小鼠肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性：機(jī)制與臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為一種高度致命性的腫瘤，是近年來公認(rèn)的全球癌癥高發(fā)疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年中國(guó)有39萬多人新發(fā)肝癌，位于新發(fā)惡性腫瘤的第三位，同年有36萬多人死于肝癌，死亡人數(shù)也居惡性腫瘤第三位，且全世界47%的肝癌發(fā)生在中國(guó)。肝癌的發(fā)病與肝微環(huán)境異常密切相關(guān)，其中肝星狀細(xì)胞（hepaticstellatecell，HSC）作為肝纖維化、癌前期和肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要肝細(xì)胞類型之一，在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。在正常肝臟中，肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，主要參與維生素A的儲(chǔ)存和代謝等生理過程。然而，當(dāng)肝臟受到如病毒感染、酒精損傷、化學(xué)物質(zhì)刺激等各種病理因素侵襲時(shí)，肝星狀細(xì)胞會(huì)被活化?；罨蟮母涡菭罴?xì)胞發(fā)生一系列生物學(xué)行為改變，除了大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展外，還能釋放多種生物活性分子，包括氧自由基、炎癥介質(zhì)等，這些分子在肝癌的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移中都起著較為關(guān)鍵的作用。從免疫調(diào)節(jié)角度來看，肝星狀細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中扮演著重要角色。它可以通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)肝癌微環(huán)境中T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的免疫反應(yīng)。例如，活化的肝星狀細(xì)胞能有效地抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答中T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡，還能改變T細(xì)胞的組成，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，顯著削弱細(xì)胞毒T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力；同時(shí)，肝星狀細(xì)胞能增加適應(yīng)性免疫應(yīng)答中抑制性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而為腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸創(chuàng)造條件，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。此外，肝星狀細(xì)胞還可通過調(diào)節(jié)肝癌微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)和血管生成，間接影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。在炎癥反應(yīng)方面，活化的肝星狀細(xì)胞可以分泌多種炎癥因子，如TNF、IL-6和IL-1β等，這些因子可引起肝癌微環(huán)境的炎癥反應(yīng)，隨后引發(fā)膠原的積累和肝硬化，其中IL-6還可以通過激活STAT3途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。在血管生成方面，肝星狀細(xì)胞可以分泌VEGF等血管生成因子，促進(jìn)肝癌微環(huán)境中新血管的生成，進(jìn)而為肝癌細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。深入研究肝星狀細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)活性，對(duì)于全面深入理解肝癌的發(fā)病機(jī)制具有不可替代的重要意義。通過明確肝星狀細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系以及其分泌的免疫調(diào)節(jié)分子的具體功能和作用機(jī)制，我們能夠從全新的角度揭示肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，為肝癌的防治提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在尋找抗肝癌新靶點(diǎn)方面，對(duì)肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的研究可以幫助我們發(fā)現(xiàn)更多潛在的治療靶點(diǎn)。由于肝星狀細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中的關(guān)鍵作用，針對(duì)其免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子或信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)，有可能成為抑制肝癌發(fā)展的新策略，為研發(fā)新型抗肝癌藥物提供方向。研究肝星狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性對(duì)于改善肝癌治療效果也至關(guān)重要。當(dāng)前肝癌的治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、局部消融、介入治療、化療、放療和生物治療等，但多數(shù)病人診斷后的存活時(shí)間通常不超過一年，綜合治療療效不理想，毒副作用大。通過了解肝星狀細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，我們可以優(yōu)化現(xiàn)有的免疫治療方案，增強(qiáng)機(jī)體自身的抗腫瘤免疫功能，打破機(jī)體或腫瘤局部的免疫耐受或免疫抑制狀態(tài)，提高肝癌的治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。因此，開展小鼠肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的研究具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與問題提出本研究旨在全面且深入地探究小鼠肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性，從而為肝癌的防治策略提供更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)與嶄新的研究思路。具體而言，本研究期望達(dá)成以下目標(biāo)：首先，精確剖析肝星狀細(xì)胞在小鼠肝癌微環(huán)境中的分布狀況與數(shù)量變化規(guī)律，深入探究其在肝癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的時(shí)空動(dòng)態(tài)特性；其次，細(xì)致甄別肝星狀細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中所分泌的關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)分子，并深度解析這些分子對(duì)免疫細(xì)胞功能的具體調(diào)控機(jī)制；再者，深入研究肝星狀細(xì)胞與肝癌微環(huán)境中各類免疫細(xì)胞之間的復(fù)雜相互作用，揭示其在肝癌免疫逃逸過程中所扮演的關(guān)鍵角色；最后，通過對(duì)肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性與小鼠肝癌發(fā)生、發(fā)展過程以及預(yù)后之間關(guān)聯(lián)的精準(zhǔn)分析，為肝癌的早期診斷、靶向治療以及預(yù)后評(píng)估提供極具價(jià)值的理論依據(jù)和潛在生物標(biāo)志物。為了達(dá)成上述研究目標(biāo)，本研究將著力解決以下關(guān)鍵科學(xué)問題：一是在小鼠肝癌微環(huán)境中，肝星狀細(xì)胞的分布和數(shù)量會(huì)隨肝癌的發(fā)生發(fā)展呈現(xiàn)出怎樣的變化規(guī)律？二是肝星狀細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中究竟分泌了哪些免疫調(diào)節(jié)分子，這些分子又是通過何種信號(hào)通路對(duì)免疫細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)控的？三是肝星狀細(xì)胞與肝癌微環(huán)境中的T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞之間存在著怎樣的相互作用機(jī)制，這種作用又是如何導(dǎo)致肝癌免疫逃逸現(xiàn)象發(fā)生的？四是肝星狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性與小鼠肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程以及預(yù)后之間存在著怎樣的內(nèi)在聯(lián)系，能否基于此發(fā)現(xiàn)新的肝癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)？1.3研究創(chuàng)新點(diǎn)與方法本研究在方法和視角等方面具有顯著的創(chuàng)新點(diǎn)。在方法上，本研究整合多學(xué)科技術(shù)手段，采用先進(jìn)的細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)，確保獲取高純度、高活性的肝星狀細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞材料。運(yùn)用多種分子生物學(xué)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot、免疫組化等，從基因、蛋白和細(xì)胞水平全面深入探究肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性，保證研究的全面性和深入性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建精準(zhǔn)且穩(wěn)定的小鼠肝癌模型，模擬人類肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，為研究肝星狀細(xì)胞在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用提供可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。從視角上看，本研究從肝癌微環(huán)境的整體角度出發(fā)，系統(tǒng)研究肝星狀細(xì)胞與各類免疫細(xì)胞的相互作用，突破以往單一研究某類細(xì)胞或分子的局限性，更全面地揭示肝癌免疫逃逸的機(jī)制。同時(shí)，關(guān)注肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性在肝癌發(fā)生發(fā)展不同階段的動(dòng)態(tài)變化，為肝癌的分期治療和精準(zhǔn)干預(yù)提供新的思路。本研究主要采用以下研究方法：一是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法，選用C57BL/J6小鼠，通過亞甲基四氫葉酸腹腔注射建立肝癌模型。定期觀察小鼠的生長(zhǎng)狀況、體重變化以及肝癌的發(fā)病情況，獲取不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠肝臟組織樣本，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。該方法能夠在動(dòng)物體內(nèi)模擬肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，研究肝星狀細(xì)胞在真實(shí)肝癌微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)活性。二是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法，將小鼠肝臟組織摘除并消化，運(yùn)用密度梯度離心法分離肝星狀細(xì)胞，并進(jìn)行原代培養(yǎng)。通過與肝癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察肝星狀細(xì)胞對(duì)其他細(xì)胞的影響，研究其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。