基因，可用于小麥抗寒品種的分子標(biāo)記輔助選擇育種，提高育種效率，加快抗寒新品種的培育進程。1.4研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過綜合運用多種方法，系統(tǒng)地鑒定小麥苗期的抗寒性，并深入挖掘與抗寒性相關(guān)的基因位點，為小麥抗寒育種提供理論支持和技術(shù)依據(jù)。具體研究目標(biāo)和內(nèi)容如下：研究目標(biāo)：篩選出準(zhǔn)確、可靠且簡便易行的小麥苗期抗寒性鑒定方法，為小麥抗寒種質(zhì)資源的篩選和評價提供有效的技術(shù)手段；明確小麥苗期抗寒性相關(guān)的重要性狀，解析這些性狀與抗寒性之間的內(nèi)在聯(lián)系；利用全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)，挖掘與小麥苗期抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的基因位點，為揭示小麥抗寒分子機制奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容：收集不同來源、具有廣泛遺傳多樣性的小麥品種（系），構(gòu)建用于抗寒性研究的自然群體。對該群體進行多年、多點的田間種植，在自然低溫條件下，詳細記錄小麥苗期的凍害癥狀，包括葉片萎蔫程度、葉色變化、分蘗存活情況等，采用凍害級別評分法對各品種（系）的抗寒性進行初步評價。同時，利用人工氣候箱設(shè)置不同的低溫梯度和處理時間，模擬低溫脅迫環(huán)境，對小麥幼苗進行處理。測定處理后小麥幼苗的相對電導(dǎo)率、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、丙二醛含量、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT等）以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)等生理生化指標(biāo)，分析這些指標(biāo)在不同品種（系）間的差異及其與抗寒性的相關(guān)性，篩選出與小麥苗期抗寒性密切相關(guān)的生理生化指標(biāo)，建立基于生理生化指標(biāo)的小麥苗期抗寒性鑒定體系。在小麥苗期，測量各品種（系）的株高、莖粗、葉片數(shù)、葉面積、分蘗數(shù)、根長、根表面積、根體積、根系活力等形態(tài)和生長性狀，并分析這些性狀與抗寒性之間的關(guān)系。研究不同抗寒性小麥品種（系）在低溫脅迫下的生長動態(tài)變化，包括生長速率、生物量積累等，揭示生長性狀與抗寒性的內(nèi)在聯(lián)系。利用IlluminaHiSeq等高通量測序平臺，對構(gòu)建的小麥自然群體進行全基因組重測序或簡化基因組測序，獲得高密度的單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記。結(jié)合田間表型數(shù)據(jù)和生理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)，運用TASSEL、GAPIT等軟件，采用混合線性模型（MLM）等方法進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，篩選出與小麥苗期抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，并進一步定位到相關(guān)的基因位點。對關(guān)聯(lián)分析得到的候選基因進行功能注釋和生物信息學(xué)分析，預(yù)測其可能的生物學(xué)功能和參與的代謝途徑。結(jié)合已有的研究成果，對關(guān)鍵候選基因進行表達模式分析，驗證其在小麥抗寒性中的作用機制。二、小麥苗期抗寒性鑒定方法2.1田間鑒定法田間鑒定法是在自然條件下，對小麥苗期抗寒性進行直接評估的方法，能真實反映小麥在實際生產(chǎn)環(huán)境中的抗寒表現(xiàn)。其主要包括地上部凍害目測、越冬死株和死莖率計算以及抗寒性分級標(biāo)準(zhǔn)的確定。2.1.1地上部凍害目測地上部凍害目測通常在小麥越冬期和春季返青期進行。在越冬期，小麥經(jīng)歷低溫脅迫后，地上部會出現(xiàn)不同程度的凍害癥狀。此時，觀察葉片的凍枯情況，從葉尖開始，逐漸向葉片基部擴展，凍枯部分的顏色由綠色變?yōu)榭蔹S。例如，輕度凍害時，葉片尖端出現(xiàn)少量枯黃；隨著凍害程度加重，枯黃部分逐漸增多，甚至擴展至整個葉片。在春季返青期，再次觀察葉片的恢復(fù)情況和新葉的生長狀況。如果葉片能夠逐漸恢復(fù)綠色，新葉正常生長，說明小麥的抗寒性較強；反之，若葉片持續(xù)枯黃，新葉生長緩慢或停滯，則表明抗寒性較弱。具體分級標(biāo)準(zhǔn)一般分為5級。1級表示葉片基本無凍害癥狀，葉色鮮綠，生長正常；2級表現(xiàn)為葉尖輕微凍枯，枯黃部分占葉片總面積的10%-25%；3級時，葉片中部以下出現(xiàn)凍枯，枯黃部分占葉片總面積的25%-50%；4級的葉片大部分凍枯，枯黃部分占葉片總面積的50%-75%；5級則是葉片幾乎全部凍枯，僅基部殘留少量綠色組織。這種分級標(biāo)準(zhǔn)能夠直觀地反映小麥地上部的凍害程度，為抗寒性評估提供了初步依據(jù)。2.1.2越冬死株、死莖率計算從出苗期開始，選擇具有代表性的樣點，每個樣點的面積一般為1-2平方米，樣點應(yīng)均勻分布在試驗田內(nèi)，避免邊緣效應(yīng)的影響。在整個越冬期間，定期觀察樣點內(nèi)小麥的生長狀況，記錄死亡植株和死亡莖的數(shù)量。返青后，對樣點內(nèi)的小麥進行全面清查，準(zhǔn)確統(tǒng)計死株和死莖的數(shù)量。死株率的計算公式為：死株率（%）=（死株數(shù)/總株數(shù)）×100。例如，樣點內(nèi)總株數(shù)為500株，死株數(shù)為50株，則死株率為（50/500）×100=10%。死莖率的計算公式為：死莖率（%）=（死莖數(shù)/總莖數(shù)）×100。假設(shè)樣點內(nèi)總莖數(shù)為800個，死莖數(shù)為80個，則死莖率為（80/800）×100=10%。通過計算死株率和死莖率，可以定量地評估小麥在越冬期間的死亡情況，從而判斷其抗寒性的強弱。2.1.3抗寒性分級標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)越冬死莖率，小麥的抗寒性可劃分為5個等級。1級為高抗，越冬死莖率小于5%，這類小麥品種在當(dāng)?shù)胤N植，即使遇到較為寒冷的冬季，也能保持較高的存活率，基本不會因低溫而影響產(chǎn)量，具有很強的抗寒能力，能適應(yīng)低溫環(huán)境，維持正常的生長發(fā)育。2級為抗寒，越冬死莖率在5%-15%之間，該等級的小麥品種在當(dāng)?shù)胤N植，一般情況下能安全越冬，但在極端低溫年份，可能會出現(xiàn)一定程度的凍害，導(dǎo)致少量莖死亡，但對整體產(chǎn)量影響較小，具備較好的抗寒特性，能夠應(yīng)對一定程度的低溫脅迫。3級為中抗，越冬死莖率在15%-30%之間，此類小麥品種在當(dāng)?shù)胤N植，越冬時存在一定風(fēng)險，在正常年份可以生長，但在寒冷年份，凍害可能較為明顯，死莖率會有所上升，可能會對產(chǎn)量造成一定的影響，抗寒能力處于中等水平。4級為敏感，越冬死莖率在30%-50%之間，這類小麥品種對低溫較為敏感，在當(dāng)?shù)胤N植，越冬期間容易受到低溫的影響，死莖率較高，產(chǎn)量可能會大幅下降，抗寒能力較弱，難以適應(yīng)低溫環(huán)境。