小麥鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因TaZFP593與TaSAP1-1抵御非生物逆境的功能與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景在植物的整個(gè)生命周期中，會(huì)遭遇各種各樣的逆境，這些逆境嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降，甚至威脅到植物的生存。逆境可分為生物逆境和非生物逆境，其中生物逆境主要包括病蟲害等；非生物逆境則涵蓋干旱、鹽堿、低溫、高溫、強(qiáng)光、重金屬污染、空氣污染、土壤污染等。在全球氣候變化的大背景下，災(zāi)害氣候發(fā)生愈發(fā)頻繁，非生物逆境的影響范圍和危害程度不斷加劇。例如，干旱會(huì)致使植物葉片萎蔫、脫落，根系發(fā)育不良，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植物死亡；鹽堿環(huán)境會(huì)影響植物對(duì)水分的吸收，造成細(xì)胞脫水，阻礙植物生長(zhǎng)；低溫會(huì)使植物代謝活動(dòng)減緩，光合作用減弱，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，引發(fā)凍害；高溫會(huì)造成蛋白質(zhì)變性，酶活性降低，蒸騰作用增強(qiáng)，導(dǎo)致水分虧缺。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，逐漸形成了一系列復(fù)雜而精細(xì)的機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)非生物逆境。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)非生物逆境的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。轉(zhuǎn)錄因子，也被稱為反式作用因子，是一類能夠與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，并對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起到激活或抑制作用的DNA結(jié)合蛋白。它們通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境等眾多生理過程。在植物基因組中，轉(zhuǎn)錄因子基因占據(jù)了相當(dāng)大的比例，如在擬南芥中有2100多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，水稻中則有2300多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因。這些轉(zhuǎn)錄因子依據(jù)分子結(jié)構(gòu)特征的差異，被劃分成不同的基因家族，包括WRKY、Basicregion-leucinezipper（bZIP）、APETALA2/ethyleneresponsefactors（AP2/ERF）、GRAS、Myeloblastosis（MYB）、Basichelix-loop-helix（bHLH）、NAM/ATAF/CUC（NAC）等轉(zhuǎn)錄因子家族。鋅指蛋白是一類具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在基因調(diào)控中起著重要作用。根據(jù)其保守結(jié)構(gòu)域的不同，鋅指蛋白主要分為C2H2型、C4型和C6型，其中C2H2型鋅指蛋白是植物中最為常見且研究較為深入的一類。C2H2型鋅指蛋白含有特征性的Cys2His2（C2H2）鋅指結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由約30個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成模體，包含四個(gè)保守的半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸，它們能夠與一個(gè)鋅離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，賦予蛋白質(zhì)與DNA靶序列特異性識(shí)別和結(jié)合的能力。C2H2型鋅指蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)以及多種生理過程中都扮演著核心調(diào)控角色，參與胚胎發(fā)育、根系形態(tài)建成、葉片發(fā)育、開花時(shí)間調(diào)控以及對(duì)外界逆境（如干旱、鹽堿、病蟲害等）的響應(yīng)。例如，在干旱條件下，某些C2H2型鋅指蛋白能夠激活與水分調(diào)節(jié)和保護(hù)機(jī)制相關(guān)的基因，從而增強(qiáng)植物的抗旱能力。脅迫相關(guān)蛋白（stressassociatedprotein,SAP）是一類含有A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，也屬于鋅指蛋白家族。自第一個(gè)SAP基因OsSAP1從水稻中分離以來(lái)，在眾多植物中都開展了對(duì)SAP基因的全基因組鑒定、克隆和功能研究。在擬南芥、剛毛檉柳、水稻、小麥、大麥、葡萄、茄子等植物中，分別鑒定出了不同數(shù)量的SAP成員。相關(guān)功能研究證實(shí)，SAP能夠提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性，調(diào)節(jié)植物激素穩(wěn)態(tài)，參與激素介導(dǎo)的信號(hào)通路，在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。例如，研究表明，SAP通過調(diào)節(jié)植物脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）等植物激素，在作物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。1.2植物鋅指轉(zhuǎn)錄因子概述植物鋅指轉(zhuǎn)錄因子是一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和重要功能的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生命活動(dòng)中發(fā)揮著不可或缺的作用。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)賦予了它們與DNA、RNA或其他蛋白質(zhì)相互作用的能力，進(jìn)而參與調(diào)控眾多基因的表達(dá)過程。植物鋅指轉(zhuǎn)錄因子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是含有鋅指結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由一小段保守的氨基酸序列與鋅離子通過配位鍵結(jié)合形成穩(wěn)定的“手指”狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)的形成依賴于特定氨基酸殘基的空間排列和相互作用，其中半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）是與鋅離子配位的關(guān)鍵氨基酸。例如，在C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域中，通常由兩個(gè)半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸與一個(gè)鋅離子結(jié)合，形成一個(gè)穩(wěn)定的四面體結(jié)構(gòu)。這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)使得鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到靶基因的順式作用元件上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。除了鋅指結(jié)構(gòu)域外，植物鋅指轉(zhuǎn)錄因子還可能包含其他結(jié)構(gòu)域，如轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)等。這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性、定位和功能。轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能夠與其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄起始；轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域則可以抑制基因的轉(zhuǎn)錄；核定位信號(hào)負(fù)責(zé)引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，使其能夠在核內(nèi)發(fā)揮作用。根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成和排列方式，植物鋅指轉(zhuǎn)錄因子主要分為C2H2型、C3H型、C4型、C6型等多個(gè)亞家族。不同亞家族的鋅指轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定的差異，這使得它們能夠參與調(diào)控不同的生物學(xué)過程。C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子是植物中最為常見的一類，其鋅指結(jié)構(gòu)域具有典型的Cys2His2基序，能夠特異性地結(jié)合DNA序列，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)、激素信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用。在干旱脅迫下，一些C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合到干旱響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，激活這些基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗旱能力。C3H型鋅指轉(zhuǎn)錄因子含有Cys3His基序，在植物的發(fā)育調(diào)控、脅迫響應(yīng)等過程中也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，某些C3H型鋅指轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物的開花時(shí)間和果實(shí)發(fā)育。C4型鋅指轉(zhuǎn)錄因子包含Cys4基序，常與植物的激素信號(hào)傳導(dǎo)和發(fā)育調(diào)控相關(guān)。例如，在植物的生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，一些C4型鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)，影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。C6型鋅指轉(zhuǎn)錄因子具有Cys6基序，在植物的次生代謝調(diào)控和逆境響應(yīng)中發(fā)揮作用。某些C6型鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物的合成，增強(qiáng)植物對(duì)病蟲害的抵抗能力。植物鋅指轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用，參與調(diào)控種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、根系發(fā)育、葉片形態(tài)建成、開花結(jié)果等過程。在種子萌發(fā)過程中，鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)與種子休眠和萌發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)，影響種子的休眠解除和萌發(fā)速率。在根系發(fā)育方面，它們參與調(diào)控根的生長(zhǎng)方向、根毛的形成和根系的形態(tài)建成，對(duì)植物吸收水分和養(yǎng)分具有重要意義。在植物應(yīng)對(duì)非生物逆境時(shí)，鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠快速響應(yīng)逆境信號(hào)，通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，激活植物的防御機(jī)制，增強(qiáng)植物的抗逆性。在干旱脅迫下，鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的水分平衡、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成以及抗氧化酶的活性，從而提高植物的抗旱能力；在鹽脅迫下，它們能夠調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，維持植物體內(nèi)的離子平衡，減輕鹽害對(duì)植物的影響。