層粘連蛋白β1與塵肺病發(fā)病風險及潛在機制解析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1塵肺病的現(xiàn)狀及危害塵肺病是由于在職業(yè)活動中長期吸入不同致病性的生產(chǎn)性粉塵，并在肺內(nèi)潴留而引起的以肺組織彌漫性纖維化為主的疾病。我國是全球塵肺病患者數(shù)量最多的國家之一，塵肺病已成為我國危害最嚴重、涉及人數(shù)最多的職業(yè)病。根據(jù)相關(guān)資料顯示，截至2021年底中國累計報告職業(yè)性塵肺病患者91.5萬人，占所報告職業(yè)病總數(shù)的88.3%。從2010年以來，每年塵肺病人均超2萬例，直到2017年，在我國統(tǒng)計的塵肺病人有85萬余例，2015年，全球疾病負擔公布我國因塵肺死亡的病例約有9538例，塵肺病的發(fā)病呈逐漸增加趨勢，已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。塵肺病常見類型主要為矽肺和煤工塵肺，其中井下煤礦作業(yè)人群的煤工塵肺又以混合性塵肺-煤矽肺為多見，占87.6%，單純的矽肺病和煤肺病較少，分別為11.4%和1.0%。2013年我國共報告新增塵肺病例23152例，占全年新發(fā)職業(yè)病的87.72%，其中95.2%是矽肺病和煤工塵肺。塵肺病不僅發(fā)病率高，致死率也不容小覷，衛(wèi)生部資料顯示，截止到2010年底，全國累計報告塵肺病676541例，死亡149110例，病死率為22.04%。塵肺病到了集中爆發(fā)的時期，不斷有患者發(fā)病和死亡，嚴重威脅患者生命健康。塵肺病嚴重影響患者的生活質(zhì)量?；颊呋疾『髸霈F(xiàn)咳嗽、咳痰、咯血、胸悶、呼吸困難等癥狀，且胸悶氣短呈進行性加重。隨著病情發(fā)展，患者呼吸功能逐漸受損，活動后胸悶氣喘癥狀逐漸加重，肺部可聽到明顯的爆裂音，胸部CT提示有典型網(wǎng)格狀的間質(zhì)性改變。塵肺病患者呼吸道抵抗力明顯降低，常常更易合并慢性支氣管炎、呼吸衰竭、肺氣腫、肺炎、肺結(jié)核等疾病，病程較長者還可能出現(xiàn)肺心病、心力衰竭等并發(fā)癥，部分患者因嚴重的低氧血癥出現(xiàn)呼吸衰竭，甚至發(fā)生氣胸，肺癌的患病率也明顯增高。由于塵肺病患者多為家庭經(jīng)濟支柱，患病后喪失勞動能力，不僅使家庭斷了生活來源，還要承受巨額治療費，導致家庭生活陷入絕境，債臺高筑，子女輟學，給家庭帶來沉重的負擔，也在一定程度上影響了社會的穩(wěn)定和發(fā)展。目前塵肺病尚無特效的治療方法，主要治療目標是緩解癥狀、延緩病情進展和提高生活質(zhì)量，但治療效果有限，給患者及其家庭帶來極大的痛苦和困擾。1.1.2層粘連蛋白β1研究的重要性塵肺病發(fā)生發(fā)展的病因、機制復雜，難以完全闡明。其一個重要的病理特征是細胞外基質(zhì)大量沉積，而層粘連蛋白是一類具有多功能域的基底膜非膠原糖蛋白，由α、β、γ鏈構(gòu)成的異三聚體，參與基底膜骨架的組裝，影響和調(diào)節(jié)細胞的粘附、遷移、分化、增殖等生物學行為，也參與細胞信號的傳導。層粘連蛋白β1鏈（LamB1）由LAMB1基因編碼，在體內(nèi)分布廣泛，參與組裝至少7種層粘連蛋白亞型。LamB1是肺發(fā)育和維持正常功能所必需的，也被報道參與腎、肝纖維化過程。然而，關(guān)于LamB1與塵肺的研究報道較少。雖然長期粉塵暴露是塵肺病的主要病因，但相同暴露條件下，發(fā)病率、病變進展快慢及纖維化嚴重程度的差異提示遺傳因素在塵肺的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。單核苷酸多態(tài)性是研究疾病遺傳易感性的重要工具，可反應個體表型、疾病易感性及對藥物、環(huán)境等影響因素反應的差異。前期對塵肺病進行的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），發(fā)現(xiàn)在LAMB1基因上一個多態(tài)性位點rs4320486與塵肺病的發(fā)生危險性存在著相關(guān)性。這表明深入研究層粘連蛋白β1與塵肺病的關(guān)系具有重要意義。深入研究層粘連蛋白β1在塵肺病發(fā)病機制中的作用，有助于揭示塵肺病發(fā)病的潛在分子機制。通過探究層粘連蛋白β1在塵肺病發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用途徑和相關(guān)信號通路，能夠更全面地理解塵肺病的發(fā)病過程，為進一步闡明塵肺病的復雜發(fā)病機制提供關(guān)鍵線索，從而為研發(fā)更有效的治療方法奠定堅實的理論基礎。同時，若能確定層粘連蛋白β1與塵肺病發(fā)病風險之間的明確關(guān)聯(lián)，就有可能將其作為塵肺病早期診斷的生物標志物。通過檢測相關(guān)指標，實現(xiàn)對塵肺病的早期篩查和診斷，有助于患者在疾病早期得到及時治療，延緩病情進展，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。此外，針對層粘連蛋白β1開展的研究，還有望為塵肺病的個性化預防和治療提供新的策略和靶點。根據(jù)個體遺傳特征和層粘連蛋白β1的表達情況，制定個性化的預防和治療方案，提高防治效果，降低塵肺病的發(fā)病率和危害。鑒于塵肺病發(fā)病機制復雜，目前尚無有效治療，且缺乏人群特異的血清學指標，深入研究層粘連蛋白β1與塵肺病間的關(guān)系，對建立有效的易感性篩查，提高粉塵接觸人群的健康監(jiān)護水平都具有實際意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀塵肺病作為我國危害最嚴重的職業(yè)病，一直是國內(nèi)外研究的重點領域。在國外，研究人員主要聚焦于粉塵暴露與塵肺病發(fā)病的關(guān)系，通過對不同行業(yè)、不同類型粉塵的暴露劑量-反應關(guān)系進行研究，試圖明確塵肺病發(fā)病的關(guān)鍵因素。如美國國家職業(yè)安全與健康研究所（NIOSH）開展的一系列針對煤礦、采石場等行業(yè)的研究，詳細分析了石英粉塵、煤塵等對肺部的損傷機制。在國內(nèi)，對塵肺病的研究同樣廣泛且深入。學者們不僅關(guān)注粉塵暴露，還深入探討遺傳因素、免疫機制等在塵肺病發(fā)病中的作用。有研究通過對大量塵肺病患者的基因分析，發(fā)現(xiàn)某些基因多態(tài)性與塵肺病的易感性密切相關(guān)。在塵肺病的診斷和治療方面，國內(nèi)也取得了一定的進展，如新型診斷技術(shù)的研發(fā)和臨床應用，以及一些中西醫(yī)結(jié)合的治療方法探索。層粘連蛋白β1作為細胞外基質(zhì)的重要組成部分，其在纖維化疾病中的作用逐漸受到關(guān)注。國外有研究報道，在腎纖維化和肝纖維化模型中，層粘連蛋白β1的表達水平顯著升高，且與纖維化程度呈正相關(guān)。在肺纖維化研究中，發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白β1參與了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，促進成纖維細胞的活化和細胞外基質(zhì)的沉積。國內(nèi)對于層粘連蛋白β1與塵肺病關(guān)系的研究相對較少。前期對塵肺病進行的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），發(fā)現(xiàn)LAMB1基因上的多態(tài)性位點rs4320486與塵肺病的發(fā)生危險性存在相關(guān)性，但具體的作用機制尚未明確。目前關(guān)于層粘連蛋白β1與塵肺病關(guān)系的研究仍存在諸多不足。一方面，研究多集中在細胞和動物模型層面，缺乏大規(guī)模的人群研究來驗證層粘連蛋白β1作為塵肺病生物標志物的可靠性和有效性。另一方面，對于層粘連蛋白β1在塵肺病發(fā)病機制中的具體作用途徑和相關(guān)信號通路，尚未完全闡明，仍需進一步深入研究。此外，現(xiàn)有的研究大多僅關(guān)注層粘連蛋白β1本身的表達變化，對于其與其他相關(guān)蛋白或分子的相互作用研究較少，這也限制了對塵肺病發(fā)病機制的全面理解。本研究擬從多個層面入手，通過大樣本的病例-對照研究，進一步驗證LAMB1基因多態(tài)性與塵肺病發(fā)生危險性的關(guān)聯(lián)；利用人群血清樣本和細胞模型，深入研究rs4320486位點突變對LAMB1基因轉(zhuǎn)錄表達的影響；借助動物模型和體外細胞模型，系統(tǒng)觀察層粘連蛋白β1在纖維化過程中的動態(tài)變化及可能的調(diào)控機制，以期為揭示塵肺病發(fā)病機制、個性化預防及治療提供新的線索和理論依據(jù)。1.3研究目的和內(nèi)容1.3.1研究目的本研究基于前期塵肺病全基因組關(guān)聯(lián)研究，深入剖析層粘連蛋白β1（Lamb1）與塵肺病發(fā)病風險及其機制，旨在為塵肺病防治開辟新思路，具體目標如下：驗證基因多態(tài)性與發(fā)病風險關(guān)聯(lián)：通過大樣本病例-對照研究，驗證LAMB1基因rs4320486位點多態(tài)性與塵肺病發(fā)生危險性之間的關(guān)聯(lián)，明確該基因多態(tài)性在塵肺病發(fā)病中的作用，為塵肺病遺傳易感性研究提供更有力的證據(jù)。探究位點突變對基因轉(zhuǎn)錄表達影響：借助人群血清樣本和細胞模型，深入研究rs4320486位點突變對LAMB1基因轉(zhuǎn)錄表達的影響，揭示基因?qū)用娴恼{(diào)控機制，從分子層面闡釋塵肺病發(fā)病的潛在機制。揭示在纖維化過程中的動態(tài)變化及調(diào)控機制：運用動物模型和體外細胞模型，系統(tǒng)觀察層粘連蛋白β1在纖維化過程中的動態(tài)變化，深入探究其可能的調(diào)控機制，為塵肺病發(fā)病機制研究提供關(guān)鍵線索，也為尋找新的治療靶點奠定基礎。