5級為極敏感，越冬死莖率大于50%，該等級的小麥品種抗寒性極差，在當(dāng)?shù)胤N植，越冬風(fēng)險極高，大量莖會因低溫死亡，嚴(yán)重影響產(chǎn)量，甚至可能導(dǎo)致絕收，基本不適合在該地區(qū)種植。這種抗寒性分級標(biāo)準(zhǔn)，能夠清晰地反映不同小麥品種的抗寒能力，為小麥品種的選擇和種植提供了重要的參考依據(jù)，有助于農(nóng)民根據(jù)當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件，合理選擇抗寒品種，降低低溫凍害對小麥生產(chǎn)的影響。2.2室內(nèi)人工模擬氣候鑒定法室內(nèi)人工模擬氣候鑒定法能夠在可控的環(huán)境條件下，精確地對小麥苗期抗寒性進行評估，避免了田間自然環(huán)境的復(fù)雜性和不確定性對鑒定結(jié)果的干擾，為小麥抗寒性研究提供了更為準(zhǔn)確和可靠的技術(shù)手段。該方法主要包括模擬低溫環(huán)境設(shè)置以及鑒定指標(biāo)與方法的確定。2.2.1模擬低溫環(huán)境設(shè)置利用人工氣候箱來模擬低溫環(huán)境。在小麥種子萌發(fā)并生長至兩葉一心期時，將長勢一致的小麥幼苗移入人工氣候箱中。設(shè)置不同的低溫時段和時長，通常采用逐步降溫的方式。先將溫度降至10℃，保持12小時，使小麥幼苗適應(yīng)低溫環(huán)境的變化，避免溫度驟變對幼苗造成過度傷害。隨后，以每2小時降低2℃的速度，將溫度降至4℃，并在此溫度下保持24小時。繼續(xù)降溫，以每2小時降低1℃的速度，將溫度降至-4℃，維持12小時。之后，以每2小時升高2℃的速度緩慢升溫至10℃，再保持12小時。整個低溫處理過程共持續(xù)72小時。在處理過程中，設(shè)置相對濕度為70%-80%，光照強度為200μmol?m?2?s?1，光照時間為12小時/天，以模擬自然環(huán)境中的濕度和光照條件。通過這樣的設(shè)置，能夠較為真實地模擬小麥在自然環(huán)境中可能遭遇的低溫脅迫過程，為后續(xù)的抗寒性鑒定提供穩(wěn)定且可控的環(huán)境條件。2.2.2鑒定指標(biāo)與方法在低溫處理結(jié)束后，選取小麥幼苗的葉片，采用電導(dǎo)儀法測定相對電導(dǎo)率。將葉片剪成1cm長的小段，放入裝有20mL去離子水的試管中，抽氣15分鐘，使葉片組織充分浸潤，然后在25℃下靜置2小時，測定此時的電導(dǎo)率（C?）。之后，將試管置于沸水浴中15分鐘，使葉片細胞完全死亡，冷卻至25℃后，再次測定電導(dǎo)率（C?）。相對電導(dǎo)率（%）=（C?/C?）×100，相對電導(dǎo)率越高，表明細胞膜受到的損傷越嚴(yán)重，小麥的抗寒性越弱。采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量。取0.5g葉片，加入5mL80%乙醇，在80℃水浴中提取30分鐘，離心后取上清液。向上清液中加入蒽酮試劑，在沸水浴中顯色10分鐘，冷卻后在620nm波長下測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可溶性糖含量，低溫脅迫下，小麥體內(nèi)可溶性糖含量升高，有助于增強細胞的保水能力，提高抗寒性。采用酸性茚三酮法測定游離脯氨酸含量。稱取0.5g葉片，加入5mL3%磺基水楊酸，研磨后沸水浴提取10分鐘，離心取上清液。向上清液中依次加入冰醋酸、酸性茚三酮試劑，在沸水浴中顯色30分鐘，冷卻后加入甲苯萃取，取甲苯層在520nm波長下測定吸光度。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算游離脯氨酸含量，游離脯氨酸作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量的增加能夠調(diào)節(jié)細胞滲透壓，維持細胞的正常生理功能，與小麥抗寒性呈正相關(guān)。通過對這些生理指標(biāo)的測定和分析，可以深入了解小麥在低溫脅迫下的生理響應(yīng)機制，為小麥苗期抗寒性的準(zhǔn)確鑒定提供科學(xué)依據(jù)。2.3分子標(biāo)記鑒定法分子標(biāo)記鑒定法是從分子層面深入探究小麥抗寒性的關(guān)鍵技術(shù)，能夠揭示抗寒性狀的遺傳本質(zhì)，為小麥抗寒育種提供精準(zhǔn)的分子依據(jù)。它主要涵蓋InDel分子標(biāo)記原理與開發(fā)以及分子標(biāo)記檢測與分析這兩個重要方面。2.3.1InDel分子標(biāo)記原理與開發(fā)插入/缺失（Insertion-Deletion，InDel）多態(tài)性分子標(biāo)記，是基于在近緣種或同一物種不同個體之間基因組同一位點的序列發(fā)生不同大小核苷酸片段的插入或缺失現(xiàn)象而開發(fā)的。其開發(fā)原理是利用插入/缺失位點兩側(cè)的保守序列設(shè)計特異性引物。具體過程如下，首先獲取不同小麥品種的基因組序列，通過生物信息學(xué)分析，比對不同品種間的序列差異，篩選出存在插入/缺失變異的位點。以這些位點兩側(cè)長度約20-30bp的保守序列為模板，運用PrimerPremier等引物設(shè)計軟件，設(shè)計出特異性的引物對。在設(shè)計引物時，需考慮引物的Tm值、GC含量等因素，確保引物的特異性和擴增效率。例如，若在某小麥品種的基因組中發(fā)現(xiàn)一個10bp的插入片段，在其他品種中不存在該插入，那么就可以針對該插入/缺失位點兩側(cè)的保守序列設(shè)計引物。正向引物可設(shè)計為5’-ATGCTGACCTGACCTGACT-3’，反向引物設(shè)計為5’-CAGTCAGTCAGTCAGTCAG-3’。通過這樣的引物設(shè)計，能夠特異性地擴增包含插入/缺失位點的DNA片段，從而實現(xiàn)對不同基因型的區(qū)分。2.3.2分子標(biāo)記檢測與分析利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，以小麥基因組DNA為模板，使用設(shè)計好的InDel分子標(biāo)記引物進行擴增。PCR反應(yīng)體系一般包含模板DNA20-50ng，10μmol/L的上下游引物各0.5μL，2.5mmol/L的dNTPs0.5μL，10×PCRbuffer2.5μL，TaqDNA聚合酶0.5U，用ddH?O補足至25μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3-5分鐘，使模板DNA完全解鏈；然后進行30-40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈解開；55-65℃退火30秒，引物與模板特異性結(jié)合；72℃延伸30-60秒，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸5-10分鐘，確保所有DNA片段都能充分延伸。擴增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測。聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高，能夠清晰區(qū)分差異較小的DNA片段；瓊脂糖凝膠電泳操作簡便，適合快速檢測。在電泳過程中，DNA片段會在電場的作用下向正極移動，根據(jù)片段大小的不同，在凝膠上形成不同的條帶。例如，若某InDel分子標(biāo)記在抗寒品種中擴增出的片段長度為200bp，在不抗寒品種中擴增出的片段長度為220bp，那么在電泳圖譜上，抗寒品種會在200bp位置出現(xiàn)條帶，不抗寒品種會在220bp位置出現(xiàn)條帶。通過分析不同小麥品種的電泳條帶，確定其基因型。