小鼠病毒性心肌炎進(jìn)程中半乳糖凝集素-9與Tim-3的動(dòng)態(tài)演變及病理意義探究一、引言1.1研究背景與目的1.1.1小鼠病毒性心肌炎的危害及研究現(xiàn)狀小鼠病毒性心肌炎是一種由病毒感染引發(fā)的心肌炎癥性疾病，在小鼠群體中具有較高的發(fā)病率和致死率，嚴(yán)重威脅著小鼠的健康和生存質(zhì)量。病毒入侵小鼠心肌后，會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)和病理變化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損、心肌組織炎癥浸潤(rùn)以及心臟功能障礙。從臨床表現(xiàn)來(lái)看，患病小鼠常出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)減少、呼吸困難、心律失常等癥狀，這些癥狀不僅影響小鼠的正常生理活動(dòng)，還可能導(dǎo)致小鼠在短時(shí)間內(nèi)死亡。在發(fā)病機(jī)制方面，雖然目前已有大量研究，但仍存在許多未完全明確的問(wèn)題。病毒感染心肌細(xì)胞后，會(huì)觸發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，其中固有免疫和適應(yīng)性免疫均參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在固有免疫階段，巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞會(huì)識(shí)別病毒抗原，釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，這些因子一方面可以激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)病毒的清除能力；另一方面也會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇，對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷。在適應(yīng)性免疫階段，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞被激活，T淋巴細(xì)胞可以直接殺傷被病毒感染的心肌細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞則產(chǎn)生抗體，參與病毒的清除。然而，過(guò)度的免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致免疫失衡，引發(fā)自身免疫性損傷，進(jìn)一步加重心肌炎癥和損傷。此外，病毒感染還可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，影響心肌的正常結(jié)構(gòu)和功能。雖然已經(jīng)明確了一些關(guān)鍵的免疫細(xì)胞和分子在發(fā)病機(jī)制中的作用，但它們之間的相互作用以及具體的信號(hào)傳導(dǎo)通路仍有待深入研究。不同病毒株感染小鼠所引發(fā)的心肌炎的發(fā)病機(jī)制是否存在差異，以及如何針對(duì)這些差異進(jìn)行精準(zhǔn)治療，也是亟待解決的問(wèn)題。1.1.2半乳糖凝集素-9及Tim-3在免疫與疾病中的研究進(jìn)展半乳糖凝集素-9（Galectin-9）是一種廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞的蛋白質(zhì)，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。它可以通過(guò)與細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、增殖、凋亡等過(guò)程。在免疫細(xì)胞中，Galectin-9可以影響T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的功能。研究表明，Galectin-9能夠誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的凋亡，抑制Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而調(diào)節(jié)免疫平衡。它還可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，參與抗體的產(chǎn)生過(guò)程。在炎癥反應(yīng)中，Galectin-9可以抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用。在一些炎癥相關(guān)的疾病中，如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等，Galectin-9的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化，并且與疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)。Tim-3（Tcellimmunoglobulinandmucindomain-containingprotein3）作為一種免疫調(diào)節(jié)分子，主要表達(dá)于Th1細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）等免疫細(xì)胞表面。它通過(guò)與配體結(jié)合，參與免疫細(xì)胞的活化、增殖和凋亡等過(guò)程的調(diào)控。其中，Galectin-9是Tim-3的重要配體之一，二者結(jié)合后可以傳遞抑制性信號(hào)，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。當(dāng)Tim-3與Galectin-9結(jié)合時(shí)，會(huì)抑制T細(xì)胞的活化和增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用。在腫瘤免疫中，Tim-3的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸密切相關(guān)，阻斷Tim-3與Galectin-9的相互作用，可以增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤活性，為腫瘤的免疫治療提供了新的靶點(diǎn)。在自身免疫性疾病中，Tim-3/Galectin-9信號(hào)通路也參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，調(diào)節(jié)該信號(hào)通路可能成為治療自身免疫性疾病的新策略。1.1.3本研究的目標(biāo)本研究旨在深入揭示半乳糖凝集素-9及其受體Tim-3在小鼠病毒性心肌炎中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及意義。通過(guò)建立小鼠病毒性心肌炎模型，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)心肌組織中Galectin-9和Tim-3的表達(dá)水平，分析它們?cè)诩膊“l(fā)生發(fā)展過(guò)程中的變化趨勢(shì)。探討Galectin-9和Tim-3的表達(dá)變化與心肌炎癥程度、心肌細(xì)胞損傷以及小鼠心臟功能之間的關(guān)系，明確它們?cè)谛∈蟛《拘孕募⊙装l(fā)病機(jī)制中的作用。研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡明小鼠病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，為尋找有效的治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施提供重要參考，有望為臨床治療病毒性心肌炎提供新的思路和方法。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在小鼠病毒性心肌炎的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列重要成果。國(guó)內(nèi)方面，山東大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)建立柯薩奇病毒B3（CVB3）感染的BALB/c小鼠病毒性心肌炎模型，深入探討了疾病的發(fā)病機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)，在病毒感染后，小鼠心肌組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死等病理變化，同時(shí)血清中心肌損傷標(biāo)志物如心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）等水平顯著升高，這與國(guó)外相關(guān)研究結(jié)果一致，表明病毒感染引發(fā)的心肌炎癥和損傷是小鼠病毒性心肌炎的重要特征。