1.3.2研究內(nèi)容圍繞上述研究目的，本研究開展以下幾方面內(nèi)容：LAMB1基因多態(tài)性與塵肺病發(fā)病風險關(guān)聯(lián)研究：收集大量塵肺病患者和無塵肺接塵對照人群的樣本，進行詳細的問卷調(diào)查，涵蓋一般人口學資料、接塵史、家族史等信息。同時，采集空腹外周靜脈血，采用TaqMan基因分型法對受試者的LAMB1基因rs4320486位點進行基因分型。運用統(tǒng)計學方法，如Logistic回歸分析、Cox回歸分析等，評估不同基因型與塵肺病發(fā)病風險以及發(fā)病間期的關(guān)聯(lián)性，并進行分層分析，探究不同因素對這種關(guān)聯(lián)的影響。rs4320486位點突變對LAMB1基因轉(zhuǎn)錄表達的影響研究：構(gòu)建包含rs4320486不同等位基因（C>T）的載體，轉(zhuǎn)染至相關(guān)細胞系，建立細胞模型。采用雙熒光素酶報告基因法檢測不同等位基因?qū)AMB1基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。同時，運用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測不同基因間、病例和對照間血清Lamb1濃度，從細胞和人群兩個層面綜合分析不同等位基因?qū)AMB1表達的影響。此外，收集正常人肺組織和纖維化人肺組織，利用qrt-pcr法檢測組織中LAMB1mRNA表達水平的差異，進一步驗證基因轉(zhuǎn)錄表達的變化。層粘連蛋白β1在纖維化過程中的動態(tài)變化及調(diào)控機制研究：分別建立SiO?和BLM誘導的小鼠肺纖維化模型，在處理后的不同時間截點，對小鼠肺組織進行病理切片，并進行HE染色，觀察肺纖維化的發(fā)生發(fā)展情況，以確認模型成功建立。分別提取各期小鼠肺組織蛋白和RNA，通過Westernblot和qrt-pcr法檢測Lamb1、上皮標志物E-cadherin、及間質(zhì)標志物α-SMA蛋白及mRNA水平的動態(tài)變化，分析層粘連蛋白β1與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程的關(guān)系。建立SiO?處理HBE細胞模型和TGF-β1誘導NIH-3T3細胞模型，誘導纖維化病變，同樣通過Westernblot和qrt-pcr法確認Lamb1與上皮間質(zhì)標志物的表達情況，并利用細胞免疫熒光直觀展示細胞中纖維化表達的變化。最后，通過抑制劑特異性阻斷活化的信號通路，研究纖維化中調(diào)控Lamb1表達的機制，深入揭示層粘連蛋白β1在塵肺病纖維化過程中的作用機制。二、層粘連蛋白β1的生物學特性2.1層粘連蛋白β1的結(jié)構(gòu)與功能層粘連蛋白β1作為層粘連蛋白家族的重要成員，由LAMB1基因編碼，其分子結(jié)構(gòu)獨特且復雜。層粘連蛋白是一類由α、β、γ三條不同的多肽鏈通過二硫鍵相互連接，組裝形成的異三聚體結(jié)構(gòu)的非膠原糖蛋白，整體呈現(xiàn)出不對稱的“十”字形或“T”字形。這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了層粘連蛋白多種生物學功能。在層粘連蛋白的三聚體結(jié)構(gòu)中，β1鏈發(fā)揮著不可或缺的作用。β1鏈包含多個不同的結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域都有其特定的功能。其氨基端和羧基端區(qū)域在與其他鏈的相互作用以及與細胞表面受體或細胞外基質(zhì)成分的結(jié)合中起到關(guān)鍵作用。例如，β1鏈上的某些結(jié)構(gòu)域含有與細胞表面整合素受體特異性結(jié)合的位點，通過這種結(jié)合，層粘連蛋白β1能夠介導細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附作用，為細胞提供穩(wěn)定的支撐結(jié)構(gòu)，影響細胞的形態(tài)和位置。在細胞粘附過程中，層粘連蛋白β1起著橋梁的作用，它一方面與細胞表面的整合素等受體緊密結(jié)合，另一方面與細胞外基質(zhì)中的其他成分，如Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素等相互作用，將細胞牢固地錨定在細胞外基質(zhì)上，維持組織和器官的正常結(jié)構(gòu)和功能。當細胞需要遷移時，層粘連蛋白β1又能通過與細胞表面受體的動態(tài)相互作用，調(diào)節(jié)細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附力，為細胞遷移提供必要的條件。細胞遷移在胚胎發(fā)育、組織修復、免疫反應等生理過程中都具有重要意義，層粘連蛋白β1的調(diào)控作用確保了這些過程的順利進行。在胚胎發(fā)育過程中，細胞的遷移和分化是構(gòu)建復雜生物體的基礎，層粘連蛋白β1參與調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細胞的遷移，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。在傷口愈合過程中，成纖維細胞和上皮細胞的遷移依賴于層粘連蛋白β1與細胞表面受體的相互作用，促進傷口的修復。層粘連蛋白β1在細胞分化過程中也扮演著關(guān)鍵角色。它可以通過與細胞表面受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，調(diào)控基因的表達，從而影響細胞的分化方向。研究表明，在胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化的過程中，層粘連蛋白β1能夠提供特定的信號，促進神經(jīng)干細胞的分化和成熟，有助于神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。在組織損傷修復過程中，層粘連蛋白β1能夠引導干細胞向受損組織部位遷移，并促進其分化為相應的細胞類型，參與組織的修復和再生。2.2層粘連蛋白β1在人體中的分布層粘連蛋白β1在人體內(nèi)分布極為廣泛，幾乎存在于所有的組織和器官中，對維持機體正常的生理功能起著不可或缺的作用。在胚胎發(fā)育過程中，層粘連蛋白β1在各個組織和器官的形成和發(fā)育中都扮演著關(guān)鍵角色。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，層粘連蛋白β1參與神經(jīng)嵴細胞的遷移和分化，為神經(jīng)細胞的正常發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)的構(gòu)建提供必要的支持。在心血管系統(tǒng)發(fā)育中，它有助于血管內(nèi)皮細胞的黏附和遷移，促進血管的形成和穩(wěn)定。在成年個體中，層粘連蛋白β1在多種組織和器官中持續(xù)發(fā)揮重要作用。在皮膚中，它分布于基底膜帶，參與維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能，對表皮細胞與真皮層之間的黏附起到關(guān)鍵作用，有助于保持皮膚的完整性和彈性。在腎臟中，層粘連蛋白β1存在于腎小球基底膜等部位，對維持腎小球的正常濾過功能和腎臟的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定至關(guān)重要。研究表明，在某些腎臟疾病，如腎小球腎炎、糖尿病腎病等，層粘連蛋白β1的表達和分布會發(fā)生改變，進而影響腎臟的正常功能，導致蛋白尿等癥狀的出現(xiàn)。在肝臟中，層粘連蛋白β1由內(nèi)皮細胞、干細胞和貯脂細胞合成，是基底膜的主要構(gòu)成成分之一。它參與肝臟內(nèi)細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，對肝臟的正常代謝、解毒功能以及組織修復等過程具有重要意義。在肝纖維化進程中，層粘連蛋白β1與Ⅳ型膠原結(jié)合，形成內(nèi)皮基膜，參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，血清中層粘連蛋白β1的測定可作為評估慢性肝炎患者肝組織纖維化程度的重要指標。在肺部組織中，層粘連蛋白β1具有獨特的分布特點和重要的生理意義。它主要分布于肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞的基底膜，在肺泡-毛細血管屏障的形成和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這種分布方式使得層粘連蛋白β1能夠直接參與肺泡與毛細血管之間的氣體交換過程，保證氧氣和二氧化碳的順利交換，維持肺部正常的氣體交換功能。同時，它還為肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞提供穩(wěn)定的支撐結(jié)構(gòu)，有助于維持細胞的形態(tài)和功能。在肺發(fā)育過程中，層粘連蛋白β1是肺正常發(fā)育所必需的。它參與調(diào)節(jié)肺上皮細胞和間質(zhì)細胞的增殖、分化和遷移，對肺組織結(jié)構(gòu)的形成和完善起著重要的調(diào)控作用。在胚胎期，層粘連蛋白β1的表達和分布變化與肺的發(fā)育進程密切相關(guān)，為肺的正常發(fā)育提供了必要的信號和環(huán)境支持。在出生后，層粘連蛋白β1繼續(xù)在維持肺的正常結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。它參與調(diào)節(jié)肺部的免疫反應，與免疫細胞表面的受體相互作用，影響免疫細胞的活性和功能，有助于維持肺部的免疫平衡，抵御病原體的入侵。2.3層粘連蛋白β1在其他疾病中的作用層粘連蛋白β1在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，深入研究其在這些疾病中的作用機制，對于理解疾病的病理過程以及開發(fā)新的治療策略具有重要意義。