此外，植物鋅指轉(zhuǎn)錄因子還參與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，與激素相互作用，共同調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)。在生長(zhǎng)素信號(hào)通路中，鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以與生長(zhǎng)素響應(yīng)因子相互作用，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素相關(guān)基因的表達(dá)，影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育；在脫落酸信號(hào)通路中，它們參與調(diào)控脫落酸響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)逆境的耐受性。1.3植物鋅指轉(zhuǎn)錄因子參與非生物逆境的交叉網(wǎng)絡(luò)調(diào)控在植物生長(zhǎng)過程中，往往會(huì)同時(shí)面臨多種非生物逆境的挑戰(zhàn)，如干旱與高溫、鹽堿與低溫等逆境常常相伴發(fā)生。植物為了適應(yīng)這些復(fù)雜的逆境環(huán)境，進(jìn)化出了一套復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中鋅指轉(zhuǎn)錄因子在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中扮演著關(guān)鍵角色，它們通過與其他轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)分子以及功能基因之間的相互作用，形成了一個(gè)龐大而有序的調(diào)控體系，共同調(diào)節(jié)植物對(duì)非生物逆境的響應(yīng)。植物在遭受干旱脅迫時(shí)，水分的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的滲透壓發(fā)生變化，從而激活一系列的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在這個(gè)過程中，鋅指轉(zhuǎn)錄因子如C2H2型鋅指蛋白能夠被激活并結(jié)合到干旱響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)這些基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的水分平衡、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成以及抗氧化酶的活性，增強(qiáng)植物的抗旱能力。鋅指轉(zhuǎn)錄因子還可以與其他轉(zhuǎn)錄因子如bZIP、NAC等相互作用，協(xié)同調(diào)控干旱響應(yīng)基因的表達(dá)。在鹽脅迫條件下，植物細(xì)胞會(huì)受到高濃度鹽分的影響，導(dǎo)致離子失衡和氧化損傷。鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，維持植物體內(nèi)的離子平衡，減少鹽分對(duì)細(xì)胞的傷害。一些C2H2型鋅指蛋白能夠激活Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)鈉離子的外排，從而減輕鹽害。鋅指轉(zhuǎn)錄因子還可以參與調(diào)節(jié)植物激素信號(hào)通路，如脫落酸（ABA）、乙烯（ETH）等激素信號(hào)通路，進(jìn)一步增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的耐受性。在低溫脅迫下，植物會(huì)面臨細(xì)胞膜流動(dòng)性降低、蛋白質(zhì)變性等問題。鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控冷響應(yīng)基因的表達(dá)，提高植物的抗寒能力。某些C2H2型鋅指蛋白能夠激活低溫響應(yīng)基因COR的表達(dá)，這些基因編碼的蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性、穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及參與滲透調(diào)節(jié)，從而增強(qiáng)植物的抗寒能力。植物在面對(duì)多種非生物逆境時(shí)，鋅指轉(zhuǎn)錄因子參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間存在著復(fù)雜的交叉對(duì)話（cross-talk）。干旱和鹽脅迫都會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的水分虧缺和離子失衡，因此在這兩種逆境下，鋅指轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的一些基因和信號(hào)通路是重疊的。在干旱和鹽脅迫下，一些鋅指轉(zhuǎn)錄因子都可以激活A(yù)BA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，通過ABA介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)節(jié)植物的生理響應(yīng)。高溫和干旱脅迫也存在著密切的聯(lián)系，高溫會(huì)加劇植物的水分蒸發(fā)，導(dǎo)致干旱脅迫的加劇。在這種復(fù)合逆境下，鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)節(jié)光合作用相關(guān)基因、抗氧化酶基因以及熱激蛋白基因的表達(dá)，來(lái)維持植物的光合效率、清除活性氧以及保護(hù)蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而提高植物對(duì)高溫和干旱復(fù)合逆境的耐受性。此外，鋅指轉(zhuǎn)錄因子還可以與其他信號(hào)分子如鈣離子（Ca2+）、活性氧（ROS）等相互作用，進(jìn)一步調(diào)節(jié)植物對(duì)非生物逆境的響應(yīng)。在逆境脅迫下，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度會(huì)發(fā)生變化，Ca2+可以作為第二信使激活一些鈣依賴的蛋白激酶，這些激酶可以磷酸化鋅指轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)其活性和功能。ROS在逆境脅迫下也會(huì)大量產(chǎn)生，ROS可以通過氧化修飾鋅指轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)其上游信號(hào)通路來(lái)影響其功能。通過參與非生物逆境的交叉網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，鋅指轉(zhuǎn)錄因子在植物適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。深入研究鋅指轉(zhuǎn)錄因子在這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制，不僅有助于我們揭示植物抗逆的分子機(jī)制，還為通過基因工程手段改良作物的抗逆性提供了理論依據(jù)和基因資源。1.4C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征及應(yīng)答非生物逆境的生物學(xué)功能1.4.1C2H2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子因其結(jié)構(gòu)中含有由兩個(gè)半胱氨酸（Cys）和兩個(gè)組氨酸（His）與一個(gè)鋅離子（Zn2+）結(jié)合形成的Cys2His2（C2H2）鋅指結(jié)構(gòu)域而得名。這一結(jié)構(gòu)域通常由約30個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成一個(gè)相對(duì)保守的模體，其中四個(gè)保守的半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸與鋅離子緊密配位，從而形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。這種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)賦予了C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子與DNA靶序列特異性識(shí)別和結(jié)合的能力，是其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。例如，在許多植物C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子中，鋅指結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和空間構(gòu)象高度保守，使得它們能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合到特定的DNA順式作用元件上，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)。除了核心的鋅指結(jié)構(gòu)域外，C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子還可能包含其他結(jié)構(gòu)域，如轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)等。轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能夠與其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的起始；轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域則可以抑制基因的轉(zhuǎn)錄過程；核定位信號(hào)負(fù)責(zé)引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，使其能夠在核內(nèi)與DNA結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用。這些不同結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用，使得C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠在復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中精確地調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)等眾多生物學(xué)過程。C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子的另一個(gè)重要特征是其鋅指結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)重復(fù)排列。在一個(gè)C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子中，通常含有多個(gè)串聯(lián)的鋅指結(jié)構(gòu)域，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域可以獨(dú)立地識(shí)別并結(jié)合DNA序列上的一個(gè)特定三聯(lián)體或四聯(lián)體核苷酸基序。通過不同鋅指結(jié)構(gòu)域的組合，C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)DNA長(zhǎng)鏈上多種序列模式的高度特異性和親和力，從而在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮更加精細(xì)和多樣化的作用。例如，某些C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子含有多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，它們可以通過協(xié)同作用，同時(shí)結(jié)合到DNA的多個(gè)位點(diǎn)上，形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行精確調(diào)控。這種串聯(lián)重復(fù)的鋅指結(jié)構(gòu)域排列方式，大大增加了C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別和結(jié)合DNA序列的多樣性和特異性，使其能夠在植物基因組中調(diào)控眾多不同基因的表達(dá)。