2025年生化實(shí)戰(zhàn)測(cè)試題及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30分）1.新型熱啟動(dòng)Taq酶通過(guò)抗體可逆結(jié)合活性中心實(shí)現(xiàn)溫度調(diào)控，其最適激活溫度通常為：A.55℃B.72℃C.95℃D.68℃2.某酶促反應(yīng)在底物濃度遠(yuǎn)低于Km時(shí)，加入競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化為：A.Vmax降低，Km不變B.Vmax不變，Km增大C.Vmax增大，Km降低D.Vmax降低，Km減小3.用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定mRNA表達(dá)水平的原位雜交技術(shù)中，探針標(biāo)記物首選：A.放射性同位素32PB.熒光素FITCC.生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)D.地高辛半抗原4.合成生物學(xué)中構(gòu)建人工代謝途徑時(shí)，為避免中間產(chǎn)物積累毒性，通常采用的策略是：A.過(guò)表達(dá)速率限制酶B.引入動(dòng)態(tài)調(diào)控元件（如轉(zhuǎn)錄調(diào)控開(kāi)關(guān)）C.敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑關(guān)鍵酶D.提高宿主菌膜通透性5.新型冠狀病毒變異株刺突蛋白S1亞基N端結(jié)構(gòu)域（NTD）出現(xiàn)K417N突變，為驗(yàn)證該突變是否影響與宿主受體ACE2的結(jié)合，最直接的實(shí)驗(yàn)方法是：A.酵母雙雜交B.表面等離子共振（SPR）C.免疫共沉淀（Co-IP）D.熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)6.工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸時(shí)，若發(fā)酵液pH持續(xù)低于6.0且菌體生物量異常升高，最可能的原因是：A.溶氧不足導(dǎo)致乳酸積累B.生物素添加過(guò)量促進(jìn)菌體生長(zhǎng)C.磷酸緩沖體系失效D.谷氨酸脫羧酶被激活7.蛋白質(zhì)晶體學(xué)中，使用同步輻射X射線衍射收集數(shù)據(jù)時(shí)，晶體冷凍保護(hù)劑的主要作用是：A.防止晶體脫水B.減少輻射損傷C.提高衍射分辨率D.增強(qiáng)晶體對(duì)稱(chēng)性8.基因編輯技術(shù)中，CRISPR-Cas12a相較于Cas9的優(yōu)勢(shì)不包括：A.切割后產(chǎn)生粘性末端B.對(duì)PAM序列要求更寬松（TTTV）C.可同時(shí)加工多個(gè)gRNA前體D.脫靶率更低9.檢測(cè)環(huán)境樣本中未知病原微生物時(shí)，宏基因組測(cè)序（mNGS）的關(guān)鍵步驟不包括：A.樣本核酸提?。ㄈコ拗鱀NA/RNA）B.隨機(jī)引物擴(kuò)增C.數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)（如NCBIRefSeq）D.熒光定量PCR驗(yàn)證10.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）中，若包被抗原濃度過(guò)高導(dǎo)致非特異性結(jié)合增強(qiáng)，應(yīng)采取的優(yōu)化措施是：A.延長(zhǎng)封閉時(shí)間B.降低包被緩沖液pHC.減少洗滌次數(shù)D.稀釋抗原至線性范圍11.原核生物轉(zhuǎn)錄終止時(shí)，ρ因子的作用機(jī)制是：A.識(shí)別終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)并水解ATP解離轉(zhuǎn)錄復(fù)合物B.與RNA聚合酶α亞基結(jié)合終止延伸C.結(jié)合mRNA3’端poly(A)尾阻礙核糖體結(jié)合D.促進(jìn)RNA-DNA雜合鏈解旋12.蛋白質(zhì)定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)中，為提高突變庫(kù)多樣性，常用的方法是：A.易錯(cuò)PCR（error-pronePCR）B.重疊延伸PCR（SOE-PCR）C.反向PCR（reversePCR）D.實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）13.生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）操作高致病性病原微生物時(shí)，必須配備的防護(hù)設(shè)備是：A.正壓防護(hù)服B.Ⅱ級(jí)生物安全柜C.自動(dòng)高壓滅菌器D.紫外消毒燈14.代謝組學(xué)研究中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析前處理需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，主要目的是：A.