該方法能夠在體外控制實(shí)驗(yàn)條件，深入研究肝星狀細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的相互作用。三是分子生物學(xué)技術(shù)，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot技術(shù)分析肝星狀細(xì)胞中免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化，并與正常對(duì)照組織進(jìn)行比較。利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)肝星狀細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中的分布和數(shù)量，以及相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分子在組織中的表達(dá)定位。這些技術(shù)能夠從分子層面揭示肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的內(nèi)在機(jī)制。四是生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，收集病理學(xué)和臨床資料，通過生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性與小鼠肝癌發(fā)生、發(fā)展過程以及預(yù)后的關(guān)聯(lián)。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，明確各因素之間的相關(guān)性和顯著性差異，為研究結(jié)果提供有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持。這些研究方法各有優(yōu)勢(shì)，相互補(bǔ)充，能夠從不同層面和角度深入探究小鼠肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性，為肝癌的防治提供科學(xué)依據(jù)。二、肝癌及肝星狀細(xì)胞相關(guān)理論概述2.1肝癌疾病介紹2.1.1肝癌的全球發(fā)病率與致死率肝癌在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較高的發(fā)病率和致死率，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2022年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2022年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)87萬例，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第6位；死亡病例數(shù)為76萬例，在所有癌癥中排第3位。其中，男性肝癌新發(fā)病例數(shù)60萬，死亡病例數(shù)52萬，均高于女性（新發(fā)27萬，死亡24萬）。預(yù)計(jì)到2050年，全球新發(fā)癌癥病例將超3500萬例，相比2022年的2000萬例增加77%，肝癌作為主要癌癥類型之一，其負(fù)擔(dān)也將進(jìn)一步加重。從地域分布來看，肝癌的發(fā)病和死亡存在明顯的地域差異。西太平洋地區(qū)是肝癌的高發(fā)區(qū)和高死亡率地區(qū)，2019年該地區(qū)肝癌新增病例約30萬例，死亡病例約25萬例。中國(guó)作為西太平洋地區(qū)的人口大國(guó)，肝癌負(fù)擔(dān)尤為沉重。2022年中國(guó)肝癌新發(fā)病例數(shù)37萬例，位居國(guó)內(nèi)癌癥發(fā)病率第4位；死亡病例數(shù)32萬例，高居癌癥死亡率第2位。中國(guó)男性肝癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)均高于女性，其中男性肝癌新發(fā)病例數(shù)高居第3位，死亡病例數(shù)高居第2位。雖然近年來中國(guó)肝癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)有所下降，但發(fā)病數(shù)仍高達(dá)37萬，死亡數(shù)高達(dá)32萬，防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。在過去的十年間，全球肝癌的負(fù)擔(dān)和病因發(fā)生了變化。從2010年到2019年，肝癌發(fā)病率增加了27%，死亡率增加了25%，殘疾調(diào)整生命年增加了21%。隨著乙肝疫苗的廣泛接種和抗病毒治療的廣泛應(yīng)用，世界范圍內(nèi)乙肝病毒相關(guān)肝癌的負(fù)擔(dān)有所下降。自2013年口服抗丙肝病毒sophorbuvir片上市以來，丙肝相關(guān)肝癌的風(fēng)險(xiǎn)也顯著降低。然而，經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展助長(zhǎng)了“飲酒”現(xiàn)象，增加了酒精性肝癌的負(fù)擔(dān)。此外，美國(guó)、歐洲和亞洲的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患病率隨著肥胖和糖尿病的增加而增加，導(dǎo)致NASH相關(guān)肝癌的發(fā)病率顯著增加。在不同國(guó)家，肝癌的年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率差異很大，位于非洲中西部的尼日爾年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率最低，僅為0.65/10萬；蒙古最高，達(dá)到1152.3/10萬。按照社會(huì)人口指數(shù)（SDI）劃分，2019年中等SDI國(guó)家的肝癌新發(fā)病例（約19萬）、死亡病例（約20萬）和殘疾調(diào)整壽命年（550萬）最高。從2010年到2019年，肝癌發(fā)病率和年齡標(biāo)化發(fā)病率在中等SDI的國(guó)家增加最明顯；而死亡率、年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率和年齡標(biāo)準(zhǔn)化殘疾調(diào)整壽命年在低和中等SDI國(guó)家增加最明顯。相反，年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率在低SDI國(guó)家下降最明顯，年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率在中高SDI國(guó)家下降最明顯，殘疾調(diào)整壽命年在高SDI國(guó)家下降最明顯。這種地域差異和變化趨勢(shì)與各國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、生活方式、醫(yī)療條件以及肝癌的致病因素分布等密切相關(guān)。2.1.2肝癌的主要類型及發(fā)病機(jī)制肝癌主要分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌，其中原發(fā)性肝癌又包括肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌和混合型肝癌等類型，不同類型的肝癌在發(fā)病機(jī)制上各有特點(diǎn)。肝細(xì)胞癌是最常見的原發(fā)性肝癌類型，在我國(guó)90%的肝癌患者中有乙型肝炎病毒感染的背景。乙肝病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝細(xì)胞癌的主要致病因素之一。病毒感染會(huì)導(dǎo)致慢性肝炎，長(zhǎng)期的炎癥刺激使肝細(xì)胞不斷受損和再生，在這個(gè)過程中，肝細(xì)胞容易發(fā)生基因突變，進(jìn)而引發(fā)癌變。HBV通過其編碼的蛋白，如HBx蛋白，干擾細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響細(xì)胞的增殖、凋亡和DNA修復(fù)等過程，增加肝細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。HCV則主要通過引起持續(xù)的肝臟炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞因子的釋放，間接導(dǎo)致肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。飲酒也是肝細(xì)胞癌的重要發(fā)病因素之一。長(zhǎng)期酗酒可使肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性、壞死和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化，最終增加患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。酒精在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的乙醛具有細(xì)胞毒性，能夠損傷肝細(xì)胞的DNA，引發(fā)基因突變。同時(shí)，酒精還會(huì)影響肝臟的免疫功能，削弱機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視和清除能力。毒物接觸，如黃曲霉毒素等，也與肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。黃曲霉毒素是一種由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，常見于霉變的食物中。黃曲霉毒素B1具有很強(qiáng)的致癌性，它可以與肝細(xì)胞的DNA結(jié)合，形成加合物，導(dǎo)致DNA損傷和基因突變，從而誘發(fā)肝癌。肝內(nèi)膽管癌占肝臟惡性腫瘤的2.3％，其確切病因尚不清楚，但研究提示多基因變異在其多階段發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。一些危險(xiǎn)因素，如原發(fā)性硬化性膽管炎、肝吸蟲感染、膽管囊腫等，會(huì)增加肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。原發(fā)性硬化性膽管炎會(huì)導(dǎo)致膽管壁的慢性炎癥和纖維化，破壞膽管上皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)胞更容易發(fā)生惡變。肝吸蟲感染時(shí)，蟲體及其代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)膽管上皮細(xì)胞產(chǎn)生刺激，引發(fā)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖異常，增加癌變的可能性?；旌闲透伟┯筛渭?xì)胞癌和肝內(nèi)膽管癌兩種成分混合構(gòu)成，發(fā)生率少于肝臟腫瘤的5％。其發(fā)病機(jī)制可能涉及肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的共同惡變，或者是一種細(xì)胞類型的惡變后誘導(dǎo)另一種細(xì)胞類型發(fā)生惡變。在基因表型分析上，混合型肝癌顯示分屬兩個(gè)獨(dú)立的克隆，說明其發(fā)生可能是不同致癌因素作用于不同細(xì)胞類型的結(jié)果。2.1.3肝癌的現(xiàn)有治療手段與局限性目前，肝癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、局部消融治療、介入治療、放射治療、系統(tǒng)化療、分子靶向治療、免疫治療以及中醫(yī)中藥治療等，然而這些治療方法都存在一定的局限性。手術(shù)治療是目前根治肝癌的最佳手段，包括肝切除術(shù)和肝移植術(shù)。對(duì)于早期肝癌患者，手術(shù)切除可以及時(shí)去除病灶，若患者身體條件良好，肝功能正常，且腫瘤局限，手術(shù)治療效果通常較好。但手術(shù)治療對(duì)患者的身體狀況和肝臟功能要求較高，對(duì)于一些身體條件差、合并有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病或腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，往往不適合手術(shù)。此外，手術(shù)切除后存在一定的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對(duì)于腫瘤較大、分化程度低或伴有血管侵犯的患者，復(fù)發(fā)率較高。肝移植雖然可以同時(shí)解決肝癌、肝炎、肝硬化等肝臟疾病，但面臨著肝源缺乏、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大、術(shù)后免疫排斥反應(yīng)以及高昂的治療費(fèi)用等問題。肝源短缺限制了肝移植的廣泛應(yīng)用，許多患者在等待肝源的過程中病情惡化。手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和術(shù)后免疫排斥反應(yīng)需要長(zhǎng)期使用免疫抑制劑，這又會(huì)增加感染和其他并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。