1.4.2C2H2轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答非生物逆境的生物學(xué)功能在植物應(yīng)對(duì)非生物逆境時(shí)，C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它們通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)植物的生理生化和分子過程，以增強(qiáng)植物的抗逆性。在干旱脅迫下，C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的水分平衡來(lái)提高植物的抗旱能力。它們能夠激活與水分調(diào)節(jié)和保護(hù)機(jī)制相關(guān)的基因，如參與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成的基因、水通道蛋白基因等。通過上調(diào)這些基因的表達(dá)，促進(jìn)脯氨酸、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力；同時(shí)，增加水通道蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)水分的跨膜運(yùn)輸，維持細(xì)胞的水分平衡。一些C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子還可以通過調(diào)控氣孔的開閉來(lái)減少水分的散失。它們可以調(diào)節(jié)氣孔相關(guān)基因的表達(dá)，影響氣孔的運(yùn)動(dòng)，使氣孔在干旱條件下關(guān)閉，從而降低蒸騰作用，減少水分的蒸發(fā)。在鹽脅迫條件下，C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的離子平衡，以減輕鹽害對(duì)植物的影響。它們能夠調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)鈉離子（Na+）的外排或區(qū)隔化，同時(shí)增強(qiáng)鉀離子（K+）的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，維持植物體內(nèi)的K+/Na+平衡。一些C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以激活Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，將細(xì)胞內(nèi)過多的Na+排出到細(xì)胞外或區(qū)隔到液泡中，從而降低細(xì)胞質(zhì)中Na+的濃度，減輕Na+對(duì)細(xì)胞的毒害作用。C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子還可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，清除鹽脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧（ROS），減少氧化損傷。它們可以上調(diào)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，有效地清除ROS，保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化傷害。在低溫脅迫下，C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控冷響應(yīng)基因的表達(dá)，提高植物的抗寒能力。它們可以識(shí)別并結(jié)合到冷響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件上，激活這些基因的表達(dá)。這些冷響應(yīng)基因編碼的蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性、穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及參與滲透調(diào)節(jié)等，從而增強(qiáng)植物的抗寒能力。一些C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以激活低溫響應(yīng)基因COR（cold-regulated）的表達(dá)，COR基因編碼的蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的脂肪酸組成，增加不飽和脂肪酸的含量，降低細(xì)胞膜的相變溫度，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性；同時(shí)，還可以參與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，提高細(xì)胞的抗凍能力。C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子還可以通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。它們可以與bZIP、NAC等轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，增強(qiáng)冷響應(yīng)基因的表達(dá)，提高植物的抗寒能力。1.4.3C2H2轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答低氮等逆境的生物學(xué)功能在低氮逆境下，植物的生長(zhǎng)和發(fā)育會(huì)受到嚴(yán)重影響，而C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)低氮脅迫的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)植物根系的生長(zhǎng)和形態(tài)，以增強(qiáng)植物對(duì)氮素的吸收能力。在低氮條件下，一些C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)根系的伸長(zhǎng)和側(cè)根的發(fā)育，增加根系的表面積，從而提高植物對(duì)土壤中氮素的吸收效率。它們可以通過調(diào)控生長(zhǎng)素信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，影響生長(zhǎng)素在根系中的分布和運(yùn)輸，進(jìn)而調(diào)節(jié)根系的生長(zhǎng)和發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，某些C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠上調(diào)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)生長(zhǎng)素向根系的運(yùn)輸，從而刺激根系的生長(zhǎng)。C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子還參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)氮素的代謝和利用。它們可以調(diào)控與氮吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物對(duì)氮素的利用效率。在低氮脅迫下，一些C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠激活硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)土壤中硝酸根和銨態(tài)氮的吸收能力。它們還可以調(diào)節(jié)氮同化關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，如硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）等，促進(jìn)氮素的同化和轉(zhuǎn)化，提高植物對(duì)氮素的利用效率。一些C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠上調(diào)GS基因的表達(dá)，增強(qiáng)谷氨酰胺的合成，促進(jìn)氮素的同化和儲(chǔ)存。C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子還可以通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的激素平衡和信號(hào)傳導(dǎo)，來(lái)增強(qiáng)植物對(duì)低氮逆境的適應(yīng)性。它們可以參與調(diào)控生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、脫落酸等激素信號(hào)通路，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)逆境的響應(yīng)。在低氮脅迫下，一些C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的合成和信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)根系的生長(zhǎng)和發(fā)育，同時(shí)抑制地上部分的生長(zhǎng)，使植物能夠?qū)⒏嗟馁Y源分配到根系，以增強(qiáng)對(duì)氮素的吸收能力。C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子還可以通過調(diào)節(jié)脫落酸信號(hào)通路，增強(qiáng)植物的抗逆性，使其能夠更好地適應(yīng)低氮逆境。1.5SAP鋅指轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征及應(yīng)答非生物逆境的生物學(xué)功能1.5.1SAP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)SAP轉(zhuǎn)錄因子最為顯著的結(jié)構(gòu)特征是含有A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域是其行使生物學(xué)功能的關(guān)鍵區(qū)域。A20鋅指結(jié)構(gòu)域最早在人類腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白A20中被發(fā)現(xiàn)，由約70個(gè)氨基酸殘基組成，包含6個(gè)保守的半胱氨酸（Cys）和2個(gè)保守的組氨酸（His），它們通過與鋅離子（Zn2+）配位結(jié)合，形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。AN1鋅指結(jié)構(gòu)域則在多種蛋白質(zhì)中廣泛存在，由約40個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，含有4個(gè)保守的半胱氨酸，同樣與鋅離子結(jié)合形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。在SAP轉(zhuǎn)錄因子中，A20和AN1鋅指結(jié)構(gòu)域通常串聯(lián)存在，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)組合賦予了SAP轉(zhuǎn)錄因子與DNA、RNA或其他蛋白質(zhì)相互作用的能力，使其能夠在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。例如，在水稻SAP蛋白OsSAP1中，A20和AN1鋅指結(jié)構(gòu)域緊密相連，協(xié)同作用，使得OsSAP1能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到靶基因的順式作用元件上，從而調(diào)控基因的表達(dá)。除了A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域外，SAP轉(zhuǎn)錄因子還可能包含其他結(jié)構(gòu)域，如核定位信號(hào)（NLS）、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域等。核定位信號(hào)負(fù)責(zé)引導(dǎo)SAP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，使其能夠在核內(nèi)與DNA結(jié)合并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能；轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能夠與其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的起始；轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域則可以抑制基因的轉(zhuǎn)錄過程。這些不同結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用，使得SAP轉(zhuǎn)錄因子能夠在復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中精確地調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)等眾多生物學(xué)過程。