提高揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性B.增強(qiáng)離子化效率C.增加色譜保留時(shí)間D.減少基質(zhì)干擾15.單克隆抗體制備過(guò)程中，雜交瘤細(xì)胞篩選常用HAT培養(yǎng)基，其作用機(jī)制是阻斷：A.嘌呤從頭合成途徑B.嘧啶補(bǔ)救合成途徑C.氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)D.糖酵解關(guān)鍵酶二、簡(jiǎn)答題（每題8分，共40分）1.簡(jiǎn)述WesternBlot實(shí)驗(yàn)中“轉(zhuǎn)膜”步驟的關(guān)鍵參數(shù)控制及失敗原因分析。2.設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證某新型抗菌肽（AMP）的作用機(jī)制是破壞細(xì)菌細(xì)胞膜完整性（要求寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)方法、預(yù)期結(jié)果及對(duì)照組設(shè)置）。3.比較原核生物（大腸桿菌）與真核生物（酵母）在DNA復(fù)制起始階段的差異（從起始位點(diǎn)識(shí)別、參與蛋白、復(fù)制叉數(shù)量三方面回答）。4.某實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pET-28a（含T7啟動(dòng)子、Kan抗性基因）出現(xiàn)降解，電泳顯示條帶模糊且有彌散，分析可能原因并提出解決方案。5.解釋“代謝工程中的途徑平衡”概念，并舉例說(shuō)明如何通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控實(shí)現(xiàn)平衡（要求具體到調(diào)控元件和操作方法）。三、案例分析題（每題15分，共30分）案例1：2025年3月，某生物制藥廠在生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞提供素（rhEPO）時(shí)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中目標(biāo)蛋白表達(dá)量?jī)H為預(yù)期的30%，且SDS顯示條帶位置略高于標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品分子量約34kDa，檢測(cè)條帶約36kDa）。經(jīng)檢測(cè)，工程菌（CHO細(xì)胞）生長(zhǎng)曲線正常，培養(yǎng)基成分無(wú)異常。（1）分析可能導(dǎo)致表達(dá)量低的原因（至少3點(diǎn)）；（2）推測(cè)條帶偏移的可能機(jī)制；（3）提出驗(yàn)證條帶偏移原因的實(shí)驗(yàn)方案（要求具體技術(shù)手段）。案例2：某邊境口岸檢測(cè)到一批來(lái)自熱帶地區(qū)的冷凍海產(chǎn)品，樣本經(jīng)初步檢測(cè)顯示細(xì)菌總數(shù)超標(biāo)（10?CFU/g），且16SrRNA測(cè)序提示存在未知革蘭氏陰性菌（與已知致病菌株同源性78%）。需完成以下任務(wù)：（1）設(shè)計(jì)該未知菌的生物安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估流程（包括關(guān)鍵指標(biāo)）；（2）若需確定其是否為新病原體，應(yīng)進(jìn)行哪些實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（要求結(jié)合柯赫法則）；（3）提出樣本運(yùn)輸及實(shí)驗(yàn)室操作的生物安全防護(hù)要求（依據(jù)WHO《實(shí)驗(yàn)室生物風(fēng)險(xiǎn)管理手冊(cè)》）。答案--一、單項(xiàng)選擇題1.C（熱啟動(dòng)酶通常在95℃變性階段抗體解離，激活酶活性）2.B（競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)活性中心，Km增大，Vmax不變）3.D（地高辛半抗原無(wú)內(nèi)源性干擾，檢測(cè)靈敏度高，適用于原位雜交）4.B（動(dòng)態(tài)調(diào)控元件可根據(jù)中間產(chǎn)物濃度自動(dòng)調(diào)節(jié)酶表達(dá)，避免積累）5.B（SPR可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間結(jié)合動(dòng)力學(xué)，直接測(cè)定親和力）6.B（生物素過(guò)量促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，消耗更多碳源用于細(xì)胞增殖而非谷氨酸合成）7.B（冷凍至-173℃可顯著降低X射線引起的自由基損傷）8.D（Cas12a脫靶率與Cas9無(wú)顯著差異，優(yōu)勢(shì)在于粘性末端和多gRNA加工）9.B（mNGS無(wú)需擴(kuò)增，直接測(cè