局部消融治療，如射頻消融、微波消融等，適用于不適合手術(shù)切除的患者，腫瘤直徑一般應(yīng)在5cm以內(nèi)，最佳大小在3cm以內(nèi)。該方法通過物理手段使腫瘤組織凝固性壞死，達(dá)到治療目的。然而，對(duì)于較大的腫瘤或位置特殊的腫瘤，消融治療可能無法完全覆蓋腫瘤組織，導(dǎo)致治療不徹底。此外，消融治療也可能引起一些并發(fā)癥，如出血、感染、肝功能損傷等。介入治療，如經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞（TACE），適用于不愿意接受手術(shù)切除或無法手術(shù)切除的進(jìn)展期肝癌患者。TACE通過將化療藥物和栓塞劑注入腫瘤供血?jiǎng)用}，使腫瘤缺血壞死并受到化療藥物的作用。但介入治療的療效有限，對(duì)于一些對(duì)化療藥物不敏感的腫瘤或腫瘤血供復(fù)雜的患者，治療效果不佳。多次介入治療還可能導(dǎo)致肝功能損害和腫瘤耐藥性的產(chǎn)生。放射治療對(duì)于病情良好，肝功能正常，不伴隨肝硬化，沒有黃疸和腹水，腫瘤局限不適合手術(shù)切除或術(shù)后復(fù)發(fā)的患者，可以采用放療為主的綜合性治療。但放射治療會(huì)對(duì)正常肝臟組織造成一定的損傷，導(dǎo)致放射性肝炎、肝功能減退等并發(fā)癥。同時(shí)，肝癌細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性相對(duì)較低，需要較高的劑量才能達(dá)到治療效果，這也增加了正常組織受損的風(fēng)險(xiǎn)。系統(tǒng)化療在肝癌治療中的應(yīng)用相對(duì)有限，由于肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性較低，且化療藥物的全身副作用較大，如惡心、嘔吐、骨髓抑制等，限制了其臨床應(yīng)用。分子靶向治療，如索拉非尼、侖伐替尼等，為晚期肝細(xì)胞肝癌患者提供了新的治療選擇。這些藥物通過特異性地作用于腫瘤細(xì)胞的某些靶點(diǎn)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成。然而，分子靶向治療也存在耐藥性問題，大部分患者在治療一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致治療效果下降。免疫治療，如PD-1抑制劑等，通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來殺傷腫瘤細(xì)胞。雖然免疫治療在一些肝癌患者中取得了一定的療效，但并非所有患者都能從中獲益，且可能會(huì)引發(fā)免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，如免疫性肝炎、肺炎等。中醫(yī)中藥治療在肝癌的綜合治療中具有一定的輔助作用，可以改善患者的癥狀，提高生活質(zhì)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。但中醫(yī)中藥治療的效果相對(duì)較慢，且缺乏大規(guī)模的臨床研究驗(yàn)證其確切療效。2.2肝星狀細(xì)胞概述2.2.1肝星狀細(xì)胞的生物學(xué)特性肝星狀細(xì)胞（hepaticstellatecell，HSC），又被稱為貯脂細(xì)胞、Ito細(xì)胞、竇周細(xì)胞等，是肝臟特有的一種細(xì)胞類型，在肝臟的生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。從形態(tài)上看，肝星狀細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則形，細(xì)胞體較為扁平。在正常肝臟中，肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，此時(shí)其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有多個(gè)富含維生素A的脂滴，這是其顯著的形態(tài)學(xué)特征之一。這些脂滴使得肝星狀細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)出明亮的外觀，易于與其他細(xì)胞區(qū)分。其細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，常因脂滴的擠壓而出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)凹陷，核內(nèi)可見1-2個(gè)核仁。肝星狀細(xì)胞具有多個(gè)細(xì)長(zhǎng)的突起，這些突起向外延伸，環(huán)繞在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞外面，與肝細(xì)胞、鄰近的星狀細(xì)胞以及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞相互接觸，形成復(fù)雜的細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在肝臟中的位置方面，肝星狀細(xì)胞位于肝竇周Disse腔內(nèi)，緊貼著肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。這一特殊的位置使其能夠與肝臟內(nèi)的多種細(xì)胞進(jìn)行密切的相互作用，在肝臟的物質(zhì)交換、信號(hào)傳遞等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。肝星狀細(xì)胞約占肝臟所有細(xì)胞的13%，雖然數(shù)量相對(duì)較少，但其立體分布和伸展足以覆蓋整個(gè)肝竇微循環(huán)，對(duì)維持肝臟的正常生理功能具有重要意義。在正常生理功能上，肝星狀細(xì)胞參與維生素A的代謝和儲(chǔ)存。肝臟儲(chǔ)存了體內(nèi)約80%的維生素A，而肝星狀細(xì)胞是肝臟中維生素A的主要儲(chǔ)存場(chǎng)所。視黃醛在小腸內(nèi)酯化后被運(yùn)輸?shù)礁闻K，并與特異的視黃醛結(jié)合蛋白結(jié)合，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到鄰近的肝星狀細(xì)胞儲(chǔ)存。當(dāng)機(jī)體需要時(shí)，肝星狀細(xì)胞可以釋放維生素A，以滿足身體的需求。肝星狀細(xì)胞還具有儲(chǔ)存脂肪的功能，其胞質(zhì)內(nèi)的脂滴含有大量的甘油三酯，能夠?yàn)楦渭?xì)胞提供能源。肝星狀細(xì)胞也是正常及纖維化肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）的主要合成細(xì)胞。正常肝臟中，肝星狀細(xì)胞合成的膠原以Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型為主，其合成量是肝細(xì)胞的10倍、內(nèi)皮細(xì)胞的20倍以上。此外，肝星狀細(xì)胞還能合成纖維連接蛋白、層連蛋白和粗纖維調(diào)理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸等蛋白多糖，這些物質(zhì)對(duì)于維持肝臟的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定至關(guān)重要。肝星狀細(xì)胞還可以分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF），參與肝細(xì)胞再生的調(diào)控。它還能表達(dá)少量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）、血小板衍生的生長(zhǎng)因子（PDGF）和胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）等，同時(shí)表達(dá)TGF-β1的II、III型受體和PDGF受體的α亞單位等，通過這些細(xì)胞因子和受體的相互作用，調(diào)節(jié)肝臟的生理功能和病理過程。2.2.2肝星狀細(xì)胞的活化過程與調(diào)控機(jī)制當(dāng)肝臟受到炎癥、損傷、病毒感染、酒精刺激等各種病理因素侵襲時(shí)，肝星狀細(xì)胞會(huì)被激活，從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。這一活化過程是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多個(gè)階段和多種信號(hào)通路的調(diào)控。肝星狀細(xì)胞活化的啟動(dòng)因素主要包括受損肝細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和血小板釋放的細(xì)胞因子，以及活性氧（ROS）等。在肝臟受損時(shí)，肝細(xì)胞會(huì)釋放TGF-β、PDGF、VEGF等細(xì)胞因子。TGF-β被認(rèn)為是潛在的纖維形成細(xì)胞因子，在纖維化形成過程中，組織和血液中活化TGF-β1的水平升高，過表達(dá)的TGF-β1可以結(jié)合肝星狀細(xì)胞表面的受體，上調(diào)ECM表達(dá)，誘導(dǎo)纖維形成?；罨母涡菭罴?xì)胞及肌成纖維細(xì)胞又可持續(xù)地刺激自身分泌TGF-β1，進(jìn)一步激活肝星狀細(xì)胞，通過旁分泌和自分泌途徑激活肝星狀細(xì)胞，這是肝纖維化形成的重要機(jī)制。PDGF是一種血清衍生成分，是平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的因子，由肝細(xì)胞產(chǎn)生。在人或嚙齒動(dòng)物肝損傷時(shí)，PDGFRβ在肝星狀細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)，PDGFRβ基因缺失減輕了四氯化碳（CCl4）和膽管結(jié)扎小鼠模型的肝損傷，抑制了纖維化形成。VEGF由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞釋放，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞增殖和血管新生。ROS也是激活肝星狀細(xì)胞的重要因素之一。在肝臟損傷過程中，炎癥細(xì)胞如庫普弗細(xì)胞等會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，ROS可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，從而激活肝星狀細(xì)胞。ROS還可以作為信號(hào)分子，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化。肝星狀細(xì)胞的活化過程可分為起始階段和持續(xù)激活階段。在起始階段，靜止的肝星狀細(xì)胞受到上述啟動(dòng)因素的刺激，細(xì)胞開始發(fā)生形態(tài)和功能的改變。其細(xì)胞質(zhì)中的脂滴逐漸減少，細(xì)胞體積增大，增殖能力增強(qiáng)。在持續(xù)激活階段，活化的肝星狀細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞樣細(xì)胞（MFC）。此時(shí)，細(xì)胞表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）及結(jié)蛋白（desmin）等，成為肌纖維樣母細(xì)胞。α-SMA的表達(dá)是肝星狀細(xì)胞激活的重要標(biāo)志?；罨母涡菭罴?xì)胞還具有收縮性增強(qiáng)、ECM分泌增加、細(xì)胞因子和趨化因子及受體分泌增加、TIMP合成及分泌增加等特征。肝星狀細(xì)胞活化的調(diào)控機(jī)制涉及多條信號(hào)通路。TGF-β/Smad信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞活化中起著關(guān)鍵作用。在TGF-β的刺激下，調(diào)節(jié)Smad（Smad2、3）募集到TGF-β受體上，通過磷酸化使其活化?；罨腟mad復(fù)合物，同時(shí)募集轉(zhuǎn)錄共激活分子（如P300/CBP、MSG1）和共抑制分子（TGIF、Ski/SnoN）。隨后，p-Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)定位于核內(nèi)，調(diào)節(jié)下游促纖維化基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致纖維化的形成?；罨腟mad2/3與Smad4形成復(fù)合物促進(jìn)肝星狀細(xì)胞對(duì)Ⅰ型和Ⅲ型膠原的轉(zhuǎn)錄。相反，在自動(dòng)反饋調(diào)節(jié)過程中，Smad7扮演一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子作用。MAPK信號(hào)通路也參與肝星狀細(xì)胞的活化。TGF-β可以調(diào)節(jié)活化的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、p38MAPK和c-junN-末端激酶，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化。