代謝組學(xué)生物樣本采集、前處理與數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化管理標(biāo)準(zhǔn)一、生物樣本采集規(guī)范（一）樣本類型與采集原則代謝組學(xué)研究涉及的生物樣本類型多樣，常見的包括血液、尿液、組織、糞便、唾液等。不同樣本類型的代謝物組成和穩(wěn)定性差異顯著，因此采集時(shí)需遵循以下核心原則：代表性原則：確保樣本能真實(shí)反映研究對象的生理或病理狀態(tài)，例如血液樣本需避免溶血，尿液樣本需采集中段尿以減少污染。穩(wěn)定性原則：代謝物易受溫度、pH、酶活性等因素影響，采集后需立即處理（如低溫保存、添加抑制劑），避免代謝物降解或轉(zhuǎn)化。一致性原則：統(tǒng)一采集時(shí)間、周期和條件（如空腹?fàn)顟B(tài)、采樣姿勢），減少個(gè)體內(nèi)變異對結(jié)果的干擾。（二）常見樣本采集流程1.血液樣本血液是代謝組學(xué)研究中最常用的樣本之一，主要分為血清、血漿和全血。血清采集：使用無抗凝劑的真空采血管，采集后室溫靜置30分鐘（促凝血），隨后以3000×g離心10分鐘分離血清，分裝后立即置于-80℃保存。血漿采集：根據(jù)研究需求選擇抗凝劑（如EDTA、肝素、檸檬酸鈉），采集后輕輕顛倒混勻，3000×g離心10分鐘分離血漿，分裝后-80℃保存。需注意：EDTA可能影響某些質(zhì)譜分析，肝素則可能干擾核磁共振（NMR）檢測。注意事項(xiàng)：避免劇烈搖晃導(dǎo)致溶血，溶血會釋放紅細(xì)胞內(nèi)的代謝物（如乳酸脫氫酶、腺苷），嚴(yán)重干擾檢測結(jié)果。2.尿液樣本尿液代謝物濃度受飲食、飲水等因素影響較大，采集時(shí)需嚴(yán)格控制條件：采集時(shí)間：優(yōu)先選擇晨尿（濃縮度高，代謝物豐富）或24小時(shí)尿液（需添加防腐劑如甲苯、疊氮鈉）。處理流程：采集后立即以4000×g離心10分鐘去除沉淀，分裝后-80℃保存。若無法立即處理，可暫時(shí)置于4℃冷藏（不超過24小時(shí)）。3.組織樣本組織樣本的采集需快速、低溫，以最大限度保留代謝物的原始狀態(tài)：采集步驟：手術(shù)或活檢獲取組織后，立即用預(yù)冷的生理鹽水沖洗表面血液，用濾紙吸干水分，迅速切成約50-100mg的小塊，放入液氮中速凍（避免冰晶形成破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)），隨后轉(zhuǎn)移至-80℃保存。注意事項(xiàng)：避免樣本在室溫下暴露超過30秒，防止代謝物因酶解或氧化發(fā)生變化。4.糞便樣本糞便樣本富含腸道微生物代謝物，采集時(shí)需注意：采集方法：使用無菌采樣管收集新鮮糞便（約5g），立即密封，置于-80℃保存。若需長期保存，可添加RNA保護(hù)劑或凍干處理。避免污染：采樣過程中避免接觸尿液、水或其他雜質(zhì)，防止微生物群落改變。二、樣本前處理技術(shù)細(xì)節(jié)樣本前處理是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。核心目標(biāo)是提取代謝物、去除雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)）、濃縮樣本。（一）提取方法選擇根據(jù)樣本類型和檢測技術(shù)（如LC-MS、GC-MS、NMR），選擇合適的提取溶劑和方法：液-液萃?。↙LE）：利用代謝物在不同溶劑中的溶解度差異分離，常用于非極性代謝物（如脂質(zhì)）的提取。例如，使用甲醇-氯仿混合溶劑（體積比2:1）提取組織中的脂質(zhì)，離心后取有機(jī)相進(jìn)行分析。固相萃取（SPE）：通過固相吸附劑富集目標(biāo)代謝物，去除基質(zhì)干擾，適用于復(fù)雜樣本（如血液、尿液）。例如，使用C18柱吸附極性代謝物，用甲醇洗脫后進(jìn)行LC-MS檢測。蛋白沉淀法：快速去除蛋白質(zhì)的常用方法，適用于血液、組織等樣本。常用溶劑包括甲醇、乙腈、丙酮，比例通常為樣本體積的3-5倍。例如，100μL血清加入400μL甲醇，渦旋混勻后4℃靜置10分鐘，12000×g離心15分鐘，取上清液進(jìn)行后續(xù)分析。（二）衍生化處理（針對GC-MS）GC-MS檢測需代謝物具有揮發(fā)性，因此非揮發(fā)性代謝物（如糖類、氨基酸）需進(jìn)行衍生化：硅烷化衍生：使用BSTFA（雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺）或MSTFA（N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺）作為衍生劑，在70℃下反應(yīng)30分鐘，將羥基、氨基等極性基團(tuán)轉(zhuǎn)化為硅醚鍵，提高揮發(fā)性。