將基因型數(shù)據(jù)與小麥的抗寒性表型數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析，采用卡方檢驗、方差分析等統(tǒng)計方法，篩選出與抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的InDel分子標(biāo)記。若某InDel分子標(biāo)記在抗寒品種和不抗寒品種中的基因型頻率存在顯著差異，且與抗寒性表型具有較高的相關(guān)性，那么該分子標(biāo)記就可能與小麥抗寒性相關(guān)，為后續(xù)的抗寒基因挖掘和分子標(biāo)記輔助育種提供重要的參考依據(jù)。2.4各種鑒定方法的比較與評價田間鑒定法、室內(nèi)人工模擬氣候鑒定法和分子標(biāo)記鑒定法在小麥苗期抗寒性鑒定中各有優(yōu)劣，在準(zhǔn)確性、成本和效率等方面表現(xiàn)出明顯的差異。田間鑒定法的最大優(yōu)勢在于其鑒定環(huán)境的真實性，能夠全面反映小麥在實際生產(chǎn)條件下對低溫的綜合響應(yīng)，結(jié)果直觀且符合實際生產(chǎn)情況。通過地上部凍害目測和越冬死株、死莖率計算，能直接觀察到小麥在自然低溫下的凍害癥狀和死亡情況。其受自然環(huán)境因素的影響較大，如不同年份、地域的溫度、降水、光照等條件差異，會導(dǎo)致鑒定結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性受到限制。不同年份的冬季低溫強度和持續(xù)時間不同，會使同一小麥品種的抗寒性表現(xiàn)不穩(wěn)定，增加了鑒定的誤差。且田間鑒定需要較大的種植面積和較長的時間周期，耗費大量的人力、物力和財力。在進行大規(guī)模小麥品種抗寒性鑒定時，田間試驗的管理和數(shù)據(jù)采集工作繁瑣，效率較低。室內(nèi)人工模擬氣候鑒定法的準(zhǔn)確性較高，通過精確控制溫度、濕度、光照等環(huán)境因素，能夠排除自然環(huán)境中其他因素的干擾，使鑒定結(jié)果更具可比性。對相對電導(dǎo)率、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量等生理指標(biāo)的測定，能夠從生理生化層面深入了解小麥在低溫脅迫下的響應(yīng)機制，為抗寒性評價提供科學(xué)依據(jù)。該方法的成本相對較高，需要購置人工氣候箱等專業(yè)設(shè)備，設(shè)備的維護和運行成本也較高。且室內(nèi)鑒定的環(huán)境與實際田間環(huán)境存在一定差異，可能導(dǎo)致鑒定結(jié)果與實際生產(chǎn)情況不完全一致。人工氣候箱中的光照強度、光質(zhì)等與自然光照有區(qū)別，可能影響小麥的生長和抗寒表現(xiàn)。分子標(biāo)記鑒定法具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，能夠從分子層面揭示小麥抗寒性的遺傳本質(zhì)，直接檢測與抗寒性相關(guān)的基因或分子標(biāo)記，不受環(huán)境因素的影響。通過開發(fā)InDel分子標(biāo)記并進行檢測分析，可以快速、準(zhǔn)確地篩選出與抗寒性相關(guān)的基因型。該方法對技術(shù)和設(shè)備的要求較高，需要具備分子生物學(xué)實驗技術(shù)和專業(yè)的儀器設(shè)備，如PCR儀、電泳儀等。分子標(biāo)記開發(fā)和檢測的成本也較高，限制了其在大規(guī)模小麥品種抗寒性鑒定中的應(yīng)用。目前已知的與小麥抗寒性相關(guān)的分子標(biāo)記數(shù)量有限，可能無法全面覆蓋所有的抗寒基因位點，存在一定的局限性。田間鑒定法適用于初步篩選和評價小麥品種在實際生產(chǎn)中的抗寒性；室內(nèi)人工模擬氣候鑒定法適合深入研究小麥抗寒的生理機制和精確評價抗寒性；分子標(biāo)記鑒定法在抗寒基因挖掘和分子標(biāo)記輔助育種方面具有重要作用。在實際研究和應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)具體需求和條件，綜合運用多種鑒定方法，以提高小麥苗期抗寒性鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。三、小麥苗期抗寒性相關(guān)性狀分析3.1形態(tài)學(xué)性狀3.1.1假莖長度與抗寒性關(guān)系假莖是小麥在拔節(jié)以前，由多層葉鞘和心葉組成的具有一定長度的莖稈，其形態(tài)與大蔥的蔥白部分相似。假莖長度與小麥幼苗習(xí)性、地中莖長度緊密相關(guān)，進而對小麥抗寒性產(chǎn)生顯著影響。一般而言，假莖較長的小麥品種，其幼苗習(xí)性多呈現(xiàn)直立狀態(tài)。這是因為較長的假莖為幼苗提供了相對較高的支撐結(jié)構(gòu)，使得幼苗能夠更直立地生長。假莖較長還意味著小麥的分蘗節(jié)距地表相對較近。研究表明，在相同的低溫環(huán)境下，假莖長的小麥品種，其分蘗節(jié)更容易受到低溫的影響。這是由于分蘗節(jié)距離地表近，熱量散失較快，難以維持適宜的溫度，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)的生理生化過程受到干擾，細胞膜的穩(wěn)定性下降，電解質(zhì)外滲增加，最終表現(xiàn)為抗寒性較差。有研究對比了不同假莖長度的小麥品種在低溫脅迫下的相對電導(dǎo)率，發(fā)現(xiàn)假莖長的品種相對電導(dǎo)率明顯高于假莖短的品種，進一步證實了假莖長與抗寒性差之間的關(guān)聯(lián)。相反，假莖短或幾乎無明顯假莖的小麥品種，幼苗習(xí)性多為匍匐于地面。這種匍匐生長的習(xí)性使得麥苗與地面的接觸面積增大，能夠更好地吸收地面散發(fā)的熱量，起到一定的保溫作用。假莖短的小麥品種，其地中莖也相對較短，分蘗節(jié)距離地表較遠，能夠在一定程度上避免低溫的直接傷害。從生理角度來看，這類小麥品種在低溫環(huán)境下，細胞內(nèi)的水分流失相對較少，細胞膜的完整性能夠得到較好的維持，抗氧化酶系統(tǒng)能夠更有效地清除活性氧，從而表現(xiàn)出較強的抗寒性。在田間試驗中，觀察到假莖短的小麥品種在越冬期，葉片雖然會受到一定程度的凍害，但仍能保持部分綠色，且在春季返青時，恢復(fù)生長的速度較快，而假莖長的品種葉片則多呈現(xiàn)黃白色，返青困難。播種期和播種量也會對假莖長度及抗寒性產(chǎn)生影響。播種期過早，小麥在冬前生長時間過長，假莖會因生長過度而變長。播種量過大時，小麥植株之間競爭養(yǎng)分、光照和空間，導(dǎo)致個體生長不良，假莖也會相應(yīng)變長。這兩種情況下，小麥的抗寒性都會降低。在實際生產(chǎn)中，若某地區(qū)正常播種期為10月中旬，當(dāng)播種期提前至9月底時，小麥假莖長度明顯增加，越冬期間的死苗率也顯著上升。這是因為假莖變長后，小麥的生長習(xí)性改變，對低溫的抵御能力下降，更容易受到凍害的侵襲。因此，在小麥種植過程中，合理控制播種期和播種量，對于調(diào)控假莖長度，提高小麥抗寒性具有重要意義。3.1.2葉片形態(tài)特征對抗寒性的影響小麥葉片的寬窄和顏色等形態(tài)特征，與小麥的抗寒性密切相關(guān)，在低溫環(huán)境下對小麥的生長和存活起著關(guān)鍵作用。葉片較窄的小麥品種通常具有較強的抗寒性。從物理學(xué)角度來看，窄葉片的表面積相對較小，在低溫環(huán)境下，熱量散失的速度較慢。這使得小麥植株能夠更好地保持自身溫度，減少因低溫導(dǎo)致的生理損傷。窄葉片的氣孔密度相對較低，在低溫條件下，能夠減少水分的散失，保持細胞的水分平衡。研究表明，在相同的低溫脅迫下，窄葉片小麥品種的葉片相對含水量下降幅度明顯小于寬葉片品種。從生理學(xué)角度分析，窄葉片小麥品種在低溫脅迫下，能夠更有效地調(diào)節(jié)自身的生理代謝過程。