在腎臟疾病方面，層粘連蛋白β1與腎纖維化密切相關(guān)。腎纖維化是許多腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的共同病理過程，其特征是細胞外基質(zhì)過度沉積和腎組織結(jié)構(gòu)破壞。研究發(fā)現(xiàn)，在腎纖維化模型中，層粘連蛋白β1的表達顯著上調(diào)。在單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）誘導的小鼠腎纖維化模型中，通過免疫組化和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著腎纖維化程度的加重，層粘連蛋白β1在腎小管上皮細胞和間質(zhì)細胞中的表達明顯增加。進一步研究表明，層粘連蛋白β1通過與細胞表面的整合素受體相互作用，激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，如PI3K/Akt和ERK1/2信號通路，促進成纖維細胞的活化和增殖，進而導致細胞外基質(zhì)成分如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原等的合成增加，最終促進腎纖維化的發(fā)展。此外，層粘連蛋白β1還可以調(diào)節(jié)腎小管上皮細胞的表型轉(zhuǎn)化，使其發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），失去上皮細胞的特性，獲得間質(zhì)細胞的特征，進一步加重腎纖維化。在肝臟疾病中，層粘連蛋白β1同樣參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。肝纖維化是肝臟對各種慢性損傷的修復反應，若持續(xù)進展可導致肝硬化和肝功能衰竭。層粘連蛋白β1主要由肝臟內(nèi)的內(nèi)皮細胞、干細胞和貯脂細胞合成，是基底膜的主要構(gòu)成成分之一。在肝纖維化進程中，層粘連蛋白β1與Ⅳ型膠原結(jié)合，形成內(nèi)皮基膜，促進細胞外基質(zhì)的沉積和纖維化的發(fā)展。臨床研究表明，血清中層粘連蛋白β1的水平與慢性肝炎患者肝組織的纖維化程度密切相關(guān)，可作為評估肝纖維化程度的重要指標之一。對慢性乙型肝炎患者的研究發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度從S1到S4逐漸加重，血清中層粘連蛋白β1的濃度也逐漸升高，且與肝組織中纖維化相關(guān)指標如羥脯氨酸含量、α-SMA表達等呈正相關(guān)。在肝纖維化的發(fā)生機制中，層粘連蛋白β1不僅通過物理支撐作用影響細胞外基質(zhì)的組裝和結(jié)構(gòu)，還可以通過調(diào)節(jié)細胞間的相互作用和信號傳導，影響肝星狀細胞的活化和增殖，以及肝細胞的凋亡和再生，從而在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在腫瘤領域，層粘連蛋白β1與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導致腫瘤患者預后不良的主要原因，而層粘連蛋白β1在這一過程中扮演著關(guān)鍵角色。在多種腫瘤細胞中，如乳腺癌、肺癌、胃癌等，層粘連蛋白β1的表達水平明顯升高，且與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)。以胃癌為例，研究發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白β1在胃癌癌結(jié)節(jié)、原發(fā)灶中的表達顯著高于癌旁組織，且其表達水平與胃癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。進一步的功能研究表明，層粘連蛋白β1可以通過多種機制促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。它可以與腫瘤細胞表面的整合素受體結(jié)合，增強腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力，為腫瘤細胞的遷移提供基礎。同時，層粘連蛋白β1還可以激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，如FAK/PI3K/Akt和RhoGTPase信號通路，調(diào)節(jié)細胞骨架的重組和細胞運動相關(guān)蛋白的表達，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。此外，層粘連蛋白β1還可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使腫瘤細胞獲得間質(zhì)細胞的特性，增強其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在對乳腺癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，沉默層粘連蛋白β1的表達可以顯著抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，同時上調(diào)上皮標志物E-cadherin的表達，下調(diào)間質(zhì)標志物N-cadherin和Vimentin的表達，表明層粘連蛋白β1通過調(diào)控EMT過程促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。三、塵肺病發(fā)病機制及研究現(xiàn)狀3.1塵肺病概述塵肺病是由于在職業(yè)活動中長期吸入不同致病性的生產(chǎn)性粉塵，并在肺內(nèi)潴留而引起的以肺組織彌漫性纖維化為主的全身性疾病。國際勞工組織（ILO）將塵肺病定義為由于長期吸入礦物性粉塵導致的肺部疾病，其特征是肺部組織的纖維化和功能損害。根據(jù)吸入粉塵的性質(zhì)，塵肺病可分為無機塵肺和有機塵肺。無機塵肺最為常見，主要由吸入無機礦物性粉塵引起，如矽肺、煤工塵肺、石棉肺等；有機塵肺則是由于吸入有機粉塵導致，如棉塵肺、農(nóng)民肺等。在我國，塵肺病的類型以矽肺和煤工塵肺最為多見。矽肺是由于長期吸入游離二氧化硅粉塵所致，其纖維化程度往往較為嚴重，對肺部功能的損害較大。煤工塵肺則主要發(fā)生在煤礦工人中，與長期吸入煤塵和煤矽混合粉塵有關(guān)。我國塵肺病的發(fā)病趨勢呈現(xiàn)出一些顯著特點。近年來，雖然隨著我國對職業(yè)病防治工作的重視和監(jiān)管力度的加強，塵肺病的發(fā)病率增長速度有所減緩，但總體發(fā)病形勢依然嚴峻。從發(fā)病數(shù)量上看，塵肺病新發(fā)病例數(shù)仍處于較高水平。根據(jù)相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，截至2021年底，中國累計報告職業(yè)性塵肺病患者91.5萬人，占所報告職業(yè)病總數(shù)的88.3%。從發(fā)病行業(yè)分布來看，塵肺病主要集中在煤炭、有色金屬、機械制造、建筑材料等行業(yè)。在煤炭行業(yè)，由于開采過程中產(chǎn)生大量的煤塵和煤矽混合粉塵，煤礦工人成為塵肺病的高發(fā)人群。在有色金屬行業(yè)，如鉛鋅礦、銅礦等開采和冶煉過程中，工人也容易接觸到各種有害粉塵，增加了塵肺病的發(fā)病風險。機械制造行業(yè)中的鑄造、打磨等工序，以及建筑材料行業(yè)中的水泥生產(chǎn)、石材加工等環(huán)節(jié)，都存在大量的粉塵污染，導致從業(yè)人員患塵肺病的幾率較高。從發(fā)病工齡來看，塵肺病的發(fā)病工齡有逐漸縮短的趨勢。過去，塵肺病患者往往在接觸粉塵10-20年后才發(fā)病，但近年來，隨著工作環(huán)境中粉塵濃度的增加以及個體易感性的差異，部分患者在接觸粉塵5-10年甚至更短時間內(nèi)就可能發(fā)病。這表明塵肺病的發(fā)病速度加快，對勞動者的健康危害更為迅速和嚴重。此外，塵肺病的發(fā)病還呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，一些年輕的勞動者由于過早接觸高濃度粉塵，在青壯年時期就患上了塵肺病，嚴重影響了他們的生活和職業(yè)發(fā)展。3.2塵肺病發(fā)病機制塵肺病的發(fā)病機制是一個極為復雜且涉及多個環(huán)節(jié)的過程，目前尚未完全明確，但普遍認為主要與粉塵沉積、炎癥反應、氧化應激和纖維化等密切相關(guān)。當人體長期暴露于高濃度的生產(chǎn)性粉塵環(huán)境中時，大量的粉塵顆粒會隨著呼吸進入呼吸道。這些粉塵顆粒的大小、形狀、化學組成等理化特性在塵肺病的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。一般來說，粒徑較小的粉塵顆粒（如小于5μm的顆粒）更容易進入肺部深部，并在肺泡內(nèi)沉積。其中，游離二氧化硅粉塵是導致矽肺等塵肺病的主要致病因子，其表面具有特殊的化學活性，能夠與肺部組織發(fā)生復雜的化學反應。一旦粉塵顆粒在肺泡內(nèi)沉積，就會引發(fā)一系列的炎癥反應。肺泡巨噬細胞作為肺部的重要免疫防御細胞，會迅速對粉塵顆粒進行吞噬。然而，對于一些難以被降解的粉塵，如游離二氧化硅粉塵，巨噬細胞在吞噬后不僅無法將其清除，反而會受到粉塵的損傷，導致細胞內(nèi)溶酶體破裂，釋放出大量的水解酶和炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥介質(zhì)會進一步激活炎癥細胞，如中性粒細胞、淋巴細胞等，使其向炎癥部位趨化聚集，引發(fā)更強烈的炎癥反應。炎癥反應的持續(xù)存在會導致肺部組織的損傷和修復失衡，損傷的組織無法正常修復，進而為后續(xù)的纖維化過程奠定基礎。氧化應激在塵肺病的發(fā)病機制中也占據(jù)著重要地位。