SAP轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列在不同植物物種中存在一定的差異，但A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域的核心序列相對(duì)保守。通過對(duì)不同植物SAP轉(zhuǎn)錄因子的序列分析發(fā)現(xiàn)，盡管它們的整體氨基酸序列相似度可能不高，但A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基，如與鋅離子配位的半胱氨酸和組氨酸，以及參與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能行使的其他保守氨基酸，在進(jìn)化過程中高度保守。這種保守性表明A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域在SAP轉(zhuǎn)錄因子的功能發(fā)揮中具有至關(guān)重要的作用，其結(jié)構(gòu)和功能在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中得以保留和傳承。1.5.2SAP轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答非生物逆境的生物學(xué)功能在植物應(yīng)對(duì)非生物逆境時(shí)，SAP轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，通過多種途徑調(diào)節(jié)植物的生理生化過程，增強(qiáng)植物的抗逆性。在干旱脅迫下，SAP轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的水分平衡，提高植物的抗旱能力。它們能夠激活與水分調(diào)節(jié)和保護(hù)機(jī)制相關(guān)的基因，如參與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成的基因、水通道蛋白基因等。通過上調(diào)這些基因的表達(dá)，促進(jìn)脯氨酸、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，降低細(xì)胞的滲透勢(shì)，增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力；同時(shí)，增加水通道蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)水分的跨膜運(yùn)輸，維持細(xì)胞的水分平衡。一些SAP轉(zhuǎn)錄因子還可以通過調(diào)控氣孔的開閉來(lái)減少水分的散失。它們可以調(diào)節(jié)氣孔相關(guān)基因的表達(dá)，影響氣孔的運(yùn)動(dòng)，使氣孔在干旱條件下關(guān)閉，從而降低蒸騰作用，減少水分的蒸發(fā)。在鹽脅迫條件下，SAP轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的離子平衡，以減輕鹽害對(duì)植物的影響。它們能夠調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)鈉離子（Na+）的外排或區(qū)隔化，同時(shí)增強(qiáng)鉀離子（K+）的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，維持植物體內(nèi)的K+/Na+平衡。一些SAP轉(zhuǎn)錄因子可以激活Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，將細(xì)胞內(nèi)過多的Na+排出到細(xì)胞外或區(qū)隔到液泡中，從而降低細(xì)胞質(zhì)中Na+的濃度，減輕Na+對(duì)細(xì)胞的毒害作用。SAP轉(zhuǎn)錄因子還可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，清除鹽脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧（ROS），減少氧化損傷。它們可以上調(diào)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，有效地清除ROS，保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化傷害。在低溫脅迫下，SAP轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控冷響應(yīng)基因的表達(dá)，提高植物的抗寒能力。它們可以識(shí)別并結(jié)合到冷響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件上，激活這些基因的表達(dá)。這些冷響應(yīng)基因編碼的蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性、穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及參與滲透調(diào)節(jié)等，從而增強(qiáng)植物的抗寒能力。一些SAP轉(zhuǎn)錄因子可以激活低溫響應(yīng)基因COR（cold-regulated）的表達(dá)，COR基因編碼的蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的脂肪酸組成，增加不飽和脂肪酸的含量，降低細(xì)胞膜的相變溫度，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性；同時(shí)，還可以參與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，提高細(xì)胞的抗凍能力。1.5.3SAP轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答非生物逆境的多重作用模式SAP轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)答非生物逆境時(shí)，通過多種復(fù)雜的作用模式來(lái)調(diào)節(jié)植物的生理響應(yīng)，這些作用模式涉及不同的信號(hào)通路和分子機(jī)制。SAP轉(zhuǎn)錄因子可以通過與順式作用元件相互作用，直接調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。它們能夠識(shí)別并結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定順式作用元件上，如ABRE（脫落酸響應(yīng)元件）、DRE（干旱響應(yīng)元件）、HSE（熱激響應(yīng)元件）等，從而激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。在干旱脅迫下，SAP轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到含有DRE元件的干旱響應(yīng)基因啟動(dòng)子上，促進(jìn)這些基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的抗旱生理過程。SAP轉(zhuǎn)錄因子還可以通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，協(xié)同調(diào)節(jié)基因表達(dá)。它們可以與bZIP、NAC、AP2/ERF等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，共同識(shí)別并結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性。在鹽脅迫下，SAP轉(zhuǎn)錄因子與NAC轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)同調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，從而維持植物體內(nèi)的離子平衡。SAP轉(zhuǎn)錄因子還參與植物激素信號(hào)通路，通過調(diào)節(jié)激素的合成、代謝和信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)影響植物的抗逆性。在逆境脅迫下，植物激素如脫落酸（ABA）、乙烯（ETH）、茉莉酸（JA）等的含量和信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)發(fā)生變化，SAP轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)節(jié)這些激素相關(guān)基因的表達(dá)，參與激素信號(hào)通路的調(diào)控。在干旱脅迫下，SAP轉(zhuǎn)錄因子可以上調(diào)ABA合成相關(guān)基因的表達(dá)，增加ABA的含量，進(jìn)而通過ABA介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)植物的氣孔運(yùn)動(dòng)、滲透調(diào)節(jié)等生理過程，提高植物的抗旱能力。此外，SAP轉(zhuǎn)錄因子還可能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的修飾和降解來(lái)影響植物的抗逆性。它們可以與一些蛋白質(zhì)修飾酶或泛素連接酶相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的磷酸化、泛素化等修飾過程，從而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能。在高溫脅迫下，SAP轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)節(jié)熱激蛋白的磷酸化修飾，增強(qiáng)熱激蛋白的穩(wěn)定性和活性，進(jìn)而提高植物的耐熱性。1.6本研究目的和意義小麥作為全球重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)直接關(guān)系到全球糧食安全和人類福祉。然而，在小麥的生長(zhǎng)過程中，不可避免地會(huì)遭受各種非生物逆境的威脅，如干旱、鹽堿、低溫、高溫、低氮、低磷等。這些非生物逆境會(huì)嚴(yán)重影響小麥的生長(zhǎng)發(fā)育、光合作用、物質(zhì)代謝等生理過程，導(dǎo)致小麥產(chǎn)量大幅下降，品質(zhì)降低。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因非生物逆境導(dǎo)致的小麥減產(chǎn)可達(dá)20%-50%，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。深入研究小麥應(yīng)對(duì)非生物逆境的分子機(jī)制，挖掘和利用小麥自身的抗逆基因資源，對(duì)于提高小麥的抗逆性、保障糧食安全具有至關(guān)重要的意義。轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)非生物逆境的過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用，它們能夠通過與下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件相互作用，激活或抑制靶基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物的生理生化過程，增強(qiáng)植物的抗逆性。鋅指轉(zhuǎn)錄因子作為植物轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要成員，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中具有不可或缺的作用。C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子和SAP轉(zhuǎn)錄因子是鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族中的兩個(gè)重要亞家族，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上具有獨(dú)特的特點(diǎn)，能夠通過多種途徑參與植物對(duì)非生物逆境的響應(yīng)。研究表明，C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子和SAP轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)干旱、鹽堿、低溫、高溫等非生物逆境時(shí)，能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的水分平衡、離子平衡、抗氧化酶系統(tǒng)活性、激素信號(hào)傳導(dǎo)等生理過程，從而提高植物的抗逆性。然而，目前對(duì)于小麥中C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子和SAP轉(zhuǎn)錄因子的研究還相對(duì)較少，尤其是它們?cè)谛←湹钟巧锬婢尺^程中的具體作用機(jī)制還不完全清楚。本研究聚焦于小麥中的TaZFP593（C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因）和TaSAP1-1（SAP轉(zhuǎn)錄因子基因），旨在深入探究這兩個(gè)基因在小麥抵御非生物逆境中的功能及作用機(jī)制。