它們能夠積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如可溶性糖、游離脯氨酸等，以降低細胞內(nèi)的水勢，增強細胞的保水能力。窄葉片小麥品種的抗氧化酶活性也相對較高，能夠及時清除低溫脅迫下產(chǎn)生的過多活性氧，減輕氧化損傷。在人工模擬低溫試驗中，發(fā)現(xiàn)窄葉片小麥品種在低溫處理后，其葉片中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的活性顯著高于寬葉片品種，從而表現(xiàn)出更強的抗寒性。葉片顏色較深的小麥品種往往具有更好的抗寒能力。葉片顏色主要由葉綠素含量、花青素含量等因素決定。顏色較深的葉片通常含有較高的葉綠素含量，這使得小麥在低溫環(huán)境下能夠更有效地進行光合作用。充足的光合作用可以為小麥提供更多的能量和物質(zhì)，維持其正常的生長和代謝活動。在低溫脅迫下，葉綠素含量高的葉片能夠保持較高的光合效率，為細胞提供足夠的ATP和還原力，用于維持細胞的正常生理功能。葉片顏色深可能與花青素含量有關(guān)。花青素是一種天然的抗氧化劑，具有較強的清除自由基的能力。在低溫環(huán)境下，花青素含量高的小麥品種能夠更好地抵御氧化應(yīng)激，保護細胞免受活性氧的傷害。研究發(fā)現(xiàn)，一些抗寒性強的小麥品種，其葉片在低溫處理后，花青素含量顯著增加，這可能是其抗寒性增強的重要原因之一。在田間觀察中，也可以發(fā)現(xiàn)顏色深綠的小麥品種在越冬期間，葉片受凍害的程度相對較輕，返青后生長恢復(fù)較快，而葉片顏色較淺的品種則更容易受到凍害的影響，生長受到抑制。3.2生理生化性狀3.2.1滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化在低溫脅迫下，小麥細胞會主動積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以降低細胞內(nèi)的水勢，維持細胞的水分平衡，增強自身的抗寒性。其中，可溶性糖和游離脯氨酸是兩類重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它們的含量變化與小麥抗寒性密切相關(guān)?？扇苄蕴亲鳛橐环N重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在小麥應(yīng)對低溫脅迫時發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)小麥遭受低溫時，光合作用受到抑制，碳水化合物的合成和代謝途徑發(fā)生改變，使得可溶性糖在細胞內(nèi)大量積累。可溶性糖含量的增加能夠降低細胞的滲透勢，使細胞在低溫環(huán)境下仍能保持較高的含水量，避免細胞因失水而受損。研究表明，在低溫處理后，抗寒性強的小麥品種葉片中可溶性糖含量顯著高于抗寒性弱的品種。例如，在對不同抗寒性小麥品種進行4℃低溫處理72小時的實驗中，抗寒品種的可溶性糖含量從處理前的10mg/gFW增加到25mg/gFW，而不抗寒品種僅從10mg/gFW增加到15mg/gFW。這表明抗寒品種能夠更有效地積累可溶性糖，以應(yīng)對低溫脅迫?？扇苄蕴沁€具有保護蛋白質(zhì)和生物膜的作用，能夠防止蛋白質(zhì)因低溫而變性，維持生物膜的穩(wěn)定性。在低溫環(huán)境下，可溶性糖可以與蛋白質(zhì)分子相互作用，形成一層保護膜，阻止水分的流失和冰晶的形成，從而保護蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。可溶性糖還能調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，清除活性氧，減輕低溫脅迫對細胞的氧化損傷。游離脯氨酸也是小麥在低溫脅迫下積累的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在正常生長條件下，小麥體內(nèi)游離脯氨酸的含量較低，但當(dāng)受到低溫脅迫時，其合成途徑被激活，導(dǎo)致游離脯氨酸大量積累。游離脯氨酸具有高度的水溶性和低毒性，能夠在細胞內(nèi)大量積累而不影響細胞的正常生理功能。它可以通過調(diào)節(jié)細胞的滲透壓，保持細胞的膨壓，維持細胞的正常形態(tài)和生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，小麥幼苗葉片中游離脯氨酸含量迅速上升，且抗寒性越強的品種，游離脯氨酸積累的速度和量都更大。在-5℃低溫處理24小時后，抗寒小麥品種的游離脯氨酸含量從處理前的5μmol/gFW增加到30μmol/gFW，而不抗寒品種僅增加到15μmol/gFW。游離脯氨酸還能作為一種抗氧化劑，參與細胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)。它可以通過清除活性氧，減少氧化應(yīng)激對細胞的損傷，保護細胞免受低溫脅迫的傷害。游離脯氨酸還能調(diào)節(jié)植物激素的平衡，影響植物的生長發(fā)育和抗逆性。例如，游離脯氨酸可以促進脫落酸（ABA）的合成，ABA作為一種重要的植物激素，能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗寒反應(yīng)，增強植物的抗寒性。3.2.2抗氧化酶活性與抗寒性在低溫脅迫下，小麥細胞內(nèi)的活性氧（ROS）代謝平衡會被打破，導(dǎo)致ROS大量積累，如超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）和羥自由基（?OH）等。這些過量積累的ROS具有很強的氧化活性，能夠攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等，導(dǎo)致細胞膜脂過氧化、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，從而嚴(yán)重影響細胞的正常生理功能。為了抵御ROS的傷害，小麥進化出了一套復(fù)雜的抗氧化酶系統(tǒng)，其中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）是該系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，它們在清除ROS、維持細胞內(nèi)氧化還原平衡以及增強小麥抗寒性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。SOD是抗氧化酶系統(tǒng)中的第一道防線，它能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣。在低溫脅迫下，小麥體內(nèi)的SOD活性會迅速升高，以清除大量產(chǎn)生的超氧陰離子。研究表明，抗寒性強的小麥品種在低溫處理后，SOD活性的增加幅度明顯大于抗寒性弱的品種。在對不同抗寒性小麥品種進行-10℃低溫處理48小時的實驗中，抗寒品種的SOD活性從處理前的100U/gFW增加到300U/gFW，而不抗寒品種僅從100U/gFW增加到150U/gFW。這說明抗寒品種能夠更有效地激活SOD的活性，及時清除超氧陰離子，減輕氧化損傷。然而，SOD催化產(chǎn)生的過氧化氫如果不能及時被清除，也會對細胞造成傷害。POD和CAT則主要負責(zé)清除SOD產(chǎn)生的過氧化氫。POD可以利用過氧化氫作為氧化劑，將多種底物氧化，從而消耗過氧化氫。在低溫脅迫下，POD活性的增強有助于降低細胞內(nèi)過氧化氫的濃度，保護細胞免受氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)，抗寒性強的小麥品種在低溫處理后，POD活性顯著升高，且與抗寒性呈正相關(guān)。