粉塵顆粒的刺激會導致肺部細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）、羥自由基（?OH）等。同時，肺部的抗氧化防御系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）等，在長期的氧化應激壓力下，其活性可能會受到抑制，導致ROS的清除能力下降，從而使ROS在細胞內(nèi)大量積累。過量的ROS會攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如細胞膜上的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等，導致細胞膜的脂質(zhì)過氧化，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能；使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化修飾，影響其正常的生物學活性；引發(fā)DNA損傷，導致基因突變等。這些損傷會進一步促進炎癥反應的發(fā)生發(fā)展，同時也會激活細胞內(nèi)的一系列信號傳導通路，如NF-κB信號通路、MAPK信號通路等，從而促進成纖維細胞的活化和增殖，最終導致肺纖維化的發(fā)生。肺纖維化是塵肺病的主要病理特征，也是導致肺部功能進行性損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在炎癥反應和氧化應激的持續(xù)作用下，肺部的成纖維細胞被大量激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞。肌成纖維細胞具有較強的增殖能力和合成細胞外基質(zhì)的能力，它們會大量合成和分泌膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等細胞外基質(zhì)成分，導致細胞外基質(zhì)在肺部組織中過度沉積，形成纖維化病灶。隨著纖維化的不斷進展，肺部組織逐漸變硬、彈性降低，肺功能也會受到嚴重影響，導致患者出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、咳痰等癥狀，嚴重時可發(fā)展為呼吸衰竭和心力衰竭，危及生命。在纖維化過程中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）也發(fā)揮著重要作用。肺泡上皮細胞在炎癥因子和氧化應激等因素的刺激下，會發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，逐漸失去上皮細胞的特征，如E-cadherin表達減少，同時獲得間質(zhì)細胞的特征，如α-SMA、Vimentin表達增加，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)樣細胞。這些間質(zhì)樣細胞可以遷移到肺間質(zhì)，參與細胞外基質(zhì)的合成和沉積，進一步促進肺纖維化的發(fā)展。3.3遺傳因素在塵肺病發(fā)病中的作用盡管長期粉塵暴露被公認為是塵肺病發(fā)病的主要原因，但在相同的粉塵暴露條件下，不同個體的塵肺病發(fā)病率、病變進展速度以及纖維化嚴重程度存在顯著差異，這強烈提示遺傳因素在塵肺病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。遺傳因素對塵肺病發(fā)病的影響主要體現(xiàn)在個體對粉塵的易感性差異上。一些個體由于遺傳背景的特殊性，其肺部對粉塵的防御和清除機制可能存在缺陷，使得他們在接觸相同濃度和時間的粉塵時，更容易受到粉塵的損傷，從而增加了塵肺病的發(fā)病風險。研究表明，某些基因的突變或多態(tài)性可能導致肺部細胞表面的受體結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生改變，影響粉塵顆粒與細胞的結(jié)合和攝取，進而影響塵肺病的發(fā)生發(fā)展。單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為遺傳變異的一種常見形式，在塵肺病遺傳易感性研究中具有重要意義。SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，其在人群中的頻率較高，且分布廣泛。許多研究致力于探索與塵肺病發(fā)病相關(guān)的SNP位點，通過全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）等技術(shù)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個與塵肺病遺傳易感性相關(guān)的SNP位點。前期對塵肺病進行的GWAS研究發(fā)現(xiàn)，在LAMB1基因上的多態(tài)性位點rs4320486與塵肺病的發(fā)生危險性存在相關(guān)性。攜帶特定基因型的個體在相同粉塵暴露條件下，塵肺病的發(fā)病風險可能更高或更低。這表明LAMB1基因的rs4320486位點多態(tài)性可能通過影響基因的表達或功能，進而影響塵肺病的發(fā)病機制。不同SNP位點對塵肺病發(fā)病風險的影響機制各不相同。一些SNP位點可能位于基因的編碼區(qū)，導致基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。在某些與氧化應激相關(guān)的基因中，SNP位點的突變可能導致編碼的抗氧化酶活性降低，使肺部細胞在面對粉塵刺激時，無法有效清除過多的活性氧（ROS），從而加重氧化應激損傷，促進塵肺病的發(fā)生發(fā)展。另一些SNP位點可能位于基因的調(diào)控區(qū)域，如啟動子、增強子或非編碼RNA結(jié)合位點等，影響基因的轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。位于基因啟動子區(qū)域的SNP位點突變可能改變轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合能力，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄起始效率，導致基因表達水平的改變。某些SNP位點還可能通過影響mRNA的穩(wěn)定性、剪接或翻譯過程，間接影響蛋白質(zhì)的表達和功能，進而影響塵肺病的發(fā)病風險。除了單個SNP位點的作用外，多個SNP位點之間的相互作用也可能對塵肺病發(fā)病風險產(chǎn)生影響?；?基因相互作用是指不同基因之間的協(xié)同或拮抗作用，多個SNP位點在不同基因上的組合可能會導致個體對塵肺病的易感性發(fā)生復雜的變化。某些基因之間的相互作用可能增強個體對粉塵的耐受性，降低塵肺病的發(fā)病風險；而另一些相互作用則可能加劇肺部損傷，增加發(fā)病風險。研究基因-基因相互作用對于深入理解塵肺病的遺傳易感性機制具有重要意義，能夠為揭示塵肺病發(fā)病的復雜遺傳網(wǎng)絡提供線索。遺傳因素在塵肺病發(fā)病中起著不可忽視的作用，單核苷酸多態(tài)性與塵肺病遺傳易感性密切相關(guān)。通過深入研究遺傳因素在塵肺病發(fā)病中的作用機制，不僅有助于我們更好地理解塵肺病的發(fā)病過程，還能為塵肺病的早期篩查、診斷和個性化防治提供重要的理論依據(jù)和生物標志物。四、層粘連蛋白β1與塵肺病發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)性研究4.1研究設計與方法4.1.1病例-對照研究設計本研究選取了[具體煤礦名稱]的煤礦工人作為研究對象，旨在深入探究層粘連蛋白β1與塵肺病發(fā)病風險之間的關(guān)聯(lián)。經(jīng)過嚴格篩選，最終納入了1091例煤工塵肺（CWP）患者和1042例無塵肺接塵對照。CWP患者的選取標準極為嚴格，所有患者均為在該煤礦從事井下接塵作業(yè)的工人，且接塵工齡不少于5年。他們均經(jīng)過高千伏胸片檢查，并依據(jù)我國現(xiàn)行的塵肺病診斷標準（GBZ70-2015）進行確診。為了確保診斷的準確性，部分疑似病例還進一步接受了胸部CT檢查以及肺功能測定?；颊叩牟∏楹w了不同的期別，其中壹期患者[X1]例，貳期患者[X2]例，叁期患者[X3]例，這樣的病例分布能夠全面反映不同病情階段的特征。無塵肺接塵對照同樣來自該煤礦的井下接塵作業(yè)工人，接塵工齡與CWP患者匹配，且近1年內(nèi)的高千伏胸片檢查未發(fā)現(xiàn)塵肺病相關(guān)改變。為了排除其他潛在因素的干擾，所有研究對象均排除了患有其他肺部疾?。ㄈ绶窝?、肺結(jié)核、肺癌等）、心血管疾?。ㄈ绻谛牟?、高血壓性心臟病等）、自身免疫性疾?。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關(guān)節(jié)炎等）以及惡性腫瘤的可能性。在研究過程中，采用了統(tǒng)一設計的調(diào)查問卷，對所有研究對象進行了詳細的問卷調(diào)查。問卷內(nèi)容涵蓋多個方面，一般人口學資料包括年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度等；接塵史涉及開始接塵時間、接塵工種、接塵工齡、作業(yè)場所粉塵濃度等；家族史主要詢問直系親屬中是否有塵肺病患者或其他肺部疾病患者；生活習慣包括吸煙史（吸煙年限、每日吸煙量、是否戒煙等）、飲酒史（飲酒年限、每周飲酒次數(shù)、每次飲酒量等）。在血樣采集方面，所有研究對象均于清晨空腹狀態(tài)下，采集5ml外周靜脈血。采血過程嚴格遵循無菌操作原則，使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的真空采血管收集血液樣本。采血后，將血樣迅速置于4℃的低溫環(huán)境中保存，并在2小時內(nèi)送往實驗室進行處理。在實驗室中，通過離心分離（3000rpm，15分鐘）獲取血漿和血細胞，將血漿和血細胞分別轉(zhuǎn)移至凍存管中，標記清楚后，置于-80℃的超低溫冰箱中保存，以備后續(xù)的基因分型和相關(guān)指標檢測使用。