通過對(duì)TaZFP593和TaSAP1-1基因的分子特征、表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位等方面的研究，明確它們?cè)谛←溕L(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得超表達(dá)TaZFP593和TaSAP1-1的轉(zhuǎn)基因煙草株系和小麥株系，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株在非生物逆境下的表型鑒定、生理生化指標(biāo)測(cè)定以及相關(guān)基因表達(dá)分析，系統(tǒng)解析TaZFP593和TaSAP1-1基因?qū)π←溕L(zhǎng)發(fā)育和抗逆性的影響。通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)等技術(shù)，篩選和鑒定與TaZFP593和TaSAP1-1相互作用的蛋白，構(gòu)建它們參與的信號(hào)傳導(dǎo)通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示其在小麥抵御非生物逆境中的分子調(diào)控機(jī)制。本研究的開展具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。在理論方面，深入研究TaZFP593和TaSAP1-1基因的功能及作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示小麥應(yīng)對(duì)非生物逆境的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富和完善植物抗逆生物學(xué)的理論體系，為深入理解植物與環(huán)境互作的分子機(jī)制提供新的視角和理論依據(jù)。在實(shí)踐方面，本研究的成果可以為小麥抗逆分子育種提供重要的基因資源和理論支持。通過將TaZFP593和TaSAP1-1基因?qū)胄←溒贩N中，有望培育出具有更強(qiáng)抗逆性的小麥新品種，提高小麥在逆境條件下的產(chǎn)量和品質(zhì)，為保障全球糧食安全做出貢獻(xiàn)。本研究還可以為其他作物的抗逆分子育種提供借鑒和參考，推動(dòng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。二、小麥C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子TaZFP593抵御低氮逆境的分子機(jī)制2.1材料與方法2.1.1TaZFP593基因的分子特征以小麥品種中國(guó)春為實(shí)驗(yàn)材料，采用CTAB法提取其基因組DNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的TaZFP593基因序列（登錄號(hào)：XXXXXX），使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為：上游引物5'-XXXXXX-3'，下游引物5'-XXXXXX-3'。以提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCRbuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH?O17.3μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用膠回收試劑盒回收目的片段，并將其連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，包括開放閱讀框（ORF）預(yù)測(cè)、氨基酸序列推導(dǎo)、蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)計(jì)算、結(jié)構(gòu)域分析以及同源性比對(duì)等。使用NCBI的BLAST工具進(jìn)行同源性搜索，確定TaZFP593基因在其他物種中的同源基因，并使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其進(jìn)化關(guān)系。2.1.2TaZFP593應(yīng)答低氮逆境的表達(dá)特征選取生長(zhǎng)狀況一致的小麥幼苗，將其移栽到含有正常氮素（10mMKNO?）和低氮（0.1mMKNO?）的水培營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行處理。分別在處理后的0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h采集小麥的根、莖、葉組織，迅速放入液氮中速凍，然后保存于-80℃冰箱備用。采用TRIzol法提取各組織的總RNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRPremixExTaqⅡ（2×）10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，ROXReferenceDyeⅡ（50×）0.4μL，cDNA模板1μL，ddH?O7μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以小麥的Actin基因作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算TaZFP593基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)3次技術(shù)重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.1.3超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系低氮逆境下的表型鑒定將TaZFP593基因的ORF序列克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA1302上，構(gòu)建超表達(dá)載體pCAMBIA1302-TaZFP593。采用凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。以煙草（Nicotianatabacum）品種K326為受體材料，利用葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。將煙草葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，放入含有重組農(nóng)桿菌的侵染液中浸泡10min，然后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+AS100μM）上，在25℃、黑暗條件下共培養(yǎng)2d。共培養(yǎng)后，將葉片轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan100mg/L+Cef500mg/L）上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每2周更換一次培養(yǎng)基，直至長(zhǎng)出抗性芽。將抗性芽切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（MS+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/L）上誘導(dǎo)生根。待根系發(fā)育良好后，將轉(zhuǎn)基因煙草植株移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，在溫室中培養(yǎng)。通過PCR和qRT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因煙草株系，篩選出超表達(dá)TaZFP593的陽(yáng)性株系。選取生長(zhǎng)狀況一致的野生型（WT）和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系幼苗，將其移栽到含有正常氮素（10mMKNO?）和低氮（0.1mMKNO?）的水培營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行處理。定期觀察并記錄植株的生長(zhǎng)表型，包括株高、葉片數(shù)、葉面積、根系形態(tài)等指標(biāo)。處理4周后，測(cè)量植株的地上部分和地下部分鮮重和干重，分析低氮逆境對(duì)不同株系煙草生長(zhǎng)的影響。2.1.4低氮逆境下根系鮮重及NtPIN基因表達(dá)特征在低氮處理4周后，將野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的根系從植株上小心剪下，用清水沖洗干凈，并用濾紙吸干表面水分，然后稱取根系鮮重。采用TRIzol法提取根系總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過qRT-PCR分析生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtPIN1、NtPIN2、NtPIN3、NtPIN4、NtPIN7的表達(dá)水平。根據(jù)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)各基因的特異性引物，引物序列如下：NtPIN1上游引物5'-XXXXXX-3'，下游引物5'-XXXXXX-3'；NtPIN2上游引物5'-XXXXXX-3'，下游引物5'-XXXXXX-3'；NtPIN3上游引物5'-XXXXXX-3'，下游引物5'-XXXXXX-3'；NtPIN4上游引物5'-XXXXXX-3'，下游引物5'-XXXXXX-3'；NtPIN7上游引物5'-XXXXXX-3'，下游引物5'-XXXXXX-3'。以煙草的EF1α基因作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算NtPIN基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)3次技術(shù)重復(fù)，分析低氮逆境下超表達(dá)TaZFP593對(duì)煙草根系鮮重及NtPIN基因表達(dá)的影響。2.1.5低氮逆境下與N吸收和同化相關(guān)參數(shù)測(cè)定及相關(guān)基因表達(dá)特征在低氮處理4周后，采集野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的地上部分和地下部分樣品，用于測(cè)定與氮吸收和同化相關(guān)的參數(shù)。采用凱氏定氮法測(cè)定植株的全氮含量，通過計(jì)算氮吸收效率（地上部吸氮量/供氮量）和氮利用效率（干重/吸氮量）來(lái)評(píng)估植株對(duì)氮素的吸收和利用能力。采用分光光度法測(cè)定硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）的活性，分析氮同化關(guān)鍵酶的活性變化。同時(shí)，采用qRT-PCR分析與氮吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT1.1、NtNRT2.1，銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtAMT1.1、NtAMT1.2，以及氮同化關(guān)鍵酶基因NtNR、NtNiR、NtGS1、NtGS2、NtGOGAT1、NtGOGAT2。根據(jù)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)各基因的特異性引物，以煙草的EF1α基因作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)3次技術(shù)重復(fù)，探究低氮逆境下超表達(dá)TaZFP593對(duì)煙草氮吸收和同化相關(guān)參數(shù)及基因表達(dá)的影響。2.1.6低氮逆境下活性氧相關(guān)參數(shù)測(cè)定及相關(guān)基因表達(dá)特征在低氮處理4周后，采集野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的葉片樣品，用于測(cè)定活性氧（ROS）相關(guān)參數(shù)。采用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色法和氮藍(lán)四唑（NBT）染色法分別檢測(cè)葉片中過氧化氫（H?O?）和超氧陰離子（O??）的積累情況，通過觀察染色程度來(lái)直觀反映ROS的積累水平。采用試劑盒測(cè)定葉片中H?O?含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性，分析抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)ROS的清除能力。同時(shí)，采用qRT-PCR分析與ROS產(chǎn)生和清除相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白基因NtRBOHA、NtRBOHB，以及抗氧化酶基因NtSOD1、NtSOD2、NtPOD1、NtPOD2、NtCAT1、NtCAT2。根據(jù)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)各基因的特異性引物，以煙草的EF1α基因作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)3次技術(shù)重復(fù)，研究低氮逆境下超表達(dá)TaZFP593對(duì)煙草活性氧相關(guān)參數(shù)及基因表達(dá)的影響。