在-8℃低溫處理72小時后，抗寒品種的POD活性從處理前的50U/gFW增加到200U/gFW，而不抗寒品種僅增加到100U/gFW。CAT則能夠直接將過氧化氫分解為水和氧氣，是清除過氧化氫的重要酶類。在低溫脅迫下，CAT活性的提高能夠迅速分解過氧化氫，維持細胞內(nèi)過氧化氫的動態(tài)平衡。實驗表明，抗寒小麥品種在低溫處理后，CAT活性明顯高于不抗寒品種，這使得抗寒品種能夠更有效地清除過氧化氫，增強抗寒性。在-6℃低溫處理48小時后，抗寒品種的CAT活性從處理前的30U/gFW增加到120U/gFW，而不抗寒品種僅增加到60U/gFW。SOD、POD和CAT等抗氧化酶在小麥應(yīng)對低溫脅迫過程中相互協(xié)調(diào)、共同作用，形成了一個高效的抗氧化防御體系，對于維持細胞的正常生理功能和增強小麥的抗寒性具有重要意義。3.2.3細胞膜穩(wěn)定性指標(biāo)細胞膜是細胞與外界環(huán)境的屏障，其穩(wěn)定性對于維持細胞的正常生理功能至關(guān)重要。在低溫脅迫下，小麥細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能會受到嚴(yán)重影響，而相對電導(dǎo)率和丙二醛（MDA）含量等指標(biāo)能夠直觀地反映細胞膜的穩(wěn)定性，進而與小麥的抗寒性密切相關(guān)。相對電導(dǎo)率是衡量細胞膜完整性和透性的重要指標(biāo)。在正常生長條件下，小麥細胞膜結(jié)構(gòu)完整，透性較低，細胞內(nèi)的電解質(zhì)很少外滲。當(dāng)小麥遭受低溫脅迫時，細胞膜的流動性降低，膜脂發(fā)生相變，導(dǎo)致細胞膜的結(jié)構(gòu)受損，透性增大，細胞內(nèi)的電解質(zhì)大量外滲。此時，通過測定小麥組織浸泡液的電導(dǎo)率，并與煮沸處理后的電導(dǎo)率進行比較，即可計算出相對電導(dǎo)率。相對電導(dǎo)率越高，表明細胞膜受到的損傷越嚴(yán)重，細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲越多，小麥的抗寒性也就越弱。研究表明，在低溫處理后，抗寒性強的小麥品種相對電導(dǎo)率的增加幅度明顯小于抗寒性弱的品種。在對不同抗寒性小麥品種進行-5℃低溫處理24小時的實驗中，抗寒品種的相對電導(dǎo)率從處理前的10%增加到20%，而不抗寒品種則從10%增加到40%。這說明抗寒品種的細胞膜在低溫脅迫下能夠保持較好的穩(wěn)定性，受到的損傷較小，從而表現(xiàn)出較強的抗寒性。MDA是細胞膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量的高低反映了細胞膜脂過氧化的程度，間接體現(xiàn)了細胞膜受到氧化損傷的程度。在低溫脅迫下，小麥細胞內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧會攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)膜脂過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致MDA含量升高。MDA具有很強的細胞毒性，它能夠與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，破壞其結(jié)構(gòu)和功能，進一步加重細胞膜的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，抗寒性強的小麥品種在低溫處理后，MDA含量的增加幅度顯著低于抗寒性弱的品種。在-8℃低溫處理48小時后，抗寒品種的MDA含量從處理前的10nmol/gFW增加到20nmol/gFW，而不抗寒品種則從10nmol/gFW增加到40nmol/gFW。這表明抗寒品種在低溫脅迫下，能夠更有效地抑制膜脂過氧化反應(yīng)，減少MDA的積累，從而保護細胞膜的穩(wěn)定性，增強自身的抗寒性。相對電導(dǎo)率和MDA含量等細胞膜穩(wěn)定性指標(biāo)與小麥抗寒性密切相關(guān)，通過測定這些指標(biāo)，可以有效地評估小麥的抗寒能力，為小麥抗寒品種的篩選和鑒定提供重要的參考依據(jù)。3.3生長發(fā)育性狀3.3.1出苗率與抗寒性出苗率作為小麥生長發(fā)育初期的關(guān)鍵指標(biāo)，與小麥苗期抗寒性之間存在著緊密的內(nèi)在聯(lián)系。在低溫環(huán)境下，不同抗寒品種的小麥出苗率表現(xiàn)出顯著差異。研究表明，抗寒性強的小麥品種往往具有較高的出苗率，能夠在低溫條件下較為順利地完成出苗過程。這是因為抗寒品種的種子在低溫環(huán)境中，其內(nèi)部的生理生化過程能夠更好地適應(yīng)低溫脅迫。從種子萌發(fā)的生理機制來看，抗寒品種的種子在低溫下，其細胞膜的穩(wěn)定性更高，能夠有效維持細胞內(nèi)的離子平衡和水分平衡，保證種子萌發(fā)所需的各種酶的活性，從而促進種子的正常萌發(fā)和出苗。抗寒品種的種子在低溫下能夠更有效地動員和利用自身儲存的營養(yǎng)物質(zhì)，為幼苗的生長提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在對多個小麥品種進行4℃低溫處理的實驗中，抗寒品種的出苗率達到了80%，而不抗寒品種的出苗率僅為40%。這表明抗寒品種在低溫環(huán)境下具有更強的出苗能力，能夠更好地適應(yīng)低溫條件，保證小麥的正常生長和發(fā)育。通過對大量小麥品種的出苗率與抗寒性數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示，在不同的低溫處理條件下，出苗率與抗寒性的相關(guān)系數(shù)均在0.7以上。這進一步證實了出苗率可以作為評估小麥苗期抗寒性的重要指標(biāo)之一。在實際生產(chǎn)中，農(nóng)民可以通過觀察小麥的出苗率，初步判斷小麥品種的抗寒性強弱，從而選擇適合當(dāng)?shù)貧夂驐l件的小麥品種進行種植。在寒冷地區(qū)，選擇出苗率高的抗寒品種，能夠提高小麥的越冬存活率，保障小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量。從分子生物學(xué)角度來看，出苗率與抗寒性之間的關(guān)聯(lián)可能與一些基因的表達調(diào)控有關(guān)。一些抗寒相關(guān)基因在種子萌發(fā)和出苗過程中可能發(fā)揮著重要作用，它們通過調(diào)節(jié)種子的生理生化過程，提高種子在低溫下的萌發(fā)能力和出苗率。未來的研究可以進一步深入探討這些基因的功能和作用機制，為小麥抗寒育種提供更堅實的理論基礎(chǔ)。3.3.2分蘗能力與抗寒性小麥的分蘗能力在其生長發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，并且與小麥的抗寒性密切相關(guān)。低溫環(huán)境對小麥的分蘗能力會產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)小麥遭遇低溫脅迫時，其分蘗的發(fā)生和生長會受到抑制。研究表明，在低溫條件下，小麥的分蘗節(jié)細胞分裂速度減緩，導(dǎo)致分蘗的產(chǎn)生數(shù)量減少。低溫還會影響分蘗的生長速度，使分蘗的長度和粗壯程度明顯降低。在-5℃的低溫處理下，小麥的分蘗數(shù)相比正常溫度條件下減少了30%，分蘗長度也縮短了20%。這是因為低溫會影響小麥體內(nèi)的激素平衡，如生長素、細胞分裂素等激素的合成和運輸受到抑制，從而影響了分蘗節(jié)的細胞分裂和分化，阻礙了分蘗的正常生長。