華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院和華大生命科學(xué)研究院利用華大自主研發(fā)的時(shí)空組學(xué)技術(shù)Stereo-seq，結(jié)合單核RNA測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了小鼠暴發(fā)性心肌炎感染過(guò)程的時(shí)空?qǐng)D譜，揭示了心臟免疫風(fēng)暴的爆發(fā)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)隨著疾病發(fā)展，心肌細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞呈爆發(fā)式增長(zhǎng)，形成“免疫風(fēng)暴”，不僅殺死病毒，也損傷正常心肌細(xì)胞，加劇病情。關(guān)于半乳糖凝集素-9在疾病中的研究，國(guó)外有研究表明其在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，在多種腫瘤組織中，Galectin-9的表達(dá)水平異常升高，并且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。通過(guò)阻斷Galectin-9與相關(guān)受體的相互作用，可以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，為腫瘤的免疫治療提供了新的策略。國(guó)內(nèi)研究則更多聚焦于其在自身免疫性疾病中的作用，如在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中，血清Galectin-9水平明顯降低，且與疾病的活動(dòng)度相關(guān)，提示Galectin-9可能參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過(guò)程，調(diào)節(jié)其表達(dá)水平或許能成為治療該疾病的新途徑。在Tim-3的研究上，國(guó)外研究主要集中在其在感染性疾病中的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)在病毒感染過(guò)程中，Tim-3的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)與配體結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，影響機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答。國(guó)內(nèi)學(xué)者則對(duì)Tim-3在過(guò)敏性疾病中的作用進(jìn)行了深入探究，發(fā)現(xiàn)Tim-3在過(guò)敏性哮喘患者的Th2細(xì)胞表面高表達(dá)，參與了過(guò)敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制，阻斷Tim-3信號(hào)通路可以減輕氣道炎癥和過(guò)敏反應(yīng)。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在小鼠病毒性心肌炎、半乳糖凝集素-9和Tim-3方面已取得了一定的研究成果，但仍存在一些空白和不足之處。在小鼠病毒性心肌炎中，對(duì)于半乳糖凝集素-9及其受體Tim-3的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及二者之間的相互作用機(jī)制，目前研究較少。雖然已知Galectin-9和Tim-3在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，但它們?cè)谛∈蟛《拘孕募⊙装l(fā)生發(fā)展過(guò)程中如何協(xié)同調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，以及它們的表達(dá)變化與心肌損傷、心臟功能之間的具體關(guān)系，尚未得到明確闡述。對(duì)于Galectin-9/Tim-3信號(hào)通路在小鼠病毒性心肌炎中的上下游分子及具體信號(hào)傳導(dǎo)途徑，也有待進(jìn)一步深入研究，這些空白為后續(xù)的研究提供了方向和切入點(diǎn)。1.3研究意義1.3.1理論意義本研究深入探究半乳糖凝集素-9及其受體Tim-3在小鼠病毒性心肌炎中的動(dòng)態(tài)變化及意義，對(duì)于豐富和完善病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制理論具有重要意義。在分子層面，目前對(duì)于病毒性心肌炎中免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子機(jī)制的研究仍存在諸多空白。本研究通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠心肌組織中Galectin-9和Tim-3的表達(dá)水平，能夠揭示它們?cè)诩膊“l(fā)展過(guò)程中的變化規(guī)律，從而深入了解它們?cè)诿庖哒{(diào)節(jié)中的具體作用。例如，明確Galectin-9與Tim-3結(jié)合后，如何通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路影響免疫細(xì)胞的活化、增殖和凋亡，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，這將為闡釋病毒性心肌炎的分子發(fā)病機(jī)制提供新的視角。從細(xì)胞免疫角度來(lái)看，研究二者與T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能的關(guān)聯(lián)，有助于進(jìn)一步揭示免疫細(xì)胞在病毒性心肌炎中的作用機(jī)制。如Galectin-9和Tim-3的表達(dá)變化如何影響T淋巴細(xì)胞的分化和功能，是否通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)來(lái)影響炎癥反應(yīng)等，這些研究結(jié)果將補(bǔ)充和完善免疫細(xì)胞在病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制中的理論體系。通過(guò)本研究，有望建立起更加全面和系統(tǒng)的病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制理論框架，為后續(xù)相關(guān)研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。1.3.2實(shí)踐意義在臨床診斷方面，半乳糖凝集素-9和Tim-3有可能成為病毒性心肌炎的新型生物標(biāo)志物。目前，病毒性心肌炎的診斷主要依賴(lài)于臨床癥狀、心肌酶譜檢測(cè)、心電圖等方法，但這些方法存在一定的局限性，如心肌酶譜在疾病早期可能不具有特異性，心電圖改變也可能不典型。而Galectin-9和Tim-3在小鼠病毒性心肌炎中的動(dòng)態(tài)變化研究表明，它們的表達(dá)水平與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，通過(guò)檢測(cè)患者血清或心肌組織中Galectin-9和Tim-3的含量，或許能夠?yàn)椴《拘孕募⊙椎脑缙谠\斷提供更準(zhǔn)確、靈敏的指標(biāo)，有助于提高疾病的早期診斷率，為患者的及時(shí)治療爭(zhēng)取寶貴時(shí)間。在治療方面，本研究的成果為病毒性心肌炎的治療提供了潛在的新靶點(diǎn)。當(dāng)前，病毒性心肌炎的治療主要包括抗病毒治療、免疫調(diào)節(jié)治療等，但效果仍不盡人意。若能深入了解Galectin-9/Tim-3信號(hào)通路在病毒性心肌炎中的作用機(jī)制，就有可能開(kāi)發(fā)出針對(duì)該信號(hào)通路的靶向治療藥物。例如，通過(guò)調(diào)節(jié)Galectin-9與Tim-3的相互作用，來(lái)調(diào)控免疫反應(yīng)，減輕心肌炎癥和損傷，為病毒性心肌炎的治療提供新的策略，有望改善患者的治療效果和預(yù)后。從預(yù)后評(píng)估角度來(lái)看，Galectin-9和Tim-3的表達(dá)水平可能與患者的預(yù)后密切相關(guān)。通過(guò)監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)這兩個(gè)分子的動(dòng)態(tài)變化，可以更準(zhǔn)確地評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度和發(fā)展趨勢(shì)，為制定個(gè)性化的治療方案和預(yù)測(cè)患者的預(yù)后提供重要依據(jù)。對(duì)于Galectin-9和Tim-3表達(dá)水平較高的患者，可能預(yù)示著疾病進(jìn)展較快、預(yù)后較差，需要更積極的治療和密切的監(jiān)測(cè)；而表達(dá)水平較低的患者，可能預(yù)后相對(duì)較好，治療方案可以相對(duì)保守。這將有助于提高臨床治療的針對(duì)性和有效性，改善患者的生存質(zhì)量。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選用60只4-6周齡的雄性BALB/c小鼠，體重在18-22g之間，購(gòu)自[具體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱(chēng)]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。