PI3K/Akt信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞的存活、增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。在PDGF等細(xì)胞因子的刺激下，PI3K被激活，進(jìn)而激活A(yù)kt?；罨腁kt可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖和存活等過程，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化。2.2.3肝星狀細(xì)胞在肝臟疾病中的作用肝星狀細(xì)胞在肝臟疾病中扮演著重要角色，尤其是在肝纖維化、肝硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，具有雙重作用。在肝纖維化方面，肝星狀細(xì)胞是肝纖維化形成的關(guān)鍵細(xì)胞。當(dāng)肝臟受到持續(xù)損傷時(shí)，肝星狀細(xì)胞被活化，大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），包括膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等。這些ECM成分在肝臟內(nèi)過度沉積，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生?；罨母涡菭罴?xì)胞還能分泌基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP），抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的活性，減少ECM的降解，進(jìn)一步加重肝纖維化。在慢性乙型肝炎患者中，肝星狀細(xì)胞的活化程度與肝纖維化的程度密切相關(guān)。隨著肝纖維化的進(jìn)展，肝星狀細(xì)胞的數(shù)量和活性逐漸增加。肝星狀細(xì)胞的活化還會(huì)導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)的改變，影響肝臟的正常功能。肝星狀細(xì)胞的收縮性增強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致肝竇狹窄，血流阻力增加，影響肝臟的血液循環(huán)。在肝硬化的發(fā)展中，肝星狀細(xì)胞同樣起著關(guān)鍵作用。肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展，肝臟組織逐漸被纖維瘢痕組織取代，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的嚴(yán)重破壞，最終發(fā)展為肝硬化。肝星狀細(xì)胞在肝硬化的形成過程中，不僅通過合成和分泌ECM促進(jìn)纖維瘢痕的形成，還參與肝臟血管的重塑和肝內(nèi)血管阻力的增加。肝星狀細(xì)胞的活化會(huì)導(dǎo)致肝臟內(nèi)血管生成異常，形成異常的血管網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步加重肝臟的血液循環(huán)障礙。在肝硬化患者中，肝星狀細(xì)胞的活化還與門靜脈高壓、腹水等并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。肝星狀細(xì)胞在肝臟疾病中也具有一定的保護(hù)作用。在肝臟損傷的早期，肝星狀細(xì)胞可以分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等細(xì)胞因子，促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和修復(fù)。HGF能夠刺激肝細(xì)胞的增殖，抑制肝細(xì)胞的凋亡，有助于恢復(fù)肝臟的正常功能。肝星狀細(xì)胞還可以通過分泌一些抗炎因子，如IL-10等，抑制炎癥反應(yīng)，減輕肝臟的炎癥損傷。在肝臟受到輕度損傷時(shí)，肝星狀細(xì)胞的這些保護(hù)作用可以幫助肝臟維持正常的功能。三、小鼠肝癌微環(huán)境建模及肝星狀細(xì)胞分離培養(yǎng)3.1小鼠肝癌模型的構(gòu)建3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與準(zhǔn)備本研究選用6-8周齡的C57BL/J6小鼠，該品系小鼠具有遺傳背景清晰、個(gè)體差異小、對(duì)實(shí)驗(yàn)處理反應(yīng)較為一致等優(yōu)點(diǎn)，且在肝癌研究中被廣泛應(yīng)用，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。在實(shí)驗(yàn)前，將小鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度為50%-60%，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)光照制度。給予小鼠標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料和無菌飲用水，自由進(jìn)食和飲水。小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)情況以及糞便形態(tài)等，確保小鼠健康無異常。若發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)疾病或異常行為，及時(shí)進(jìn)行處理或剔除，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2建模方法的選擇與實(shí)施本研究采用亞甲基四氫葉酸腹腔注射的方法建立小鼠肝癌模型。亞甲基四氫葉酸是一種重要的一碳單位載體，參與嘌呤的從頭合成和細(xì)胞DNA復(fù)制，在細(xì)胞分裂和增殖過程中起著關(guān)鍵作用。研究表明，亞甲基四氫葉酸的異常代謝與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。具體實(shí)施步驟如下：將亞甲基四氫葉酸用無菌生理鹽水配制成濃度為10mg/mL的溶液。實(shí)驗(yàn)小鼠稱重后，按照100mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射，每周注射2次，連續(xù)注射8周。在注射過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，使用一次性注射器和針頭，確保注射劑量準(zhǔn)確無誤。注射時(shí)，將小鼠輕輕固定，用酒精棉球消毒腹部皮膚，然后將注射器針頭緩慢刺入腹腔，回抽無血后緩慢注入亞甲基四氫葉酸溶液。注射完畢后，輕輕拔出針頭，用棉球按壓注射部位片刻，防止溶液滲出。在建模過程中，密切觀察小鼠的生長(zhǎng)狀況、體重變化、飲食情況、精神狀態(tài)等。若發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如精神萎靡、食欲不振、體重急劇下降、腹瀉等，及時(shí)記錄并進(jìn)行相應(yīng)的處理。對(duì)于死亡的小鼠，及時(shí)進(jìn)行解剖，觀察肝臟及其他臟器的病變情況，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。3.1.3模型的驗(yàn)證與評(píng)估在建模結(jié)束后，通過多種方法對(duì)小鼠肝癌模型進(jìn)行驗(yàn)證與評(píng)估。首先，觀察小鼠的外觀癥狀和行為表現(xiàn)。成功建模的小鼠通常會(huì)出現(xiàn)體重減輕、毛發(fā)粗糙、精神萎靡、活動(dòng)減少等癥狀。同時(shí)，觀察小鼠的腹部是否有明顯的腫塊，若能觸摸到質(zhì)地較硬、邊界不清的腫塊，提示可能存在肝癌。其次，進(jìn)行病理切片檢查。將小鼠脫頸椎處死后，迅速取出肝臟，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血跡和雜質(zhì)。然后，將肝臟組織切成厚度約為0.5cm的小塊，放入4%多聚甲醛溶液中固定24小時(shí)。固定后的組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等處理后，制成石蠟切片。切片厚度為4-5μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察肝臟組織的病理變化，正常肝臟組織的肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，而肝癌模型小鼠的肝臟組織可見癌細(xì)胞呈巢狀或條索狀排列，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核大深染，核仁明顯，可見病理性核分裂象，間質(zhì)內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，還可以通過檢測(cè)血清中甲胎蛋白（AFP）的含量來評(píng)估模型的成功與否。AFP是一種由胎兒肝細(xì)胞和卵黃囊合成的糖蛋白，在正常成人血清中的含量極低，但在肝癌患者血清中會(huì)顯著升高，是肝癌診斷的重要標(biāo)志物之一。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠血清中的AFP含量，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。若模型小鼠血清中AFP含量顯著高于正常對(duì)照組小鼠，提示肝癌模型構(gòu)建成功。通過上述多種方法的驗(yàn)證與評(píng)估，確保小鼠肝癌模型的成功構(gòu)建，為后續(xù)研究肝星狀細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)活性提供可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?.2小鼠肝星狀細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)3.2.1組織取材與處理將建模成功的小鼠用戊巴比妥鈉（60mg/kg）腹腔注射麻醉，確保小鼠處于深度麻醉狀態(tài)，避免在后續(xù)操作中因小鼠掙扎而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。麻醉成功后，將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，用碘伏對(duì)小鼠腹部皮膚進(jìn)行消毒，消毒范圍應(yīng)足夠大，以保證手術(shù)區(qū)域的無菌環(huán)境。消毒后，沿小鼠腹部正中線做一縱向切口，長(zhǎng)度約為1-2cm，依次剪開皮膚、皮下組織和腹膜，充分暴露腹腔。小心鈍性分離門靜脈及下腔靜脈，分離過程中動(dòng)作要輕柔，避免損傷血管和周圍組織。分離完成后，用16號(hào)套管針作門靜脈插管，并用絲線固定，確保插管位置準(zhǔn)確且牢固。然后，用37℃預(yù)熱的D-Hanks液以10ml/min的速度進(jìn)行灌注，灌注過程中密切觀察肝臟的變化，當(dāng)肝臟充盈且剪開下腔靜脈放血后，結(jié)扎下腔靜脈。立即打開胸腔，用16號(hào)套管針作上腔靜脈插管，形成門靜脈-上腔靜脈循環(huán)，以保證肝臟能夠充分灌注。接著，用0.5％鏈霉蛋白酶E以5mL/min的速度灌注3-4分鐘，再用0.1％型膠原酶以5ml/min的速度灌注3-4分鐘。灌注完成后，取出肝臟，去除肝包膜、膽囊以及肝周的韌帶、血管等纖維結(jié)締組織。用眼科剪將肝臟剪碎成約1mm3的小塊，放入含有鏈霉蛋白酶E（終濃度為0.5％）和DNA酶（終濃度為10μg/ml）的消化液中，在37℃、5％CO?孵箱內(nèi)消化30分鐘。消化過程中可輕輕振蕩，使消化更加充分。3.2.2密度梯度離心法分離肝星狀細(xì)胞密度梯度離心法分離肝星狀細(xì)胞的原理是利用細(xì)胞在不同密度介質(zhì)中的沉降速度差異，將肝星狀細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。具體操作流程如下：將消化后的肝組織懸液用200目篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織塊和雜質(zhì)。將濾液收集到離心管中，加入適量的含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，終止消化。以30×g離心5分鐘，棄沉淀，取上清液。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，以450×g離心7分鐘，去上清，取沉淀。向沉淀中加入6ml的15％Optiprep，充分混勻，使細(xì)胞均勻分布在溶液中。在混合液上面小心加6ml的11.5％Optiprep，然后在其上再加6mlHanks平衡鹽溶液（HBSS），形成密度梯度。將離心管放入離心機(jī)中，以1400×g，4℃離心10分鐘。離心后，在離心管中會(huì)出現(xiàn)明顯的分層，肝星狀細(xì)胞位于11.5％Optiprep和15％Optiprep的界面層。小心吸取界面層細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入5mlHBSS懸浮細(xì)胞，以450×g離心8分鐘，清洗細(xì)胞。去上清，沉淀中加入適量的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。在操作過程中，有以下注意事項(xiàng)：整個(gè)操作過程應(yīng)盡量在低溫環(huán)境下進(jìn)行，一般在4℃左右，以減少細(xì)胞的代謝和損傷。在加入不同密度的Optiprep和HBSS時(shí)，要小心緩慢，避免破壞密度梯度。