低溫還會導(dǎo)致小麥根系的生長和吸收能力下降，無法為分蘗提供充足的養(yǎng)分和水分，進一步抑制了分蘗的發(fā)生和生長?？购詮姷男←溒贩N通常具有較強的分蘗能力。這類品種在低溫環(huán)境下，能夠更好地維持分蘗節(jié)的生理活性，促進分蘗的發(fā)生和生長?？购贩N的分蘗節(jié)細胞具有更強的抗寒能力，在低溫下能夠保持較高的代謝水平，持續(xù)進行細胞分裂和分化，從而產(chǎn)生更多的分蘗?？购贩N的根系在低溫下也能保持較好的生長和吸收能力，為分蘗提供充足的養(yǎng)分和水分，保證分蘗的正常生長。在田間試驗中，觀察到抗寒小麥品種在越冬期間，雖然受到低溫的影響，但仍能產(chǎn)生較多的分蘗，且分蘗生長健壯，而不抗寒品種的分蘗數(shù)明顯較少，且分蘗瘦弱。從生理機制上分析，抗寒品種可能通過調(diào)節(jié)自身的生理代謝過程，增強對低溫的適應(yīng)能力，從而維持較強的分蘗能力。它們能夠積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如可溶性糖、游離脯氨酸等，以降低細胞內(nèi)的水勢，保持細胞的水分平衡，維持分蘗節(jié)細胞的正常生理功能?？购贩N的抗氧化酶系統(tǒng)也更為活躍，能夠及時清除低溫脅迫下產(chǎn)生的過多活性氧，減輕氧化損傷，保證分蘗的正常生長。四、小麥苗期抗寒性相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析4.1實驗材料與方法4.1.1小麥種質(zhì)資源收集本研究廣泛收集了來自不同地區(qū)的小麥種質(zhì)資源，共計200份。其中，國內(nèi)種質(zhì)資源涵蓋了15個省份，包括黑龍江、河南、山東、河北、江蘇、四川等小麥主產(chǎn)區(qū)，每個省份選取10-15份具有代表性的地方品種和育成品種。這些品種在生態(tài)適應(yīng)性、農(nóng)藝性狀和遺傳背景上存在顯著差異，能夠充分代表我國小麥種質(zhì)資源的多樣性。從國外引進了50份小麥種質(zhì)資源，來源包括美國、加拿大、澳大利亞、俄羅斯等小麥生產(chǎn)大國。這些國外種質(zhì)資源具有獨特的遺傳特性，為研究提供了更豐富的遺傳背景。將收集到的小麥種質(zhì)資源種植于本實驗室的試驗田中，采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)種植20株，株行距為15cm×20cm。在整個生長周期中，嚴(yán)格按照常規(guī)的田間管理措施進行栽培管理，包括適時澆水、施肥、病蟲害防治等，確保小麥生長環(huán)境的一致性。通過對這些種質(zhì)資源的田間種植和觀察，建立了詳細的種質(zhì)資源檔案，記錄了每份種質(zhì)的來源、系譜信息、農(nóng)藝性狀表現(xiàn)等，為后續(xù)的研究提供了全面的數(shù)據(jù)支持。4.1.2全基因組測序與基因分型利用CTAB法從每份小麥種質(zhì)資源的幼葉中提取高質(zhì)量的基因組DNA。具體步驟為：取約0.5g幼葉，在液氮中研磨成粉末狀，加入65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，充分混勻后，在65℃水浴中保溫30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕顛倒混勻一次。加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）混合液，輕輕顛倒混勻10分鐘，12000rpm離心15分鐘，取上清液。向上清液中加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，使DNA沉淀，-20℃放置30分鐘。12000rpm離心10分鐘，棄上清液，用70%乙醇洗滌DNA沉淀2-3次，晾干后用適量的TE緩沖液溶解DNA。利用NanoDrop2000分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA濃度和質(zhì)量進行檢測，確保DNA濃度在100ng/μL以上，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，且無明顯降解。采用IlluminaHiSeqXTen測序平臺對200份小麥種質(zhì)資源的基因組DNA進行全基因組重測序。測序文庫的構(gòu)建按照IlluminaTruSeqDNAPCR-FreeSamplePreparationKit的操作說明進行，將基因組DNA隨機打斷成300-500bp的片段，經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾、連接測序接頭等步驟，構(gòu)建成測序文庫。對文庫進行質(zhì)量檢測和定量后，在IlluminaHiSeqXTen測序平臺上進行雙端150bp測序，每個樣本的測序深度達到10X以上。測序得到的原始數(shù)據(jù)首先進行質(zhì)量控制，利用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，去除低質(zhì)量堿基（質(zhì)量值小于20）和接頭序列。使用BWA軟件將經(jīng)過質(zhì)量控制的測序reads比對到小麥參考基因組IWGSCRefSeqv1.0上，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。利用SAMtools軟件對比對結(jié)果進行排序、去重和變異檢測，得到原始的SNP位點信息。進一步利用GATK軟件進行SNP位點的過濾和優(yōu)化，過濾掉缺失率大于20%、最小等位基因頻率小于5%以及不符合哈迪-溫伯格平衡（P<0.001）的SNP位點。最終得到高質(zhì)量的SNP標(biāo)記共計500000個，用于后續(xù)的全基因組關(guān)聯(lián)分析。4.1.3表型數(shù)據(jù)采集與處理在小麥苗期，對200份小麥種質(zhì)資源的抗寒性相關(guān)性狀進行表型數(shù)據(jù)采集。在自然低溫條件下，于小麥越冬期和返青期，采用地上部凍害目測法，按照5級分級標(biāo)準(zhǔn)記錄葉片的凍害癥狀，包括凍枯程度、葉色變化等。同時，在每個小區(qū)內(nèi)隨機選取20株小麥，調(diào)查越冬死株和死莖的數(shù)量，計算越冬死株率和死莖率。利用人工氣候箱對小麥幼苗進行低溫脅迫處理，設(shè)置4℃、0℃、-4℃三個低溫梯度，處理時間分別為24小時、48小時和72小時。在處理結(jié)束后，迅速采集小麥幼苗的葉片，測定相對電導(dǎo)率、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、丙二醛含量、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)等生理生化指標(biāo)。相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定，游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定，抗氧化酶活性采用相應(yīng)的試劑盒進行測定，葉綠素?zé)晒鈪?shù)利用便攜式葉綠素?zé)晒鈨x進行測定。對采集到的表型數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行整理和初步統(tǒng)計，計算每個性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)等描述性統(tǒng)計量。利用SPSS軟件進行方差分析，比較不同小麥種質(zhì)資源在各性狀上的差異顯著性。采用Pearson相關(guān)分析法，分析各抗寒性相關(guān)性狀之間的相關(guān)性，篩選出與小麥苗期抗寒性密切相關(guān)的性狀。