4.1.2基因分型方法本研究采用Taqman基因分型法對受試者的LAMB1基因rs4320486位點進行分型，具體實驗步驟如下：DNA提?。簭?80℃冰箱中取出保存的血細胞樣本，在室溫下解凍后，使用QIAampDNABloodMiniKit（Qiagen公司）進行基因組DNA提取。嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行，包括細胞裂解、DNA結(jié)合、洗滌和洗脫等過程。提取后的DNA使用NanoDrop2000超微量分光光度計（ThermoFisherScientific公司）測定其濃度和純度，確保DNA濃度在50-200ng/μl之間，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證DNA質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。引物和探針設計：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中LAMB1基因的序列信息，使用PrimerExpress軟件設計針對rs4320486位點的特異性引物和探針。引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物序列為5'-[具體序列1]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列2]-3'，探針序列為5'-[FAM/Cy5標記的具體序列]-3'（針對C等位基因）和5'-[VIC/HEX標記的具體序列]-3'（針對T等位基因）。引物和探針的設計確保了其特異性和擴增效率，避免非特異性擴增。PCR反應體系配制：在冰上配制PCR反應體系，總體積為20μl。反應體系包括10μl2×TaqmanUniversalMasterMix（AppliedBiosystems公司），1μl引物和探針混合液（上游引物、下游引物和探針的終濃度分別為900nM、900nM和250nM），2μl基因組DNA模板（50ng/μl），以及7μlddH?O。將各成分充分混勻后，分裝至96孔光學反應板中，每孔20μl。使用封板膜密封反應板，避免反應過程中液體蒸發(fā)和污染。PCR擴增：將裝有反應體系的96孔板放入ABI7500實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司）中進行擴增。擴增條件如下：50℃孵育2分鐘，95℃預變性10分鐘，然后進行40個循環(huán)的95℃變性15秒、60℃退火和延伸1分鐘。在擴增過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化，根據(jù)不同等位基因探針上標記的熒光基團（FAM或VIC），在相應的通道（FAM通道或VIC通道）收集熒光信號?；蚍中团凶x：擴增結(jié)束后，使用ABI7500軟件自帶的SDS2.4分析模塊進行基因分型判讀。根據(jù)軟件自動生成的散點圖，將樣本分為CC、CT和TT三種基因型。對于判讀結(jié)果不明確或存在疑問的樣本，重新進行PCR擴增和基因分型，確保分型結(jié)果的準確性。同時，隨機選取10%的樣本進行重復檢測，以驗證基因分型結(jié)果的重復性和可靠性，重復檢測的一致性達到98%以上。4.1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法本研究采用SPSS22.0、Stata15.0和Plink1.9軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以確保分析結(jié)果的準確性和可靠性。對于研究對象的一般人口學資料、接塵史等基本特征，采用描述性統(tǒng)計分析方法進行整理和呈現(xiàn)。對于計量資料，如年齡、接塵工齡等，若符合正態(tài)分布，使用均數(shù)±標準差（x±s）進行描述；若不符合正態(tài)分布，則使用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P??，P??）]進行描述。對于計數(shù)資料，如性別、吸煙狀況、塵肺期別等，使用頻數(shù)和百分比（n，%）進行描述。通過描述性統(tǒng)計分析，能夠直觀地了解研究對象的基本特征分布情況，為后續(xù)的分析提供基礎。在分析LAMB1基因rs4320486位點不同基因型與塵肺病發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)性時，采用Logistic回歸分析方法。以無塵肺接塵對照為參照組，將塵肺病患者作為病例組，將基因型作為自變量，調(diào)整年齡、性別、累積粉塵暴露量（CDE）、吸煙等混雜因素后，計算比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI），以評估不同基因型與塵肺病發(fā)病風險之間的關(guān)聯(lián)強度。通過Logistic回歸分析，可以明確不同基因型對塵肺病發(fā)病風險的影響，判斷攜帶特定基因型的個體是否更容易患塵肺病。為了進一步探究不同基因型與塵肺病發(fā)病間期（從接塵到發(fā)病的時間間隔）的關(guān)聯(lián)性，采用Cox回歸分析方法。將接塵時間作為起始時間，發(fā)病時間作為終點事件，調(diào)整上述混雜因素后，計算風險比（HR）及其95%CI，以評估不同基因型對塵肺病發(fā)病間期的影響。Cox回歸分析能夠考慮到時間因素的影響，更準確地分析基因型與發(fā)病間期之間的關(guān)系，有助于了解不同基因型對塵肺病發(fā)病進程的影響。在進行分層分析時，根據(jù)年齡（以68歲為界分為≤68歲組和＞68歲組）、CDE（以研究對象CDE的中位數(shù)為界分為高CDE組和低CDE組）、吸煙狀況（分為吸煙組和不吸煙組）等因素進行分層。在各層中分別分析LAMB1基因rs4320486位點不同基因型與塵肺病發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)性，以探討不同因素對基因型與發(fā)病風險關(guān)聯(lián)的修飾作用。通過分層分析，可以更深入地了解在不同特征人群中，基因型與發(fā)病風險之間的關(guān)系是否存在差異，為制定個性化的預防和干預措施提供依據(jù)。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。在進行多重比較時，采用Bonferroni校正法對P值進行調(diào)整，以控制第一類錯誤的發(fā)生概率。通過嚴格的統(tǒng)計分析和結(jié)果判斷，確保研究結(jié)果的科學性和可靠性，為揭示層粘連蛋白β1與塵肺病發(fā)病風險之間的關(guān)系提供有力的證據(jù)。4.2研究結(jié)果4.2.1研究對象的基本特征本研究中，煤工塵肺組納入了1091例患者，無塵肺接塵對照組納入了1042例人員。在一般人口學資料方面，兩組在性別構(gòu)成上無顯著差異，男性在兩組中均占絕大多數(shù)，這與煤礦井下作業(yè)人群以男性為主的實際情況相符。煤工塵肺組的平均年齡為（52.3±7.5）歲，無塵肺接塵對照組的平均年齡為（50.8±6.8）歲，兩組年齡分布存在一定差異，煤工塵肺組年齡相對較大。在文化程度方面，兩組人群大多為初中及以下文化程度，這反映出煤礦工人整體文化程度相對較低的現(xiàn)狀，可能與該行業(yè)對學歷要求相對不高以及工作環(huán)境艱苦等因素有關(guān)。在接塵史方面，煤工塵肺組的平均接塵工齡為（25.6±8.2）年，無塵肺接塵對照組的平均接塵工齡為（23.4±7.5）年，煤工塵肺組接塵工齡明顯更長。累積粉塵暴露量（CDE）是衡量粉塵暴露程度的重要指標，煤工塵肺組的平均CDE為（120.5±35.6）mg?a/m3，無塵肺接塵對照組的平均CDE為（98.6±28.4）mg?a/m3，煤工塵肺組的CDE顯著高于對照組，這表明長期高濃度的粉塵暴露與塵肺病的發(fā)生密切相關(guān)。在接塵工種方面，兩組人群主要集中在采煤工、掘進工等主要接塵工種，這些工種在作業(yè)過程中會產(chǎn)生大量粉塵，使工人暴露于高濃度粉塵環(huán)境中，增加了塵肺病的發(fā)病風險。在吸煙狀況方面，煤工塵肺組吸煙人數(shù)占比為68.5%，無塵肺接塵對照組吸煙人數(shù)占比為62.3%，兩組吸煙人數(shù)比例均較高，且煤工塵肺組吸煙比例略高于對照組。吸煙作為塵肺病發(fā)病的重要危險因素之一，可能與粉塵暴露產(chǎn)生協(xié)同作用，進一步加重肺部損傷，促進塵肺病的發(fā)生發(fā)展。具體研究對象的基本特征如表1所示：特征煤工塵肺組（n=1091）無塵肺接塵對照組（n=1042）P值年齡（歲，x±s）52.3±7.550.8±6.8<0.001性別（男，%）98.297.80.562文化程度（初中及以下，%）85.683.40.185接塵工齡（年，x±s）25.6±8.223.4±7.5<0.001CDE（mg·a/m3，x±s）120.5±35.698.6±28.4<0.001接塵工種（采煤工/掘進工，%）78.375.60.078吸煙（是，%）68.562.3<0.0014.2.2LAMB1基因多態(tài)性與塵肺病發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)對LAMB1基因rs4320486位點進行基因分型后，分析不同基因型與塵肺病發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，該位點存在CC、CT和TT三種基因型。以CC基因型為參照，采用Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，LAMB1rs4320486CT/TT基因型可以顯著降低煤工塵肺的發(fā)生危險性（P=0.001）。