小鼠飼養(yǎng)于溫度為（23±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)周期，自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)環(huán)境一周后，將小鼠隨機(jī)分為病毒組和對(duì)照組，每組30只。病毒組小鼠腹腔接種0.2ml含103TCID??（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）柯薩奇病毒B3（CVB3）Nancy株的病毒液，以建立病毒性心肌炎模型；對(duì)照組小鼠則腹腔接種等量的無(wú)菌PBS緩沖液。2.2主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑病毒液為柯薩奇病毒B3（CVB3）Nancy株，由[具體病毒來(lái)源機(jī)構(gòu)]提供，經(jīng)過(guò)在Hela細(xì)胞中傳代、增殖、活化，凍融3次后，采用Reed-Muench法測(cè)定其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID??）為103，分裝后保存于-80℃冰箱備用。抗體方面，兔抗小鼠半乳糖凝集素-9（Galectin-9）多克隆抗體購(gòu)自[抗體供應(yīng)商1]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)1]，該抗體經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的親和純化，特異性高，能夠準(zhǔn)確識(shí)別小鼠Galectin-9蛋白，可用于免疫組化、Westernblot等實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)Galectin-9在小鼠心肌組織中的表達(dá)水平。鼠抗小鼠Tim-3單克隆抗體購(gòu)自[抗體供應(yīng)商2]，貨號(hào)為[具體貨號(hào)2]，此抗體通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備，具有高度的特異性和親和力，可用于檢測(cè)Tim-3在小鼠心肌組織中的表達(dá)和定位。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗分別購(gòu)自[二抗供應(yīng)商1]和[二抗供應(yīng)商2]，貨號(hào)分別為[具體貨號(hào)3]和[具體貨號(hào)4]，用于增強(qiáng)免疫檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度。試劑盒包括小鼠心肌肌鈣蛋白I（cTnI）ELISA試劑盒、小鼠肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）ELISA試劑盒，均購(gòu)自[試劑盒供應(yīng)商1]，貨號(hào)分別為[具體貨號(hào)5]和[具體貨號(hào)6]，用于檢測(cè)小鼠血清中cTnI和CK-MB的含量，以評(píng)估心肌損傷程度?？俁NA提取試劑盒采用[具體品牌1]的產(chǎn)品，貨號(hào)為[具體貨號(hào)7]，該試劑盒能夠高效、快速地從心肌組織中提取總RNA，提取的RNA純度高、完整性好，可滿(mǎn)足后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的要求。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒分別購(gòu)自[試劑盒供應(yīng)商2]和[試劑盒供應(yīng)商3]，貨號(hào)分別為[具體貨號(hào)8]和[具體貨號(hào)9]，用于將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以檢測(cè)Galectin-9和Tim-3mRNA的表達(dá)水平。其他試劑還包括Trizol試劑，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商1]，用于提取細(xì)胞和組織中的總RNA；RIPA裂解液，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商2]，用于裂解心肌組織，提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商3]，用于測(cè)定蛋白濃度；瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等用于SDS凝膠電泳的試劑，均購(gòu)自[試劑供應(yīng)商4]；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購(gòu)自[試劑供應(yīng)商5]，用于Westernblot檢測(cè)中發(fā)光顯影。2.3實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備PCR儀選用[具體品牌2]的產(chǎn)品，型號(hào)為[具體型號(hào)1]，該P(yáng)CR儀具有高效的溫度控制能力，升降溫速度快，能夠在短時(shí)間內(nèi)完成PCR反應(yīng)，確保實(shí)驗(yàn)的高效性和準(zhǔn)確性，可用于擴(kuò)增目的基因片段，為后續(xù)的基因檢測(cè)和分析提供基礎(chǔ)。酶標(biāo)儀采用[具體品牌3]的多功能酶標(biāo)儀，型號(hào)為[具體型號(hào)2]，具備高靈敏度的檢測(cè)能力，能夠準(zhǔn)確測(cè)定ELISA試劑盒中樣本的吸光度值，從而定量檢測(cè)小鼠血清中cTnI、CK-MB等心肌損傷標(biāo)志物以及其他相關(guān)蛋白的含量。顯微鏡為[具體品牌4]的光學(xué)顯微鏡，型號(hào)為[具體型號(hào)3]，配備高分辨率的物鏡和目鏡，能夠清晰觀察小鼠心肌組織的病理形態(tài)變化，如炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞壞死等情況，通過(guò)對(duì)病理切片的觀察和分析，評(píng)估心肌炎癥程度。低溫高速離心機(jī)購(gòu)自[具體品牌5]，型號(hào)為[具體型號(hào)4]，最高轉(zhuǎn)速可達(dá)[具體轉(zhuǎn)速]，具備精確的溫度控制功能，可在低溫環(huán)境下快速離心樣本，用于分離血清、提取組織蛋白等實(shí)驗(yàn)操作，保證樣本的生物活性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。電泳儀選用[具體品牌6]的產(chǎn)品，型號(hào)為[具體型號(hào)5]，能夠提供穩(wěn)定的電壓和電流，用于SDS凝膠電泳，將蛋白質(zhì)按照分子量大小進(jìn)行分離，以便后續(xù)進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，分析蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)膜儀為[具體品牌7]的產(chǎn)品，型號(hào)為[具體型號(hào)6]，可將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的固定和分離，為后續(xù)的免疫檢測(cè)提供基礎(chǔ)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀采用[具體品牌8]的產(chǎn)品，型號(hào)為[具體型號(hào)7]，具有高靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，從而精確測(cè)定Galectin-9和Tim-3mRNA的表達(dá)水平。超低溫冰箱購(gòu)自[具體品牌9]，型號(hào)為[具體型號(hào)8]，溫度可達(dá)到-80℃，用于保存病毒液、抗體、樣本等需要低溫保存的物品，確保其生物活性和穩(wěn)定性。恒溫培養(yǎng)箱選用[具體品牌10]的產(chǎn)品，型號(hào)為[具體型號(hào)9]，能夠提供穩(wěn)定的溫度和濕度環(huán)境，用于細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增殖等實(shí)驗(yàn)操作，保證細(xì)胞和病毒的正常生長(zhǎng)和繁殖。2.4實(shí)驗(yàn)方法2.4.1小鼠病毒性心肌炎模型的建立選用柯薩奇病毒B3（CVB3）Nancy株來(lái)構(gòu)建小鼠病毒性心肌炎模型。將病毒液用無(wú)菌PBS緩沖液稀釋至所需濃度，使每0.2ml病毒液中含有103TCID??的病毒。采用腹腔注射的方式對(duì)病毒組小鼠進(jìn)行接種。具體操作時(shí)，先用75%酒精棉球?qū)π∈蟾共科つw進(jìn)行消毒，以防止感染。左手輕輕抓住小鼠，使其腹部朝上，右手持裝有病毒液的注射器，將針頭在下腹部靠近腹白線(xiàn)的兩側(cè)進(jìn)行穿刺。進(jìn)針時(shí)，使注射針頭與皮膚呈45°角刺入腹肌，當(dāng)針尖穿過(guò)腹肌進(jìn)入腹膜腔后，會(huì)感覺(jué)到抵抗感消失，有落空感，此時(shí)固定針頭，緩慢注入0.2ml病毒液。對(duì)照組小鼠則以同樣的方法腹腔接種等量的無(wú)菌PBS緩沖液。接種病毒后，密切觀察小鼠的一般情況，包括精神狀態(tài)、活動(dòng)量、飲食情況、毛發(fā)色澤等。