注意事項(xiàng)：衍生化需在無水條件下進(jìn)行，避免衍生劑水解失效；衍生后樣本需立即檢測，防止衍生物分解。（三）分餾技術(shù)（針對復(fù)雜樣本）對于代謝物種類繁多的樣本（如組織、糞便），可通過分餾技術(shù)分離不同類型的代謝物：固相微萃?。⊿PME）：適用于揮發(fā)性代謝物（如揮發(fā)性脂肪酸）的提取，無需溶劑，通過纖維頭吸附樣本中的揮發(fā)性成分，直接進(jìn)樣GC-MS分析。凝膠過濾色譜（GFC）：利用分子大小差異分離代謝物，例如使用SephadexG-10柱去除樣本中的大分子蛋白質(zhì)，收集小分子代謝物組分。三、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化流程代謝組學(xué)數(shù)據(jù)具有高維度、高噪聲的特點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)化處理是消除系統(tǒng)誤差、確保數(shù)據(jù)可比性的核心步驟。（一）原始數(shù)據(jù)預(yù)處理峰檢測與對齊：使用專業(yè)軟件（如XCMS、MarkerLynx、ProgenesisQI）對LC-MS/GC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、峰對齊和峰匹配，校正保留時(shí)間漂移和質(zhì)量偏差。例如，XCMS通過“m/z窗口”和“保留時(shí)間窗口”識別相同代謝物的峰，確保不同樣本間的峰對應(yīng)一致?；€校正與噪聲去除：通過平滑算法（如Savitzky-Golay）去除基線漂移，使用閾值法（如3倍信噪比）過濾噪聲峰，減少假陽性結(jié)果。（二）數(shù)據(jù)歸一化歸一化的目的是消除樣本間的體積差異、濃度差異和儀器響應(yīng)差異，常用方法包括：質(zhì)量歸一化：以樣本干重或濕重為基準(zhǔn)，適用于組織樣本。例如，100mg組織提取的代謝物濃度歸一化為“每mg組織的代謝物含量”。內(nèi)標(biāo)歸一化：添加已知濃度的內(nèi)標(biāo)物（如肌醇、2-氯苯丙氨酸），通過內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值校正樣本的提取效率和儀器波動(dòng)。內(nèi)標(biāo)物需滿足：不天然存在于樣本中、提取和檢測行為與目標(biāo)代謝物相似?？偡迕娣e歸一化：將每個(gè)代謝物的峰面積除以樣本總峰面積，適用于無合適內(nèi)標(biāo)的情況，但可能受高豐度代謝物的干擾。中位數(shù)歸一化：假設(shè)樣本中大多數(shù)代謝物的表達(dá)水平無差異，將每個(gè)樣本的代謝物峰面積除以樣本中位數(shù)，校正整體偏移。（三）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換與縮放對數(shù)轉(zhuǎn)換：將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為對數(shù)形式（如log2、log10），減少數(shù)據(jù)的偏態(tài)分布，使結(jié)果更符合統(tǒng)計(jì)分析的正態(tài)性假設(shè)。自動(dòng)縮放（Auto-scaling）：對每個(gè)代謝物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（均值為0，標(biāo)準(zhǔn)差為1），適用于不同代謝物濃度差異較大的情況，可突出低豐度代謝物的變化。**Pareto縮放**：介于原始數(shù)據(jù)和自動(dòng)縮放之間，對每個(gè)代謝物除以其標(biāo)準(zhǔn)差的平方根，既保留了數(shù)據(jù)的動(dòng)態(tài)范圍，又減少了高豐度代謝物的權(quán)重。四、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化管理標(biāo)準(zhǔn)（一）實(shí)驗(yàn)記錄標(biāo)準(zhǔn)化完整、規(guī)范的實(shí)驗(yàn)記錄是數(shù)據(jù)可重復(fù)和可追溯的基礎(chǔ)，需包含以下核心信息：樣本信息：編號、類型、采集時(shí)間、采集人、保存條件。