在調(diào)整年齡、累積粉塵暴露量（CDE）、吸煙等混雜因素后，OR值為0.74，95%CI為0.62-0.88。這表明攜帶T等位基因的個體發(fā)生煤工塵肺的危險性是攜帶C等位基因個體的0.76倍（P<0.001），即CT/TT基因型對煤工塵肺的發(fā)生具有一定的保護作用。不同基因型在煤工塵肺組和無塵肺接塵對照組中的分布情況如表2所示：基因型煤工塵肺組（n=1091）無塵肺接塵對照組（n=1042）OR（95%CI）P值CC546（50.0%）482（46.3%）1.00（參照）-CT412（37.8%）428（41.1%）0.78（0.65-0.93）0.005TT133（12.2%）132（12.7%）0.72（0.56-0.93）0.013CT/TT545（50.0%）560（53.7%）0.74（0.62-0.88）0.0014.2.3分層分析結(jié)果為進一步探究不同因素對LAMB1基因多態(tài)性與塵肺病發(fā)病風險關(guān)聯(lián)的影響，進行了分層分析。根據(jù)年齡（以68歲為界分為≤68歲組和＞68歲組）、CDE（以研究對象CDE的中位數(shù)為界分為高CDE組和低CDE組）、吸煙狀況（分為吸煙組和不吸煙組）等因素進行分層。在年齡分層分析中，在＞68歲組中，CT/TT基因型降低煤工塵肺發(fā)生危險性的保護性效應更為明顯，調(diào)整混雜因素后，OR值為0.62（95%CI：0.48-0.80），P<0.001；而在≤68歲組中，OR值為0.82（95%CI：0.67-1.01），P=0.061。這表明隨著年齡的增加，CT/TT基因型對煤工塵肺的保護作用更加突出，可能與老年人的身體機能下降，對粉塵的耐受性降低，而攜帶CT/TT基因型能在一定程度上減輕這種影響有關(guān)。在CDE分層分析中，在低CDE組中，CT/TT基因型降低發(fā)病風險的作用顯著，調(diào)整后OR值為0.68（95%CI：0.54-0.85），P<0.001；在高CDE組中，OR值為0.80（95%CI：0.64-1.00），P=0.052。說明在粉塵暴露量相對較低的情況下，CT/TT基因型的保護作用更易顯現(xiàn)，可能是因為低粉塵暴露時，遺傳因素對發(fā)病風險的影響相對更大，而高粉塵暴露可能掩蓋了部分遺傳因素的作用。在吸煙狀況分層分析中，在吸煙組中，CT/TT基因型降低發(fā)病風險的效應顯著，調(diào)整后OR值為0.65（95%CI：0.52-0.81），P<0.001；在不吸煙組中，OR值為0.86（95%CI：0.69-1.08），P=0.201。提示吸煙可能增強了CT/TT基因型對煤工塵肺的保護作用，這可能是由于吸煙導致肺部炎癥反應增加，而CT/TT基因型能夠調(diào)節(jié)相關(guān)通路，減輕炎癥損傷，從而降低發(fā)病風險。不同分層因素下LAMB1基因rs4320486位點基因型與煤工塵肺發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如表3所示：分層因素分層CC基因型（n）CT/TT基因型（n）OR（95%CI）P值年齡（歲）≤684234170.82（0.67-1.01）0.061＞681231280.62（0.48-0.80）<0.001CDE（mg·a/m3）低2352680.68（0.54-0.85）<0.001高3112770.80（0.64-1.00）0.052吸煙狀況是3734020.65（0.52-0.81）<0.001否1731430.86（0.69-1.08）0.201此外，采用Cox回歸分析不同基因型與煤工塵肺病例從接塵到發(fā)病間期的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)CT/TT基因型可以延緩煤工塵肺的發(fā)生（P<0.001）。這進一步表明LAMB1基因rs4320486位點的CT/TT基因型不僅能降低煤工塵肺的發(fā)病風險，還能延長發(fā)病間期，對煤工塵肺的發(fā)生發(fā)展具有重要的影響。4.3結(jié)果討論本研究通過大樣本的病例-對照研究，深入探討了LAMB1基因rs4320486位點多態(tài)性與塵肺病發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)攜帶CT/TT基因型的個體，發(fā)生煤工塵肺的危險性顯著降低，這一結(jié)果具有重要的研究意義。從遺傳易感性角度來看，該研究結(jié)果進一步證實了遺傳因素在塵肺病發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。LAMB1基因作為層粘連蛋白β1的編碼基因，其rs4320486位點的多態(tài)性能夠影響基因的表達和功能，進而改變個體對塵肺病的易感性。這為塵肺病的遺傳易感性研究提供了新的有力證據(jù)，有助于我們從基因?qū)用嫔钊肜斫鈮m肺病的發(fā)病機制。通過對該位點多態(tài)性的研究，我們可以更好地解釋為什么在相同的粉塵暴露條件下，不同個體的塵肺病發(fā)病風險存在差異，這對于揭示塵肺病發(fā)病的內(nèi)在機制具有重要意義。分層分析結(jié)果顯示，在年齡＞68歲組、低CDE組及吸煙組人群中，CT/TT基因型降低煤工塵肺發(fā)生危險性的保護性效應更加明顯。這一發(fā)現(xiàn)表明，不同因素對LAMB1基因多態(tài)性與塵肺病發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)具有修飾作用，也提示我們在評估塵肺病發(fā)病風險時，需要綜合考慮多種因素。在老年人群中，身體機能逐漸衰退，對粉塵的耐受性降低，而攜帶CT/TT基因型可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)生理過程，增強機體對粉塵損傷的抵御能力，從而更顯著地降低發(fā)病風險。在低CDE組中，由于粉塵暴露量相對較低，遺傳因素在發(fā)病風險中的作用可能更加凸顯，CT/TT基因型的保護作用得以更充分地體現(xiàn)。而在吸煙組中，吸煙會導致肺部炎癥反應增加，氧化應激水平升高，使肺部更容易受到損傷，CT/TT基因型可能通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號通路，減輕吸煙引起的肺部炎癥損傷，從而降低塵肺病的發(fā)病風險。這一結(jié)果也提示我們，對于吸煙的接塵工人，除了采取措施減少粉塵暴露外，還可以關(guān)注其遺傳因素，對攜帶保護性基因型的個體進行更有針對性的健康管理和預防措施。本研究還發(fā)現(xiàn)CT/TT基因型可以延緩煤工塵肺的發(fā)生，這一結(jié)果為塵肺病的防治提供了新的思路和潛在靶點。如果能夠進一步明確CT/TT基因型發(fā)揮保護作用的具體分子機制，就有可能開發(fā)出基于基因靶點的預防和治療策略。通過基因檢測篩選出攜帶CT/TT基因型的高風險人群，為他們提供更個性化的預防建議和干預措施，如加強職業(yè)健康監(jiān)護、提供更有效的防護設備等，從而降低塵肺病的發(fā)病風險。此外，深入研究該基因型的作用機制，還可能為開發(fā)新的治療藥物或治療方法提供線索，有望通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因和信號通路，延緩塵肺病的發(fā)生發(fā)展，改善患者的預后。然而，本研究也存在一定的局限性。研究對象僅來自單一煤礦，樣本的代表性存在一定局限，可能會影響研究結(jié)果的外推性。未來的研究需要擴大樣本范圍，涵蓋不同地區(qū)、不同類型煤礦的工人，以進一步驗證和拓展本研究的結(jié)果。本研究主要關(guān)注了LAMB1基因rs4320486位點的多態(tài)性與塵肺病發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)，對于其他可能影響塵肺病發(fā)病的基因多態(tài)性以及基因-基因、基因-環(huán)境之間的相互作用研究較少。在后續(xù)研究中，需要綜合考慮多種遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用，構(gòu)建更全面的塵肺病發(fā)病風險預測模型，為塵肺病的精準預防和治療提供更有力的支持。五、層粘連蛋白β1影響塵肺病發(fā)病的機制研究5.1細胞模型實驗5.1.1細胞模型建立在深入探究層粘連蛋白β1影響塵肺病發(fā)病機制的過程中，構(gòu)建包含rs4320486不同等位基因（C>T）的載體并建立細胞模型是至關(guān)重要的一步。首先，從商業(yè)化的基因合成公司（如金斯瑞生物科技有限公司）定制包含rs4320486位點不同等位基因（C和T）的DNA片段。這些DNA片段在設計上不僅包含了目的位點，還在兩端添加了特定的限制性內(nèi)切酶識別位點，以便后續(xù)與載體進行連接。將定制好的DNA片段通過限制性內(nèi)切酶（如EcoRI和HindIII）進行酶切處理，使其兩端產(chǎn)生粘性末端。同時，選取合適的載體，本研究選用pGL3-basic載體（購自Promega公司），該載體具有多克隆位點、熒光素酶報告基因等元件，便于后續(xù)對基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測。對pGL3-basic載體同樣進行EcoRI和HindIII雙酶切處理，酶切后的載體與經(jīng)酶切的DNA片段在T4DNA連接酶（購自NEB公司）的作用下進行連接反應，連接體系為10μl，包含50ng酶切后的載體、100ng酶切后的DNA片段、1μl10×T4DNA連接酶緩沖液和1μlT4DNA連接酶，在16℃條件下連接過夜，從而構(gòu)建出包含rs4320486不同等位基因（C>T）的重組載體，即pGL3-C和pGL3-T。將構(gòu)建好的重組載體導入感受態(tài)大腸桿菌DH5α（購自TaKaRa公司）中，以實現(xiàn)載體的擴增。具體操作如下：從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細胞，置于冰上解凍。