)序避免偏好性）10.D（抗原濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致包被過(guò)飽和，非特異性結(jié)合增加，需稀釋至線性范圍）11.A（ρ因子通過(guò)ATP酶活性沿RNA移動(dòng)，解離RNA-DNA雜合鏈）12.A（易錯(cuò)PCR通過(guò)改變dNTP比例或添加Mn2+提高突變率）13.B（BSL-3必須使用Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)生物安全柜，正壓防護(hù)服為BSL-4要求）14.A（衍生化（如硅烷化）可將極性代謝物轉(zhuǎn)化為非極性，提高GC分離效率）15.A（HAT培養(yǎng)基中氨基蝶呤阻斷從頭合成，細(xì)胞需通過(guò)HGPRT（補(bǔ)救途徑）合成嘌呤，未融合的骨髓瘤細(xì)胞缺乏HGPRT死亡）二、簡(jiǎn)答題1.轉(zhuǎn)膜關(guān)鍵參數(shù)：電流/電壓：濕轉(zhuǎn)通常100V恒壓1-2h，半干轉(zhuǎn)15V恒壓30-60min；時(shí)間：與蛋白分子量相關(guān)（大蛋白需延長(zhǎng)時(shí)間）；緩沖液：含20%甲醇（促進(jìn)蛋白與NC膜結(jié)合），pH8.3；膜類(lèi)型：NC膜（低分子量）或PVDF膜（高分子量，需甲醇活化）。失敗原因：條帶模糊：電流過(guò)大導(dǎo)致產(chǎn)熱，蛋白擴(kuò)散；轉(zhuǎn)膜不全：分子量＞100kDa未用高分子量轉(zhuǎn)膜緩沖液（含SDS）；膜上無(wú)條帶：膜與膠方向顛倒（膠在陰極，膜在陽(yáng)極）；背景高：緩沖液甲醇濃度過(guò)高（＞25%）導(dǎo)致膠收縮，蛋白滯留。2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：（1）方法：熒光染色法：將細(xì)菌與AMP共孵育，加入碘化丙啶（PI，膜完整時(shí)不能進(jìn)入）和SYTO9（膜完整時(shí)著色），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PI陽(yáng)性率；電鏡觀察：透射電鏡觀察細(xì)菌細(xì)胞膜是否出現(xiàn)孔洞、破裂；胞內(nèi)物質(zhì)泄漏檢測(cè)：測(cè)定上清液中核酸（260nm吸光值）或ATP含量（熒光素酶法）。（2）預(yù)期結(jié)果：AMP處理組PI陽(yáng)性率、260nm吸光值及ATP含量顯著高于未處理對(duì)照組（P＜0.05），電鏡可見(jiàn)膜結(jié)構(gòu)破壞。（3）對(duì)照組：陰性對(duì)照：未加AMP的細(xì)菌懸液；陽(yáng)性對(duì)照：加入已知膜破壞劑（如十二烷基硫酸鈉SDS）的細(xì)菌懸液。3.復(fù)制起始差異：（1）起始位點(diǎn)識(shí)別：大腸桿菌識(shí)別OriC（含3個(gè)13bp重復(fù)序列和4個(gè)9bp重復(fù)序列），由DnaA蛋白結(jié)合；酵母識(shí)別ARS（自主復(fù)制序列，含A/T富集區(qū)和B1-B3元件），由ORC（復(fù)制起始復(fù)合物）結(jié)合。（2）參與蛋白：大腸桿菌需DnaA（識(shí)別位點(diǎn)）、DnaB（解旋酶）、DnaC（加載解旋酶）；酵母需ORC、Cdc6、Cdt1（加載Mcm解旋酶）。（3）復(fù)制叉數(shù)量：大腸桿菌單一起始位點(diǎn)，雙向復(fù)制形成2個(gè)復(fù)制叉；酵母多個(gè)起始位點(diǎn)（約400個(gè)），每個(gè)位點(diǎn)形成2個(gè)復(fù)制叉，總復(fù)制叉數(shù)量＞800。4.質(zhì)粒降解原因及解決：（1）可能原因：核酸酶污染：操作過(guò)程中未戴手套，引入外切酶（如DNaseI）；保存條件不當(dāng)：-20℃反復(fù)凍融導(dǎo)致斷裂；質(zhì)粒自身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：含重復(fù)序列或插入片段過(guò)大（＞10kb）易發(fā)生重組；轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細(xì)胞未滅活核酸酶：如使用未處理的大腸桿菌JM109（含endA1基因，編碼內(nèi)切酶）。（2）解決方案：優(yōu)化操作：使用無(wú)核酸酶的槍頭、離心管，操作前用75%乙醇擦拭臺(tái)面；保存質(zhì)粒：小份分裝（5-10μL/管），避免反復(fù)凍融；更換宿主菌：使用endA1缺陷型菌株（如DH5α、Top10）；若為結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，改用低拷貝質(zhì)粒（如pSC101）或刪除重復(fù)序列。5.代謝途徑平衡：指通過(guò)調(diào)控不同酶的表達(dá)水平，使代謝流在各分支途徑中分配合理，避免前體積累或產(chǎn)物不足。