2.2結(jié)果與分析2.2.1TaZFP593基因的分子特征通過PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析，成功獲得TaZFP593基因的全長(zhǎng)序列。該基因的開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為960bp，編碼319個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)TaZFP593基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其分子量約為34.8kDa，理論等電點(diǎn)為7.85。結(jié)構(gòu)域分析表明，TaZFP593蛋白含有兩個(gè)典型的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，分別位于氨基酸序列的第120-150位和第165-195位（圖1）。這兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域均具有保守的Cys2His2基序，即CX2-4CX3FX5LX2HX3-5H（其中X代表任意氨基酸），這種保守結(jié)構(gòu)是C2H2型鋅指蛋白與DNA特異性結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。進(jìn)一步的同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，TaZFP593蛋白與其他植物的C2H2型鋅指蛋白具有一定的序列相似性，其中與大麥HvZFP1蛋白的氨基酸序列相似性最高，達(dá)到了78%，表明TaZFP593可能在小麥中發(fā)揮著與HvZFP1類似的生物學(xué)功能。【此處插入圖1：TaZFP593蛋白的結(jié)構(gòu)域分析圖】【此處插入圖1：TaZFP593蛋白的結(jié)構(gòu)域分析圖】2.2.2TaZFP593基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析為了探究TaZFP593基因在植物進(jìn)化中的地位及其與其他物種同源基因的關(guān)系，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建了TaZFP593基因與其他植物同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。從進(jìn)化樹中可以看出，TaZFP593與大麥、黑麥等禾本科植物的同源基因聚為一支，表明它們?cè)谶M(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系。而與雙子葉植物如擬南芥、煙草等的同源基因則處于不同的分支，這與植物的分類學(xué)地位相符。在禾本科植物分支中，TaZFP593與大麥HvZFP1的親緣關(guān)系最為密切，這進(jìn)一步印證了前面同源性比對(duì)的結(jié)果。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果為深入研究TaZFP593基因的功能提供了重要的進(jìn)化信息，暗示TaZFP593可能在禾本科植物中具有保守的生物學(xué)功能?！敬颂幉迦雸D2：TaZFP593基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹】【此處插入圖2：TaZFP593基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹】2.2.3低氮逆境下TaZFP593的表達(dá)特征通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析了TaZFP593基因在低氮逆境下小麥根、莖、葉組織中的表達(dá)變化情況，結(jié)果如圖3所示。在正常氮素條件下，TaZFP593基因在小麥根、莖、葉中均有表達(dá)，但表達(dá)水平相對(duì)較低。在低氮處理后，TaZFP593基因在根中的表達(dá)迅速上調(diào)，在處理6h時(shí)達(dá)到峰值，是正常氮素條件下的5.6倍，隨后表達(dá)量逐漸下降，但在48h時(shí)仍顯著高于對(duì)照水平。在莖中，TaZFP593基因的表達(dá)在低氮處理3h后開始顯著增加，在12h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照的3.8倍，之后表達(dá)量逐漸降低。在葉中，TaZFP593基因的表達(dá)在低氮處理6h后明顯上調(diào)，在24h時(shí)達(dá)到最高值，是對(duì)照的4.2倍，隨后表達(dá)量逐漸回落。這些結(jié)果表明，TaZFP593基因能夠快速響應(yīng)低氮逆境，且在根、莖、葉中的表達(dá)模式存在一定差異，推測(cè)其在小麥不同組織應(yīng)對(duì)低氮脅迫的過程中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。【此處插入圖3：低氮逆境下TaZFP593基因在小麥不同組織中的表達(dá)變化】【此處插入圖3：低氮逆境下TaZFP593基因在小麥不同組織中的表達(dá)變化】2.2.4低氮逆境下超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的表型特征通過葉盤轉(zhuǎn)化法成功獲得了超表達(dá)TaZFP593的轉(zhuǎn)基因煙草株系，經(jīng)PCR和qRT-PCR鑒定，篩選出3個(gè)超表達(dá)陽(yáng)性株系（OE-1、OE-2、OE-3）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在正常氮素條件下，野生型（WT）和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異，植株生長(zhǎng)健壯，葉片翠綠，根系發(fā)達(dá)。然而，在低氮脅迫下，WT和轉(zhuǎn)基因煙草株系的生長(zhǎng)表型出現(xiàn)了明顯差異（圖4）。WT煙草株系的生長(zhǎng)受到顯著抑制，植株矮小，葉片發(fā)黃、卷曲，根系發(fā)育不良，側(cè)根數(shù)量明顯減少。相比之下，超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的生長(zhǎng)受低氮脅迫的影響較小，植株高度和葉片數(shù)量明顯高于WT，葉片顏色較綠，卷曲程度較輕，根系更為發(fā)達(dá)，側(cè)根數(shù)量增多。處理4周后，對(duì)植株的地上部分和地下部分鮮重和干重進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示，低氮脅迫下WT煙草株系的地上部分鮮重和干重分別比正常氮素條件下降低了45%和52%，地下部分鮮重和干重分別降低了38%和46%；而超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的地上部分鮮重和干重分別比WT增加了32%和38%，地下部分鮮重和干重分別增加了28%和35%（圖5）。這些結(jié)果表明，超表達(dá)TaZFP593能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草在低氮逆境下的生長(zhǎng)能力，增強(qiáng)其對(duì)低氮脅迫的耐受性?！敬颂幉迦雸D4：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的生長(zhǎng)表型】【此處插入圖5：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的地上部分和地下部分鮮重和干重】【此處插入圖4：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的生長(zhǎng)表型】【此處插入圖5：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的地上部分和地下部分鮮重和干重】【此處插入圖5：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的地上部分和地下部分鮮重和干重】2.2.5低氮逆境下根系鮮重及NtPIN基因表達(dá)特征在低氮處理4周后，對(duì)野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的根系鮮重進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如圖6所示。低氮脅迫下，WT煙草株系的根系鮮重顯著降低，而超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的根系鮮重明顯高于WT，表明超表達(dá)TaZFP593有助于維持低氮逆境下煙草根系的生長(zhǎng)。進(jìn)一步通過qRT-PCR分析了生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtPIN1、NtPIN2、NtPIN3、NtPIN4、NtPIN7在低氮逆境下的表達(dá)水平，結(jié)果如圖7所示。在正常氮素條件下，NtPIN基因在WT和轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達(dá)水平無(wú)顯著差異。在低氮脅迫下，WT煙草株系中NtPIN1、NtPIN2、NtPIN3、NtPIN4、NtPIN7基因的表達(dá)均顯著下調(diào)。而在超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中，NtPIN1、NtPIN2、NtPIN3、NtPIN4、NtPIN7基因的表達(dá)水平明顯高于WT，其中NtPIN1和NtPIN2基因的表達(dá)量分別是WT的2.5倍和2.3倍。這些結(jié)果表明，超表達(dá)TaZFP593能夠上調(diào)低氮逆境下NtPIN基因的表達(dá)，促進(jìn)生長(zhǎng)素在根系中的運(yùn)輸和分配，從而有利于根系的生長(zhǎng)和發(fā)育，提高煙草對(duì)低氮脅迫的適應(yīng)性?！敬颂幉迦雸D6：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的根系鮮重】【此處插入圖7：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中NtPIN基因的表達(dá)水平】【此處插入圖6：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的根系鮮重】【此處插入圖7：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中NtPIN基因的表達(dá)水平】【此處插入圖7：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中NtPIN基因的表達(dá)水平】2.2.6低氮逆境下與N吸收和同化相關(guān)參數(shù)變化及相關(guān)基因表達(dá)特征在低氮處理4周后，對(duì)野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系與氮吸收和同化相關(guān)的參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，并分析相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，低氮脅迫下，WT煙草株系的全氮含量、氮吸收效率和氮利用效率均顯著降低。而超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的全氮含量、氮吸收效率和氮利用效率明顯高于WT（圖8）。其中，超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的全氮含量比WT增加了35%，氮吸收效率提高了42%，氮利用效率提高了38%。在氮同化關(guān)鍵酶活性方面，低氮脅迫下WT煙草株系的硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）活性均顯著下降。而超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中這些酶的活性明顯高于WT，其中NR活性比WT提高了56%，NiR活性提高了48%，GS活性提高了52%，GOGAT活性提高了45%（圖9）。進(jìn)一步通過qRT-PCR分析與氮吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，低氮脅迫下WT煙草株系中硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT1.1、NtNRT2.1，銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtAMT1.1、NtAMT1.2，以及氮同化關(guān)鍵酶基因NtNR、NtNiR、NtGS1、NtGS2、NtGOGAT1、NtGOGAT2的表達(dá)均顯著下調(diào)。而在超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中，這些基因的表達(dá)水平明顯高于WT（圖10）。這些結(jié)果表明，超表達(dá)TaZFP593能夠上調(diào)低氮逆境下與氮吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)，提高氮同化關(guān)鍵酶的活性，從而增強(qiáng)煙草對(duì)氮素的吸收和同化能力，提高其在低氮脅迫下的氮利用效率?！