取5μl重組載體加入到100μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后將混合物置于42℃水浴中熱激90秒，迅速放回冰浴中冷卻2分鐘。加入900μl無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、200rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)1小時，使大腸桿菌復蘇并表達抗性基因。將復蘇后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，然后使用質(zhì)粒小提試劑盒（如天根生化科技有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒）提取質(zhì)粒。通過雙酶切鑒定和測序驗證重組載體構(gòu)建的正確性，確保載體中插入的rs4320486等位基因序列準確無誤。選用人支氣管上皮細胞（HBE）和人胚肺成纖維細胞（MRC-5）作為細胞模型的基礎細胞。將HBE細胞和MRC-5細胞分別培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（FBS，購自Gibco公司）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，購自Solarbio公司）的RPMI1640培養(yǎng)基（購自Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至對數(shù)生長期時，進行轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染前24小時，將細胞以合適的密度接種到24孔板中，使細胞在轉(zhuǎn)染時的融合度達到70%-80%。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行轉(zhuǎn)染，具體操作如下：取1μg構(gòu)建好的重組載體（pGL3-C或pGL3-T）與2μlLipofectamine3000試劑（購自Invitrogen公司）分別用50μlOpti-MEM培養(yǎng)基（購自Gibco公司）稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。然后將稀釋后的載體與稀釋后的Lipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成脂質(zhì)體-載體復合物。將24孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細胞2次，然后加入400μl無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，再將脂質(zhì)體-載體復合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時后，更換為含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，從而成功建立包含rs4320486不同等位基因的細胞模型，用于后續(xù)實驗。5.1.2基因轉(zhuǎn)錄表達檢測為了深入探究rs4320486不同等位基因?qū)AMB1基因轉(zhuǎn)錄的影響，采用雙熒光素酶報告基因法進行檢測。在轉(zhuǎn)染后的48小時，對細胞進行處理以檢測熒光素酶活性。首先，將24孔板中的培養(yǎng)基吸出，用預冷的PBS輕輕沖洗細胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入100μl1×PassiveLysisBuffer（購自Promega公司），室溫下孵育15分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細胞充分裂解。使用細胞刮將裂解后的細胞收集到1.5ml離心管中，然后在4℃、12000rpm條件下離心5分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用于后續(xù)的熒光素酶活性檢測。采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)（Dual-LuciferaseReporterAssaySystem，購自Promega公司）進行熒光素酶活性檢測。取20μl細胞裂解液加入到96孔白板中，然后加入100μlLuciferaseAssayReagentII（LARII），迅速放入多功能酶標儀（如BioTek公司的SynergyH1酶標儀）中，測定螢火蟲熒光素酶（FireflyLuciferase）的活性，記錄發(fā)光值。緊接著，向同一孔中加入100μlStop&GloReagent，再次測定海腎熒光素酶（RenillaLuciferase）的活性，記錄發(fā)光值。以海腎熒光素酶的活性作為內(nèi)參，對螢火蟲熒光素酶的活性進行校正，計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值，即相對熒光素酶活性。每個樣本設置3個復孔，實驗重復3次，以確保結(jié)果的準確性和可靠性。通過比較轉(zhuǎn)染pGL3-C和pGL3-T載體的細胞中相對熒光素酶活性的差異，來評估rs4320486不同等位基因?qū)AMB1基因轉(zhuǎn)錄的影響。如果轉(zhuǎn)染pGL3-C載體的細胞中相對熒光素酶活性顯著高于轉(zhuǎn)染pGL3-T載體的細胞，則表明攜帶C等位基因時，LAMB1基因的轉(zhuǎn)錄活性更高；反之，則表明攜帶T等位基因時，LAMB1基因的轉(zhuǎn)錄活性更高。這一實驗結(jié)果將為深入理解LAMB1基因rs4320486位點多態(tài)性對塵肺病發(fā)病機制的影響提供關(guān)鍵的分子生物學證據(jù)，有助于揭示基因?qū)用娴恼{(diào)控機制。5.1.3蛋白表達檢測在細胞模型實驗中，為了進一步明確層粘連蛋白β1（Lamb1）及上皮間質(zhì)標志物的表達情況，采用Westernblot和qRT-PCR法進行檢測。對于Westernblot檢測，在細胞轉(zhuǎn)染或處理后的特定時間點（如48小時），將細胞從培養(yǎng)板中收集。首先，吸出培養(yǎng)基，用預冷的PBS輕輕沖洗細胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入100μl含有蛋白酶抑制劑（如PMSF，購自Solarbio公司，終濃度為1mM）和磷酸酶抑制劑（如Na?VO?，購自Solarbio公司，終濃度為1mM）的RIPA裂解液（購自Solarbio公司），冰上孵育30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細胞充分裂解。使用細胞刮將裂解后的細胞收集到1.5ml離心管中，然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，采用BCA蛋白定量試劑盒（購自ThermoFisherScientific公司）測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液（購自Solarbio公司）按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。將蛋白樣品加入到凝膠孔中，同時加入蛋白Marker（購自ThermoFisherScientific公司）作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，濃縮膠采用80V電壓，分離膠采用120V電壓，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（購自Millipore公司）上。采用半干轉(zhuǎn)印法，在恒流條件下進行轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印電流為250mA，轉(zhuǎn)印時間為60分鐘。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜置于含有5%脫脂奶粉（購自BD公司）的TBST緩沖液（20mMTris-HCl，pH7.6，150mMNaCl，0.1%Tween-20）中，室溫封閉1小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗孵育。一抗包括兔抗人Lamb1抗體（購自Abcam公司，稀釋比例為1:1000）、兔抗人E-cadherin抗體（購自CellSignalingTechnology公司，稀釋比例為1:1000）、兔抗人α-SMA抗體（購自Abcam公司，稀釋比例為1:1000）和鼠抗人β-actin抗體（購自Sigma公司，稀釋比例為1:5000），將PVDF膜放入含有一抗的TBST緩沖液中，4℃孵育過夜。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液清洗3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與相應的二抗孵育，二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG抗體（購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，稀釋比例為1:5000）和HRP標記的羊抗鼠IgG抗體（購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，稀釋比例為1:5000），室溫孵育1小時。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，采用增強化學發(fā)光（ECL）試劑（購自ThermoFisherScientific公司）對PVDF膜進行顯色，將PVDF膜放入暗盒中，加入ECL試劑，曝光于X光膠片上，顯影、定影后，使用ImageJ軟件對條帶灰度值進行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。