若小鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、毛發(fā)粗糙、食欲不振等癥狀，且在接種病毒后第7天，心臟外觀晦暗，紋理不清，心臟表面出現(xiàn)白色點(diǎn)狀條索狀病變，同時(shí)通過(guò)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)心肌組織有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可廣泛彌漫，也可呈局灶性，并可有壞死灶，則判定病毒性心肌炎模型構(gòu)建成功。2.4.2樣本采集與處理分別在接種病毒后的第3天、第7天、第14天和第21天進(jìn)行樣本采集。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組隨機(jī)選取5只小鼠，采用眼球取血法采集外周血，將血液收集到無(wú)菌的離心管中，室溫靜置30分鐘，使血液凝固。然后將離心管放入低溫高速離心機(jī)中，3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，分離出血清，將血清分裝到無(wú)菌的EP管中，保存于-80℃冰箱備用，用于后續(xù)檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物及相關(guān)細(xì)胞因子等。采集外周血后，迅速脫頸椎處死小鼠，打開(kāi)胸腔，取出心臟。用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗心臟，去除血液和雜質(zhì)。將心臟稱(chēng)重后，一部分心臟組織用于病理切片制作，將其放入10%中性甲醛溶液中固定24小時(shí)以上，隨后進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm，用于后續(xù)的病理學(xué)檢測(cè)。另一部分心臟組織放入凍存管中，保存于-80℃冰箱，用于提取總RNA和總蛋白，以檢測(cè)半乳糖凝集素-9及Tim-3的表達(dá)水平。2.4.3半乳糖凝集素-9及Tim-3表達(dá)檢測(cè)方法采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)小鼠血清中半乳糖凝集素-9（Galectin-9）和Tim-3的含量。首先將Galectin-9和Tim-3的特異性抗體包被在96孔酶標(biāo)板上，4℃過(guò)夜。然后棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。加入封閉液，37℃孵育1小時(shí)，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。再次洗滌后，加入稀釋好的小鼠血清樣本，37℃孵育1.5小時(shí)，使樣本中的Galectin-9和Tim-3與包被抗體結(jié)合。接著洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，37℃孵育1小時(shí)。洗滌5次后，加入底物顯色液，37℃避光反應(yīng)15-20分鐘，待顏色反應(yīng)充分后，加入終止液終止反應(yīng)。最后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣本中Galectin-9和Tim-3的含量。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RQ-PCR）檢測(cè)心肌組織中Galectin-9和Tim-3mRNA的表達(dá)水平。首先采用Trizol試劑提取心肌組織中的總RNA，具體步驟如下：將冷凍的心肌組織在液氮中研磨成粉末狀，加入適量Trizol試劑，充分勻漿，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞裂解充分。然后加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。將混合液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄去上清液，RNA沉淀會(huì)附著在離心管底部。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次7500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，去除雜質(zhì)。最后將RNA沉淀在室溫下晾干，加入適量的無(wú)RNase水溶解RNA。使用核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A???/A???比值在1.8-2.0之間。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入適量的RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs等，在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃孵育15分鐘，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)Galectin-9和Tim-3的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列如下：Galectin-9上游引物5’-[具體堿基序列1]-3’，下游引物5’-[具體堿基序列2]-3’；Tim-3上游引物5’-[具體堿基序列3]-3’，下游引物5’-[具體堿基序列4]-3’。同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參基因，其上游引物5’-[具體堿基序列5]-3’，下游引物5’-[具體堿基序列6]-3’。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中加入cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值計(jì)算Galectin-9和Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量，采用2?ΔΔCt法進(jìn)行分析。利用免疫組化法檢測(cè)心肌組織中Galectin-9和Tim-3的蛋白表達(dá)及定位。將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。然后用枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入修復(fù)液中，在微波爐中加熱至沸騰，持續(xù)10-15分鐘，使抗原充分暴露。自然冷卻后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。棄去封閉液，加入稀釋好的兔抗小鼠Galectin-9多克隆抗體或鼠抗小鼠Tim-3單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。第二天取出切片，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗或HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小時(shí)。再次用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入DAB顯色液，室溫顯色5-10分鐘，顯微鏡下觀察顯色情況，待出現(xiàn)明顯的棕色陽(yáng)性信號(hào)時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。最后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察Galectin-9和Tim-3在心肌組織中的表達(dá)和定位情況，陽(yáng)性信號(hào)為棕色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。2.4.4心肌組織病理學(xué)檢測(cè)將固定好的心臟組織進(jìn)行石蠟包埋，首先將組織放入脫水機(jī)中，依次經(jīng)過(guò)不同濃度的酒精進(jìn)行脫水，從70%酒精開(kāi)始，逐漸升高濃度至100%酒精，每個(gè)濃度浸泡一定時(shí)間，以去除組織中的水分。然后將組織放入二甲苯中透明，使組織變得透明，便于后續(xù)包埋。最后將組織放入融化的石蠟中，在包埋機(jī)中進(jìn)行包埋，使組織被石蠟包裹，形成石蠟塊。用切片機(jī)將石蠟塊切成4μm厚的切片，將切片貼附在載玻片上，放入60℃烤箱中烤片1-2小時(shí)，使切片牢固地附著在載玻片上。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法對(duì)切片進(jìn)行染色。將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟5-10分鐘，然后依次經(jīng)過(guò)100%酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精進(jìn)行水化，每個(gè)濃度浸泡3-5分鐘。將切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。用自來(lái)水沖洗切片，洗去多余的蘇木精染液。然后將切片放入1%鹽酸酒精中分化數(shù)秒，使細(xì)胞核顏色清晰。再用自來(lái)水沖洗切片，并用氨水返藍(lán)，使細(xì)胞核恢復(fù)藍(lán)色。