前處理信息：提取溶劑、衍生化試劑、儀器型號、操作步驟（如離心轉(zhuǎn)速、時(shí)間）。檢測信息：儀器參數(shù)（如LC-MS的流動(dòng)相組成、梯度洗脫程序；GC-MS的柱溫箱程序）、檢測日期、操作員。數(shù)據(jù)文件：原始數(shù)據(jù)文件名、存儲路徑、預(yù)處理軟件及參數(shù)。（二）數(shù)據(jù)存儲與共享標(biāo)準(zhǔn)存儲格式：推薦使用開放格式存儲數(shù)據(jù)，如mzML（LC-MS/GC-MS）、nmrML（NMR），避免使用proprietary格式（如儀器自帶的.raw格式）導(dǎo)致數(shù)據(jù)無法讀取。元數(shù)據(jù)管理：元數(shù)據(jù)是描述數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)，需包含樣本的臨床信息（如年齡、性別、疾病狀態(tài)）、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（如對照組、處理組）、統(tǒng)計(jì)方法等。推薦使用ISA-Tab（InvestigationStudyAssayTabular）格式管理元數(shù)據(jù)，確保數(shù)據(jù)的可理解性和可共享性。共享平臺：將數(shù)據(jù)上傳至公共數(shù)據(jù)庫，如MetaboLights（歐洲生物信息研究所）、MetabolomicsWorkbench（美國國立衛(wèi)生研究院），促進(jìn)數(shù)據(jù)的開放獲取和二次利用。（三）質(zhì)量控制（QC）標(biāo)準(zhǔn)QC樣本是評估實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵，需貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程：QC樣本制備：將所有研究樣本的提取物按等體積混合，制備成**pooledQC樣本**，與研究樣本一同進(jìn)行檢測。QC指標(biāo)：保留時(shí)間穩(wěn)定性：同一代謝物在不同QC樣本中的保留時(shí)間偏差需<0.1分鐘（LC-MS）或<0.5分鐘（GC-MS）。峰面積RSD：QC樣本中代謝物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）需<30%（一般標(biāo)準(zhǔn)）或<20%（嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)），RSD過高表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，需重新優(yōu)化前處理或檢測方法。主成分分析（PCA）：QC樣本在PCA得分圖中應(yīng)聚集在一起，表明實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)穩(wěn)定；若QC樣本分散，則需排查儀器漂移、樣本處理差異等問題。（四）數(shù)據(jù)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)驗(yàn)證：對檢測方法進(jìn)行線性范圍、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率和精密度（日內(nèi)、日間）的驗(yàn)證，確保方法的可靠性。例如，LC-MS方法的回收率需在80%-120%之間，日內(nèi)精密度RSD<15%，日間精密度RSD<20%。生物重復(fù)驗(yàn)證：每個(gè)實(shí)驗(yàn)組至少包含6個(gè)生物重復(fù)（推薦10個(gè)以上），減少個(gè)體差異對結(jié)果的影響。統(tǒng)計(jì)分析需使用多重檢驗(yàn)校正（如FDR、Bonferroni），避免假陽性結(jié)果。五、常見問題與解決方案問題類型表現(xiàn)形式解決方案樣本溶血血清/血漿呈紅色，代謝物峰異常升高采集時(shí)避免劇烈搖晃，若溶血嚴(yán)重則棄用樣本代謝物降解目標(biāo)代謝物峰面積降低采集后立即低溫處理，添加酶抑制劑（如磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑）儀器漂移保留時(shí)間偏移，峰面積RSD升高定期校準(zhǔn)儀器，使用QC樣本監(jiān)控，必要時(shí)重新優(yōu)化色譜條件數(shù)據(jù)批次效應(yīng)不同批次樣本聚類分離采用批次校正方法