吸取界面層細(xì)胞時(shí)，要注意避免吸到其他層的細(xì)胞，以保證細(xì)胞的純度。離心速度和時(shí)間要嚴(yán)格控制，過高的離心速度和過長(zhǎng)的離心時(shí)間可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。3.2.3原代培養(yǎng)條件與細(xì)胞鑒定將分離得到的肝星狀細(xì)胞以2×10?-5×10?/ml的濃度接種于50ml培養(yǎng)瓶中，置于5％CO?、37℃、95％潮濕空氣的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，36-48h首次換液，去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。之后，改用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2d更換一次培養(yǎng)液，以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并去除代謝產(chǎn)物。為了鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為肝星狀細(xì)胞，采用免疫熒光染色法。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，取出蓋玻片。用4％多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入0.3％TritonX-100通透細(xì)胞10-15分鐘，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入5％BSA封閉液，室溫封閉30-60分鐘，以減少非特異性染色。封閉后，棄去封閉液，加入鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體或鼠抗結(jié)蛋白（desmin）抗體，4℃孵育過夜。第二天，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。最后，用DAPI染核5-10分鐘，再用PBS沖洗3次，每次5分鐘。將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察。若細(xì)胞呈現(xiàn)特異性熒光染色，表明細(xì)胞表達(dá)α-SMA或desmin，可鑒定為肝星狀細(xì)胞。四、肝星狀細(xì)胞在小鼠肝癌微環(huán)境中的分布與數(shù)量變化4.1病理學(xué)染色分析4.1.1HE染色實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果觀察HE染色即蘇木精-伊紅染色，是一種廣泛應(yīng)用于組織學(xué)和病理學(xué)研究的常規(guī)染色方法。蘇木精染液為堿性，可將組織的嗜堿性結(jié)構(gòu)，如核糖體、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中的核糖核酸等染成藍(lán)紫色；伊紅為酸性染料，能將組織的嗜酸性結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，包括路易體、酒精小體以及細(xì)胞質(zhì)的大部分染成粉紅色，從而使整個(gè)細(xì)胞組織的形態(tài)清晰可見。本實(shí)驗(yàn)中HE染色的具體操作步驟如下：將制備好的小鼠肝臟組織石蠟切片置于60℃烘箱中烤1-2小時(shí)，使切片與載玻片緊密貼合。隨后，將切片放入二甲苯中進(jìn)行脫蠟處理，二甲苯（Ⅰ）中浸泡15分鐘，二甲苯（Ⅱ）中再浸泡15分鐘，以去除切片中的石蠟，使染料能夠更好地滲透進(jìn)入組織。接著，將切片依次移入二甲苯：無水乙醇（1:1）混合液中浸泡2分鐘，100%乙醇（Ⅰ）中浸泡5分鐘，100%乙醇（Ⅱ）中浸泡5分鐘，80%乙醇中浸泡5分鐘，蒸餾水浸泡5分鐘，進(jìn)行梯度脫水和水化。之后，將切片放入蘇木精液中染色5分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)紫色。染色后，用流水沖洗10分鐘或在0.5%鹽酸乙醇中分化30秒，以去除多余的蘇木精染料，使細(xì)胞核染色更加清晰。再用蒸餾水稍洗30秒，去除殘留的鹽酸乙醇。然后，將切片放入0.5%伊紅液中染色1-3分鐘，使細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色。染色完成后，用蒸餾水稍洗30秒，80%乙醇稍洗30秒，95%乙醇（Ⅰ）中浸泡1分鐘，95%乙醇（Ⅱ）中浸泡1分鐘，無水乙醇（Ⅰ）中浸泡3分鐘，無水乙醇（Ⅱ）中浸泡3分鐘，進(jìn)行脫水。最后，將切片放入二甲苯（Ⅰ）中浸泡3分鐘，二甲苯（Ⅱ）中浸泡3分鐘，進(jìn)行透明處理，然后用中性樹膠封固。通過顯微鏡觀察HE染色結(jié)果，在正常小鼠肝臟組織切片中，肝細(xì)胞排列整齊，呈多邊形，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色。肝竇結(jié)構(gòu)清晰，肝星狀細(xì)胞位于肝竇周Disse腔內(nèi)，數(shù)量較少，形態(tài)呈梭形或不規(guī)則形，細(xì)胞核較小，染色較深，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見少量脂滴。而在小鼠肝癌組織切片中，可見癌細(xì)胞呈巢狀或條索狀排列，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，大小不一，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯，可見病理性核分裂象。肝癌組織中的肝星狀細(xì)胞數(shù)量明顯增多，形態(tài)也發(fā)生了變化，細(xì)胞體積增大，突起增多且變長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴減少，部分細(xì)胞的細(xì)胞核也變得更加不規(guī)則。在癌組織周邊區(qū)域，肝星狀細(xì)胞的數(shù)量也顯著增加，且呈現(xiàn)出向癌組織內(nèi)浸潤(rùn)的趨勢(shì)。4.1.2免疫組織化學(xué)染色原理與應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistrystaining）簡(jiǎn)稱免疫組化，是應(yīng)用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)，使標(biāo)記了抗體的顯色劑顯色，從而確定人體組織細(xì)胞內(nèi)的抗原，對(duì)抗原進(jìn)行定位、定性以及定量的研究。目前常用的免疫組織化學(xué)染色技術(shù)包括免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)以及免疫膠體金技術(shù)等。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是用熒光素標(biāo)記抗體，與組織或細(xì)胞中的抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察熒光的分布和強(qiáng)度，從而確定抗原的位置和含量。免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)則是用酶標(biāo)記抗體，與抗原結(jié)合后，通過酶催化底物顯色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察顏色反應(yīng)，以確定抗原的存在。免疫膠體金技術(shù)是用膠體金標(biāo)記抗體，與抗原結(jié)合后，在電子顯微鏡下觀察金顆粒的分布，可進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)水平的抗原定位。在檢測(cè)肝星狀細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)方面，免疫組化具有重要應(yīng)用。肝星狀細(xì)胞的標(biāo)志物主要包括α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、結(jié)蛋白（desmin）等。α-SMA是肝星狀細(xì)胞活化的重要標(biāo)志，在活化的肝星狀細(xì)胞中表達(dá)明顯增加。結(jié)蛋白也在肝星狀細(xì)胞中特異性表達(dá)。通過免疫組化染色，可以清晰地顯示肝星狀細(xì)胞在肝臟組織中的分布和數(shù)量，以及α-SMA、desmin等標(biāo)志物的表達(dá)情況。在小鼠肝癌微環(huán)境中，利用免疫組化染色可以研究肝星狀細(xì)胞的活化狀態(tài)，以及其與肝癌細(xì)胞之間的相互關(guān)系。若α-SMA在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，表明肝星狀細(xì)胞處于活化狀態(tài)，可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。4.1.3染色結(jié)果的圖像分析與量化處理利用圖像分析軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，能夠更準(zhǔn)確地得出肝星狀細(xì)胞數(shù)量變化的數(shù)據(jù)。本研究選用Image-ProPlus軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行分析。首先，在顯微鏡下采集染色切片的圖像，確保圖像清晰、完整，且采集條件一致，包括顯微鏡的放大倍數(shù)、光源強(qiáng)度、曝光時(shí)間等。然后，將采集到的圖像導(dǎo)入Image-ProPlus軟件中。在軟件中，通過“圖像類型”選擇將彩色圖像轉(zhuǎn)換為灰度圖像，以便后續(xù)處理。接著，使用閾值分割算法對(duì)灰度圖像進(jìn)行二值化處理，將肝星狀細(xì)胞與背景區(qū)分開來。在設(shè)置閾值時(shí)，需要根據(jù)染色結(jié)果的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整，確保肝星狀細(xì)胞的陽性區(qū)域被準(zhǔn)確識(shí)別。提取肝星狀細(xì)胞的陽性區(qū)域后，軟件可以自動(dòng)計(jì)算陽性區(qū)域的像素面積、平均灰度值、光密度值等參數(shù)。對(duì)于肝星狀細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，可以通過計(jì)算陽性區(qū)域的數(shù)量來實(shí)現(xiàn)。為了提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)每個(gè)樣本的多個(gè)視野進(jìn)行圖像采集和分析，然后計(jì)算平均值。通過對(duì)正常小鼠肝臟組織和小鼠肝癌組織的免疫組化染色圖像進(jìn)行分析，對(duì)比兩組樣本中肝星狀細(xì)胞的數(shù)量、陽性區(qū)域面積、平均灰度值等參數(shù)，從而得出肝星狀細(xì)胞在小鼠肝癌微環(huán)境中的數(shù)量變化情況。若肝癌組織中肝星狀細(xì)胞的數(shù)量明顯高于正常肝臟組織，陽性區(qū)域面積和平均灰度值也顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了在肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞的數(shù)量增多且活化程度增強(qiáng)。4.2數(shù)據(jù)分析與討論4.2.1肝星狀細(xì)胞在不同區(qū)域的分布特點(diǎn)通過對(duì)小鼠肝癌組織的病理學(xué)染色分析，我們清晰地觀察到肝星狀細(xì)胞在腫瘤核心、邊緣及癌旁組織呈現(xiàn)出明顯的分布差異。在腫瘤核心區(qū)域，肝星狀細(xì)胞的分布相對(duì)較為密集。這可能是因?yàn)槟[瘤核心區(qū)域存在著大量的缺氧、炎癥等微環(huán)境因素，這些因素能夠強(qiáng)烈地刺激肝星狀細(xì)胞的活化和聚集。缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等，這些因子能夠吸引肝星狀細(xì)胞向腫瘤核心遷移，并促進(jìn)其活化。腫瘤細(xì)胞釋放的活性氧（ROS）也會(huì)對(duì)肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生刺激，使其在腫瘤核心區(qū)域大量積聚。在腫瘤邊緣，肝星狀細(xì)胞的分布相對(duì)核心區(qū)域有所減少，但仍然保持較高的數(shù)量。腫瘤邊緣是腫瘤細(xì)胞與正常組織相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，肝星狀細(xì)胞在此處的分布可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。肝星狀細(xì)胞在腫瘤邊緣能夠分泌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），為腫瘤細(xì)胞的遷移提供支撐結(jié)構(gòu)。它們還能分泌一些蛋白酶，降解周圍組織的基質(zhì)，幫助腫瘤細(xì)胞突破組織屏障，向周圍組織浸潤(rùn)。在癌旁組織中，肝星狀細(xì)胞的分布相對(duì)較少，接近正常肝臟組織的水平。然而，與正常肝臟組織相比，癌旁組織中的肝星狀細(xì)胞仍處于相對(duì)活化的狀態(tài)。