舉例：在大腸桿菌合成番茄紅素的途徑中，上游途徑（MEP途徑）的關(guān)鍵酶Dxs（1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶）和下游途徑（八氫番茄紅素合成酶CrtB、八氫番茄紅素脫氫酶CrtI）需協(xié)調(diào)表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)以下方法調(diào)控：?jiǎn)?dòng)子工程：為Dxs基因更換弱啟動(dòng)子（如J23106，強(qiáng)度為100），為CrtB和CrtI更換強(qiáng)啟動(dòng)子（如J23101，強(qiáng)度為1000），避免上游代謝物（IPP、DMAPP）積累；核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）優(yōu)化：通過(guò)RBS計(jì)算器調(diào)整CrtB和CrtI的RBS序列，使翻譯效率匹配；動(dòng)態(tài)調(diào)控：引入基于中間產(chǎn)物（如FPP）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控開(kāi)關(guān)（如LacI/IPTG系統(tǒng)），當(dāng)FPP濃度過(guò)高時(shí)抑制Dxs表達(dá)，降低上游代謝流。三、案例分析題案例1：（1）表達(dá)量低的可能原因：①目的基因轉(zhuǎn)錄效率低：T7啟動(dòng)子突變或宿主細(xì)胞（CHO）中T7RNA聚合酶表達(dá)量不足（需確認(rèn)是否共轉(zhuǎn)染T7聚合酶基因）；②翻譯水平抑制：mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)過(guò)強(qiáng)（如5’UTR存在穩(wěn)定莖環(huán)）阻礙核糖體結(jié)合；③蛋白分泌障礙：信號(hào)肽（如EPO天然信號(hào)肽）與CHO細(xì)胞分泌系統(tǒng)不兼容，導(dǎo)致蛋白滯留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；④蛋白酶降解：目標(biāo)蛋白在胞內(nèi)或培養(yǎng)基中被CHO細(xì)胞分泌的蛋白酶水解（可通過(guò)添加蛋白酶抑制劑驗(yàn)證）。（2）條帶偏移機(jī)制：可能是糖基化異常。rhEPO為糖蛋白（糖鏈占比約40%），正常含3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。若CHO細(xì)胞中糖基轉(zhuǎn)移酶（如β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶）表達(dá)不足，可能導(dǎo)致糖鏈延長(zhǎng)不完全（如唾液酸添加減少），分子量增加（異常糖鏈可能更大或電荷改變影響電泳遷移率）。（3）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案：①糖基化檢測(cè)：使用PNGaseF（N-糖基化酶）處理樣品，SDS觀察條帶是否恢復(fù)至34kDa（若恢復(fù)，說(shuō)明N-糖基化異常）；②質(zhì)譜分析：通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析糖肽，確定糖鏈組成（如唾液酸、半乳糖含量）；③實(shí)時(shí)定量PCR：檢測(cè)CHO細(xì)胞中糖基轉(zhuǎn)移酶（如ST3GAL3，唾液酸轉(zhuǎn)移酶）的mRNA表達(dá)水平，與正常細(xì)胞對(duì)比；④免疫熒光：用抗唾液酸抗體（如SNA，識(shí)別α2,6-連接唾液酸）標(biāo)記細(xì)胞，觀察高爾基體中糖鏈修飾情況。案例2：（1）生物安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估流程：①基本特性分析：革蘭氏染色（確認(rèn)陰性）、生長(zhǎng)條件（需氧/厭氧、最適溫度）、生化反應(yīng)（氧化酶、觸酶、API20E鑒定）；②毒力因子檢測(cè)：PCR篩查已知毒力基因（如內(nèi)毒素LPS合成基因、Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因）、全基因組測(cè)序（WGS）預(yù)測(cè)毒力島；③感染性實(shí)驗(yàn)：使用模式生物（如斑馬魚(yú)、小鼠）進(jìn)行半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定，觀察病理?yè)p傷；④傳播途徑評(píng)估：檢測(cè)是否通過(guò)消化道、呼吸道或接觸傳播（如菌毛、粘附素基因分析）；⑤防控難度：評(píng)估對(duì)抗生素敏感性（藥敏試驗(yàn)）、環(huán)境存活能力（干燥/低溫下存活時(shí)間）。（2）新病原體驗(yàn)證（柯赫法則）：①?gòu)幕疾∷拗鳎ㄈ粲校┲蟹蛛x該菌，純培養(yǎng)；②將純培養(yǎng)物接種健康模式生物（如小鼠），觀察是否出現(xiàn)相同癥狀；③從接種后發(fā)病的生物體內(nèi)重新分離該菌，確認(rèn)與原菌形態(tài)、基因一致；④補(bǔ)充分子柯赫法則：敲除推測(cè)的毒力基因后，菌株致病性消失；恢復(fù)該基因后，致病性恢復(fù)（需構(gòu)建基因敲除株）。（3）生物安全防護(hù)要求：①樣本運(yùn)輸：使用三層包裝（主