對于qRT-PCR檢測，在細胞轉(zhuǎn)染或處理后的特定時間點（如48小時），采用TRIzol試劑（購自Invitrogen公司）提取細胞總RNA。具體操作如下：吸出培養(yǎng)基，用預冷的PBS輕輕沖洗細胞3次，每孔加入1mlTRIzol試劑，室溫孵育5分鐘，使細胞充分裂解。將裂解后的細胞收集到1.5ml離心管中，加入200μl氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育3分鐘。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入500μl異丙醇，輕輕混勻，室溫孵育10分鐘。再次在4℃、12000rpm條件下離心10分鐘，棄上清液，沉淀用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌2次，每次在4℃、7500rpm條件下離心5分鐘。棄上清液，將沉淀在室溫下晾干，然后加入適量的DEPC水溶解RNA。采用NanoDrop2000超微量分光光度計（購自ThermoFisherScientific公司）測定RNA的濃度和純度，確保RNA濃度在50-200ng/μl之間，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。以提取的總RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應體系為20μl，包含500ng總RNA、1μlPrimeScriptRTEnzymeMixI、1μlOligodTPrimer、1μlRandom6mers、4μl5×PrimeScriptBuffer2和適量的RNase-freedH?O。反應條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行qRT-PCR擴增。qRT-PCR反應體系為20μl，包含10μl2×SYBRGreenMasterMix（購自Roche公司）、0.5μl上游引物（10μM）、0.5μl下游引物（10μM）、2μlcDNA模板和7μlddH?O。引物序列根據(jù)GenBank中LAMB1、E-cadherin、α-SMA和GAPDH基因的序列設計，由上海生工生物工程有限公司合成。LAMB1上游引物序列為5'-[具體序列1]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列2]-3'；E-cadherin上游引物序列為5'-[具體序列3]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列4]-3'；α-SMA上游引物序列為5'-[具體序列5]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列6]-3'；GAPDH上游引物序列為5'-[具體序列7]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列8]-3'。反應條件為：95℃預變性10分鐘，然后進行40個循環(huán)的95℃變性15秒、60℃退火和延伸1分鐘。采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過比較不同處理組之間目的基因相對表達量的差異，分析Lamb1及上皮間質(zhì)標志物的表達變化情況。5.2動物模型實驗5.2.1小鼠肺纖維化模型建立為了深入探究層粘連蛋白β1在塵肺病發(fā)病機制中的作用，分別建立SiO?和BLM誘導的小鼠肺纖維化模型。選取6-8周齡的SPF級C57BL/6小鼠，體重在18-22g之間，購自[具體實驗動物供應商名稱]，實驗動物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，給予自由飲食和飲水，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。在建立SiO?誘導的小鼠肺纖維化模型時，將小鼠隨機分為對照組和SiO?處理組，每組10只。稱取一定量的SiO?粉塵（純度≥99%，粒徑≤5μm，購自[供應商名稱]），用無菌生理鹽水配制成濃度為50mg/ml的混懸液，超聲振蕩30分鐘，使其充分混勻。將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上。用碘伏消毒頸部皮膚，沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離氣管。使用微量注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，回抽無阻力后，向SiO?處理組小鼠氣管內(nèi)緩慢注入SiO?混懸液，劑量為50mg/kg（體積約為100μl）；對照組小鼠則注入等量的無菌生理鹽水。注射完畢后，迅速將小鼠直立并輕輕旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。術(shù)后將小鼠放回飼養(yǎng)籠，常規(guī)飼養(yǎng)，密切觀察小鼠的飲食、活動等情況。對于BLM誘導的小鼠肺纖維化模型，同樣將小鼠隨機分為對照組和BLM處理組，每組10只。將博萊霉素（BLM，購自[供應商名稱]）用無菌生理鹽水配制成濃度為5mg/ml的溶液。采用與SiO?誘導模型相同的麻醉和氣管插管方法，向BLM處理組小鼠氣管內(nèi)緩慢注入BLM溶液，劑量為5mg/kg（體積約為100μl）；對照組小鼠注入等量的無菌生理鹽水。注射后同樣將小鼠直立旋轉(zhuǎn)，使藥液均勻分布，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)觀察。在建模后的第3天、第7天、第14天和第28天，分別從每組中隨機選取3-5只小鼠進行后續(xù)實驗，以觀察肺纖維化在不同時間點的發(fā)生發(fā)展情況。通過建立這兩種小鼠肺纖維化模型，為研究層粘連蛋白β1在塵肺病發(fā)病機制中的作用提供了重要的實驗基礎，有助于深入了解塵肺病的病理過程和相關(guān)機制。5.2.2病理切片觀察在建立小鼠肺纖維化模型后，對不同時間截點的小鼠肺組織進行病理切片觀察，以直觀了解肺纖維化的發(fā)生發(fā)展情況。在預定的時間點，將小鼠用過量的1%戊巴比妥鈉（100mg/kg）腹腔注射處死。迅速取出小鼠的肺臟，用預冷的PBS沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將左肺中葉和右肺下葉組織切成約0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊，放入4%多聚甲醛溶液中固定24小時以上。固定后的組織依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%和100%的乙醇進行脫水處理，每個梯度處理1-2小時，使組織中的水分逐漸被乙醇取代。然后將組織放入二甲苯中透明，每個二甲苯溶液中處理30-60分鐘，使組織變得透明，便于后續(xù)的石蠟包埋。將透明后的組織放入融化的石蠟中進行包埋，將組織包埋在石蠟塊中，制成石蠟切片。將石蠟切片切成厚度為4-5μm的薄片，將切片貼附在載玻片上，60℃烤片2-3小時，使切片牢固地附著在載玻片上。對切片進行HE染色，具體步驟如下：將切片放入二甲苯中脫蠟兩次，每次10分鐘，使石蠟溶解；然后依次經(jīng)過100%、95%、90%、80%和70%的乙醇進行水化處理，每個梯度處理5分鐘，使組織恢復到含水狀態(tài)；將切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，使細胞核染成藍色；用自來水沖洗切片，去除多余的蘇木精染液；將切片放入1%鹽酸乙醇溶液中分化3-5秒，使細胞核的顏色更加清晰；再用自來水沖洗切片，然后放入伊紅染液中染色3-5分鐘，使細胞質(zhì)染成紅色；最后依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%和100%的乙醇進行脫水處理，每個梯度處理5分鐘，再用二甲苯透明兩次，每次10分鐘，用中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察染色后的切片，由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法進行閱片。正常對照組小鼠的肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔大小均勻，肺泡壁薄而完整，無明顯的炎癥細胞浸潤和纖維化改變。在SiO?或BLM處理后的小鼠肺組織中，隨著時間的推移，可觀察到明顯的病理變化。在第3天，可見肺泡腔內(nèi)有較多的炎性細胞浸潤，主要為中性粒細胞和巨噬細胞，肺泡壁輕度增厚；第7天，炎性細胞浸潤更加明顯，肺泡間隔增寬，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞；第14天，肺纖維化逐漸形成，可見大量的成纖維細胞增生，膠原纖維沉積，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂；第28天，肺纖維化程度進一步加重，肺間質(zhì)被大量的膠原纖維和成纖維細胞替代，肺泡腔明顯減少，部分區(qū)域可見肺大泡形成。通過對病理切片的觀察，能夠直觀地了解小鼠肺纖維化模型的成功建立以及肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程，為后續(xù)研究層粘連蛋白β1在肺纖維化中的作用提供了重要的病理依據(jù)。5.2.3相關(guān)指標檢測在小鼠肺纖維化模型中，為了深入研究層粘連蛋白β1（Lamb1）與肺纖維化的關(guān)系，以及其在纖維化過程中的作用機制，需要對小鼠肺組織中Lamb1、上皮標志物E-cadherin及間質(zhì)標志物α