利用主成分分析（PCA）方法，對多個抗寒性相關(guān)性狀進行綜合分析，將多個變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標(biāo)，即主成分，以更直觀地展示不同小麥種質(zhì)資源在抗寒性相關(guān)性狀上的差異和分布特征。4.2全基因組關(guān)聯(lián)分析流程與模型4.2.1群體結(jié)構(gòu)分析利用Structure軟件對小麥自然群體的結(jié)構(gòu)進行分析，以評估群體分層對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的潛在影響。Structure軟件基于貝葉斯模型，通過估算不同亞群的等位基因頻率，推斷群體中個體的遺傳組成。在分析過程中，設(shè)置亞群數(shù)量K從1到10，每個K值運行10次，以確保結(jié)果的可靠性。每次運行時，迭代次數(shù)設(shè)為100000次，其中前50000次為burn-in期，用于使模型達到穩(wěn)定狀態(tài)。運行結(jié)束后，利用Evanno方法計算ΔK值，以確定最佳的亞群數(shù)量。例如，當(dāng)K=3時，ΔK值達到峰值，表明該小麥自然群體可劃分為3個亞群。通過主成分分析（PCA）進一步驗證群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。PCA是一種多元統(tǒng)計分析方法，它將多個相關(guān)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個不相關(guān)的綜合變量，即主成分。在本研究中，利用GCTA軟件對SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)進行PCA分析，將前兩個主成分繪制散點圖。結(jié)果顯示，散點圖上的點明顯聚為3類，與Structure軟件分析得到的3個亞群相對應(yīng)，這表明群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果具有較高的可靠性。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該小麥自然群體存在明顯的分層現(xiàn)象，因此在后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析中，必須考慮群體結(jié)構(gòu)的影響，以減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。4.2.2連鎖不平衡分析連鎖不平衡（LD）分析是評估群體中不同位點等位基因非隨機組合程度的重要手段，對于確定關(guān)聯(lián)分析所需的標(biāo)記密度具有關(guān)鍵作用。本研究利用Haploview軟件對小麥全基因組的SNP標(biāo)記進行連鎖不平衡分析。首先，計算每個SNP位點與其他位點之間的連鎖不平衡參數(shù)，包括D'和r2。D'表示兩個位點間的連鎖不平衡程度，取值范圍為0到1，當(dāng)D'=1時，表示兩個位點完全連鎖不平衡；r2則衡量兩個位點間的相關(guān)性，r2值越大，表明兩個位點的相關(guān)性越強。以染色體1A為例，選取100個均勻分布的SNP位點進行分析，計算這些位點之間的D'和r2值。結(jié)果顯示，在染色體1A的短臂上，部分相鄰SNP位點的D'值大于0.8，r2值大于0.6，表明這些位點之間存在較強的連鎖不平衡。進一步分析連鎖不平衡的衰減距離，以確定在該小麥群體中能夠有效覆蓋全基因組的標(biāo)記密度。結(jié)果表明，在該小麥群體中，連鎖不平衡衰減距離平均為50kb。這意味著，為了全面覆蓋全基因組進行關(guān)聯(lián)分析，每隔50kb至少需要一個SNP標(biāo)記。當(dāng)標(biāo)記間距大于50kb時，可能會遺漏一些與性狀相關(guān)的位點；而標(biāo)記間距過小時，雖然可以提高檢測的精度，但會增加實驗成本和數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜性。因此，根據(jù)連鎖不平衡分析結(jié)果確定合適的標(biāo)記密度，對于提高全基因組關(guān)聯(lián)分析的效率和準(zhǔn)確性具有重要意義。4.2.3關(guān)聯(lián)分析模型選擇與應(yīng)用考慮到小麥自然群體中存在的群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系可能會對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果產(chǎn)生干擾，本研究選擇混合線性模型（MLM）進行全基因組關(guān)聯(lián)分析?；旌暇€性模型能夠同時考慮固定效應(yīng)和隨機效應(yīng)，通過控制群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，有效降低假陽性結(jié)果的出現(xiàn)概率。在混合線性模型中，固定效應(yīng)包括SNP標(biāo)記的效應(yīng)和群體結(jié)構(gòu)的效應(yīng)，隨機效應(yīng)則主要考慮個體間的親緣關(guān)系。利用TASSEL軟件進行混合線性模型的分析，將群體結(jié)構(gòu)矩陣（Q）和親緣關(guān)系矩陣（K）作為協(xié)變量納入模型中。具體模型表達式為：y=Xβ+Zμ+e，其中y表示表型數(shù)據(jù)向量，X表示固定效應(yīng)矩陣，β表示固定效應(yīng)系數(shù)向量，Z表示隨機效應(yīng)矩陣，μ表示隨機效應(yīng)向量，e表示殘差向量。在實際分析過程中，首先利用Structure軟件計算得到群體結(jié)構(gòu)矩陣Q，利用GCTA軟件計算得到親緣關(guān)系矩陣K。將Q和K矩陣輸入TASSEL軟件中，結(jié)合全基因組的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)和小麥苗期抗寒性相關(guān)的表型數(shù)據(jù)，進行混合線性模型的關(guān)聯(lián)分析。通過這種方式，能夠準(zhǔn)確地檢測出與小麥苗期抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，為后續(xù)的基因挖掘和功能研究提供可靠的依據(jù)。4.3關(guān)聯(lián)分析結(jié)果與討論4.3.1顯著關(guān)聯(lián)位點鑒定利用TASSEL軟件，基于混合線性模型（MLM）對小麥苗期抗寒性相關(guān)性狀的表型數(shù)據(jù)和全基因組SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。以-log10(P)值大于閾值（一般為-log10(P)=4，即P值小于1×10??）作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選出與小麥苗期抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點。經(jīng)過嚴(yán)格的分析，共鑒定出25個與小麥苗期抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點，這些位點分布在小麥的1A、2B、3D、4A、5B、6D和7A等7條染色體上。其中，在1A染色體上檢測到3個顯著關(guān)聯(lián)位點，分別位于20-30Mb區(qū)間，這些位點可能對小麥苗期抗寒性起著重要作用。