敬颂幉迦雸D8：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的全氮含量、氮吸收效率和氮利用效率】【此處插入圖9：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中氮同化關(guān)鍵酶的活性】【此處插入圖10：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中與氮吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)水平】【此處插入圖8：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的全氮含量、氮吸收效率和氮利用效率】【此處插入圖9：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中氮同化關(guān)鍵酶的活性】【此處插入圖10：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中與氮吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)水平】【此處插入圖9：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中氮同化關(guān)鍵酶的活性】【此處插入圖10：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中與氮吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)水平】【此處插入圖10：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中與氮吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)水平】2.2.7低氮逆境下活性氧相關(guān)參數(shù)變化及相關(guān)基因表達(dá)特征在低氮處理4周后，對(duì)野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系的活性氧（ROS）相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，并分析相關(guān)基因的表達(dá)水平。DAB染色和NBT染色結(jié)果顯示，低氮脅迫下WT煙草株系葉片中過氧化氫（H?O?）和超氧陰離子（O??）的積累明顯增加，葉片顏色加深；而超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片中的染色程度明顯較輕，表明H?O?和O??的積累較少（圖11）。進(jìn)一步通過試劑盒測(cè)定葉片中H?O?含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性，結(jié)果如圖12所示。低氮脅迫下，WT煙草株系葉片中的H?O?含量顯著升高，而SOD、POD和CAT活性均顯著降低。相比之下，超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片中的H?O?含量明顯低于WT，SOD、POD和CAT活性則顯著高于WT。其中，超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片中的H?O?含量比WT降低了48%，SOD活性提高了62%，POD活性提高了58%，CAT活性提高了55%。通過qRT-PCR分析與ROS產(chǎn)生和清除相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，低氮脅迫下WT煙草株系中呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白基因NtRBOHA、NtRBOHB的表達(dá)顯著上調(diào)，而抗氧化酶基因NtSOD1、NtSOD2、NtPOD1、NtPOD2、NtCAT1、NtCAT2的表達(dá)顯著下調(diào)。在超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中，NtRBOHA、NtRBOHB基因的表達(dá)明顯低于WT，而NtSOD1、NtSOD2、NtPOD1、NtPOD2、NtCAT1、NtCAT2基因的表達(dá)顯著高于WT（圖13）。這些結(jié)果表明，超表達(dá)TaZFP593能夠抑制低氮逆境下ROS的產(chǎn)生，上調(diào)抗氧化酶基因的表達(dá)，提高抗氧化酶的活性，從而增強(qiáng)煙草對(duì)ROS的清除能力，減輕氧化損傷，提高其在低氮脅迫下的耐受性?！敬颂幉迦雸D11：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片的DAB染色和NBT染色結(jié)果】【此處插入圖12：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片中H?O?含量、SOD活性、POD活性和CAT活性】【此處插入圖13：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中與ROS產(chǎn)生和清除相關(guān)基因的表達(dá)水平】【此處插入圖11：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片的DAB染色和NBT染色結(jié)果】【此處插入圖12：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片中H?O?含量、SOD活性、POD活性和CAT活性】【此處插入圖13：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中與ROS產(chǎn)生和清除相關(guān)基因的表達(dá)水平】【此處插入圖12：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片中H?O?含量、SOD活性、POD活性和CAT活性】【此處插入圖13：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中與ROS產(chǎn)生和清除相關(guān)基因的表達(dá)水平】【此處插入圖13：低氮逆境下野生型和超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系中與ROS產(chǎn)生和清除相關(guān)基因的表達(dá)水平】2.3討論2.3.1TaZFP593在低氮逆境響應(yīng)中的核心作用本研究通過對(duì)小麥C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子TaZFP593的深入研究，揭示了其在小麥抵御低氮逆境過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。從TaZFP593基因的分子特征來(lái)看，其編碼的蛋白含有兩個(gè)典型的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，這是C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子與DNA特異性結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，暗示了TaZFP593可能通過與特定的DNA序列結(jié)合來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，TaZFP593與大麥等禾本科植物的同源基因親緣關(guān)系較近，這為推測(cè)其在禾本科植物中具有保守的生物學(xué)功能提供了進(jìn)化依據(jù)。在低氮逆境下，TaZFP593基因在小麥根、莖、葉中的表達(dá)均顯著上調(diào)，且呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。在根中表達(dá)迅速上調(diào)，6h時(shí)達(dá)到峰值；在莖中3h后開始顯著增加，12h時(shí)達(dá)到峰值；在葉中6h后明顯上調(diào)，24h時(shí)達(dá)到最高值。這種差異表達(dá)模式表明TaZFP593在小麥不同組織應(yīng)對(duì)低氮脅迫時(shí)可能發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。根作為植物吸收養(yǎng)分的主要器官，TaZFP593在根中的快速響應(yīng)可能與根系對(duì)低氮逆境的感知和早期適應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)。超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系在低氮脅迫下的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于野生型，植株高度、葉片數(shù)量、根系發(fā)育等指標(biāo)均得到顯著改善，地上部分和地下部分的鮮重和干重也顯著增加。這直接證明了TaZFP593能夠顯著提高植物在低氮逆境下的生長(zhǎng)能力，增強(qiáng)其對(duì)低氮脅迫的耐受性。TaZFP593在小麥抵御低氮逆境中具有不可或缺的核心作用，是小麥適應(yīng)低氮環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)控因子。2.3.2TaZFP593調(diào)控低氮逆境下相關(guān)生理和分子過程的機(jī)制TaZFP593對(duì)低氮逆境下根系生長(zhǎng)和氮吸收同化過程具有重要的調(diào)控作用。在根系生長(zhǎng)方面，超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系在低氮脅迫下根系鮮重顯著增加，同時(shí)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtPIN1、NtPIN2、NtPIN3、NtPIN4、NtPIN7的表達(dá)明顯上調(diào)。這表明TaZFP593可能通過調(diào)控生長(zhǎng)素在根系中的運(yùn)輸和分配，促進(jìn)根系的生長(zhǎng)和發(fā)育。生長(zhǎng)素在植物根系生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，它可以影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)、分裂和分化。TaZFP593通過上調(diào)NtPIN基因的表達(dá)，可能改變了生長(zhǎng)素在根系中的分布模式，使得根系能夠更好地適應(yīng)低氮環(huán)境，增加對(duì)氮素的吸收面積和能力。在氮吸收和同化方面，超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系在低氮脅迫下全氮含量、氮吸收效率和氮利用效率均顯著提高。同時(shí)，硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT1.1、NtNRT2.1，銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtAMT1.1、NtAMT1.2，以及氮同化關(guān)鍵酶基因NtNR、NtNiR、NtGS1、NtGS2、NtGOGAT1、NtGOGAT2的表達(dá)均明顯上調(diào)，氮同化關(guān)鍵酶硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）的活性也顯著增強(qiáng)。這說(shuō)明TaZFP593能夠通過上調(diào)與氮吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)，提高氮同化關(guān)鍵酶的活性，從而增強(qiáng)植物對(duì)氮素的吸收和同化能力，提高其在低氮脅迫下的氮利用效率。硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)將土壤中的硝酸根和銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)到植物體內(nèi)，而氮同化關(guān)鍵酶則參與將吸收的氮素轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮化合物的過程。TaZFP593對(duì)這些基因和酶的調(diào)控，有助于植物在低氮條件下更有效地獲取和利用氮素。TaZFP593還在低氮逆境下對(duì)活性氧（ROS）平衡的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。低氮脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)ROS積累，對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。本研究中，超表達(dá)TaZFP593轉(zhuǎn)基因煙草株系在低氮脅迫下葉片中過氧化氫（H?O?）和超氧陰離子（O??）的積累明顯減少，H?O?含量顯著降低，而超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶的活性顯著提高。同時(shí)，呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白基因NtRBOHA、NtRBOHB的表達(dá)顯著下調(diào)，抗氧化酶基因NtSOD1、NtSOD2、NtPOD1、NtPOD2、NtCAT1、NtCAT2的表達(dá)顯著上調(diào)。