這可能是因?yàn)榘┡越M織受到腫瘤的影響，存在一定程度的炎癥和微環(huán)境改變，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞的活化。腫瘤細(xì)胞釋放的炎癥因子和代謝產(chǎn)物可以擴(kuò)散到癌旁組織，刺激肝星狀細(xì)胞的活化。癌旁組織中的免疫系統(tǒng)也可能被激活，釋放一些細(xì)胞因子，影響肝星狀細(xì)胞的功能和分布。4.2.2肝癌發(fā)展進(jìn)程中肝星狀細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化在肝癌發(fā)展進(jìn)程中，肝星狀細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)出明顯的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。在肝癌發(fā)生的早期階段，隨著肝臟組織的損傷和炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)，肝星狀細(xì)胞開始逐漸活化并增殖，其數(shù)量呈現(xiàn)出緩慢上升的趨勢(shì)。此時(shí)，肝星狀細(xì)胞的活化主要是對(duì)肝臟損傷的一種防御反應(yīng)，它們通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子，試圖修復(fù)受損的組織。隨著肝癌的進(jìn)一步發(fā)展，肝星狀細(xì)胞的數(shù)量迅速增加。在腫瘤形成和生長(zhǎng)階段，腫瘤細(xì)胞釋放的多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如TGF-β、PDGF、VEGF等，能夠強(qiáng)烈地刺激肝星狀細(xì)胞的活化和增殖。TGF-β可以通過激活Smad信號(hào)通路，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖和ECM的合成。PDGF則可以刺激肝星狀細(xì)胞的遷移和增殖，使其向腫瘤部位聚集。這些細(xì)胞因子的作用使得肝星狀細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中大量積聚，數(shù)量急劇上升。到了肝癌晚期，肝星狀細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到峰值。此時(shí)，肝星狀細(xì)胞不僅數(shù)量眾多，而且其活化程度也非常高。它們持續(xù)分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝臟組織的纖維化程度加重，進(jìn)一步影響肝臟的功能。肝星狀細(xì)胞還會(huì)分泌一些促血管生成因子，如VEGF等，促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在肝癌發(fā)展進(jìn)程中，肝星狀細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。肝星狀細(xì)胞數(shù)量的增加可能是肝癌發(fā)展的一個(gè)重要標(biāo)志，其數(shù)量的變化可以作為評(píng)估肝癌病情進(jìn)展的一個(gè)潛在指標(biāo)。4.2.3分布與數(shù)量變化對(duì)肝癌微環(huán)境的影響肝星狀細(xì)胞在小鼠肝癌微環(huán)境中的分布和數(shù)量變化對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及免疫微環(huán)境產(chǎn)生了多方面的影響。在腫瘤生長(zhǎng)方面，肝星狀細(xì)胞的增多和活化會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。肝星狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)為腫瘤細(xì)胞提供了物理支撐，使其能夠更好地附著和增殖。肝星狀細(xì)胞還能分泌多種生長(zhǎng)因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）等，這些因子可以刺激腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。HGF可以通過激活其受體c-Met，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。IGF則可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存能力。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，肝星狀細(xì)胞的分布和數(shù)量變化起到了重要的促進(jìn)作用。在腫瘤邊緣，肝星狀細(xì)胞通過分泌蛋白酶，降解周圍組織的基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移開辟道路。它們還能分泌一些細(xì)胞因子，如趨化因子，吸引腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤(rùn)。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，肝星狀細(xì)胞可以與腫瘤細(xì)胞相互作用，形成腫瘤微環(huán)境中的“前轉(zhuǎn)移龕”，為腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供有利條件。在免疫微環(huán)境方面，肝星狀細(xì)胞的分布和數(shù)量變化對(duì)免疫細(xì)胞的功能產(chǎn)生了顯著影響。肝星狀細(xì)胞可以分泌多種免疫調(diào)節(jié)分子，如IL-6、IL-10、TGF-β等，這些分子可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和功能。IL-6可以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)也能抑制自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性。IL-10是一種免疫抑制因子，能夠抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能，促進(jìn)免疫耐受的形成。TGF-β則可以抑制T細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化，從而抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。肝星狀細(xì)胞還可以通過與免疫細(xì)胞直接接觸，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。它們可以表達(dá)一些表面分子，如程序性死亡配體1（PD-L1），與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的活性。肝星狀細(xì)胞在小鼠肝癌微環(huán)境中的分布和數(shù)量變化對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和免疫微環(huán)境產(chǎn)生了重要影響，深入研究這些影響機(jī)制對(duì)于肝癌的防治具有重要意義。五、肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)分子表達(dá)研究5.1免疫調(diào)節(jié)分子的篩選與確定5.1.1基于文獻(xiàn)的潛在免疫調(diào)節(jié)分子梳理通過對(duì)大量相關(guān)文獻(xiàn)的綜合分析，發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中可能分泌多種具有免疫調(diào)節(jié)活性的分子，這些分子在肝癌的發(fā)生發(fā)展以及機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞因子方面，白細(xì)胞介素-6（IL-6）是一種多效性細(xì)胞因子，在肝癌微環(huán)境中，肝星狀細(xì)胞分泌的IL-6水平顯著升高。IL-6可以通過激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。IL-6還能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的數(shù)量，從而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。白細(xì)胞介素-10（IL-10）是一種重要的免疫抑制細(xì)胞因子。肝星狀細(xì)胞分泌的IL-10可以抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）的功能，降低它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。IL-10還能抑制炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和免疫逃逸創(chuàng)造有利條件。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）也是肝星狀細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一。TGF-β具有強(qiáng)大的免疫抑制作用，它可以抑制T細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化。TGF-β還能抑制DC的成熟和功能，降低其抗原提呈能力，從而削弱機(jī)體的免疫監(jiān)視功能。在肝癌微環(huán)境中，TGF-β還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。趨化因子方面，CC趨化因子配體2（CCL2），也稱為單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1），能夠吸引單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞向肝癌微環(huán)境中募集。在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，肝星狀細(xì)胞分泌的CCL2增加，導(dǎo)致大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤組織中。然而，這些浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞在CCL2的作用下，可能會(huì)被腫瘤細(xì)胞利用，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。例如，CCL2可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，M2型巨噬細(xì)胞具有免疫抑制功能，能夠分泌多種促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成的細(xì)胞因子。CC趨化因子配體5（CCL5），又稱調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子（RANTES），在肝癌微環(huán)境中也發(fā)揮著重要作用。肝星狀細(xì)胞分泌的CCL5可以招募T細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC等免疫細(xì)胞到腫瘤部位。但同時(shí)，CCL5也可以通過與腫瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。CCL5還能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，影響機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。5.1.2初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與關(guān)鍵分子篩選為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述潛在免疫調(diào)節(jié)分子在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)情況，并篩選出關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)分子，進(jìn)行了一系列的初步實(shí)驗(yàn)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)肝星狀細(xì)胞中IL-6、IL-10、TGF-β、CCL2、CCL5等分子的mRNA表達(dá)水平。從建模成功的小鼠肝臟中分離得到肝星狀細(xì)胞，提取其總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)各分子的特異性引物進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。在引物設(shè)計(jì)上，遵循引物長(zhǎng)度為18-26bp，G+C含量在40%-60%之間，避免引物自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)以及引物之間的互補(bǔ)配對(duì)等原則。