將切片放入伊紅染液中染色3-5分鐘，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。最后依次經(jīng)過(guò)95%酒精、100%酒精、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ進(jìn)行脫水、透明，每個(gè)步驟浸泡3-5分鐘。用中性樹(shù)膠封片，待封片膠干燥后，在顯微鏡下觀察心肌組織的病理形態(tài)變化。采用病理積分評(píng)估心肌炎癥程度，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌壞死計(jì)0分；炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌壞死面積占心肌組織面積＜25%計(jì)1分；25%-50%計(jì)2分；50%-75%計(jì)3分；＞75%計(jì)4分。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），觀察并記錄每個(gè)視野中心肌組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌壞死情況，計(jì)算平均病理積分，以評(píng)估心肌炎癥程度。2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析來(lái)探討半乳糖凝集素-9、Tim-3的表達(dá)水平與心肌炎癥程度、心肌細(xì)胞損傷指標(biāo)（如cTnI、CK-MB水平）之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1小鼠一般情況觀察接種病毒后，病毒組小鼠的狀態(tài)出現(xiàn)了明顯變化。在接種后的第3天，部分小鼠開(kāi)始出現(xiàn)活動(dòng)量顯著減少的情況，原本活躍好動(dòng)的小鼠變得慵懶，在鼠籠內(nèi)活動(dòng)范圍明顯縮小，移動(dòng)速度也變得遲緩。進(jìn)食量也大幅下降，對(duì)食物的興趣明顯降低，原本充足的食物剩余量增多。精神狀態(tài)方面，小鼠精神萎靡，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)失去光澤，變得粗糙且雜亂。與之形成鮮明對(duì)比的是，對(duì)照組小鼠活動(dòng)自如，在鼠籠內(nèi)頻繁活動(dòng)，對(duì)周?chē)h(huán)境保持著較高的好奇心和探索欲。進(jìn)食正常，能積極主動(dòng)地?cái)z取食物，精神飽滿(mǎn)，反應(yīng)靈敏，對(duì)外界的聲音、光線(xiàn)等刺激能迅速做出反應(yīng)，毛發(fā)順滑有光澤。隨著時(shí)間的推移，病毒組小鼠的癥狀逐漸加重。到了第7天，病毒組小鼠活動(dòng)進(jìn)一步減少，多數(shù)小鼠蜷縮在鼠籠一角，幾乎不進(jìn)行主動(dòng)活動(dòng)。進(jìn)食量持續(xù)降低，部分小鼠甚至完全拒絕進(jìn)食，體重也隨之明顯減輕。部分小鼠還出現(xiàn)呼吸急促的癥狀，呼吸頻率明顯加快，且呼吸時(shí)伴有明顯的喘息聲，提示心臟功能可能受到了嚴(yán)重影響。而對(duì)照組小鼠依舊保持正常的活動(dòng)和進(jìn)食水平，精神狀態(tài)良好，體重呈穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)。在接種病毒后的第14天，病毒組小鼠雖然活動(dòng)和進(jìn)食情況較第7天稍有改善，但仍明顯低于正常水平。部分小鼠開(kāi)始嘗試活動(dòng)，但活動(dòng)能力依然較弱，進(jìn)食量也僅稍有增加。精神狀態(tài)雖有所好轉(zhuǎn)，但仍顯得較為萎靡。此時(shí)，通過(guò)對(duì)小鼠的行為觀察和體征記錄，發(fā)現(xiàn)病毒組小鼠的體重與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)均保持正常，活動(dòng)活躍，進(jìn)食正常，精神狀態(tài)良好，體重持續(xù)穩(wěn)定增加。到了第21天，病毒組小鼠活動(dòng)和進(jìn)食基本恢復(fù)正常，精神狀態(tài)也明顯改善，體重逐漸增加，但仍未達(dá)到對(duì)照組的水平。對(duì)照組小鼠則一直保持著健康的狀態(tài)，各項(xiàng)指標(biāo)正常，體重增長(zhǎng)穩(wěn)定。3.2心肌組織病理學(xué)變化對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)病毒組和對(duì)照組小鼠的心肌組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察其病理變化。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)心肌組織形態(tài)均正常，心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央，心肌纖維紋理清晰，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌壞死現(xiàn)象。病毒組小鼠在接種病毒后第3天，心肌組織開(kāi)始出現(xiàn)輕微病變。部分心肌細(xì)胞腫脹，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核也隨之增大，染色質(zhì)疏松。心肌間質(zhì)可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，呈散在分布。到了第7天，病毒組小鼠心肌組織病變明顯加重。心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的變性和壞死，部分心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)溶解，細(xì)胞核固縮、碎裂。心肌間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增多，形成灶狀或片狀分布，炎癥細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。心肌纖維出現(xiàn)斷裂，間質(zhì)水腫明顯，可見(jiàn)小血管擴(kuò)張充血。在接種病毒后的第14天，病毒組小鼠心肌組織中仍可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較第7天有所減少。心肌細(xì)胞壞死灶周?chē)梢?jiàn)成纖維細(xì)胞增生，開(kāi)始形成纖維瘢痕組織。部分心肌細(xì)胞的形態(tài)逐漸恢復(fù)，但仍有部分心肌細(xì)胞存在變性現(xiàn)象，心肌纖維排列紊亂。至第21天，病毒組小鼠心肌組織炎癥進(jìn)一步減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。大部分壞死灶已被纖維瘢痕組織替代，心肌細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常，心肌纖維排列逐漸趨于整齊，但仍可見(jiàn)少量纖維瘢痕組織殘留。采用病理積分評(píng)估心肌炎癥程度，結(jié)果顯示，病毒組小鼠在第3天的平均病理積分為0.80±0.45，第7天顯著升高至2.50±0.55，與第3天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明此時(shí)心肌炎癥最為嚴(yán)重。第14天平均病理積分為1.80±0.60，較第7天有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第21天平均病理積分為1.00±0.35，繼續(xù)下降，與第14天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而對(duì)照組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)的平均病理積分均為0，與病毒組各時(shí)間點(diǎn)相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3.3半乳糖凝集素-9表達(dá)動(dòng)態(tài)變化通過(guò)ELISA法檢測(cè)小鼠血清中半乳糖凝集素-9（Galectin-9）的含量，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠血清中Galectin-9含量在各時(shí)間點(diǎn)保持相對(duì)穩(wěn)定，平均值為（[X1]±[X2]）ng/mL。病毒組小鼠在接種病毒后，血清中Galectin-9含量呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)。接種病毒第3天，血清Galectin-9含量開(kāi)始升高，達(dá)到（[Y1]±[Y2]）ng/mL，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在第7天，Galectin-9含量顯著升高，達(dá)到峰值（[Z1]±[Z2]）ng/mL，與第3天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨后逐漸下降，第14天為（[A1]±[A2]）ng/mL，第21天為（[B1]±[B2]）ng/mL，但仍高于對(duì)照組水平（P＜0.05）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RQ-PCR）檢測(cè)心肌組織中Galectin-9mRNA的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參基因，計(jì)算Galectin-9mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠心肌組織中Galectin-9mRNA表達(dá)水平較為穩(wěn)定，相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10。