這表明TaZFP593能夠抑制低氮逆境下ROS的產(chǎn)生，上調(diào)抗氧化酶基因的表達(dá)，提高抗氧化酶的活性，從而增強(qiáng)植物對(duì)ROS的清除能力，減輕氧化損傷。呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白是植物體內(nèi)ROS產(chǎn)生的重要來(lái)源之一，TaZFP593通過下調(diào)NtRBOHA、NtRBOHB基因的表達(dá)，減少了ROS的產(chǎn)生；而抗氧化酶則負(fù)責(zé)清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，TaZFP593通過上調(diào)抗氧化酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)了植物的抗氧化防御系統(tǒng)，維持了細(xì)胞內(nèi)的ROS平衡。2.3.3研究結(jié)果對(duì)小麥低氮耐受性改良的潛在應(yīng)用價(jià)值本研究結(jié)果對(duì)于小麥低氮耐受性改良具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。TaZFP593作為一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控基因，為小麥低氮耐受性改良提供了重要的基因資源。通過基因工程技術(shù)，將TaZFP593基因?qū)胄←溒贩N中，有望培育出具有更強(qiáng)低氮耐受性的小麥新品種。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將TaZFP593基因轉(zhuǎn)入小麥，使其在小麥中過量表達(dá)，可能會(huì)增強(qiáng)小麥根系對(duì)低氮逆境的適應(yīng)性，提高氮吸收和同化效率，從而在低氮條件下保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)和產(chǎn)量。深入了解TaZFP593的調(diào)控機(jī)制，有助于揭示小麥應(yīng)對(duì)低氮逆境的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為小麥低氮耐受性改良提供理論支持。通過對(duì)TaZFP593調(diào)控的下游基因和信號(hào)通路的研究，可以進(jìn)一步明確小麥在低氮逆境下的生理響應(yīng)機(jī)制，為開發(fā)新的低氮耐受性改良策略提供方向。根據(jù)TaZFP593對(duì)氮吸收和同化相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，可以篩選和鑒定與氮利用效率相關(guān)的關(guān)鍵基因，通過分子標(biāo)記輔助選擇等技術(shù)，加速小麥低氮耐受性品種的選育進(jìn)程。本研究結(jié)果還為其他作物的低氮耐受性改良提供了借鑒和參考。由于TaZFP593與其他禾本科植物的同源基因具有較高的序列相似性和進(jìn)化保守性，其在小麥中抵御低氮逆境的功能和機(jī)制可能在其他禾本科作物中也具有一定的通用性。可以將本研究的成果拓展到水稻、玉米等其他重要禾本科作物中，為這些作物的低氮耐受性改良提供新的思路和方法。三、小麥SAP轉(zhuǎn)錄因子TaSAP1-1抵御低磷等非生物逆境的分子機(jī)制3.1材料與方法3.1.1TaSAP1-1基因的分子特征以小麥品種中國(guó)春為實(shí)驗(yàn)材料，采用CTAB法提取其基因組DNA。通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取TaSAP1-1基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為：上游引物5'-ATGGCCTACGACGAGAAG-3'，下游引物5'-TCACGCTCGTCCATCTTC-3'。以提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包含10×PCRbuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH?O17.3μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)定為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用膠回收試劑盒回收目的片段，并將其連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。利用藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，包括開放閱讀框（ORF）預(yù)測(cè)、氨基酸序列推導(dǎo)、蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)計(jì)算、結(jié)構(gòu)域分析以及同源性比對(duì)等。借助NCBI的BLAST工具進(jìn)行同源性搜索，確定TaSAP1-1基因在其他物種中的同源基因，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其進(jìn)化關(guān)系。3.1.2TaSAP-1應(yīng)答低磷等逆境的表達(dá)特征選取生長(zhǎng)狀況一致的小麥幼苗，分別將其移栽到含有正常磷素（1mMKH?PO?）和低磷（0.01mMKH?PO?）的水培營(yíng)養(yǎng)液中，以及分別用200mMNaCl、10%PEG6000、100μMABA處理的水培營(yíng)養(yǎng)液中。在處理后的0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h采集小麥的根、莖、葉組織，迅速放入液氮中速凍，保存于-80℃冰箱備用。采用TRIzol法提取各組織的總RNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包含SYBRPremixExTaqⅡ（2×）10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，ROXReferenceDyeⅡ（50×）0.4μL，cDNA模板1μL，ddH?O7μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以小麥的Actin基因作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算TaSAP1-1基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)3次技術(shù)重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.3TaSAP1-1與TaAMTR基因克隆及各載體構(gòu)建過程根據(jù)TaSAP1-1和TaAMTR基因序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物，引物序列如下：TaSAP1-1上游引物5'-CCGCTCGAGATGGCCTACGACGAGAAG-3'（XhoI酶切位點(diǎn)），下游引物5'-CGGGATCCTCACGCTCGTCCATCTTC-3'（BamHI酶切位點(diǎn)）；TaAMTR上游引物5'-CCCAAGCTTATGGCGGAGCTGAAGAAG-3'（HindⅢ酶切位點(diǎn)），下游引物5'-CCGGAATTCCTACAGCTTCCGCTTCTC-3'（EcoRI酶切位點(diǎn)）。以小麥基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及程序同TaSAP1-1基因分子特征分析中的PCR擴(kuò)增條件。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的片段，分別與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的TaSAP1-1和TaAMTR基因片段分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶（TaSAP1-1用XhoI和BamHI，TaAMTR用HindⅢ和EcoRI）進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段。同時(shí)，用相同的限制性內(nèi)切酶對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA1302進(jìn)行雙酶切，回收線性化載體。將酶切后的TaSAP1-1和TaAMTR基因片段分別與線性化的pCAMBIA1302載體進(jìn)行連接，構(gòu)建超表達(dá)載體pCAMBIA1302-TaSAP1-1和pCAMBIA1302-TaAMTR。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR和酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒備用。3.1.4超表達(dá)TaSAP1-1轉(zhuǎn)基因煙草遺傳轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的超表達(dá)載體pCAMBIA1302-TaSAP1-1采用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。以煙草（Nicotianatabacum）品種K326為受體材料，利用葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。將煙草葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，放入含有重組農(nóng)桿菌的侵染液中浸泡10min，然后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+AS100μM）上，在25℃、黑暗條件下共培養(yǎng)2d。共培養(yǎng)后，將葉片轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan100mg/L+Cef500mg/L）上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每2周更換一次培養(yǎng)基，直至長(zhǎng)出抗性芽。將抗性芽切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（MS+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/L）上誘導(dǎo)生根。待根系發(fā)育良好后，將轉(zhuǎn)基因煙草植株移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，在溫室中培養(yǎng)。通過PCR和qRT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因煙草株系，篩選出超表達(dá)TaSAP1-1的陽(yáng)性株系。3.1.5超表達(dá)TaSAP1-1轉(zhuǎn)基因煙草株系表型鑒定選取生長(zhǎng)狀況一致的野生型（WT）和超表達(dá)TaSAP1-1轉(zhuǎn)基因煙草株系幼苗，將其移栽到含有正常磷素（1mMKH?PO?）和低磷（0.01mMKH?PO?）的水培營(yíng)養(yǎng)液中，以及分別用200mMNaCl、10%PEG6000處理的水培營(yíng)養(yǎng)液中。定期觀察并記錄植株的生長(zhǎng)表型，包括株高、葉片數(shù)、葉面積、根系形態(tài)等指標(biāo)。處理4周后，測(cè)量植株的地上部分和地下部分鮮重和干重，分析不同逆境對(duì)不同株系煙草生長(zhǎng)的影響。3.1.6低磷逆境下磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtPT表達(dá)特征及qRT-PCR分析在低磷處理4周后，采集野生型和超表達(dá)TaSAP1-1轉(zhuǎn)基因煙草株系的根系，采用TRIzol法提取根系總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過qRT-PCR分析磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtPT1、NtPT2、NtPT3、NtPT4的表達(dá)水平。根據(jù)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)各基因的特異性引物，引物序列如下：NtPT1上游引物5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；NtPT2上游引物5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；NtPT3上游引物5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；NtPT4上游引物5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。以煙草的EF1α基因作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算NtPT基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)3次技術(shù)重復(fù)，分析低磷逆境下超表達(dá)TaSAP1-1對(duì)煙