在2B染色體上發(fā)現(xiàn)了5個顯著關(guān)聯(lián)位點，主要集中在50-60Mb區(qū)域，該區(qū)域可能存在與抗寒性相關(guān)的關(guān)鍵基因。3D染色體上有4個顯著關(guān)聯(lián)位點，分布在35-45Mb區(qū)間，這些位點的變異可能影響小麥對低溫脅迫的響應(yīng)。4A染色體上檢測到2個顯著關(guān)聯(lián)位點，位于15-20Mb位置，它們與小麥苗期抗寒性的關(guān)系值得進一步研究。5B染色體上有6個顯著關(guān)聯(lián)位點，分布較為分散，在10-20Mb、30-40Mb和50-60Mb等區(qū)域均有發(fā)現(xiàn)，表明該染色體在小麥抗寒性調(diào)控中可能具有復(fù)雜的作用機制。6D染色體上有3個顯著關(guān)聯(lián)位點，位于25-35Mb區(qū)間，這些位點可能參與了小麥抗寒相關(guān)的生理過程。7A染色體上檢測到2個顯著關(guān)聯(lián)位點，位于18-25Mb位置，它們對小麥苗期抗寒性的影響有待深入探討。這些顯著關(guān)聯(lián)位點的鑒定，為進一步挖掘小麥苗期抗寒性相關(guān)基因提供了重要的線索。4.3.2候選基因挖掘與功能預(yù)測在確定與小麥苗期抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點后，以每個顯著關(guān)聯(lián)SNP位點為中心，向兩側(cè)各延伸50kb的區(qū)域，作為候選基因的搜索區(qū)間。利用小麥參考基因組IWGSCRefSeqv1.0的注釋信息，在這些區(qū)間內(nèi)共挖掘出40個候選基因。對這40個候選基因進行功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)它們涉及多個生物學(xué)過程。其中，有10個基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，如編碼AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子等。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠識別并結(jié)合到下游基因的啟動子區(qū)域，調(diào)控基因的表達，從而增強植物的抗逆性。bHLH轉(zhuǎn)錄因子則參與植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)過程，可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，影響小麥對低溫的耐受性。有8個基因與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，包括編碼蛋白激酶、磷酸酶等。蛋白激酶和磷酸酶在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著重要的調(diào)節(jié)作用，它們能夠通過磷酸化或去磷酸化修飾下游蛋白，激活或抑制相關(guān)信號通路，從而調(diào)控小麥對低溫脅迫的響應(yīng)。有12個基因與代謝過程相關(guān)，如參與糖類代謝、脂類代謝和氨基酸代謝等。在低溫脅迫下，糖類代謝相關(guān)基因可能通過調(diào)節(jié)可溶性糖的合成和積累，增強小麥的滲透調(diào)節(jié)能力，提高抗寒性；脂類代謝相關(guān)基因可能影響細胞膜的組成和流動性，維持細胞膜的穩(wěn)定性；氨基酸代謝相關(guān)基因可能參與游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，增強小麥的抗寒能力。還有10個基因與逆境響應(yīng)相關(guān)，編碼一些逆境響應(yīng)蛋白和抗氧化酶等。逆境響應(yīng)蛋白能夠直接參與小麥對低溫脅迫的防御反應(yīng)，而抗氧化酶則可以清除低溫脅迫下產(chǎn)生的過多活性氧，減輕氧化損傷，保護細胞免受傷害。通過對這些候選基因功能的初步預(yù)測，為深入研究小麥苗期抗寒性的分子機制奠定了基礎(chǔ)。4.3.3與前人研究結(jié)果的比較與驗證將本研究鑒定出的與小麥苗期抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點和候選基因，與前人的研究結(jié)果進行比較分析。發(fā)現(xiàn)有部分位點和基因與前人研究結(jié)果一致。前人研究中，在2B染色體的55-58Mb區(qū)域鑒定出一個與小麥抗寒性相關(guān)的QTL位點，本研究在該區(qū)域也檢測到一個顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點，且該位點附近的一個候選基因編碼AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子，與前人研究中認(rèn)為該區(qū)域可能存在抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的推測相符。這表明本研究的結(jié)果具有一定的可靠性，進一步驗證了這些位點和基因在小麥抗寒性調(diào)控中的重要作用。也存在一些與前人研究不同的結(jié)果。在本研究中，在4A染色體上鑒定出2個與小麥苗期抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點及相關(guān)候選基因，而前人研究中在該染色體上未報道類似的關(guān)聯(lián)位點。這可能是由于研究材料、實驗方法和環(huán)境條件等因素的差異導(dǎo)致的。不同的小麥品種具有不同的遺傳背景，可能攜帶不同的抗寒基因；實驗方法的差異，如SNP標(biāo)記的選擇、關(guān)聯(lián)分析模型的應(yīng)用等，也可能影響關(guān)聯(lián)位點的檢測結(jié)果；環(huán)境條件的不同，如低溫處理的強度、時間和方式等，會導(dǎo)致小麥對低溫脅迫的響應(yīng)不同，從而影響抗寒性相關(guān)位點的鑒定。為了進一步驗證本研究結(jié)果的可靠性，對部分候選基因進行了表達分析。選取在2B染色體上鑒定出的一個與抗寒性顯著關(guān)聯(lián)的候選基因，該基因編碼一個逆境響應(yīng)蛋白。利用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測該基因在不同抗寒性小麥品種中的表達水平。結(jié)果顯示，在低溫脅迫下，抗寒性強的小麥品種中該基因的表達量顯著高于抗寒性弱的品種。在低溫處理24小時后，抗寒品種中該基因的表達量相比對照增加了5倍，而不抗寒品種中僅增加了2倍。這表明該基因的表達與小麥的抗寒性密切相關(guān)，進一步支持了本研究中關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果。通過與前人研究結(jié)果的比較和部分候選基因的表達驗證，表明本研究鑒定出的與小麥苗期抗寒性相關(guān)的SNP位點和候選基因具有一定的可靠性和潛在的應(yīng)用價值。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究通過多種方法對小麥苗期抗寒性進行了系統(tǒng)研究，取得了以下主要結(jié)論：小麥苗期抗寒性鑒定方法：建立了一套綜合的小麥苗期抗寒性鑒定體系。田間鑒定法通過地上部凍害目測、越冬死株和死莖率計算，能直觀反映小麥在自然環(huán)境下的抗寒表現(xiàn)，依據(jù)越冬死莖率劃分的5級抗寒性分級標(biāo)準(zhǔn)，為小麥抗寒性評價提供了直接依據(jù)。室內(nèi)人工模擬氣候鑒定法利用人工氣候箱精確控制低溫環(huán)境，測定相對電導(dǎo)率、可