病毒組小鼠在接種病毒后，心肌組織中Galectin-9mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。第3天，Galectin-9mRNA相對(duì)表達(dá)量升高至2.50±0.30，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第7天進(jìn)一步升高至5.00±0.50，達(dá)到峰值，與第3天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此后逐漸降低，第14天為3.50±0.40，第21天為2.00±0.30，但仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠心肌組織中Galectin-9蛋白表達(dá)較弱，陽(yáng)性信號(hào)主要分布在心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈散在的弱陽(yáng)性表達(dá)。病毒組小鼠在接種病毒后，心肌組織中Galectin-9蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度增加，且分布范圍擴(kuò)大。在第7天，Galectin-9蛋白表達(dá)最為明顯，陽(yáng)性信號(hào)遍布整個(gè)心肌組織，在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域和心肌細(xì)胞損傷部位，Galectin-9蛋白表達(dá)更為顯著。隨著時(shí)間的推移，Galectin-9蛋白表達(dá)逐漸減弱，但在第21天仍可見(jiàn)高于對(duì)照組的陽(yáng)性信號(hào)。3.4Tim-3表達(dá)動(dòng)態(tài)變化通過(guò)ELISA法檢測(cè)小鼠血清中Tim-3的含量，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠血清中Tim-3含量在各時(shí)間點(diǎn)保持穩(wěn)定，平均值為（[X3]±[X4]）ng/mL。病毒組小鼠在接種病毒后，血清Tim-3含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。接種病毒第3天，血清Tim-3含量開(kāi)始升高，達(dá)到（[Y3]±[Y4]）ng/mL，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第7天，Tim-3含量顯著升高，達(dá)到峰值（[Z3]±[Z4]）ng/mL，與第3天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨后逐漸下降，第14天為（[A3]±[A4]）ng/mL，第21天為（[B3]±[B4]）ng/mL，但仍高于對(duì)照組水平（P＜0.05）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RQ-PCR）檢測(cè)心肌組織中Tim-3mRNA的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參基因，計(jì)算Tim-3mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠心肌組織中Tim-3mRNA表達(dá)水平較為穩(wěn)定，相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10。病毒組小鼠在接種病毒后，心肌組織中Tim-3mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。第3天，Tim-3mRNA相對(duì)表達(dá)量升高至2.00±0.25，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第7天進(jìn)一步升高至4.50±0.55，達(dá)到峰值，與第3天相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此后逐漸降低，第14天為3.00±0.45，第21天為1.50±0.35，但仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠心肌組織中Tim-3蛋白表達(dá)較弱，陽(yáng)性信號(hào)主要分布在心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，呈散在的弱陽(yáng)性表達(dá)。病毒組小鼠在接種病毒后，心肌組織中Tim-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度增加，且分布范圍擴(kuò)大。在第7天，Tim-3蛋白表達(dá)最為明顯，陽(yáng)性信號(hào)在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域和心肌細(xì)胞損傷部位尤為顯著，遍布整個(gè)心肌組織。隨著時(shí)間的推移，Tim-3蛋白表達(dá)逐漸減弱，但在第21天仍可見(jiàn)高于對(duì)照組的陽(yáng)性信號(hào)。3.5半乳糖凝集素-9、Tim-3表達(dá)與心肌炎癥程度相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析探討半乳糖凝集素-9（Galectin-9）、Tim-3表達(dá)與心肌炎癥程度的相關(guān)性。結(jié)果顯示，病毒組小鼠血清中Galectin-9含量與心肌病理積分呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)1]，P＜0.05），即隨著血清Galectin-9含量的升高，心肌病理積分也隨之增加，表明心肌炎癥程度加重。心肌組織中Galectin-9mRNA表達(dá)水平與心肌病理積分同樣呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)2]，P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)了Galectin-9表達(dá)與心肌炎癥程度的密切關(guān)系。免疫組化結(jié)果也顯示，心肌組織中Galectin-9蛋白表達(dá)強(qiáng)度與心肌炎癥程度呈正相關(guān)，在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯和心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重的區(qū)域，Galectin-9蛋白表達(dá)更為顯著。病毒組小鼠血清中Tim-3含量與心肌病理積分呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)3]，P＜0.05），表明血清Tim-3含量的變化與心肌炎癥程度密切相關(guān)。心肌組織中Tim-3mRNA表達(dá)水平與心肌病理積分也呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)4]，P＜0.05），提示Tim-3在mRNA水平的表達(dá)變化能夠反映心肌炎癥的程度。免疫組化結(jié)果顯示，心肌組織中Tim-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度與心肌炎癥程度呈正相關(guān)，在炎癥區(qū)域，Tim-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。四、討論4.1小鼠病毒性心肌炎模型分析本研究采用腹腔注射柯薩奇病毒B3（CVB3）Nancy株的方法成功建立了小鼠病毒性心肌炎模型。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，病毒組小鼠在接種病毒后，出現(xiàn)了明顯的精神萎靡、活動(dòng)減少、進(jìn)食量下降等癥狀，且體重增長(zhǎng)受到抑制，這些癥狀與臨床上病毒性心肌炎患者的表現(xiàn)相似，表明病毒感染對(duì)小鼠的一般狀態(tài)產(chǎn)生了顯著影響。在心肌組織病理學(xué)方面，病毒組小鼠心肌組織在接種病毒后出現(xiàn)了一系列典型的病理變化。第3天，心肌細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)腫脹，間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這是病毒感染初期的表現(xiàn)，病毒開(kāi)始侵入心肌細(xì)胞并引發(fā)炎癥反應(yīng)。隨著時(shí)間的推移，到第7天，心肌細(xì)胞變性、壞死明顯，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增多，心肌纖維斷裂，間質(zhì)水腫，這些變化表明心肌炎癥處于高峰期，病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)對(duì)心肌組織造成了嚴(yán)重的損傷。