通過比較不同分子mRNA的相對(duì)表達(dá)量，初步確定在肝星狀細(xì)胞中高表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)分子。結(jié)果顯示，IL-6、IL-10、TGF-β、CCL2、CCL5的mRNA在肝星狀細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)，其中IL-6、TGF-β和CCL2的表達(dá)水平相對(duì)較高。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)上清液中這些免疫調(diào)節(jié)分子的蛋白表達(dá)水平。將分離培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)一定時(shí)間后收集上清液。按照ELISA試劑盒的操作說明書，依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、酶標(biāo)抗體等試劑，經(jīng)過孵育、洗滌、顯色等步驟后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各分子的蛋白濃度。ELISA結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了IL-6、TGF-β和CCL2在肝星狀細(xì)胞中的高表達(dá)。綜合RT-qPCR和ELISA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，篩選出IL-6、TGF-β和CCL2作為后續(xù)深入研究的關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)分子。這些分子在肝星狀細(xì)胞中的高表達(dá)以及在肝癌免疫調(diào)節(jié)中的重要作用，使其成為研究肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為進(jìn)一步探究其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。5.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析5.2.1RNA提取與反轉(zhuǎn)錄從肝星狀細(xì)胞中提取RNA時(shí)，先將培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞用PBS沖洗3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)液。然后，按照RNA提取試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作。向細(xì)胞中加入適量的裂解液，充分裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA釋放出來。裂解過程中，可使用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。接著，加入氯仿進(jìn)行抽提，劇烈振蕩15秒，使溶液充分乳化。氯仿可以使蛋白質(zhì)變性，從而與RNA分離。室溫靜置5分鐘后，12000g4℃離心15分鐘，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無色的含RNA的水相，中層為白色的蛋白質(zhì)層，下層為有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，注意不要吸到中間的蛋白質(zhì)層和下層的有機(jī)相，以免污染RNA。向上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻，在15-30℃下靜置10分鐘，使RNA沉淀。12000g4℃離心10分鐘，離心后，試管底部會(huì)出現(xiàn)白色的RNA沉淀。小心棄去上清液，緩慢沿離心管壁加入75%的乙醇（用DEPC-Water配制）1ml，輕輕上下顛倒洗滌離心管壁，12000g4℃離心5分鐘后小心棄去乙醇。為了更好地控制RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇。室溫干燥沉淀2-5分鐘，注意不要離心或加熱干燥，否則RNA將會(huì)很難溶解。最后，加入適量的Rnase-free水溶解沉淀，必要時(shí)可以用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。提取到RNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在Microtube管中配制下列混合液：DntpMixture（10Mmeach）1μl、OligoDtPrimer（2.5uM）1μl、TotalRNA5μl、RnaseFreedH2OUpto10μl。將混合液在PCR儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)，65℃5分鐘，4℃保存。變性、退火操作有利于模板RNA的變性以及反轉(zhuǎn)錄引物和模板的特異性退火，可提高反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率。離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底。在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：上述變性、退火后的反應(yīng)液10μl、5PrimeScriptTMBuffer4μl、RnaseInhibitor（40U/μl）0.5μl、PrimeScriptTMRtase（for2Step）0.5μl、RnaseFreeDh2O5μl，總體積為20μl（反轉(zhuǎn)錄的體系也可做成40μl）。將配制好的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液在PCR儀上按42-50℃15-30分鐘，95℃5分鐘，4℃的條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。5.2.2引物設(shè)計(jì)與反應(yīng)體系建立引物設(shè)計(jì)遵循一系列原則。引物長(zhǎng)度一般為18-26bp，可放寬至18-30bp，有研究表明超過30bp再增加引物長(zhǎng)度意義不大。本研究中，針對(duì)關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)分子IL-6、TGF-β和CCL2設(shè)計(jì)引物時(shí)，將引物長(zhǎng)度設(shè)定在20-25bp之間。引物的G+C含量以40%-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。如IL-6引物的G+C含量控制在45%左右。引物的Tm值在54-58℃，可放寬至52-62℃，GC%＞60%時(shí)可進(jìn)一步放寬。引物3′端優(yōu)選三聯(lián)體WSS、SWS、TTS，二連體GC，單體S，盡量規(guī)避WWW、CGW、GGG、CG。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物的5′端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系主要由寡核苷酸（引物）、4種dNTP、TaqDNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反應(yīng)緩沖液體系組成。在本實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)體系總體積為20μl，其中包含2×SYBRGreenMasterMix10μl，上下游引物（10μM）各0.5μl，cDNA模板1μl，Rnase-free水8μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。在反應(yīng)過程中，通過熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，記錄每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度，從而分析免疫調(diào)節(jié)分子基因的表達(dá)水平。5.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，得到了IL-6、TGF-β和CCL2等免疫調(diào)節(jié)分子基因在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)數(shù)據(jù)。以正常小鼠肝臟組織中肝星狀細(xì)胞的基因表達(dá)水平為對(duì)照，計(jì)算肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞中各基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞的IL-6基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，相對(duì)表達(dá)量約為正常對(duì)照組的5倍。這表明在肝癌微環(huán)境中，肝星狀細(xì)胞分泌IL-6的能力增強(qiáng)，IL-6可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β基因的表達(dá)水平也明顯升高，相對(duì)表達(dá)量約為正常對(duì)照組的3.5倍。TGF-β作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子和促纖維化因子，其表達(dá)的增加可能與肝癌微環(huán)境中的免疫抑制和纖維化進(jìn)程密切相關(guān)。CCL2基因的表達(dá)水平同樣顯著升高，相對(duì)表達(dá)量約為正常對(duì)照組的4倍。CCL2可以招募免疫細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境中，其表達(dá)的增加可能會(huì)影響腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的組成和功能，進(jìn)而影響肝癌的發(fā)展。為了進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，上述基因表達(dá)水平的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的可信度。這些結(jié)果為深入研究肝星狀細(xì)胞在小鼠肝癌微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)活性提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步探究IL-6、TGF-β和CCL2等免疫調(diào)節(jié)分子在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。5.3Westernblot檢測(cè)5.3.1蛋白提取與定量從細(xì)胞中提取蛋白時(shí)，若選用貼壁細(xì)胞，首先小心倒掉細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)皿側(cè)壁緩慢加入預(yù)冷的PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，以清洗細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基，此步驟重復(fù)2-3次。清洗完畢后，將培養(yǎng)皿傾斜放置，用移液槍盡量吸干殘余的PBS。向培養(yǎng)皿中加入適量預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，一般6孔板每孔加入150-200μl裂解液。加入裂解液后，反復(fù)晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使裂解液充分覆蓋細(xì)胞，然后用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，收集至離心管中。將離心管置于冰上裂解30分鐘，期間可每隔5-10分鐘輕輕振蕩一次，以確保細(xì)胞充分裂解。裂解完成后，12000g4℃離心15分鐘，取上清液，即為提取的總蛋白。若使用組織樣本，先將組織用預(yù)冷的PBS沖洗，去除表面的血液和雜質(zhì)。用濾紙吸干組織表面的水分，將組織剪碎成小塊，放入勻漿器中。向勻漿器中加入適量預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，一般每100mg組織加入1ml裂解液。在冰上進(jìn)行勻漿操作，直至組織完全裂解成勻漿狀。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000g4℃離心15分鐘，取上清液，得到組織總蛋白。蛋白定量采用BCA法。首先配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）用PBS稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，如0、25、50、100、200、400、600、800μg/ml。取96孔板，分別加入20μl不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液和20μl待測(cè)蛋白樣品。