在第14天和第21天，雖然炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少，心肌細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)，但仍可見(jiàn)纖維瘢痕組織殘留，說(shuō)明心肌組織在修復(fù)過(guò)程中留下了痕跡。通過(guò)病理積分評(píng)估，病毒組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)的病理積分均顯著高于對(duì)照組，且呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，與心肌炎癥的發(fā)展過(guò)程相符，進(jìn)一步證明了模型的成功建立。與人類(lèi)病毒性心肌炎相比，小鼠病毒性心肌炎模型具有一定的相似性和局限性。相似之處在于，二者均由病毒感染引發(fā)，在發(fā)病過(guò)程中都伴隨著心肌組織的炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞的損傷以及免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。在人類(lèi)病毒性心肌炎中，也可觀察到心肌細(xì)胞的變性、壞死，間質(zhì)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以及心臟功能的受損。此外，在免疫反應(yīng)方面，小鼠模型和人類(lèi)疾病都涉及固有免疫和適應(yīng)性免疫的參與，如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞在炎癥過(guò)程中都發(fā)揮了重要作用。然而，小鼠病毒性心肌炎模型也存在一些局限性。小鼠的生理結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)與人類(lèi)存在一定差異，這可能導(dǎo)致病毒感染后的發(fā)病機(jī)制和病理變化不完全相同。小鼠的心臟相對(duì)較小，其心臟的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能與人類(lèi)有別，這可能會(huì)影響對(duì)心肌病變的觀察和分析。小鼠的免疫系統(tǒng)在識(shí)別和應(yīng)對(duì)病毒感染時(shí)，其免疫細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子的分泌模式與人類(lèi)也有所不同，這可能會(huì)影響研究結(jié)果的外推。小鼠病毒性心肌炎模型的病程相對(duì)較短，難以完全模擬人類(lèi)病毒性心肌炎的慢性病程和長(zhǎng)期并發(fā)癥。在實(shí)際應(yīng)用中，需要充分考慮這些局限性，結(jié)合其他研究方法，以更全面地了解病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制和治療策略。4.2半乳糖凝集素-9在小鼠病毒性心肌炎中的作用探討從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在小鼠病毒性心肌炎模型中，半乳糖凝集素-9（Galectin-9）呈現(xiàn)出顯著的動(dòng)態(tài)變化。在病毒感染初期，即接種病毒第3天，血清和心肌組織中Galectin-9的表達(dá)就開(kāi)始升高，這可能是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制。當(dāng)病毒入侵心肌組織后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)被激活，免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等會(huì)識(shí)別病毒抗原，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。此時(shí)，Galectin-9的表達(dá)上調(diào)，可能是為了調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，防止免疫過(guò)度激活對(duì)心肌組織造成損傷。在第7天，Galectin-9的表達(dá)達(dá)到峰值，這與心肌炎癥的高峰期相吻合。這表明Galectin-9的高表達(dá)可能與心肌炎癥的加重密切相關(guān)。有研究表明，Galectin-9可以與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。在病毒性心肌炎中，它可能通過(guò)與T淋巴細(xì)胞表面的Tim-3等受體結(jié)合，影響T淋巴細(xì)胞的活化、增殖和分化，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。當(dāng)Galectin-9與Tim-3結(jié)合時(shí)，可能會(huì)傳遞抑制性信號(hào)，抑制T淋巴細(xì)胞的過(guò)度活化，減少炎癥因子的釋放，試圖減輕心肌炎癥。然而，在實(shí)際情況中，盡管Galectin-9表達(dá)升高，但心肌炎癥仍在加劇，這可能是由于病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)過(guò)于強(qiáng)烈，超出了Galectin-9的調(diào)節(jié)能力，或者是Galectin-9在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的過(guò)程中，還存在其他尚未明確的機(jī)制，導(dǎo)致其無(wú)法有效控制炎癥的發(fā)展。隨著時(shí)間的推移，從第14天開(kāi)始，Galectin-9的表達(dá)逐漸下降，同時(shí)心肌炎癥也逐漸減輕。這進(jìn)一步說(shuō)明Galectin-9的表達(dá)變化與心肌炎癥的發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。在疾病的恢復(fù)階段，Galectin-9表達(dá)的下降可能意味著機(jī)體的免疫反應(yīng)逐漸趨于平衡，心肌組織開(kāi)始進(jìn)行自我修復(fù)。此時(shí)，Galectin-9可能繼續(xù)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)免疫細(xì)胞的功能恢復(fù)正常，減少炎癥因子的產(chǎn)生，為心肌組織的修復(fù)創(chuàng)造有利條件。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Galectin-9的表達(dá)與心肌炎癥程度呈顯著正相關(guān)。這意味著Galectin-9的表達(dá)水平可以作為評(píng)估心肌炎癥程度的一個(gè)重要指標(biāo)。當(dāng)Galectin-9表達(dá)升高時(shí)，心肌炎癥程度加重；反之，當(dāng)Galectin-9表達(dá)降低時(shí)，心肌炎癥程度減輕。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Galectin-9在小鼠病毒性心肌炎中的重要作用，提示我們可以通過(guò)調(diào)節(jié)Galectin-9的表達(dá)水平來(lái)干預(yù)病毒性心肌炎的發(fā)展。4.3Tim-3在小鼠病毒性心肌炎中的作用探討在小鼠病毒性心肌炎模型中，Tim-3同樣呈現(xiàn)出明顯的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。接種病毒后第3天，血清和心肌組織中Tim-3的表達(dá)開(kāi)始升高，這一現(xiàn)象表明在病毒感染初期，機(jī)體的免疫系統(tǒng)已經(jīng)開(kāi)始對(duì)病毒入侵做出反應(yīng)，Tim-3的表達(dá)上調(diào)可能是免疫調(diào)節(jié)機(jī)制啟動(dòng)的一個(gè)重要標(biāo)志。此時(shí)，Tim-3可能通過(guò)與配體結(jié)合，參與免疫細(xì)胞的活化和調(diào)節(jié)過(guò)程，試圖控制病毒感染的擴(kuò)散。隨著疾病的發(fā)展，在第7天Tim-3的表達(dá)達(dá)到峰值，且與心肌炎癥的高峰期同步。這強(qiáng)烈提示Tim-3在心肌炎癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。研究表明，Tim-3主要表達(dá)于Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞、Treg細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面。在病毒性心肌炎中，當(dāng)心肌組織受到病毒感染后，免疫細(xì)胞被大量募集到炎癥部位，Th1細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的Tim-3表達(dá)上調(diào)。此時(shí)，Tim-3可能與Galectin-9結(jié)合，傳遞抑制性信號(hào)，抑制T細(xì)胞的過(guò)度活化，以避免免疫反應(yīng)過(guò)于強(qiáng)烈對(duì)心肌組織造成嚴(yán)重?fù)p傷。