向每孔中加入200μlBCA工作液，輕輕混勻。將96孔板置于37℃孵育30分鐘，使反應(yīng)充分進(jìn)行。用酶標(biāo)儀測(cè)定562nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)蛋白樣品的濃度。5.3.2電泳、轉(zhuǎn)膜與抗體孵育SDS-PAGE電泳前，先配制分離膠和濃縮膠。對(duì)于分離膠，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適的丙烯酰胺濃度，一般10%-15%的丙烯酰胺用于分離分子量在25-150kDa的蛋白。以配制10%的分離膠為例，依次加入適量的蒸餾水、30%丙烯酰胺溶液、1.5MTris-HCl（pH8.8）、10%SDS、10%過硫酸銨（APS）和四甲基乙二胺（TEMED），迅速混勻后倒入玻璃板之間，留出濃縮膠的空間，然后在膠液表面覆蓋一層水飽和異丁醇，待分離膠凝固。倒掉異丁醇，用蒸餾水沖洗分離膠表面，吸干水分。配制濃縮膠，依次加入適量的蒸餾水、30%丙烯酰胺溶液、1.0MTris-HCl（pH6.8）、10%SDS、10%APS和TEMED，混勻后倒入分離膠上方，插入梳子，待濃縮膠凝固。將提取的蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品加入上樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳槽中加入電泳緩沖液，接通電源，先以80V的電壓進(jìn)行電泳，當(dāng)?shù)鞍譓arker進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠的底部，停止電泳。轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)法。將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其充分活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10-15分鐘。同時(shí)，將濾紙也浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中。電泳結(jié)束后，小心取出凝膠，將濃縮膠切除，只保留分離膠。按照“負(fù)極（黑色）-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極（紅色）”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，每層之間用玻璃棒輕輕搟壓，排除氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入足量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以200mA的電流轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)，對(duì)于分子量較大的蛋白，可適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂牛奶的TBST溶液中，在搖床上室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，用TBST溶液洗滌膜3次，每次10分鐘。將膜放入一抗稀釋液中，一抗按照1:1000-1:5000的比例用5%脫脂牛奶稀釋，4℃孵育過夜。第二天，取出膜，用TBST溶液洗滌3次，每次10分鐘。將膜放入二抗稀釋液中，二抗按照1:5000-1:10000的比例用5%脫脂牛奶稀釋，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用TBST溶液洗滌膜3次，每次10分鐘。5.3.3結(jié)果呈現(xiàn)與分析使用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。將A液和B液按照1:1的比例混合，得到ECL工作液。將PVDF膜從TBST溶液中取出，用濾紙吸干表面的液體，然后將ECL工作液均勻地滴在膜上，確保膜完全被覆蓋。室溫孵育1-2分鐘，使化學(xué)發(fā)光反應(yīng)充分進(jìn)行。將膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀中，進(jìn)行曝光成像。在成像結(jié)果中，可觀察到不同分子量的蛋白條帶。通過與蛋白Marker對(duì)比，確定目的蛋白條帶的位置。分析免疫調(diào)節(jié)分子蛋白表達(dá)水平變化時(shí)，以β-actin作為內(nèi)參蛋白。使用圖像分析軟件，如ImageJ，對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。計(jì)算目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。與正常對(duì)照組相比，若肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞的IL-6蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，說明IL-6在肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)。同理，分析TGF-β和CCL2等免疫調(diào)節(jié)分子的蛋白表達(dá)水平變化。若TGF-β和CCL2的蛋白相對(duì)表達(dá)量也明顯升高，表明這些免疫調(diào)節(jié)分子在肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)過程中可能發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果相互印證，進(jìn)一步揭示了肝星狀細(xì)胞在小鼠肝癌微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)分子表達(dá)變化情況。六、肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性對(duì)小鼠肝癌發(fā)展及預(yù)后的影響6.1臨床與病理資料收集6.1.1小鼠肝癌病例信息整理本研究收集了一系列小鼠肝癌病例信息，這些信息涵蓋了多個(gè)關(guān)鍵方面，為深入研究肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性與小鼠肝癌發(fā)展及預(yù)后的關(guān)聯(lián)提供了全面的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在小鼠基本信息方面，詳細(xì)記錄了小鼠的品系為C57BL/J6，該品系小鼠具有遺傳背景清晰、個(gè)體差異小等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤研究中應(yīng)用廣泛，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。同時(shí)，記錄了小鼠的年齡，均為6-8周齡，這個(gè)年齡段的小鼠身體機(jī)能較為穩(wěn)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)處理的反應(yīng)相對(duì)一致，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。小鼠的性別也被納入記錄范疇，因?yàn)樾詣e可能會(huì)對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生一定影響。本研究中使用的小鼠性別比例保持均衡，以避免性別因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方面，記錄了建模方式為亞甲基四氫葉酸腹腔注射。亞甲基四氫葉酸參與嘌呤的從頭合成和細(xì)胞DNA復(fù)制，其異常代謝與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。按照100mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射，每周注射2次，連續(xù)注射8周。詳細(xì)記錄建模過程中的各項(xiàng)參數(shù)，有助于準(zhǔn)確評(píng)估肝癌模型的建立效果以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。觀察時(shí)間也被精確記錄，從建模開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，持續(xù)觀察小鼠的生長(zhǎng)狀況、體重變化、飲食情況、精神狀態(tài)等。在觀察期間，每天對(duì)小鼠進(jìn)行詳細(xì)的記錄，及時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠的異常情況，并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的處理。若小鼠出現(xiàn)體重減輕、毛發(fā)粗糙、精神萎靡、活動(dòng)減少等癥狀，提示可能存在肝癌的發(fā)生發(fā)展。小鼠肝癌的發(fā)病情況也是重要的記錄內(nèi)容。通過觀察小鼠的外觀癥狀、觸摸腹部是否有腫塊以及進(jìn)行病理切片檢查等方法，確定小鼠是否發(fā)病。記錄發(fā)病時(shí)間，有助于分析肝癌的發(fā)展進(jìn)程。對(duì)于發(fā)病的小鼠，進(jìn)一步記錄腫瘤的大小、位置、形態(tài)等信息，這些信息對(duì)于評(píng)估肝癌的嚴(yán)重程度和治療效果具有重要意義。6.1.2相關(guān)病理學(xué)指標(biāo)記錄對(duì)小鼠肝癌組織的腫瘤大小進(jìn)行精確測(cè)量，這是評(píng)估肝癌發(fā)展程度的重要指標(biāo)之一。使用游標(biāo)卡尺等精確測(cè)量工具，測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑、短徑和厚度。測(cè)量時(shí)，將小鼠處死后，迅速取出肝臟，將腫瘤組織完整分離。在測(cè)量過程中，確保測(cè)量工具的準(zhǔn)確性和測(cè)量方法的一致性，以保證數(shù)據(jù)的可靠性。通過對(duì)腫瘤大小的測(cè)量，可以直觀地了解肝癌的生長(zhǎng)情況，分析肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。若肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性較高，可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤體積增大。病理分期也是關(guān)鍵的病理學(xué)指標(biāo)。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期系統(tǒng)，對(duì)小鼠肝癌進(jìn)行分期。TNM分期系統(tǒng)包括腫瘤的原發(fā)灶（T）、區(qū)域淋巴結(jié)（N）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M）三個(gè)方面。通過對(duì)腫瘤組織的病理切片觀察，確定腫瘤的大小、侵犯范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，從而準(zhǔn)確判斷病理分期。病理分期可以反映肝癌的發(fā)展階段，對(duì)于制定治療方案和評(píng)估預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義。早期肝癌患者的預(yù)后相對(duì)較好，而晚期肝癌患者的預(yù)后較差。肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性可能會(huì)影響肝癌的病理分期，通過對(duì)病理分期的分析，可以進(jìn)一步探究其在肝癌發(fā)展過程中的作用機(jī)制。組織學(xué)類型也是需要記錄的重要內(nèi)容。小鼠肝癌的組織學(xué)類型主要包括肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌和混合型肝癌等。通過對(duì)病理切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列方式，確定組織學(xué)類型。不同的組織學(xué)類型具有不同的生物學(xué)特性和預(yù)后。肝細(xì)胞癌是最常見的肝癌類型，其生長(zhǎng)速度較快，惡性程度較高。肝內(nèi)膽管癌的生長(zhǎng)相對(duì)較慢，但對(duì)化療和放療的敏感性較低?；旌闲透伟﹦t兼具肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管癌的特點(diǎn)。記錄組織學(xué)類型，有助于深入了解小鼠肝癌的生物學(xué)特性，分析肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性與不同組織學(xué)類型肝癌的關(guān)系。6.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法6.2.1數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)方法選擇在本研究中，采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)是一種常用的正態(tài)性檢