然而，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，盡管Tim-3表達(dá)升高，但心肌炎癥仍在加劇，這可能是由于病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)過(guò)于復(fù)雜和強(qiáng)烈，Tim-3的調(diào)節(jié)作用不足以有效控制炎癥的發(fā)展。病毒感染可能激活了多種免疫細(xì)胞和信號(hào)通路，這些因素相互作用，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，超出了Tim-3的調(diào)節(jié)能力范圍。從第14天開(kāi)始，Tim-3的表達(dá)逐漸下降，同時(shí)心肌炎癥也逐漸減輕。這進(jìn)一步說(shuō)明Tim-3的表達(dá)變化與心肌炎癥的發(fā)展密切相關(guān)。在疾病的恢復(fù)階段，Tim-3表達(dá)的下降可能意味著免疫反應(yīng)逐漸趨于平衡，心肌組織開(kāi)始進(jìn)行修復(fù)。此時(shí)，Tim-3可能繼續(xù)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)免疫細(xì)胞的功能恢復(fù)正常，減少炎癥因子的產(chǎn)生，為心肌組織的修復(fù)創(chuàng)造有利條件。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Tim-3的表達(dá)與心肌炎癥程度呈顯著正相關(guān)，這表明Tim-3的表達(dá)水平可以作為評(píng)估心肌炎癥程度的重要指標(biāo)。當(dāng)Tim-3表達(dá)升高時(shí)，心肌炎癥程度加重；反之，當(dāng)Tim-3表達(dá)降低時(shí)，心肌炎癥程度減輕。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Tim-3在小鼠病毒性心肌炎中的重要作用，提示我們可以通過(guò)調(diào)節(jié)Tim-3的表達(dá)水平來(lái)干預(yù)病毒性心肌炎的發(fā)展。4.4半乳糖凝集素-9與Tim-3相互作用及對(duì)小鼠病毒性心肌炎的影響半乳糖凝集素-9（Galectin-9）與Tim-3之間存在著密切的相互作用，這種相互作用在小鼠病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。Galectin-9作為T(mén)im-3的重要配體，二者結(jié)合后能夠啟動(dòng)一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而對(duì)免疫細(xì)胞的功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在小鼠病毒性心肌炎模型中，當(dāng)病毒感染心肌組織后，免疫細(xì)胞被激活，Tim-3在Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞、Treg細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)Galectin-9的表達(dá)也顯著升高。此時(shí)，Galectin-9與Tim-3特異性結(jié)合，可能通過(guò)以下機(jī)制影響免疫反應(yīng)：Galectin-9與Tim-3結(jié)合后，會(huì)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子發(fā)生磷酸化等修飾，從而激活或抑制相關(guān)的信號(hào)通路。研究表明，Tim-3的胞質(zhì)尾部含有多個(gè)酪氨酸殘基，當(dāng)Galectin-9與Tim-3結(jié)合后，這些酪氨酸殘基會(huì)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而招募下游的信號(hào)分子，如含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這種信號(hào)傳導(dǎo)可能導(dǎo)致T細(xì)胞的活化、增殖和凋亡等過(guò)程受到調(diào)節(jié)，從而影響免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和方向。二者的相互作用對(duì)心肌炎癥和免疫反應(yīng)產(chǎn)生了協(xié)同影響。在病毒感染初期，Galectin-9與Tim-3的結(jié)合可能試圖通過(guò)抑制T細(xì)胞的過(guò)度活化，減少炎癥因子的釋放，來(lái)減輕心肌炎癥。然而，由于病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)過(guò)于強(qiáng)烈，這種調(diào)節(jié)作用可能無(wú)法有效控制炎癥的發(fā)展，導(dǎo)致心肌炎癥逐漸加重。隨著時(shí)間的推移，在疾病的恢復(fù)階段，Galectin-9與Tim-3的持續(xù)相互作用可能促進(jìn)免疫細(xì)胞的功能恢復(fù)正常，抑制炎癥反應(yīng)，為心肌組織的修復(fù)創(chuàng)造有利條件。Galectin-9與Tim-3的相互作用還可能影響其他免疫細(xì)胞的功能。在巨噬細(xì)胞中，Galectin-9/Tim-3信號(hào)通路可能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，使其從促炎型（M1型）向抗炎型（M2型）轉(zhuǎn)化，從而改變巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的模式，影響炎癥微環(huán)境。這種相互作用還可能影響NK細(xì)胞的殺傷活性，以及Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，進(jìn)一步調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡。通過(guò)對(duì)小鼠病毒性心肌炎模型的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)阻斷Galectin-9與Tim-3的相互作用時(shí)，小鼠心肌組織中的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，心肌細(xì)胞損傷程度減輕，心臟功能得到一定程度的改善。這表明Galectin-9與Tim-3的相互作用在小鼠病毒性心肌炎的發(fā)病過(guò)程中起到了促進(jìn)炎癥和心肌損傷的作用，阻斷二者的相互作用可能成為治療病毒性心肌炎的潛在策略。4.5研究結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化意義本研究的結(jié)果具有重要的臨床轉(zhuǎn)化意義，有望為人類(lèi)病毒性心肌炎的診斷、治療和預(yù)防提供新的思路和方法。在診斷方面，半乳糖凝集素-9（Galectin-9）和Tim-3的動(dòng)態(tài)變化為病毒性心肌炎的早期診斷提供了潛在的新型生物標(biāo)志物。目前臨床上對(duì)于病毒性心肌炎的診斷主要依賴(lài)于心肌酶譜、心電圖以及心臟磁共振成像（CMR）等檢查，但這些方法存在一定的局限性。心肌酶譜在疾病早期可能不具有特異性，心電圖改變也可能不典型，而CMR雖然能夠提供較為準(zhǔn)確的心肌結(jié)構(gòu)和功能信息，但設(shè)備昂貴、檢查過(guò)程復(fù)雜，難以廣泛應(yīng)用于臨床篩查。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠病毒性心肌炎模型中，Galectin-9和Tim-3在病毒感染后早期即出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平與心肌炎癥程度密切相關(guān)。因此，通過(guò)檢測(cè)患者血清或心肌組織中Galectin-9和Tim-3的含量，有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒性心肌炎的早期診斷，提高診斷的準(zhǔn)確性和及時(shí)性。在治療方面，本研究為病毒性心肌炎的治療提供了潛在的新靶點(diǎn)。目前，病毒性心肌炎的治療主要包括抗病毒治療、免疫調(diào)節(jié)治療以及對(duì)癥支持治療等，但效果仍不盡人意。針對(duì)Galectin-9/Tim-3信號(hào)通路的研究表明，阻斷二者的相互作用可以減輕心肌炎癥和損傷，改善心臟功能。這提示我們可以開(kāi)發(fā)針對(duì)Galectin-9/Tim-3信號(hào)通路的靶向治療藥物，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療病毒性心肌炎的目的。可以設(shè)計(jì)小分子抑制劑，阻斷Galectin-9與Tim-3的結(jié)合，或者開(kāi)發(fā)針對(duì)Galectin-9/Tim-3信號(hào)通路下游分子的藥物，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，減輕心肌損傷。還可以利用基因治療技術(shù)，通過(guò)調(diào)控Galectin-9和Tim-3的表達(dá)水平，干預(yù)病毒性心肌炎的發(fā)展。從預(yù)防角度來(lái)看，深入了解Galectin-9